血清浓度及溶氧对培养rCHO细胞生产尿激酶原的影响

血清浓度及溶氧对培养rCHO细胞生产尿激酶原的影响

胡显文1　肖成祖1　高丽华1　李佐虎2

(1军事医学科学院生物工程研究所　北京100071;

　2中国科学院化工冶金研究所　北京100080)

摘要　在30L搅拌式反应器中用多孔微载体培养分泌尿激酶原的DNA重组中国仓鼠卵巢细胞(rCH O),研究了血清浓度及溶氧对细胞生长和表达的影响。结果表明,在2×105Πml低密度接种条件下,使用低(无)血清培养基会延长细胞生长延滞期并降低比生长速率,而细胞密度大于106Πml时,血清浓度对细胞生长和产物表达的影响没有显著差别。溶氧(DO)维持在20%～45%时,对细胞表达产物和葡萄糖代谢无明显影响,但溶氧降至7%～9%时,细胞表达水平明显降低,葡萄糖代谢转化为乳酸的比例上升。

关键词　细胞培养,多孔微载体,尿激酶原,无血清培养基,溶氧

E ffects of serum concentration and dissovled oxygen on production

of prourokinase with rCH O cell culture

H U X ian2Wen,XI AO Cheng2Zu,G UO Li2Hua,LI Zuo2Hu

(Institute o f Biotechnology,Academy o f Military Medical Sciences,Beijing100071,P.R.China)

Abstract　A recombinant Chinese hamster ovary cell line,which secrets prourokinase(Pro2UK),was cultivated on porous micro2 carriers in a30L stirred tank reactor.Cell growth and expression were studied in different serum concentration and diss olved oxy2 gen(DO)level.The specific growth rate decreased and lag phase extended when cell grew in low serum or serum2free medium at low inoculated density of～2.0×105Πml,but no significant effect on cell growth and expression was observed when cell density was m ore than1.0×106Πml.There was few difference in cell expression and glucose metabolism when DO varied from20%～45%.But when DO level dropped to7%～9%,the cell expression level decreased and specific lactate production rate increased greatly.

K ey w ords　cell culture,porous microcarrier,prourokinase,serum2free medium,diss olved oxygen

尿激酶原是双链尿激酶的单链前体,给药时保持无活性的酶原形式,只有与血栓表面结合时才转变为具有激活纤维蛋白表面的纤溶蛋白原活性的双链尿激酶,因而具有选择性溶栓作用。临床研究表明,尿激酶原是一种高效、特异、副作用小、再栓塞率低的第二代溶栓药物[1,2]。目前,美国、德国、日本等利用基因重组哺乳动物细胞株表达的尿激酶原已进入临床试验阶段。大规模动物细胞培养技术是生产基因工程药物、单克隆抗体和疫苗等生物制品的关键技术,例如利用重组CH O细胞表达的促红细胞生成素(EPO)1998年的全球销售额已达30亿美元,成为仅次于奥美拉唑的销售额第二大医药产品[3]。在国外真核表达系统及动物细胞培养技术在生物制药中的比例早已超过原核表达系统及细菌发酵技术[4]。商业用动物细胞培养技术应有以下特征:“大规模、高密度、长期和高表达”(large2scale,high2den2 sity,long2term and high2level expression)。用含血清培养基生产生物制品有许多不利,如增加培养成本和污染机会,增加纯化难度和成本,增加产品质控指标,因此,大规模生产临床使用的生物制品应尽可能使用无血清培养基。本工作研究了血清浓度和溶氧水平对于大规模高密度长期培养基因重组动物细胞的影响,为尿激酶原的产业化奠定基础。

1　材料与方法

1.1　细胞株、培养基和多孔微载体

培养分泌尿激酶原(pro2UK)的重组CH O细胞株C L211G (军事医学科学院生物工程研究所),细胞在方瓶培养中的表达水平(q

pro2UK

)约500UΠ(106cells?d)。采用无血清培养基(表1),基本组成为DME MΠF12(1:1)(Hyclone C https://www.wendangku.net/doc/2813442970.html, A),添

加适量蛋白胨、胰岛素及某些氨基酸和无机盐等小分子物质。为防止在细胞培养中,单链pro2UK过度降解成双链尿激酶,在培养基中加入少量Aprotinin(抑蛋白酶肽,Bayer C o.),过滤除菌。

Cytopore纤维素多孔微载体(Pharmacia C o.),用前用0.1 m olΠL、pH7.0的磷酸缓冲液(P BS)浸泡,4h后,倾去P BS,再用P BS洗涤3次,在121℃高压灭菌30min后,吸出P BS,用DME MΠF12培养基浸泡备用。Cytopore多孔微载体机械强度高,可回收重复使用。

表1　无血清培养基配方

主要成分50%DME M(低糖)培养基50%F212培养基

添加成分　4.5gΠL～6.0gΠL葡萄糖

1.5gΠL～

2.5gΠL NaHCO3

0.5gΠL谷氨酰胺

1.0gΠL蛋白胨

1.0gΠL Hepes

120UΠL胰岛素

10KIUΠm l Aprotinin

某些氨基酸、维生素及微量元素

1.2　反应器和培养方法

30L Biostat UC(工作体积20L)(B.Braun C o.,G ermany)在位灭菌搅拌式反应器。反应器中装备自行设计的可反冲细胞截留系统,在细胞换液连续培养时可将生长在微载体中的细胞截留在反应器中,提高细胞培养密度和反应器的生产能力[5]。采用无泡通气薄壁硅胶管气体交换系统,避免细胞培养中直接通气时气泡的凝聚破裂对细胞产生的机械损伤。

细胞由方瓶(单层贴壁培养)→转瓶(单层贴壁培养)→搅拌瓶(多孔微载体培养)→5L CelliG en反应器(多孔微载体培养)→30L Biostat UC反应器(多孔微载体培养)逐级放大培养。由于细胞能在长满细胞的载体和空载体之间自动转移,每级放大培养时,先在更大规模的反应器中预先加入适量培养基和经过处理的多孔微载体,长满细胞的多孔微载体通过管道直接进入下一级反应器中,而无需胰酶的消化来帮助细胞培养的接种和放大[6]。控制pH为7.0±0.05,DO为7%～40%,温度为37.0℃±0.1℃,搅拌转速为70rΠmin～90rΠmin,多孔微载体的浓度为2gΠL～4gΠL培养基。采用批式换液连续培养方式,每天通过细胞截留系统换液1～1.2个工作体积,将微载体截留在反应器中,收获含产品的上清并加入新鲜培养基[6,7]。

1.3　检测方法

1.3.1　细胞计数　结晶紫柠檬酸溶液染色法[8]。

1.3.2　pro2UK活性测定　用改进的琼脂糖2纤维蛋白2平板法[9]。

1.3.3　葡萄糖和乳酸的测定　葡萄糖浓度用血糖诊断试剂盒测定(中国科学院百泰技术公司)。乳酸浓度由乳酸酶试剂盒测定(Centronic G mbH)。2　结果与讨论

