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微生态制剂防治大鼠非酒精性脂肪肝炎模型作用机制的实验研究

微生态制剂防治大鼠非酒精性脂肪肝炎模型作用机制的实验研究

于洪波,戴 林,彭海英1,左 中2 (中国人民解放军210医院消化内科,大连 116021)

摘 要: 目的 探讨微生态制剂防治非酒精性脂肪性肝炎的作用机理。方法 雄性S D 大鼠50只随机分组为5组,每组10只,正常组普通饲料喂养;模型Ⅰ组、Ⅱ组喂高脂饲料;微生态制剂治疗组和饮食组分别在喂饲高脂饲料12周末予美常安灌胃和改为普通饲料喂养。12周末处死正常组、模型Ⅰ组大鼠;剩余2组大鼠继续喂养至16周末处死,测定血清转氨酶(ALT 、AST ),肿瘤坏死因子α

(T NF α)水平,肝匀浆丙二醛(MDA )含量,超氧化物歧化酶(S OD )活性,总抗氧化能力(T 2AOC ),一氧化氮(NO )、诱导型一氧化氮合酶(i N OS )及谷胱甘肽(GSH )水平,观察肝组织学改变。结果 模型组大鼠12周出现单纯性脂肪肝,16周发展为脂肪性肝炎。与正常组

比,模型组大鼠肝组织脂质过氧化产物MDA 含量明显增多(6145±1107,8138±1132μmol/g vs 5108±0191μmol/g,P <0101),而抗氧化物S OD (171±14,148±26kNU /gt vs 198±25kK U /gt,P <0105和P <0101),GSH (4018±511,3510±910mg/g vs 4815±716mg/g,P

<015和P <0101)含量明显降低,且肝脏的脂肪变性严重程度随着高脂饮食喂养的时间延长而加剧,微生态制剂治疗组大鼠各项指标

较模型组有明显改善(P <0105或P <0101),脂肪变性程度明显减轻,而饮食治疗组大鼠各项指标与模型组比无显著差异。结论 微生态制剂美常安可能通过减轻体重,改善机体脂质代谢紊乱,抗脂质过氧化反应,抗炎等综合作用来防治非酒精性脂肪性肝炎。

关键词: 微生态制剂; 非酒精性脂肪性肝炎

[中图分类号]R575 [文献标志码]A [文章编号]10052541X (2006)062350203

1沈阳军区大连疗养院桃源疗区检验科2

中国人民解放军大连210医院病理科

Exper i m en t a l Stud i es on the EffectsM echan is m of Trea t m en t Ra t Nona lcoholi c Stoa tohepa titis M odel by M i crob i a l Phar maceuti cs

Y U Hong 2bo,DA IL i n ,PENG Ha i 2y i n g,ZUO Zhong

D epart m en t of Ga stroen terlogy,210th Hosp it a l of PLA,Da li a n 116021,Ch i n a

Abstract: O bjecti ve To exp l ore the mechanis m s of m icr obial phar maceutics (MP )in the treat m ent of steat ohepatitis in rats fed by high 2fat diets 1M ethods 50male Sp rague Da wley rats were random ly assigned int o 5gr oup s 1The rats fed by nor mal food served as the contr ols 1The rats in model gr oup s (Ⅰ,Ⅱ)were fed with high 2fat diets,and those in medicati on gr oup were given MP 12wk after high 2fat diets feeding 1The rats in diet therapeutic gr oup were fed with nor mal f ood 12wk after high 2fat diet feeding 1The ani m al in contr ol and moder I gr oup were killed at 12wk,and the rest ones were killed at 16wk 1B l ood sa mp le were collected for the detecti on of serum as partate transa m inase (AST ),alanine a m inotrans 2ferase (ALT ),and liver tissues were obtained for the detecti on of mal ondialdehyde (MDA )contents,super oxide dis mutase (S OD )activity,t otal an 2ti oxidative capacity (T 2AOC ),nitric oexide (NO ),inducible nitric oxide synthase (i N OS )and glutathi one (GSH )levels 1The hist ol ogical changes were observed under lightm icr oscope 1Results Pure fatty liver for med in the model rats at 12,and fatty hepatitiswas established at 16wk 1I n com 2paris on with those of nor mal rats,the contents ofMDA increased (6145±1107,8138±1132μmol/g vs 5108±0191μmol/g,P <0101)but anti 2oxide S OD (171±14,148±26kNU /gt vs 198±25kNU /gt,P <015and P <0101),GSH (4018±511,3510±910mg/g vs 4815±716mg/g,

