平喘宁对哮喘大鼠肺组织TGF_1_Cycl_省略_nD1及p_ERK1_2mRN

?研究报告?

平喘宁对哮喘大鼠肺组织TGF -β1、CyclinD1及

p -ERK1/2 mRNA表达的影响

方向明1，王智星1，邬锡琴2

（1安徽中医药大学，合肥 230038； 2合肥工业大学，合肥 230009）

摘要：目的：观察平喘宁对寒性哮喘大鼠肺组织中转化生长因子-β1（T G F -β1）、细胞周期蛋白D1（CyclinD1）和磷酸化细胞外信号调节激酶1、2（p -ERK1/2）mRNA表达的影响。方法：雄性SD大鼠105只，随机分为正常组、模型组、桂龙咳喘宁组、地塞米松组、平喘宁高剂量组、平喘宁中剂量组、平喘宁低剂量组，每组15只。以卵蛋白致敏及寒冷刺激复制大鼠哮喘模型，造模21d后，正常组、模型组每天给予蒸馏水灌服，其它各组给予相应药物灌服，4周后解剖大鼠并取出肺组织。采用免疫组化法测定肺组织中TGF -β1、CyclinD1的含量，采用RT -PCR检测平喘宁治疗哮喘前后p -ERK1/2 mRNA表达的变化。结果：和正常组比较，模型组发生明显炎性细胞侵润，气道平滑肌增厚；肺组织TGF -β1、CyclinD1的表达水平上升（P <0.05，P <0.01）；p -ERK1/2 mRNA表达水平提高（P <0.05，P <0.01）。和模型组比较，各治疗组肺组织病理改变有不同程度的好转；TGF -β1、CyclinD1表达下降，p -ERK1/2 mRNA表达水平降低（P <0.05，P <0.01）。结论：平喘宁可通过抑制P -ERK1/2 mRNA表达，调节ERK信号转导通路，抑制TGF -β1、CyclinD1表达，抑制气道重塑而治疗哮喘。

关键词： 哮喘；平喘宁；TGF -β1；CyclinD1；p -ERK1/2 mRNA 基金资助：国家自然科学基金（No.81173187）

In ? uence of Pingchuanning on expression of TGF-β1, CyclinD1 and p-ERK1/2 mRNA in lung tissues of asthma rats

FANG Xiang-ming 1, WANG Zhi-xing 1, WU Xi-qin 2

( 1Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230038, China; 2Hefei University of Technology, Hefei 230009, China )

Abstract: Objective: To study the influence of Pingchuanning on the expression of TGF-β1, CyclinD1 and p-ERK 1/2

mRNA in lung tissue of asthma rats. Methods: 105 male SD rats were randomly divided into normal group, model group, Guilong Kechuanning group, dexamethasone group, high, middle and low dose of Pingchuanning groups, and with 15 rats in each group. The stimulations as ovalbumin sensitization and cold were used to establish the asthma rat model. After 21 days, rats in normal group and model group received gavage administration with distilled water, and rats in the other groups received gavage administration with corresponding drugs for 4 weeks. The contents of TGF-β1 and CyclinD1 in lung were tested by suing immunohistochemistry method, and the expression of p-ERK1/2 mRNA was determined by using RT-PCR. Results: Compared with normal group, there was obvious infl ammatory cell invasion in lung tissue of rats in model group, the airway smooth muscle was thickened, and the contents of TGF-β1, CyclinD1 and expression of p-ERK1/2 mRNA in lung tissue of rats in model group was increased (P <0.05, P <0.01). Compared with model group, the pathological changes of rats in the treatment groups were all improved to some extent, and the contents of TGF-β1 and CyclinD1 and the expression of p-ERK1/2 mRNA in lung tissue of rats in treatment groups were all decreased (P <0.05, P <0.01). Conclusion: Pingchuanning could treat asthma through inhibiting the expression of p-ERK1/2 mRNA, TGF-β1 and CyclinD1, regulating ERK signal transduction pathway, and inhibiting airway remodeling.