2.1　血清浓度对细胞生长和表达的影响

在低密度细胞接种(如2×105Πml),低(无)血清培养基对细胞生长不利,延滞期明显延长,比生长速率下降近1Π2。而当细胞密度大于106Πml时,细胞在0.1%血清培养基中的比生长速率与在1%血清培养基中相差不大(表2)。因此,应尽可能增加大规模细胞培养的接种密度以缩短生长延滞期,提高细胞比生长速率。如果接种密度较低时,在培养开始阶段,应使用含血清培养基,待细胞密度达到一定水平(如>106Πml)、细胞进入对数生长期时再换用无血清培养基。用多孔微载体在30L生物反应器中培养细胞时,血清浓度对基因工程CH O细胞表达尿激酶原的影响不显著(表2),与在方瓶中用含2%～5%血清培养基培养细胞的表达水平(q pro2UK约500UΠ(106cells?d))相近。这表明我们开发的低廉的无血清培养基可以很好地支持rCH O细胞的生长和表达产物。

表2　血清浓度对大规模细胞培养的影响

血清浓度

(%)

接种密度

(×106Πm l)

生长延滞期

(d)

比生长速率

(d-1)

细胞表达水平

UΠ(106cells?d) 1

0.1

0.1

0.1

0.34

0.20

0.98

4.0

0.9

11.2

～1

～3

～1

<1

～1

<1

0.182

0.112

0.153

0.172

0.217

0.178

420～540

500～6203

500～6003

400～6603

421～546

418～497

3细胞密度未包含上清中的悬浮细胞(约占总细胞数的10%),因而计算细胞表达水平时要比实际高约10%

2.2　溶氧对多孔微载体培养细胞的影响

2.2.1　细胞生长曲线　利用Cytopore多孔微载体在30L搅拌式反应器中无血清培养重组CH O细胞生产尿激酶原(图1)。在高密度细胞培养过程中,由于营养、生长空间、传质限制等外部因素,易于导致细胞凋亡而缩短培养时间,大大降低反应器的生产能力[9]。比较前40天培养结果,可发现当细胞密度达到2.2×107Πml后,反应器生产能力(P reactor)从2.1gΠd逐渐降至0.75gΠd,在第35天时更新1Π4微

载体后,P

reactor

又逐渐恢复到2.5gΠd的水平,可见采取定期更新部分微载体的方法,可改善细胞生长微环境,维持细胞高密度长期培养。分别于培养的第35天、48天、60天和73天更新1Π4～1Π5的微载体,可保持细胞密度在(1.2～2.6)×107Πml,培养时间持续90天以上。在91天培养中,上清中尿激酶原的

最高含量可达110mg ΠL ,每天可收获20～24L 上清,反应器的生产能力为0.5～2.5g Πd 。共获得含尿激酶原114.7g 的上清1827L ,连同在7L 反应器中获得的约含21g 尿激酶原的上清,经纯化得到约80g 冻干成品供临床试验。

比较第40天至72天的培养结果,细胞密度基

本维持在(2.0～2.2)×107

Πml ,DO 维持在20%时,P reactor 一般为1.7～2.5g Πd ,而DO 降至7%～9%时,P reactor 降至0.75～1.7g Πd ,而且即使在第72天后,通

过更新部分微载体,使溶氧恢复至15%～30%的水

平,P reactor 仍不能恢复至最高水平,可见长期低溶氧状态会影响细胞的蛋白表达而导致P reactor 的严重下降。DO 在7%～9%时换液前上清中乳酸浓度(23～35mm ol ΠL )比DO 在20%～40%(<22mm ol ΠL )高,说明葡萄糖通过厌氧代谢途径生成乳酸的比例升高。2.2.2　溶氧对细胞葡萄糖代谢和产物表达的影响　溶氧对细胞的生长和代谢具有重要作用,但不同的文献报导的细胞培养最适溶氧范围从8%～

100%[10]

。一般认为动物细胞培养的适宜DO 在10%～60%之间,DO 大于100%,可损伤细胞膜甚至

DNA ,从而导致细胞死亡[11]

。而DO 过低又会改变细胞的代谢,降低细胞蛋白表达水平,甚至因缺氧而

导致细胞逐渐凋亡。尤其是多孔微载体中长满细胞后,生长在微载体中心的细胞存在传质限制,当溶液中的DO 为20%时,多孔微载体中心的DO 大于

10%[12]

。图2给出了在30L 反应器中91天无血清连续换液培养重组CH O 细胞时,溶氧变化对细胞生长和代谢影响的过程曲线,表3则比较了在不同溶氧水平下细胞表达水平(q pro 2UK )、基于葡萄糖的产物得率系数(Y pro 2UK Πglu )、细胞产乳酸率(q lac )及葡萄糖代谢为乳酸的转化率(Y lac Πglc )等参数。从图2及表3中可以看出,经过一段时间培养后(如从第10天至第

35天),q pro 2UK 可从最高时535U Π(106cells ?d )降至286U Π(106cells ?d ),培养基的有效利用率(Y pro 2UK Πglu )也从1700U Πg glu 降到最低时的1090U Πg glu ,而q lac 、Y lac Πglc 均有所上升,说明多孔微载体中长满细胞后存

在传质限制。而每隔12～13天更新部分微载体后,以上指标都得到不同程度的改善。另外,DO 维持在20%～40%时,细胞的表达水平、培养基的有效利用率等无明显差别,约12.5%的葡萄糖通过厌氧代谢途径生成乳酸。而DO 降至7%～9%后,细胞的表达水平可下降约20%,葡萄糖生成乳酸的比例上升至20%以上,培养基的有效利用率明显降低。因而利用多孔微载体大规模培养细胞时,溶氧水平应保持在20%以上,才能较好满足细胞对溶氧的需求

。

图1　用多孔微载体在30L 搅拌式生物反应器中无血清培养rCHO 细胞生产尿激酶原

(上)细胞生长曲线及反应器生产力;　(下)换液前培养上清中葡萄糖和乳酸的残留浓度

图2　溶氧对细胞表达和葡萄糖代谢的影响

(上)细胞表达水平及产物得率系数;(下)溶氧对葡萄糖代谢的影响表3　溶氧对细胞表达和葡萄糖代谢的影响

DO(%)

q pro2UK

[UΠ(106cells?d)]

Y pro2UKΠglu

[UΠg glu]

q lac

[g lacΠ(106cells?d)]

Y lacΠglu

[g lacΠg glu]

20～40(第0天～第52天) 7～9(第53天～第73天)406±56

327±87

1460±172

1188±177

0.066±0.009

0.109±0.013

0.250±0.034

0.417±0.071

参考文献

1　W eaver W D,Hartmann J,Anders on JL,et al.New recombinant glyco2 sylated prourokinase for treatment of patients with acute my ocardial in2 fraction.J Am C oll Cardiol,1994,24:1242

2　俞炜源,张正光,肖成祖.尿激酶原的性质、结构、功能及其药代动力学和临床应用效果.生物技术通讯,1998,9(3):35

3　许铁男.世界医药产业展望.中国医药情报,1998,4(4):212

4　S pier RE.Recent Advance in Animal Cell Biotechnology.In:Sasaki R &Ikura Ked.Animal Cell Culture and Production of https://www.wendangku.net/doc/2813442970.html,h2 erland:K luwer Academ ic Publishers,1991.1～5

5　Hu X ianwen,X iao Chengzu,Huang Z icai et al.Long2term culture of CHO cells on porous m icrocarriers in a stirred tank equipped with a m odified cell retention system.In:Sasaki R&Ikura K ed.Animal Cell T echnology:Challenges for the21st https://www.wendangku.net/doc/2813442970.html,herland:K luwer Aca2 dem ic Publishers,1999.81～86