P <0105and P <0101)contents decreased significantly 1The severity degree of hepatic fatty degenerati on aggravated with the p r ol onging of the

high 2fat diet given ti m e 1I n comparis on with those of model rats,the markers such asMDA,S OD,and GSH etc 1were all significantly i m p r oved in the medicati on rats (P <0105or P <0101),and the degree of fatty degenerati on was als o alleviated 1L ight or moderated fatty degenerati on was ob 2served in diet therapeutic rats,and the relative markers were not notably different fr om those of model gr oup 1Conclusi on M icr obial phar maceutics mei chang an has therapeutic effect on nonalcoholic steat ohepatitis by the acti on of lighting body weight,i m p r oving li p id metabolis m dis order,anti 2li p id per oxidati on,and anti 2infla mmati on 1

Key words: M icr obial phar maceutics; Nonalcoholic steat ohepatitis

我们通过高脂饮食建立非酒精性脂肪性肝炎

(NASH )大鼠模型,动态检测血脂、脂质过氧化指标及

肿瘤坏死因子α(T NF

α),并应用微生态制剂(美常安)进行干预,观察其对实验性NASH 血脂和肝组织

的氧化、抗氧化系统及T NF α的影响,以探讨NASH 形成的发病机制及美常安防治NASH 的机制。

1 材料和方法

111 材料 雄性S D 大鼠50只,体质量150±10g,

购自大连医科大学实验动物中心。微生态制剂美常

安由北京韩美药品有限公司提供。胆固醇购自上海伯奥生物工程公司,猪油自备。血清丙氨酸转氨酶(ALT )、门冬氨酸转氨酶(AST ),总胆固醇(TC )和甘油三酯(TG )试剂盒购自澳斯邦生物工程公司;超氧化物岐化酶(S OD )、丙二醛(MDA )、总抗氧化能力(T 2

AOC)、还原型谷胱甘肽(GSH)、一氧化氮(NO)、诱导型一氧化氮合酶(i N OS)试剂盒购自南京建成生物工程公司;肿瘤坏死因子α(T NFα)试剂盒购自华美生物工程公司。

112 方法 大鼠普通饲料喂养1周后,随机分为5组(n=10组)。正常组普通饲料喂养;模型Ⅰ,Ⅱ组喂高脂饲料(880g/kg普通饲料+100g/kg猪油+20g/ kg胆固醇);微生态制剂治疗组和饮食治疗组别在喂饲高脂饲料12周后予微生态制剂100mg(kg?d)灌胃和改为普通饮食喂养,每日1次,其他组以相同剂量蒸馏水(5m l)灌胃。各组大鼠自由进食、进水,分笼(每笼5只)饲养于20±2℃、明暗各12h的动物实验室内。12周末处死正常组,模型Ⅰ组大鼠;剩余3组大鼠继续喂养至16周末处死。①测定体质量、肝比重和lee’s指数;②采用全自动生化分析仪测定血清ALT、AST、TG和TC;③肝匀浆测定MDA含量(改进后的硫代巴比妥酸荧光法)、S OD活性(改良的盐酸羟胺法)、T2AOC、NO、i N OS、GSH(按试剂盒说明操作);④肝脏病理学检查,光镜下评估脂肪变性程度并计算炎症活动度计分[1,2]。