Key words: Asthma; Pingchuanning; TGF-β1; CyclinD1; P-ERK1/2 mRNA

Funding: National Natural Science Foundation of China (No.81173187)

通讯作者：方向明，合肥市梅山路103号安徽中医药大学中医临床学院，邮编：230038，电话：0551-********，E -mail：fxm.bsh@https://www.wendangku.net/doc/2213079823.html,

支气管哮喘是气道慢性炎性反应，由多种细胞（如嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、气道上皮细

胞等）和细胞组分参与的，以气道高反应性、气道重建和可逆性气道阻塞为主要临床特征的疾患。平喘宁是本课题组长期

治疗寒哮的有效方剂，由射干麻黄汤与三子养亲汤化裁而成，具有温肺化痰、止咳平喘之功效。本实验通过建立大鼠寒哮动物模型，观察平喘宁对哮喘大鼠肺组织中转化生长因子-β1（transforming grouth factor-β1，TGF-β1）、细胞周期蛋白D1（CyclinD1）和磷酸化细胞外信号调节激酶1、2（p-ERK1/2） mR NA表达的影响，探讨平喘宁调节细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信号通路治疗哮喘的作用机制。

材料

1．动物及分组 健康雄性SD大鼠105只，体质量180-220g，清洁级，由安徽医科大学动物实验中心提供，许可证编号：SCXK（皖）2011-002。随机分为正常组，模型组，平喘宁高、中、低剂量组，地塞米松组，桂龙咳喘宁组7组，每组15只。

2．药物及试剂 平喘宁方药组成：麻黄、杏仁、苏子、半夏等，中药来自于安徽中医药大学第一附属医院中药房，分别煎制成生药浓度为1.96g/mL（高剂量）、0.98g/mL（中剂量）、0.49g/mL （低剂量）。地塞米松片（上海信谊药业有限公司产品，批号：030402）；桂龙咳喘宁（山西桂龙医药有限公司产品，批号：Z20103119）。卵蛋白（Sigma公司，批号：20140508）；水合氯醛（上海化学试剂公司，批号：20140819）；TGF-β1（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：H0578）、CyclinD1抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：G0526）；DAB显色剂试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：k137726A）；通用型二抗试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：K1356261）；Trizol试剂（美国Invitrogen公司，批号：14105）；逆转录试剂盒（Promega公司，批号：00155712）；目的基因和GA PDH引物（上海捷瑞生物生物工程有限公司，批号：20130618）；琼脂糖（Promega公司，批号：11182）；DEPC（美国Gibico公司，批号：20121156）；EB（美国Sigma公司，批号：20130107）。

3．仪器 402A型超声雾化器（江苏鱼跃医疗设备有限公司产品）；寒冷箱0-2℃（荣事达有限公司）；切片机(德国Leica 公司产品)；光学显微镜（日本奥林巴斯公司产品，型号CX21）。PCR仪（德国Eppendorf公司）；电泳仪及电泳槽（北京市六一仪器厂）；凝胶密度扫描仪及Quantity One 4.62分析软件（美国BIO公司）。

方法

1．造模及给药 参照文献[1-3]复制哮喘模型，哮喘各组均在第1天和第8天腹腔注射10%卵蛋白（OVA）1mL致敏，第15天开始以1%OVA雾化激发，每次30min，每天1次；同时将大鼠间断放入可调的寒冷箱内（0-2℃），1次/d，每次2h，连续7d，以SD大鼠出现畏寒肢冷、呼吸急促、腹肌抽搐，口唇发绀代表模型复制成功。正常组参照上述方法，只是致敏与激发时均以0.9%氯化钠溶液代替OVA，不用寒冷刺激。造模成功后，继续雾化激发与寒冷刺激4周。造模第21天后开始给药，根据《药理实验方法学》，各组动物用药量按人与动物的体表面积换算，成人与大鼠间的系数是0.018（以成人体质量70kg计）。正常组、模型组灌胃等容积的9.0g/L氯化钠溶液，地塞米松组将地塞米松药片研碎后用0.9%氯化钠溶液溶解后灌服（0.4mg?kg-1?d-1），桂龙咳喘宁组将桂龙咳喘宁胶囊内的药粉倒出用0.9%氯化钠溶液溶解后灌服（10g?kg-1?d-1），平喘宁高、中、低剂量组给予平喘宁灌服（19.6、9.8、4.9g?kg-1?d-1），每日1次，连续给药4周。实验结束后，停药禁食一天后处死大鼠。末次激发后1-2h，用10%的水合氯醛3.5mL/kg 腹腔注射麻醉，取左上肺置于10%甲醛液中固定；取右肺和左肺组织放入冻存管中，置-80℃冰箱中保存备用。

2. TGF-β1和CyclinD1检测 常规病理切片，选取组织标本蜡块进行免疫组化检测。石蜡切片常规脱蜡至水；滴加3%H2O2，室温静置10-15min；PBS洗3次各3min，滴加正常山羊血清封闭液，室温30min；滴加Ⅰ抗：TGF-β1和CyclinD1按照一定浓度稀释室温孵育10-15min，4℃过夜；37℃复温10-20min；滴加生物素标记的Ⅱ抗工作液，37℃ 30min；PBS洗3次各5min；PBS洗3次各5min，DAB显色5-10min；冲洗后苏木素复染，脱水，透明，中性树胶封片；烤片，拍照。