6　X iao Chengzu,Huang Z icai,Hu X ianwen et al.High density and scale2up cultivation of recombinant CHO cell line and hybridomas with porous m icrocarrier Cytopore.Cytotechnology,1999,30:1437　Hu X ianwen,X iao Chengzu,Huang Z icai et al.Pilot production of u2 PA with porous m icrocarrier cell culture.Cytotechnology,2000,33,13 8　胡显文,肖成祖,黄子才.纤维素多孔微载体的制备及其用于动物细胞培养.生物工程学报,1999,15(1),93

9　高丽华,肖成祖,于　芳.尿激酶原测定方法的改进及对C L211G 细胞表达尿激酶原水平稳定性的观察.生物技术通讯,1997,8

(2):94

10　胡显文,肖成祖,李佐虎等.多孔微载体无血清培养rCHO细胞生产u2PA.生物工程学报,2000,16(3):387

11　Jan DCH,Petch DA,Huzel N et al.The effect of diss olved oxygen on the metabolic profile of a murine hybridoma grown in serum2free medium in continuous culture.Biotechnol Bioeng,1997,54(2):153

12　Shigenaga MK,Hagen T M,Ames BN.Oxidative damage and m itochon2 drial decay in aging.Proc Natl Acad Sci US A,1994,91:10771

13　M ignot G,Faure T,G anne V et al.Production of recombinant V on W illebrand factor by CHO cells cultured in macroporous m icrocarriers.

Cytotechnology,1990,4:163

(2000210223　收稿)

细胞传代培养的原理及操作步骤,细胞冻存,细胞复苏

细胞传代培养的原理及操作步骤 （一）原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，须进行传代再培养。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 （二）细胞传代培养具体操作 1、细胞：贴壁细胞株 2、操作步骤 1）将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 2)加入0.5-1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。 3)瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml培养液终止消化。 观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1-3分钟。 4)用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。 细胞冻存 1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射15min；培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水 浴箱37℃预热备用；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液 2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入适量胰蛋白酶消化。 3. 适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的 细胞悬液。 4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心(1000r/min，10分钟)。 5. 去上清液，加入与细胞悬液等量的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀 6. 冷存管置于4℃10分钟----20℃30分钟----80℃16～18小时(或隔夜)---液氮槽vaporphase长期储 存。-20℃不可超过1h，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 7．记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。 细胞复苏 1.室内紫外消毒；培养基、PBS于37℃恒温水浴预热备用。 2.自液氮罐中取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，离心。 3.去上清，加入培养基，吹打，然后移入培养瓶中，用培养基清洗冻存管，清洗液也移入培养瓶中。 4.于培养瓶中加入适量培养基，放入CO2培养箱中培养 5.记录复苏日期；次日换液。

人干细胞无血清培养基

人干细胞无血清/无饲养层培养基 Stemmera TM人无血清/无饲养层培养基（SFM）是在无血清和饲养层情况下，用于培养人的干细胞能支持干细胞的生长，包括胚胎干细胞和诱导多能干细胞。 规格: 500ml 产品描述： Stemmera TM人ESCs/iPSCs无血清/无饲养层培养基(hStemSFM)是一种成分明确的即用型培养基，特殊的配方，在完全无血清和无饲养层环境下能用于人诱导多能干细胞（hiPSCs）和胚胎干细胞(hESC)的重编程、增殖和维持。 产品成分： 两种成分混合后是一种即用型完全培养基 存储和运输： Stemmera TM hStemSFM中的两种成分是分开运输的，基本培养基在室温下运输然而SFM添加物是在干冰环境下运输。在收到产品后基本培养基需存储在2-8°C环境中而SFM 需要存储在-20°C，避免多次冻融。完全培养基储存在2-8°C的黑暗环境中能使用长达1个月。完全培养基分成等份的供每日使用，避免反复预热，避光保存最佳。 产品使用：该产品是仅用于体外使用和研究使用。不可用于人类或动物的诊断或治疗使用。 使用注意事项： 1.使用aerosol barrier枪头，每次用完更换新的枪头。 2.要用新的，干净的手套和穿实验服。 3.材料安全数据表（MSDS）可在网站下载。

4.用70%乙醇或其他合适的消毒剂清洁工作空间。 培养条件: 培养基：Stemmera TM hStemSFM。 细胞：人诱导多能干细胞（hiPSCs）和人胚胎干细胞（hESCs）。 培养类型：单细胞传代和贴壁培养。 温度范围：37°C。 孵育器的环境：在含5% CO2或5% O2的潮湿环境中，确保适当的气体交换，减少与外界接触。 建议培养容器：基质胶包被的板子、皿或烧瓶（Corning，货号：356231，稀释比1:100），根据容器的大小，调整细胞数量。 操作手册: ?完全SFM培养基的制备：添加3.5ml冷冻SFM添加物（货号 ST02001-S1）到500ml 基础培养基中（货号st02001-bm 500ml），搅拌均匀，0.22μM滤膜过滤。 ?将完全培养基分成等份并在室温下预热SFM供每天使用。。 ?Corning基质胶包被培养容器：使用Corning基质胶（货号356231，稀释比1:100）包被容器，在5% CO2或5% O2（低氧孵育器）的孵育器中37 o C孵育至少30min或过夜。 已包被的容器能在一周内使用。使用前，立即倒掉所有的基质胶，更换预热的完全Stemmera TM hStemSFM培养基。 注意：所有成分在有效期内存储在黑暗的2-8o C环境中，完全培养基StemmeraTM hStem SFM 能稳定储存时间长达4周。 在完全培养基hStemSFM 中hiPSCs 和hESCs的复苏 1.37°C水浴迅速解冻一小瓶冷冻人干细胞。 2.用移液管轻轻将小瓶中的所有干细胞都吸入含完全培养基的15ml无菌离心管中。 3.在1000转下离心5min。 4.吸弃上清液，尤其小心避免干扰细胞颗粒。 5.在含10nM Rock 抑制剂Y27632（Fisher Scientific, 货号50-863-7）的1ml预热完全培 养基中重悬细胞。

原代细胞培养与分离

原代细胞的培养与建系 凡是来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。细胞的纯化或细胞克隆技术是细胞培养工作的基础。 原代细胞的取材 人和动物细胞的取材是原代细胞培养成功的首要条件，直接影响细胞的体外培养。 一、取材的基本要求 .1．取材要注意新鲜和保鲜 .2．应严格无菌 .3．防止机械损伤 .4．去除无用组织和避免干燥 .5．应注意组织类型、分化程度、年龄等 .6．作好记录 二、各类组织的取材技术 皮肤和粘膜的取材 内脏和实体瘤的取材 血液细胞的取材 骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材 动物组织取材 人胚体组织取材 鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材 皮肤和粘膜的取材 主要取自于手术过程中的皮片，方法似外科取断层皮片手术操作，但面积一般2~4平方厘