统计学处理:计量资料以均值±标准差表示。各组间实验数据采用两样本均数的t检验。等级资料采用秩和检验。

2 结 果

211 大鼠体质指标变化 模型Ⅰ、Ⅱ组,饮食组大鼠均呈明显腹型肥胖状态。模型Ⅰ、Ⅱ组及饮食组体质量、肝比重、Lee’s指数和正常组相比显著增高(P< 0105,P<0101);微生态组肝比重、Lee’s指数与模型Ⅱ组比显著下降(P<0101)见表1。

212 血清ALT、AST、T C、TG变化 与正常组比较,模型Ⅰ、Ⅱ组及饮食组ALT、AST、TG、T C显著增高(P <0101);微生态组各指标与模型Ⅱ组比显著下降(P <0101)。见表2。

表1 各组大鼠体质变化

分组鼠数(只)体质量(g)肝比重(%)Lee’s指数

正常10354±473114±011429419±518

模型Ⅰ10436±78a3136±0124a30615±717b 模型Ⅱ10450±51b3143±0126b31111±817b 微生态10379±35d3114±0115d29514±816d 饮食10450±35b3124±0120a30610±915b

a1P<0105,b1P<0101,vs正常组;c1P<0105,d1P<0101,vs模型组表2 各组血清AL T、AST、TC、TG变化

分组只ALT(nkat/L)AST(nkat/L)TG(mmol/L)TC(mmol/L)

正常10490±931303±1510180±01142109±0132

模型Ⅰ10668±115b1650±92b0194±0108b3108±0188b 模型Ⅱ10661±109b1878±166b1119±0130b3113±0171b 微生态Ⅱ10495±112d1521±145d0189±0112d2124±0156d 饮食10612±79b1688±255b0198±0110b3105±0168b

a1P<0105,b1P<0101,vs正常组;c1P<0105,d1P<0101,vs模型组213 氧化和抗氧化指标和T NFα变化

21311 氧化和抗氧化指标 与正常组比较,模型Ⅰ组MDA显著增高,S OD、GSH、GSH2PX下降明显(P <0105,P<0101);模型Ⅱ组MDA、i N OS、NO显著增高(P<0101,P<0105);模型Ⅱ组S OD、T2AOC, GSH、GSH2PX明显下降(P<0101);饮食组S OD,T2 AOC、GSH下降明显(P<0101),MDA、NO、i N OS增高显著(P<0101,P<0105)。与模型Ⅱ组比,微生态组S OD、GSH、T2AOC及GSH2PX明显增高(P< 0101,P<0105),而MDA、i N OS、NO显著降低(P< 0101,P<0105)。

21312 血清T NFα 与正常组比,模型Ⅰ、Ⅱ组及饮食组T NFα显著增高(P<0101);与模型Ⅱ组比,微生态组和饮食组T NFα显著下降(P<0101,P< 0105)。见表3。

表3 各组氧化和抗氧化指标和TNFα变化

分组只S OD(kUN/gt)T AOC(μkat/g)GSH(mg/g)MDA(μmol/g)NO(μmol/g)i N OS(ku/g)T NFα(μg/L)正常10198±252618±3174815±7165108±01910189±01210141±01120182±0118模型Ⅰ10171±14a2412±314a4018±511b6145±1107b0195±01150145±01121195±0139b 模型Ⅱ10148±26b2118±316b3510±910b8138±1132b1108±0117a0160±0115b2148±0150b 微生态10189±12d2516±218c4413±519c5173±0154d0191±0111c0145±0147d1189±0125b d 饮食10165±14b2213±215b3816±511b7136±1108b1105±0111a0150±0107a2115±0134b a1P<0105,b1P<0101,vs正常组;c1P<0105,d1P<0101,vs模型组