3. p-ERK1 mRNA和p-ERK2 mRNA测定 引物：根据已发表的cDNA文库及参考文献，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，见表1。RNA的提取：取100g肺组织放于匀浆管内，冰上操作，加入PDGF-BB（25μg/L）刺激20min，诱导ERK磷酸化[1]，加入1mL Trizol进行组织裂解，研磨组织后，倒入1.5mL EP管中，混匀静置在室温中5min后，加入0.2mL氯仿，再混匀静置在室温中5min后，15 000r/min离心15min，将上层水相转入新的

表1 PCR检测中引物序列引物长度（bp）

基因名称 引物序列PCR产物长度（bp）p-ERK1上游：5’-AGC ACC CAC CCT GGA AGC CA-3’251

下游：5’- CAG CAA TCC GGG CAA GGC CA-3’

p-ERK2上游：5’- GCG CCT ACG GCA TGG TTT GTT CT-3’422

下游：5’- TGC AAC ACG GGC AAG GCC AA-3’

GAPDH上游：5’-ACA GCA ACA GGG TGG TGG AC -3’252

下游：5’- TTT GAG GGT GCA GCG AAC TT-3’

1.5mL EP管里，加入0.5mL异丙醇，混匀后放置于-20℃中1h，然后12 000r/min离心10min，留取沉淀，加入1mL75%乙醇，震荡洗涤RNA沉淀1次，后7 500r/min离心5min，弃上清液，再加入18μL DEPC水溶解完全，在55-60℃下孵育10min助溶，即得肺组织总RNA。将提取的总RNA保存于-80℃超低温冰箱中。RT反应：在0.2mLEP管中，加入总RNA8μL、10μM Oligo （dT）1μL和DEPC水4μL，轻轻混匀，点动离心。PCR仪上65℃加热5min，冰浴3min，在上述管中加入MMLV1.0μL、10mmol/L dNTPs

2.0μL、Oligo（dt）primer 1.0μL、5×Reaction Buffer 1.0μL、R Nasin 1μL、RNA 2μL、Water、nuclease-free 9μL，混匀后点动离心，在PCR仪器上进行下述操作：42℃ 60min，70℃ 5min，取出上述反应液，即为cDNA，-20℃ 保存。PCR反应：吸取上述反应液5μL作为模板，加入到PCR反应管中。反应条件：p-ERK1：变性30s，95℃；退火51℃，30s；72℃延伸，1min；共进行30个循环，最后72℃延伸5min，扩增长度片段251bP。p-ERK2：变性30s，95℃；退火50℃，30s；72℃延伸，1min；共进行35个循环，最后72℃延伸5min，扩增长度片段422bP。PCR 产物电泳分析：分别取5μL PCR产物与1μL DNA加样缓冲液混匀，以1%琼脂糖凝胶电泳，同时加100bp Marker作对照标记，其结果用Eagle EyeⅡ凝胶成像仪分析：①确定产物位置；

②光密度值扫描（密度代表基因表达丰度）；③半定量计算：以β-actin为内参照，对p-ERK1 mRNA、p-ERK2 mRNA表达丰度进行分析。

4. 统计学方法 应用SPSS 17.0软件进行统计学处理，所有数据用x-±s来表达。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK检验，因素间用相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1. 各组大鼠肺组织中TGF-β1及CyclinD1比较 见图1-图2及表2。免疫荧光显微镜下，正常组大鼠各级支气管结构大体正常，无明显炎性细胞浸润；模型组通过显色可见TGF-β1和CyclinD1蛋白表达水平上升，支气管黏膜充血，皱襞增多，大量的炎性细胞浸润，黏膜上皮中杯细胞数目明显增加，上皮细胞脱落，各级支气管的管壁、管壁平滑肌层和基底膜增厚，细支气管更为明显，并见管道变窄，甚至趋近闭塞。地塞米松组、桂龙咳喘宁组、平喘宁组较模型组的TGF-β1和CyclinD1蛋白表达改变明显降低，