米。 内脏和实体瘤的取材 内脏除消化道外基本是无菌的，但取材时要明确和熟悉所需组织的类型和部位，实体瘤取材时要取肿瘤细胞丰富的区域，要避开破溃、坏死液化部分，以防污染，尽量去除混杂的结缔组织。 血液细胞的取材 血细胞、淋巴细胞的取材，一般多抽取静脉外周血，或从淋巴组织中（如脾、扁桃体、胸腺、淋巴结等）分离细胞，取材时应注意抗凝。 骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材 严格无菌，注意抗凝，还要尽快分离培养，离心后，用无钙、镁PBS洗两次，再用培养液洗一次后即可培养，不宜低温存放。 动物组织取材 1、鼠胚组织取材 首先用引颈或气管窒息致死法处死孕期合适的动物，然后将其整个浸泡在含有75%酒精的烧杯中，5分钟后（注意时间不能太长，以避免酒精从口或其他通道进入体内，影响组织活力），取出动物，在消毒过的木板上可用无菌的图钉或大头针固定四肢，切开皮肤，用无菌操作法解剖取胚或用无菌止血钳挟起皮肤、用无菌眼科剪沿躯干中部环形剪开皮肤，用止血钳分别挟住两侧皮肤拉向头尾，把动物反包，暴露躯干，然后再固定，更换无菌解剖器材，采用无菌操作法解剖取出胚胎。 2、幼鼠胚肾（或肺）取材 幼鼠采用上述方法处死消毒后，腹部朝上固定在木板上，先切开游离毛皮并拉开至两侧：然后采用无菌法打开胸腔取肺，或背部朝上固定在木板上，先将背部毛皮切开游离并拉向两侧，

无血清培养基的研究进展

[17]　FDA news FDA add boxed waming for heart2related risk to antrdinbetes drug A vandial[E B/OL].2007211214.http// www.fdagov/bbs/topics/NEWS/2007/NEW0173him1. [18]　EMEA:Questions and answers on the benefits and risk of rosiglitazone[EB/OL].2007210218[2007212215]. http//www.emeaeuropaeu/pdfs/human/press/pr/48446407 en pdf. [19]　张杰.罗格列酮心血管安全性问题尚需监测与进一步 评价[J].中国临床药理学杂志,2008,24(1):92294. [20]　Lars Slordal,Olav Spigset.Heart Failure Induced by Non2Cardiac Drugs[J].Drug Safety,2006,29(7):5672 586. (收稿日期:2009202219)无血清培养基的研究进展 梁　菁,李多伟(西北大学生命科学学院,陕西西安710069) 摘要:目的　总结无血清培养基的组成、主要补充因子及作用、应用以及新近研究进展,为细胞培养等研究工作提供参考。方法　查阅国内外文献资料进行整理和归纳。结果　无血清培养基克服了完全培养基的种种弊端,且关于无血清培养基的研究取得了诸多进展。结论　无血清培养基在生产实践中已得到广泛应用,进一步提高其通用性、降低成本、用于大规模生产的方法有待探索。 关键词:无血清培养基;补充因子;研究进展 中图分类号:R97 文献标识码:A 文章编号:100422407(2009)0420325203 动物细胞培养技术近年来发展迅速。传统的含血清培养基中的血清给生产与科研带来多种不利因素。血清的主要作用在于给细胞提供生长增殖所需的激素、生长因子、转移蛋白和其它营养物质,但其存在多种缺点:具有批间差异、需要大量验证工作、使用不方便、成分不明确、有抑制生长的成分、不利于疫苗和单克隆抗体等目的产品的分离纯化、容易被病毒和支原体感染;血清昂贵,可能发生供应紧张,血清的来源不稳定等问题。无血清培养基是加入成分明确的血清替代成分,既能满足细胞的培养要求,又能有效避免因使用血清带来的诸多不利因素。因而无血清培养基得到了越来越普遍的应用,而且无血清培养基技术也迅速发展并取得了许多进展。1　无血清培养基的发展过程 无血清培养基的发展大致经过了三代,第四代培养基的研制开发并投入市场将成为发展趋势[1](见表1)。 表1　无血清培养基的发展过程 成分优缺点 第1代不含血清,但含有大量的动物或 植物蛋白如BSA和动物激素等。蛋白含量高(低于有血清培养基),不利于目标蛋白的分离纯化,降低回升率,增加成本。 第2代完全不用动物来源蛋白(无动物 衍生蛋白)。降低生产成本,加快报批的速度(目前市面上销售的主要产品)。 第3代完全没有蛋白或含量极低。化学成分确知,细胞培养与生产容易做到恒定, 分离纯化容易,成本低,管理容易。仅限于应用 几株细胞系。 第4代无血清,无蛋白。适合多种不同细胞生长并可高温消毒。2　无血清培养基的组成及其主要补充因子 无血清培养基一般认为是由两部分组成,即基础培养基和替代血清的补充因子。 2.1　基础培养基　无血清培养基的基础培养基一般为与所需培养细胞相应的合成培养基,是按细胞生长需要由一定比例的氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖等组成的。在对不同的细胞进行培养时可根据需要对基础培养基和某些组分进行相应的调整。 2.2　补充因子　补充因子是无血清培养基中用于代替血清的各种因子的总称。这些补充因子可使培养基既能满足动物细胞培养的要求,又能有效避免血清培养基成分不明确、有批间差异、常被病毒和支原体污染、血清来源不稳定、细胞产品不易纯化等问题。补充因子可分为如下几类[2]。 2.2.1　激素和生长因子　激素可分为多肽类激素和甾体类激素。多肽类激素有胰岛素、生长因子、胰高血糖素等;甾体类激素有孕酮、氢化可的松、雌二醇等。多肽类生长因子有表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子等[3]。 在细胞无血清培养中,胰岛素可以促进RNA、蛋白质和脂肪酸的合成,抑制细胞凋亡,是重要的细胞存活因子[3]。Jan等[4]认为在批式培养中胰岛素迅速耗尽是细胞比生长速率下降的主要原因。生长因子是维持细胞体外培养生存、增殖和分化所必需的补充因子。氢化可的松能促进细胞贴壁和细胞分离,在某些情况下会诱导细胞生长和诱导细胞分化[3]。 2.2.2　结合蛋白　无血清培养基中的结合蛋白主要是白蛋白和转铁蛋白。白蛋白可通过与维生素、脂类、激素、金属离子和生长因子的结合而稳定并调节上述物质在无血清培养基中的活性,此外还有结合毒素和减轻蛋白酶对细胞影响的作用[1,5]。大多数哺乳动物细胞上存在特定的转铁蛋白受体,受体与转铁蛋白/Fe3+复合物结合是细胞获取必需的微量元素铁的主要来源,此外转铁蛋白还具有生长因子的性质并能与其它微量元素如钒等结合[6]。 2.2.3　贴壁和铺展因子　绝大多数的动物细胞在体外生长时需要固着于适宜生长的基质上,并铺展成一单层,才能开始增殖。目前在无血清培养中常用的贴壁和铺展因子有纤黏蛋白、胶原、聚赖氨酸、昆布氨酸、血清铺展因子等[1,2]。 2.2.4　微量元素和低相对分子质量营养元素　一些细胞系的无血清培养还需要补充某些低相对分子质量的化学物质,如微量元素、维生素、脂类等。微量元素能消除过氧化物酶和氧自由基对细胞的损害,维生素参与代谢、抗氧化等[3],维生素B主要以辅酶的形式参与细胞代谢,维生素C和维生素E 具有抗氧化作用。丁二胺和亚油酸等提供细胞膜合成所需的脂质和细胞生长所需的水溶性脂质[1]。 2.2.5　酶抑制剂　有时将细胞用酶处理后会有一些酶残留,此时若不对残余的酶加以处理可能会对细胞不利,应加入相应的酶抑制剂终止残余酶的作用以达到保护细胞的作用。 3　无血清培养基的研究进展 由于近年来动物细胞体外培养技术的迅速发展以及无血清培养基在动物细胞培养中的广泛应用,与无血清培养基相关的研究在近几年来也取得了很大的进展,主要表现在以下方面。 3.1　有关无血清培养基的新方法　在人牙龈上皮细胞培养

