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探针的设计原则

实时荧光Taqman 探针设计的几个要点

实验室很多同学都要做Real time PCR实验,实验室的师兄师姐都会有很多宝贵意见,不过也有实验室前没有做过的,查找了下资料和大家分享下关于实时荧光Taqman探针设计、实时荧光PCR探针的选择、

引物的设计及评价。

荧光探针法是用序列特异的荧光标记探针来检测产物,探针法的出现使得定量PCR技术的特异性比常规PCR技术大大提高。目前较常提及的有TaqMan探针、FRET杂交探针(荧光共振能量传递探针)和分子信

标Molecular Beacon。

广泛使用的TaqMan探针法是指PCR扩增时在加入一对引物的同时另外加入一个特异性的荧光探针,该探针只与模板特异性地结合,其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有荧光报告基团(Reporter, R),如FAM、VIC等,3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q),如TAMRA等。当探针完整的时候,5′端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3′端荧光基团淬灭,仪器检测不到5′端报告基团所激发的荧光信号(就是说5’荧光基团的发射波长正好是3’ 荧光基团的吸收波长,因而能量被吸收传递到3’荧光基团而发出其它荧光)。随着PCR的进行,Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针,其5′-3′外切酶活性(此活性是双链特异性的,游离的单链探针不受影响)就会将切割探针,释放5′端报告基团游离于反应体系中,远离3′端荧光淬灭基团的屏蔽,5′端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。也就是说每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。报告信号

的强度就代表了模板DNA的拷贝数。

(请注意,该图显示的不是普通的Taqman探针法,而是Taqman MGB探针法)Taqman探针检测的是积累荧光。常用的荧光基团有FAM,TET,VIC,HEX等等。当探针完整的时候,由于3′端的荧光淬灭基团在吸收5′端报告基团所发射的荧光能量,本身会发射波长不同的荧光而导致本底高,因此TaqMan探针近来又有新的发展——TaqMan MGB探针。MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher),本身不产生荧光,可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有MGB (Minor Groove Binder)修饰基团,可以将探针的Tm值提高10°C左右。因此为了获得同样的Tm值,MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短,既降低了合成成本,也使得探针设计的成功率大为提高——因为在模板的DNA碱基组成不理想的情况下,短的探针比长的更容易设计。实验证明,TaqMan MGB探针对于富含A/T

的模板可以区分得更为理想。

Taqman探针法已经得到广泛使用,不过有人认为这种技术利用了Taq酶5`—3`外切酶活性,一般试剂厂家只给Taq酶的聚合酶活性定标,没有同时给Taq酶5`—3`外切酶活性定标,不同批号试剂之间会给定量带来差异。另外对探针的熔点温度(Tm)仅要求其高于60°C,这就使不同试剂盒之间的特异性参差不齐,难

于做质控检测。

Real time PCR Taqman探针设计、实时多重PCR探针的选择和引物的设计及评价

一、实时荧光Taqman探针设计

总原则:探针选择要保守,引物选择要保守,因此必须找一段100-200bp相对要保守的片段来设计引物与探针。即real-time PCR的扩增片段是50bp----150bp。当找不到150bp的保守片段时,必须确保探针的

片段是保守的。

在设计探针和引物时,要同时考虑在两条链上设计引物与探针。但要注意的是:在那条链上设计探针时,就应靠近在同一条链上设计的引物(即上游引物)。这样,可保证在将来扩增时,即便没有完全扩增,也有荧光信号报告出来。两者的距离最好是探针的5’端离上游引物的3’有一个碱基,但也可以重叠。

若在原序列中找不到合适的探针与引物(1主要是探针和上游引物的距离太远,而离下游引物的距离却较近时;2突变位点要求在探针的5’ 端也能检测到荧光信号,但却是在3’端),可在互补的序列中设计引物与探

针。

另real-time PCR中的探针和引物的Tm值,均要高于平常PCR的引物和杂交的探针的Tm值。

二、探针的设计

探针设计的基本原则:

1. 保守:探针要绝对的保守,有时分型就单独依靠探针来决定。理论上有一个碱基不配对,就可能检测不出来。若找不到完全保守的片段,也只能选取有一个碱基不同的片段。且这个不同的碱基最好在探针的中间,对探针与目的片段的杂交影响不大,不相同的碱基最好不要在两端,因为两端不利于探针的杂交。且最好为A或T,而不能为G或A,因为A、T为双键,而G、A为三键。

2. 探针长度:Taqman探针的长度最好在25-32bp之间,且Tm值在68-72℃之间,最好为70℃,确保探针的Tm值要比引物的Tm值高出10℃,这样可保证探针在煺火时先于引物与目的片段结合。因此探针最好是富含GC的保守片段,保证其的Tm值较高。现在有Taqman MGB探针,在TAMER之后再标记一个MGB,可使探针的Tm值较高,即使探针片段较短,也可达到Taqman探针的Tm值要求(68-70℃)。

3. 探针的名称:应标记探针在基因组的位置及长度。

4. 探针Tm值计算: 用oligo或primer preiemer软件即可计算Tm值。确保探针中GC含量在30-80%。

应避免探针中多个重复的碱基出现,尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现。

5. 探针的评价:用DNAstar软件中的Primerselect软件,点击“log”菜单中的“create primer catalog”,在“name”中输入探针的名称、位置,按Tab键进入“sequence”,粘贴或输入要分析的探针序列。选中整个序列后,在“report”菜单下“primer self dimer”,分析探针的二聚体。弹出的窗口中就告诉此探针有多少个dimer,并对此探针用dG值进行评价(通常给出最差的dG值,理论上是dG值越大越好)。在“report”菜单下“primer hairpins”,分析探针的发夹结构。弹出的窗口中就告诉此探针有多少个hairpins,并对此探针的hairpins进行评价。多重荧光PCR 时,要对多条探针进行“pair dimer”进行分析。

6. 探针的5’端不能为G,因为即使单个G碱基与FAM荧光报告基团相连时,G可以淬灭FAM基团所发

出的荧光信号,从而导致假阴性的出现。

7. Taqman探针与引物之间的位置:Taqman探针应靠近上游引物,即Taqman探针应靠近与其在同一条链上的上游引物。两者的距离最好是探针的5’ 端离上游引物的3’有一个碱基,但也可以重叠,要保证

Taqman探针的5’端离上游引物的5’端至少有4bp。