214 肝脏病理学变化 与正常组比,模型组大鼠肝脂肪变程度明显加重(P<0105),炎症活动度计分显著增加(P<0105);中药组和微生态组大鼠肝脂肪变性程度和炎症活动度计分较模型组明显降低(P<0105),与正常组比无明显差异(P>0105);而饮食治疗组肝脂肪变性程度较模型组有所减轻,但2者间无显著差异(P>0105),而其炎症活动度计分较正常组明显增高(P<0105)。见表4、5。

表4 各组大鼠肝脂肪变性程度

分组只2++++++++++P

正常1043210

模型Ⅱ1001135a

中药Ⅱ1014320c

微生Ⅱ1015310c

饮食1001351

注:采用秩和检验,H=211383,P=01000

表5 各组大鼠肝组织炎症活动度计分

分组只中位数(m)m in max P

正常1031000011006100

模型Ⅱ10810000410012100a

中药Ⅱ1041000021008100c

微生Ⅱ1041000021008100c

饮 食10710000410012100a 注:采用秩和检验,H=231221,P=01000

a1P<0105,b1P<0101,vs正常组;c1P<0105,vs模型组。

3 讨 论

大量研究证实NASH与肥胖、2型糖尿病、高脂血症等代谢综合征密切相关,并被认为代谢综合征在肝脏的一种病理表现[3]。肝脏是体内参与脂质代谢的重要场所,而肝脏脂质代谢稳态的变化是构成各种形式脂肪肝的基础。本研究经过连续6周的高脂、高胆固醇饮食喂养发现NASH模型组大鼠向心性肥胖,各体质指标明显增高,且出现明显的血脂代谢紊乱,血清TG和T C明显增高。第12周,模型组大鼠出现明显的脂肪变性,且随着喂养时间的延长,脂肪变性的程度逐渐加重,到第16周,大鼠肝组织出现炎细胞浸润,同时转氨酶增高显著,提示病变发展为脂肪性肝炎阶段[4]。

在对NASH发病机制研究中,“二次打击”理论被大多数学者认可。首次打击主要是胰岛素抵抗,可导致肝细胞脂肪变性,并为进一步的脂质过氧化提供反应基质;二次打击主要为各种原因引起的氧应激或脂质过氧化损伤,引起脂肪性肝炎。本研究发现血清T NFα水平在造模第12周,即单纯性脂肪肝时明显增高,随着喂养时间的延长,一直维持着较高水平。表明T NFα为非酒精性脂肪肝发病过程中胰岛素抵抗的一个关键性介质[5]。S OD是机体抗氧化损伤防御体系中的最重要的抗氧化酶;T2AOC是反映机体整体水平的抗氧化水平高低的重要指标[6];GSH是“抗氧化剂复合链”的主要成员之一[7];MDA是一种最具代表性脂质过氧化物,NO在众多的氧化损伤中发挥着重要作用[8],而NOS是NO生成的主要限速因子;肝内炎症反应多表现为T NFα等炎性介质的释放。本研究发现模型组大鼠肝组织S OD活性和T2AOC、GSH含量下降显著,而MDA、NO和i N OS含量明显增高,表明NASH时产生大量的自由基和脂质过氧化物,消耗了大量的S OD、T2AOC、GSH,从而使机体的抗氧化损伤的防御机制受损,不能清除过多的自由基而导致肝损伤[9]。与模型组比较,微生态制剂治疗组大鼠体质量显著下降,与正常组比较无统计学意义,提示美常安具有减轻体重的作用;血清TG、T C含量显著降低,肝组织S OD、T2AOC和GSH升高明显,而脂质过氧化终产物MDA、NO和i N OS明显下降,表明美常安具有改善机体脂质代谢紊乱,抗脂质过氧化反应等作用,这与国内外研究结果一致[10];血清T NFα水平明显降低,同时组织学示炎症反应明显减轻,表明美常安具有减轻肝脏炎症反应的作用,抗炎效果在于调节CD 组织中的淋巴细胞活性,可能与其免疫防御作用有关[11]。

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(收稿日期:2006205208)

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