动物细胞培养及无血清培养研究进展

动物细胞培养及无血清培养研究进展 摘要：细胞培养是生物学中一项重要技术，应用较为广泛，目前已渗透到细胞生物学、生物化学、临床检验学等多个领域。其中动物细胞培养是动物细胞工程中最常用的技术手段，而且动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。本文主要介绍了动物细胞培养和其中发展较快的无血清培养技术的研究应用进展。为未来实际的研究和生产作一些总结和展望。 关键词：动物细胞；细胞培养；无血清培养基 1 引言 组织培养技术创建于18世纪末，之后于1907 年美国生物学家Harrison在无菌条件下，以淋巴液为培养基在试管中培养蛙胚神经组织宣告成功后，才逐渐发展成为一种从机体获取细胞，模拟体内生存环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖并维持结构和功能的实验技术。这种技术为细胞学、遗传学、病毒学、免疫学的研究和应用做出了重要贡献。近年来生命科学迅速发展，各种在分子水平的实验如核移植、细胞杂交、DNA 介导的基因转移等，都是借助细胞培养技术而得以实现的。然而各领域的动物细胞培养技术发展并不平衡，存在许多的局限性，使用范围有限，还未出现适合整个生命科学研究领域的培养体系。因此本文对细胞培养及大规模培养、无血清培养做一些总结。 2动物细胞培养 动物细胞培养方式包括原代和传代培养。培养方式有贴壁、悬浮以及固定化培养等方式。 2.1动物细胞培养的基本概念 细胞培养指的是从体内组织取出细胞，并为其提供一个无菌、具有适当温度及酸碱度的环境，给予充分营养，使其生长繁殖并维持其结构和功能的一种培养技术。从体内取出的细胞进行的首次培养式细胞培养最初的阶段，也称为原代培养。原代培养式细胞培养当中重要的必经环节。原代培养细胞生长到一定时候后，由于受群体环境影响，需要转移到另一个容器，这种培养称为传代培养。传代后的动物细胞与原代培物形状一致的话，则表示传代成功，这些细胞称为细胞系或细胞株。 2.2动物细胞培养技术的内容

细胞培养基本方法.docx

1?操作台基本要求: S ii. ??*SΛl-≤手的工作A通冈禹基也布局α *!!崗左芋￡丄fTAβ^WLJt禺整丄fl-??' 上豹品矿播班苗 2?随着传代次数的增加，连续培养细胞系遗传物质不稳定，不得将细胞存放于-20C 或-80C冰柜中，因为细胞存在次低温条件下活力迅速降低。 3.细胞污染： (1)细菌污染 A S 佛3相差&Λ凰示旳螯主长的丄S ??tfΛ?t i li??- 1EfeS??T可见Iii垦壬庭司的区14存査■ ??S?????^ffi?1但是?

(2)酵母污染 阴站.M栢差圉煙昱示J?壁增齐的23」迄無蛍醉母污果?陌集的H*??ffl胞呈髓兀电貶也??!???生屮转Ke e JH* I (3)霉困污染 初期PH值维持稳定，污染严重后PH值迅速升高，导致培养基浑浊。 (4)病毒污染 一般不会对与其宿主物种不同的细胞培养物造成不良影响，通过电子显微镜检查、一组抗体的免疫染色，ELISA实验或者采用适当病毒引物的PCR技术可以检测出细胞为病毒污染。 (5)支原体污染 唯一检测支原体污染的方法是采用荧光染色、ELISE PCR免疫染色、放射自显 影 4.抗生素只能作为对付污染的最后手段而且只能短期使用，并应尽快撤出 5 ?适合贴壁的细胞和悬浮的细胞

6.基础培无血清培养基 7.PH值：大多数正常哺乳动物细胞系PH为7.4; 成纤维细胞系适合轻度偏碱 （pH747?7） Sf9和sf21等昆虫细胞系最适合在PH值为6.2的环境中生长 8.温度：大多数人和哺乳动物细胞系在36C至37C最佳 昆虫细胞在27C为最佳禽类细胞在38.5C最佳冷血动物（15C -26C） 9.动物细胞形态划分： 成纤维细胞，贴附生长上皮样细胞呈多角形，贴附淋巴母细胞样细胞呈球形，不贴附特殊形态： I型有长突触 U型没有轴突 10.细胞增长模式

细胞传代培养

细胞传代培养（胰蛋白酶消化法） 具体操作： 一. 传代前准备： 1.预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。 2.用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。 3.正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。 4.点燃酒精灯：注意火焰不能太小。 5.准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8分钟再次消毒。 6.取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。 7.从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。 8.打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。 二.胰蛋白酶消化； 1.加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。 2. 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。 3.吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。 三.吹打分散细胞： 1.吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。 2.吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。 3.平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6-8分钟。 4.弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。 四.分装稀释细胞： 1.分装：将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。 2.显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。最后要做好标记。 五.继续培养： 用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25％时为一个＋，占50％为＋＋，占75％时为＋＋＋。 传代细胞培养注意事项： 1.严格的无菌操作 2.适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。

无血清培养人脐带间充质干细胞的文献整理

无血清培养人脐带间充质干细胞的文献整理 人间充质干细胞培养基的发展 第一代培养基+牛血清 第二代培养基+牛血清替代品：人血清、血小板裂解液和脐带血清 第三代无血清、无动物源、成分确定的培养基 第三代人间充质干细胞培养基不含牛血清或人血清之类的血清替代品，无动物源而且成分确定，免除了异种血清带来的病原体污染风险，而且批次稳定，适合干细胞治疗的临床研究。 一知网 搜索方法 使用题名“脐带”、“间充质干细胞”和“培养”，摘要“无血清”在中国知网搜索，共18篇文献。 人脐带间充质干细胞无血清培养相关整理

二Pubmed 搜索方法 使用(Umbilical Cord[Title] AND Mesenchymal Stem Cells[Title]) AND serum free[Title/Abstract] 在Pubmed搜索，共20篇。 人脐带间充质干细胞无血清培养相关整理 参考文献 一知网 [1]赵艳坤,邵伟,雒诚龙,余雄.无血清共培养条件下脐带间充质干细胞对奶牛乳腺上皮细胞的增殖作用（英文）[J].中国实验动物学报,2017,25(04):391-398. [2]屈玟,宋磊,赵瑶,胡振波.人脐带间充质干细胞不同培养方案的比较与优化[J].海南医学院学报,2017,23(08):1009-1013. [3]孙亚如,张炳强,王福斌,许评,王二朴,李翠翠.培养体系对维持人脐带间充质干细胞特性及其体外扩增效率的影响[J].中国组织工程研究,2017,21(13):2023-2028. [4]刘宇,马明,侯俊,高雪华,陈思翔,刘月,邓银,郑东明,田奕,张蓉,陈静娴.体外培养传代人脂肪、脐带、胎盘间充质干细胞的遗传特性比较研究[J].中国细胞生物学学报,2015,37(12):1616-1622. [5]吴洁莹,陆琰,陈劲松,吴韶清,汤雪薇,李焱.脐带血血浆分离培养脐带间充质干细胞及体外扩增人脐血CD34~+细胞的研究[J].中国实验血液学杂志,2015,23(04):1112-1119. [6]任春红,张昕.无动物源成分培养基用于人脐带间充质干细胞培养的研究[J].延安大学学报(医学科学版),2015,13(01):1-4. [7]陈林,张坤,董伟,杨珂,艾辉,陈禄华.脐带间充质干细胞无血清和含胎牛血清培养体系比较[J].重

