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Southern Blot操作流程

酶切后产生的粘性末端;

7、电泳:1v/cm。

二、转膜

1、碱变性:把胶条转移到含碱变性液的器皿中,摇床处理15 min;重复一次;

2、中和:倒出器皿中的碱变性液,加入中和液,摇床处理15 min;重复一次;

3、倒出中和液,加入20×SSC,摇床处理15 min;

4、转膜:

1)在一干净的容器中放入一包吸水纸,倒入20×SSC,浸湿;

2)放上一张与胶条大小相当的sigma 3M滤纸,倒上一层20×SSC,防止产生

气泡;

3)将预先剪裁好的尼龙膜放入ddH2O中充分浸润2分钟;

4)小心把胶条铺在滤纸上面,用玻璃棒擀平,赶走气泡;

5)往胶上倒上一层20×SSC,将尼龙膜铺在胶条上,再向上倒上一层20×SSC;6)再放上一张与胶条大小相当的sigma 3M滤纸;

7)用保鲜膜把胶条四周封上,在上面压上一包吸水纸,再用一个约250mg的物体压在吸水纸上面;

8)转膜过夜;

5、固定

将膜放在用10×SSC浸湿的滤纸上面,使含DNA面朝上,放入紫外交联仪中,以1.5J,254n,2.5min的程序将DNA固定在尼龙膜上。

三、杂交

1、标记探针:可用随机引物法或PCR方法标记探针;

2、将尼龙膜有DNA 的一面朝内,卷成筒状放入杂交管中,加入10 ml 经预热至50℃的DIG Easy Hyb,于50℃预杂交30 min;

3、取10 ul经标记的探针,热水浴5 min变性,然后迅速放入冰水混合物中;

4、将变性后的探针加入4 ml预热的DIG Easy Hyb中,混匀,并防止气泡的产生(气泡会产生背景);

5、倒出预杂交液,加入含探针的杂交液,杂交4h或过夜。

6、杂交温度的计算