病理改变减轻。

图1 各组大鼠肺组织中TGF-β1表达（

DAB显色×400）注：A. 正常组；B. 模型组；C. 地塞米松组；D. 桂龙咳喘宁组；

E. 平喘宁低剂量组；

F. 平喘宁中剂量组；

G. 平喘宁高剂量组。图2同。

A

D

B

E

C

F

G

图2 各组大鼠肺组织中CyclinD1表达（DAB显色×400）

A

D

B

E

C

F

G

2. 各组大鼠肺组织p-ERK1/2 mRNA表达丰度半定量比

较 见表3，图3。p-ERK1/2 mRNA表达丰度半定量，以 GAPDH 为内参，各组PCR产物采用1%琼脂糖凝胶电泳，用GSM凝胶图像分析管理系统分析。与正常组比较，模型组肺组织p-ERK1 mRNA、p-ERK2 mRNA显著上升（P<0.01）。与模型组比较，

图3 各组大鼠肺组织中p-ERK1/2 mRNA表达注：1. 正常组；2. 模型组；3. 桂龙咳喘宁组；4. 地塞米松组；

5. 平喘宁高剂量组；

6. 平喘宁中剂量组；

7. 平喘宁低剂量组。

表2 各组大鼠肺组织中TGF-β1及CyclinD1平均光密度表达

（x-±s）

组别n TGF-β1/A CyclinD1/A

正常组150.476±0.0340.496±0.032

模型组130.825±0.078**0.675±0.125**地塞米松组110.663±0.011*△△0.578±0.041*△△桂龙咳喘宁组120.747±0.040*△0.613±0.018*△△平喘宁低剂量组110.671±0.066*△△0.568±0.080*△△平喘宁中剂量组120.597±0.026*△△0.553±0.040*△△平喘宁高剂量组130.533±0.027*△△0.520±0.048*△△注：与正常组比较：*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01。下表同。

各治疗组肺组织p-ERK 1mRNA、p-ERK2mRNA显著下降（P<0.05，P<0.01）。

表3 各组大鼠肺组织中p-ERK1 mRNA及p-ERK2 mRNA表达

丰度半定量比较（x-±s）

组别n p-ERK1 mRNA/

GAPDH

p-ERK2 mRNA/

GAPDH

正常组150.379±0.0290.364±0.021

模型组130.673±0.020**0.634±0.039**桂龙咳喘宁组120.632±0.045*△0.529±0.013*△地塞米松组110.558±0.023*△△0.539±0.052*△平喘宁高剂量组130.443±0.027*△△0.428±0.028*△△平喘宁中剂量组120.541±0.041*△△0.481±0.027*△△平喘宁低剂量组110.567±0.018*△0.533±0.024*△讨论

TGF-β1在T细胞、B细胞、DC、肥大细胞和嗜酸粒细胞等炎性细胞中是抑制性的，它还改变了支气管上皮细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞等结构性细胞的功能[4]。Cyclin D作为细胞周期进程的正性调控蛋白，能够促进平滑肌细胞的分裂增殖，与哮喘的发生发展密切相关[5]。

ERK属于有丝分裂原激活蛋白激酶（MAPK）家族，它是细胞内重要的信号传递分子，并有多种亚型，在平滑肌中主要有ERK1、ERK2两种[6]。ERK1/2信号通道介导哮喘气道重塑的机制有可能涉及多个方面，包括气道平滑肌细胞的增殖、气道上皮细胞损伤后再修复和细胞外基质分泌等[7]。MAPK信号通路与多种细胞增殖有关，ERK1/2作为MAPK通路的重要成员，是该通路中的关键酶，其通路是不同促增殖因子调控的共同通路。已发现ERK1/2在气道平滑肌上广泛分布，这说明其在哮喘气道重塑中ASMCs增殖中起重要作用[8]。在慢性哮喘患者的气道中，ERK1/2持续活化或过度活化加重气道炎性反应、气道重构和气道的高反应性，为哮喘气道高反应的发生发展与持续存在提供了分子基础[9]。有研究发现[10]，p-ERK特异性抑制剂U0126可以抑制PDGF及FBS诱导的气道平滑肌ERK的磷酸化，核内转录因子c-fos、细胞周期蛋白D和RSK等表达也被抑制，同时ASMCs的增殖也明显受到抑制。

本研究的造模方法在前期实验中已多次应用，并检测过肺功能指标，证实此种造模方法可以复制寒哮模型。平喘宁从经方射干麻黄汤与三子养亲汤化裁而成，是本课题组期治疗寒哮的验方，主要由麻黄、苏子、杏仁、半夏等中药组成，全方温肺散寒，止咳平喘。本实验显示，平喘宁可通过调节ERK信号转导通路，抑制p-ERK1/2 mRNA表达，从而抑制TGF-β1、CyclinD1表达，抑制气道重塑而治疗哮喘，有关平喘宁治疗哮喘的作用机制有待于进一步研究。

参 考 文 献

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（收稿日期：2015年3月25日）