原代细胞的培养与建系

原代细胞的培养与建系(一) 细胞的来源多样，培养方法也各不相同，凡是来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。原代细胞经分散接种之手段称为传代。凡能经传代方式进行再次培养的细胞称为传代细胞。若能稳定生长传至10~20代以上的细胞可确立为细胞系。若有条件能开展单细胞克隆、纯化，经大量扩增后所形成的生物学特性稳定的克隆化细胞群，称之为细胞株或克隆细胞。此过程称为细胞的纯化或细胞克隆。这些基本技术是从事细胞培养工作的基础，只有熟悉和掌握了基本技术，才可能更快捷地学习和掌握其他方法，本章重点叙述常用的基本技术。 第一节原代细胞的取材 人和动物细胞的取材是原代细胞培养成功的首要条件，是进行细胞培养的第一步，若取材不当，将会直接影响细胞的体外培养，现将取材的基本要求和注意事项叙述如下： 一、取材的基本要求 （1）取材要注意新鲜和保鲜新鲜组织易于培养成功，取材时应尽量在4~6h内能制作成细胞，尽快入箱培养，若不能即时培养，应将组织浸泡于培养液内，于4℃存放。若组织块较大，应在清除表面血块、坏死组织、脂肪和结缔组织后，切碎于培养液内4℃存放，但时间不能超过24h.对于已切碎的组织或血液、淋巴组织应加入含10%二甲基亚砜的培养基，按细胞冻存方式于液氮中冷冻保存。 （2）取材应严格无菌所取标本材料应在无菌条件下进行，为了确保无菌，对所取材料若疑有污染的可能，应将所取组织在含高浓度抗菌素（400单位/mL）甚至加入适量的两性霉素B或10%达克宁液的培养液内于4℃下存放2小时以上，再用PBS洗2~3次，以确保所取材料无菌。要用无菌包装的器皿或事先消毒好的带少许培养液（内含400单位/mL抗菌素）的小瓶等便于携带的物品来取材，所取材料应避免接触有毒有害的化学物质，如碘、汞等。 （3）取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。 （4）要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。 （5）取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。取材时应尽量选用易培养的组织进行培养。 （6）原代细胞取材时要同时留好组织学标本和电镜标本。对组织的来源、部位、包括供体的一般情况要做详细的记录，以备以后查询。 二、各类组织的取材技术

vero细胞无血清培养基培养技术与应用

V ero细胞是日本学者Y asumura等于1962年从正常成年非洲绿猴肾分离获得的贴附依赖性细胞系, V ero一词由世界语中的verde(意为绿色的)和reno意为肾脏的)两个词合并而成。V ero细胞是世界卫生组织和我国生物制品规程认可的疫苗生产细胞系。与用作疫苗生产的原代细胞、二倍体细胞和其他一些传代细胞基质相比，V ero细胞具有以下特点:①来源方便，可连续传代，生长速度快;②对多种病毒的感染敏感、病毒增殖滴度高;③遗传性状稳定，恶性转化程度低，生物安全性较高;④培养条件要求不苛刻，易于在生物反应器实施大规模培养。疫苗的接种对象主要是大范围的健康人群，其质量和安全性一直是备受关注的首要问题。疫苗的质量和安全性在很大程度上取决于疫苗的生产方式和过程。血清是一种组分复杂而尚不完全明确的混合物，至少含有1 000种不同的蛋白质，总蛋白量高达60~150g/L，它能为细胞的体外培养提供必要的生长因子、激素、细胞贴附因子和营养成分。受V ero细胞自身的贴附依赖生长特性和动物细胞培养技术发展进程的影响，本世纪之前的V ero细胞培养及病毒疫苗生产均存在着对血清的依赖。血清组分的复杂性和不确定性，以及其中存在病毒等病原微生物污染的潜在风险，影响着病毒疫苗的生产工艺和疫苗质量。从病毒疫苗生产工艺角度考虑，血清组分的复杂性和批次间的质量差异增加了病毒疫苗生产的不稳定性和产品质量控制的难度;从病毒疫苗的安全性角度考虑，血清中潜在的病原微生物，如引起牛海绵状脑炎的阮病毒，给疫苗的使用带来了不容忽视的安全隐患阎。 由血清使用所造成的细胞培养过程和细胞表达产物安全性的不确定因素增加的现实问题，成为动物细胞无血清培养技术研究和应用的发展动因。随着动物细胞无血清培养技术的不断进步，为包括V ero细胞在内的动物细胞大规模无血清培养技术的应用提供了必要的技术支撑，无血清培养已成为包括疫苗在内的生物技术药物生产的总趋势问。2010年，美国、欧盟和日本等发达国家将全面停止在生物制药中应用血清，FDA将停止含血清细胞培养工艺生产的生物技术新药的申报受理。 V ero细胞无血清培养基的研究和商业开发 1.1 V ero细胞无血清培养基的研究 培养基是影响体外培养细胞生长代谢、增殖乃至生存的最直接和最重要的环境因素。V ero细胞无血清培养的技术关键在于无血清培养基的设计和优化。 设计V ero细胞无血清培养基组成配方的技术核心是筛选和确定具有促进细胞贴附生长、维持细胞存活、提高病毒扩殖效果的培养基组成成分。基于细胞生长和代谢的高通量分析及Plackett-Burman实验设计和Box-Behnken响应面设计是V ero细胞无血清培养基设计和优化的主要技术。V ero细胞的培养需要在适宜的介质表面贴附、铺展才开始有丝分裂、增殖，病毒的有效感染和增殖也有赖于细胞的贴附生长状态。此外，在某些病毒疫苗(如流感病毒疫苗)的生产过程中，需要在培养基中加人一定浓度的胰蛋白酶以提高病毒的感染和增殖效率。另一方面，病毒的感染和增殖不仅是细胞代谢负荷不断加大的过程，也是细胞病变、以致凋亡和坏死、甚至裂解的渐进性过程。V ero细胞无血清培养基的设计和优化相对于应用于动物细胞悬浮培养工艺生产重组蛋白、特别是治疗性抗体生产的无血清培养基更具挑战性。 设计V ero细胞无血清培养基的较为便捷和有效的策略是以DMEM,F-12,M199和RPMI1640等商品化的合成培养基的单独使用或联合使用为基础培养基，以反映细胞生长和代谢的主要参数为评价指标，结合统计学方法确定向其中添加生长因子、激素、结合蛋白及豁附因子、微量元素、脂类和脂类前体物等的种类和浓度。无血清培养基中常用的黏附因子主要是存在于细胞间质和血清中的胞外基质(extracellular matrix,ECM)蛋白，如纤粘连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白和胶原等。其中，纤粘连蛋白和层粘连蛋白不仅具有提高细胞的砧附力及活力的作用，同时在促进有丝分裂中也起着重要的作用。某些含有精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸(RGD)序列的短肤也能够有效地促进V ero细胞贴附到以聚苯乙烯和醋酸纤维素为材

