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Southern Blot操作流程

Southern Blot 操作流程

1、哺乳动物基因组DNA 的提取(或用OMEGA 试剂盒E.Z.N.A.TM Tissue DNA Kit )

1、 取约30mg 样品,加入600 ul SNET ,再加入12 ul (20.2mg/ml )的蛋白酶

K ,使蛋白酶K 的终浓度为400ug/ml ;

2、 55℃振荡过夜;

3、 加入0.6 ul RNaseA ,室温下孵育10 min ,后置于65℃ 10 min ;

4、 加入300 ul Tris 饱和酚,288 ul 氯仿和12 ul 异戊醇,室温下振荡30 min ;

5、 17,000 g 离心5min ,转移上层水相(600 ul )至一新的离心管;

6、 加入等体积(600 ul )的异丙醇沉淀DNA ,于4℃下13,250 g 离心15 min ;

7、 小心除去异丙醇,加入1 ml 70%的乙醇。离心5 min 后除去乙醇,室温下干

燥15~20 min ;

8、 加入100 ul TE ,使核酸沉淀溶解。

一、 酶切

1、 拷贝数的计算

哺乳动物基因组全长3.0×109个碱基对,按插入基因单拷贝计算如下:

()g plasmid of mass bp bp DNA of Insertion

μ10100.39=⨯

2、 酶切体系

基因组DNA 10 ug 10*Buffer

10 ul 酶(10U/ul)

10 ul Total 100 ul

3、 混合后置于适宜酶切温度进行酶切反应;

4、 对酶切产物进行纯化,用30 ul TE 洗脱;

5、 制备1%浓度的琼脂糖凝胶(不加EB );

6、 将纯化后的酶切产物敞开盖子于70℃放置15 min ,以除尽残留乙醇和消除

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