什么是“真正的无血清”间充质干细胞培养基

什么是“真正的无血清”间充质干细胞培养基 近几年，随着细胞治疗的进展，对细胞体外培养的关注热度也在不断提高，作为药品监管的细胞制品，跟所有的药品一样，其评价标准也是“安全性、有效性”。因此培养间充质干细胞的培养基，就成为了研究、应用MSC细胞的企业、科研机构的核心关注点。 市场上突然多出了许多“无血清”培养基，价格从1000-4000不等。弄得用户一头雾水，不知所以。 友康生物作为中国无血清培养基领域的领先企业，经常被客户问起这个问题，换位思考，也觉得确实有必要把这个问题给用户说清楚。 “无血清”间充质干细胞培养基，是指某种培养基可以培养MSC细胞，不需额外添加任何组分，并且这种培养基中没有添加血清。 市场上的“无血清”间充质干细胞培养基产品，可分为三类。第一种是“假的无血清”MSC 培养基；第二种是“揣着明白装糊涂的无血清”MSC培养基；第三种是“真正的无血清”MSC 培养基。以下就简要介绍下这三种产品的历史由来及如何简单的去区分。 一、“假的无血清”间充质干细胞培养基，产品形式一般为1瓶450ml的培养基，培养一瓶50ml的添加剂。销售方称之为无血清添加剂，但其是货真价实的血清。做过细胞实验的都清楚，使用基础培养基一般都要添加10%比例的血清。这种产品来源于实验室的发现，由于不同批号的血清，来自不同种群的牛，血液的成分有所不同是自然的事情，有的血清中的EGF的含量相当低，而EGF对促进细胞生长的作用又很大。所有有经验的实验室老师一般在用血清培养基培养MSC细胞时额外添加一些EGF,会有更好的培养效果。一些企业在血清中额外添加了EGF，称之为“无血清添加剂”。这种产品，在市场上比较少，也比较容易辨识。 二、“揣着明白装糊涂的无血清”MSC培养基。这种产品，很有迷惑性。他确实没有添加血清，因此，从字面理解，是无血清。但他加了牛血，更具体说是牛的血小板。我们都清楚，血液笼统可分为血清、血浆、血小板。在10年前，有人就发现，通过将血小板冷冻、再融化；再冷冻、再融化这种反复冻融的形式，可促使血小板裂解，将其中的物质释放出来，加入培养基中，可以收到与血清相类似的培养效果。由于血小板的含量比较少，一直以来都是作为血清生产的下脚料，后来伴随血清价格的上升，处理下脚料在经济上显得划算了起来。所以，就出现了血小板裂解物这样的产品，有的公司命名为“血清替代物”。从产品形式来看，一般装量为20ml，可以添加到500ml的基础培养基中（比如DMEM/F12，a-MEM）或添加到1000ml的减血清培养基中。这种产品，在市场上为数不少，比较有迷惑性。确实没有加血清，但是加了血小板。

原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项

初代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒 初代消化培养法 1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速 （500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。 7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。 8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。 2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。 3. 轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4. 培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。

CHO 细胞无血清培养基技术手册2009

CHO细胞无血清培养基技术手册2009 北京清大天一生物技术有限公司 BEIJING TSINGHUA SKYWING BIO TECH Co.,LTD. 2009年9月

1 CHO细胞 CHO细胞是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)，1957年美国科罗拉多大学Dr. Theodore T. Puck从一成年雌性仓鼠卵巢分离获得，为上皮贴壁型细胞，是目前生物工程上广泛使用的细胞系。工业生产上应用较多的是CHO-K1细胞，为转化细胞系，细胞染色体分布频率是2n＝22，系亚二倍体细胞。ATCC 保存CHO-K1细胞株，编号为CCL-61，被广泛地用于重组DNA蛋白的表达。由于该细胞存在遗传缺陷，无脯氨酸合成基因，不能将谷氨酸转变为谷氨酸-γ-半醛，培养过程中需在培养基中添加L-脯氨酸才能生长。并且由于该细胞已经霍乱毒素适应，形态学有所改变。最初细胞为贴壁型细胞，经多次传代筛选后，也可悬浮生长。 ATCC提供的CHO-K1细胞照片 CHO细胞容易发生基因突变，也较易进行基因转染，是良好的哺乳动物基因表达宿主细胞，代表性细胞有二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase）营养缺陷型突变细胞株（CHO/dhfr-）、转染谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase,GS）基因的GS-CHO细胞。 二氢叶酸还原酶是真核细胞核苷酸生物合成过程中起着重要作用的一种酶，是常用的遗传选择标记之一，它可催化二氢叶酸还原成四氢叶酸。对于dhfr突变体细胞而言，由于不能够合成四氢叶酸，阻断了正常核酸代谢途径，因此不能在常规培养基上生长，但若在培养基中加入次黄嘌呤（hypoxanthine）和胸苷（thymidine），则突变体细胞可以借助核苷酸的补救合成途径维持生长。利用

7 间充质干细胞无血清培养基

质干细胞基础培养基（BM0001）、AdvCell?干细胞培养添加剂 A（SCM0001A）以及AdvCell?干细胞培养添加物 B（SCM0001B）于37℃解冻并迅速混合。 2.完全培养基的存储：配制好的完全培养基放在4℃冰箱避光保存，并尽量在一个月内使用完。 3.根据需要，培养过程中可添加一定剂量青霉素∕链霉素(P∕S)。 4.为达到最佳培养效果，所有细胞培养皿或培养瓶在接种细胞前用细胞垫材料（Cellpad）（BCP0001）包 被过夜或室温包被2小时，包被后用吸管取走多余的 AdvCell? 细胞垫材料（BCP0001），再接种胞。5.如客户用自己配制的冻存液冻存的细胞是用作临床治疗，应避免用甘油作为保护剂。 ★培养条件 37℃，5%CO2 ，无菌恒温培养箱培养。 ★细胞培养 【复苏】 1.将配置好的完全培养基放入37℃水浴中预热5-15 min； 2.从液氮中取出干细胞迅速放入37℃水浴快速解冻（解冻后不要继续孵育细胞）； 3.在超净台中加入5 ml的完全培养基重悬细胞，1000 rpm离心5 min； 4.弃上清，加入 5 ml的完全培养基重悬细胞，转移到T-25培养瓶中（带滤芯）； 5.将培养瓶置于37℃，5%CO2 的无菌恒温培养箱中培养； 6.第二天用新鲜的完全培养基给细胞换液。 【培养】 1.在显微镜下观察细胞，当细胞融合度达到80%时，即可传代； 2.37℃水浴预热完全培养基； 3.在超净台中，弃掉T-25细胞培养瓶中的培养基，加入2 ml PBS清洗，再加入1 ml 0.25%胰酶-EDTA 消化细胞；

4.在显微镜下观察到细胞变圆，有细胞开始脱离瓶壁时，即可加入5 ml 完全培养基终止消化； 5.用移液器轻轻吹打瓶壁上剩余的细胞，并轻轻吹打将细胞吹散； 6.将细胞转移到15 ml离心管中，1000 rpm离心5 min； 7.弃上清,加入15-20 ml的完全培养基重悬细胞后转入T-75细胞培养瓶中或按适当比例传到T-25细胞培养瓶中。确保后融合度在25-50%之间，细胞密度在1×104cells/cm2（2.5×105 cells/T-25瓶），混合细胞悬液，确保细胞均匀分布； 8.将细胞培养瓶置于37℃，5%CO2 的无菌恒温培养箱中培养； 9.每两天用新鲜、预热的完全培养基进行换液。 【冻存】 1.细胞消化和计数，用胰酶对待冻存的细胞进行消化，并对细胞进行计数。 2.1000 rpm离心5 min，去掉上清。 3.根据细胞计数的情况，加入适量的冻存液，使细胞密度在1×106/ml左右（或根据自己希望达到的细胞 密度）。 4.轻轻地重悬细胞（务必重悬均匀），将重悬的细胞按等份加入到灭菌的冻存管（需提前做好标记或者贴 上标签）中，旋紧冻存管盖。 5.将冻存管放入程序降温冻存盒中，然后将冻存盒直接放入-80℃。 6.第二天将细胞从-80℃转移到液氮中。

无血清培养基介绍

无血清培养基 转载请注明来自丁香园 发布日期：2012-02-17 12:29 文章来源：丁香园 分享到：收藏夹新浪微博腾讯微博开心网豆瓣社区人人网 关键词：丁香园生物专题义翘神州细胞培养培养基点击次数：1026 无血清培养基(serum free medium,SFM):是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。但是它们可能包含个别蛋白或大量蛋白组分。虽然基础培养基加少量血清所配制的完全培养基可以满足大部分细胞培养的要求，但对有些实验却不适合，如观察一种生长因子对某种细胞的作用，这时需要排除其他生长因子的干扰作用。而血清中可能含有各种生长因子；又如需要测定某种细胞在培养过程中分泌某种物质（抗体、生长因子）的能力；或者要大规模的培养某种细胞，以获得它们的分泌产物。因此研制出无血清培养基一直是生物科学工作者努力的目标。 无血清培养基的基本配方:基本成分为基础培养基及添加组分两大部分。用于生物制药和疫苗生产的细胞在体外培养时，多数呈贴壁生长或兼性贴壁生长；而当其在无血清、无蛋白培养基中生长时，由于缺乏血清中的各种粘附贴壁因子如纤粘连蛋白、层粘连蛋白、胶原、玻表粘连蛋白，细胞往往以悬浮形式生长。 添加组分 1.促贴壁物质：许多细胞必须贴壁才能生长，这种情况下无血清培养基中一定要添加促贴壁和扩展因子，一般为细胞外基质，如纤连蛋白、层粘连蛋白等。它们还是重要的分裂素以及维持正常细胞功能的分化因子，对许多细胞的繁殖和分化，起着重要作用。纤连蛋白主要促进来自中胚层细胞的贴壁与分化，这些细胞包括成纤维细胞、肉瘤细胞、粒细胞、肾上皮细胞、肾上腺皮质细胞、CHO细胞、成肌细胞等。 2.促生长因子及激素：针对不同细胞添加不同的生长因子。激素也是刺激细胞生长、维持细胞功能的重要物质，有些激素是许多细胞必不可少的，如胰岛素。 3.酶抑制剂：培养贴壁生长的细胞，需要用胰酶消化传代，在无血清培养基中必不可少须含酶抑制剂，以终止酶的消化作用，达到保护细胞的目的。最常用的是大豆胰酶；抑制剂。 4.结合蛋白和转运蛋白：常见如转铁蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比较大，可增加培养基的粘度，保护细胞免受机械损伤。许多旋转式培养的无血清培养基都含有牛血清白蛋白。 5.微量元素：硒是最常见的。 使用方法 目前，血清仍是动物细胞培养中最基本的的添加物，尤其是在原代培养或者细胞生长状况不良时，常常会先使用有血清的培养液进行培养，待细胞生长旺盛以后，再换成无血清培养液。细胞转入无血清培养基培养要有一个适应过程，一般要逐步降低血清浓度，从10%减少到5%，3%，1%，直至无血清培养。在降低过程中要注意观察细胞形态是否发生变化，是否有部分细胞死亡，存活细胞是否还保持原有的功能和生物学特性等。在实验后这些细胞一般不再继续保留，很少有细胞能够长期培养于无血清培养基而不发生改变的。细胞转入无血清培养之前，要留有种子细胞，种子细胞按常规培养于含血清的培养基中，以保证细胞的特性不发生变化。 为了使细胞适应无血清培养，关键的是使所培养细胞：

细胞血清培养基和无血清培养基的配制以及区别

细胞血清培养基和无血清培养基的配制以及区别 细胞培养基是如何配制的？培养细胞的完全培养基由基础培养基和添加剂(如血清或无血清培养用的某些确定的激素及生长因子)组成，培养基的配方一直在改进，其中包括抗生素和抗有丝分裂剂等等。 基础培养基 绝大多数培养基是建立在平衡盐溶液基础上，添加了氨基酸、维生素和其它与血清中浓度相似的营养物质。最广泛应用的培养基是迈健基础培养基和迈健培养基营养添加物的混合物，其中含有13种必须氨基酸、8种维生素。而迈健培养基也包括非必须氨基酸，维生素的范围亦很广，另外常规含有无机盐和代谢添加剂(例如核苷酸)。现应用于快速生长的细胞，同培养基含有相同的营养成分，但浓度高出2~4倍。选择某种培养基，应仔细了解成分表，应知道大多数情形下培养基都有不足。例如，有些培养基在氨基酸中包括有谷氨酸，而这种培养基虽广泛用于神经生物学领域，但它对某些对谷氨酸敏感的可能有细胞外毒性损伤的神经元而言，则并非最佳选择，特别是如果神经元生长在缺乏胶质的环境中时。F12中含有硫酸亚铁，据报道也有神经毒效应。 在所有这些培养基中，谷氨酸比其他氨基酸有更高的浓度，这是因为它具有不稳定性以及在许多细胞培养中它常用作碳源。对于神经元的培养常常在基础培养基中增加葡萄糖的含量到0.6%或者加入丙酮酸(若培养基中这两种物质缺乏时)。但通常在原代培养中使用也能有比较令人满意的结果。 血清 细胞在单纯的基础培养基中不能存活，在特殊类型的细胞培养中必须提供某些痕量营养物质及生长因子才能使细胞得以生长并维持生长状态。基础培养基常常要添加血清，血清终浓度多为5~20%。特殊用途的血清来源须用经验确定，广泛应用的血清种类有马血清与胎牛血清。胎牛血清中富含有丝分裂因子，常选其作增殖细胞用的血清，也用于细胞系和原代培养。而马血清常常用来作有丝分裂后的神经元培养。然而，很多人也将胎牛血清用于神经元培养，也有人用马血清来培养胶质细胞。用大鼠进行神经元培养的某些研究者喜欢使用同型血清;人类的胎盘血清，亦曾用于神经组织的器官类型的培养，也用在一些特殊培养种类中。 血清培养基存在一定的弊端，无法规避动物血清中的异源体，如果使用动物血清培养基培育出来的细胞输入人体，所以可能存在人体异源体排斥和冲突，有一定风险，现如今该研究领域为了规避这样的风险，研究发明了迈健细胞无血清培养基，取代血清培养基的不利因素。 无血清培养基 1979年神经细胞培养出现了一个重要进展，用化学添加剂即可维持神经细胞存活与生长而不需要在培养基中添加血清。其工作基础是用合适的激素、营养物和促贴壁的物质的