生物样品微量药物的分析技术(130535)
生物样品微量药物的分析技术
体内药物分析是指体内样品（生物体液、器官或组织）中药物及其代谢物或内源性生物活性物质的定量分析。体内药物分析与体内药代动力学研究和临床治疗药物监测密切相关，它直接关系到药物的体内作用机制探讨与质量评价和药物临床使用的安全、有效与合理。
药物产生药理作用的强度与其在体内作用部位（受体组织）的浓度直接相关，而药物在体内主要依靠血液输送至作用部位，因此血药浓度可作为药物在作用部位浓度的表观指标，即血液是体内药物分析的主要样品。另外，尿液、唾液、头发和脏器组织等也可作为体内样品。药物在体内的某些代谢产物常具有一定的生理活性，它们在体内的变化规律对母体药物的药理学与毒理学评价极为重要；机体内源性生物活性物质往往参与机体重要的生理过程，其变化规律的异常改变也与某些疾病的发病机制密切相关。所以，体内特定药物代谢物和机体内源性生物活性物质也是体内药物分析监测的目标。
药物进入体内后，其化学结构与存在状态均可能发生显著变化。在体液中，药物的存在形式多样化，除游离型的原形药物或其代谢物，也有原形药物或其代谢物与葡萄糖醛酸等内源性小分子经共价结合的结合物（或称缀合物，conjugate），还有与蛋白质分子经氢键及其他分子间力结合的结合型药物；而且药物及其代谢物的浓度通常很低、干扰物质多。在测定体内药物及其特定代谢物或内源性生物活性物质时，除少数情况将体液作简单处理后可直接测定外，通常在测定之前要对体内样品进行分离净化与浓集等样品前处理，从而为体内样品中药物的测定提供良好的环境与条件。常用的样品前处理方法包括：去除蛋白质、缀合物水解、化学衍生化、分离浓集等方法。其中，去除蛋白质法主要有溶剂沉淀法、中性盐析法、强酸沉淀法、超滤法及热凝固法；分离浓集法通常采用液相萃取、固相萃取与膜分离技术。
从药物的研究到临床应用，药物质量的正确评价尺度是有效性和安全性，即根据药物在体内的表现作出评价。新药进入临床之前，首先在试验
动物体内进行药代动力学和毒代动力学研究。所以，体内药物分析的对象不仅是人体，也包括试验动物。
对体内药物进行研究时，要求分析方法的灵敏度、专属性和可靠性的程度均较高，建立有效的分析方法是体内药物分析的首要任务。其次，在新药研究过程中，按照国家新药注册审批有关规定，要提供药物在动物和人体内的药物动力学参数、生物利用度及血浆蛋白结合率等基本数据，这些研究工作要靠体内药物分析来完成。再者，为保证临床用药安全有效，体内药物分析也应为治疗药物监测（Therapeutic Drug Monitoring，TDM）提供准确的血药浓度测定值，并对血药浓度进行具体分析和合理解释，提供药学情报和信息，参与指导临床合理用药、确定最佳剂量、制订治疗方案。另外，监测和研究体内内源性物质的浓度变化，对于某些疾病的诊断及治疗具有重要意义；对于麻醉药品和精神药品滥用的检测和运动员体内违禁药物的监测，也必须依据体内药物分析手段和技术才能完成。
体内样品大都具有以下性质特点：①采样量少。体内样本采样量一般为数毫升至数十微升，且多数在特定条件下采集，不易重新获得。②待测物浓度低。体内样本中待测药物及其代谢物或内源性生物活性物质浓度通常在10-9~10-6g/ml级，甚至低至10-12g/ml。③干扰物质多。生物样本，尤其是血样中含有蛋白质、脂肪、尿素等有机物和Na+、K+等大量内源性物质通常对测定构成干扰；且体内的内源性物质可与药物结合，也能干扰测定；即使是药物的代谢产物也往往干扰原形药物的分析。
因此，体内药物分析的特点是：①体内样品需经分离与浓集，或经化学衍生化处理后才能进行分析；②对分析方法的灵敏度及专属性要求较高；
③分析工作量大，测定数据的处理和结果的阐明较为繁杂。
基于这些特点，体内药物分析中常用的测定方法主要有色谱分析法、免疫分析法和生物学方法。其中，色谱分析法主要包括气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC）、色谱-质谱联用法（LC-MS、LC-MS/MS、GC-MS、GC-MS/MS）等，可用于药代动力学研究（PK）与临床治疗药物监测（TDM）的体内样品中大多数小分子药物及其特定代谢产物的测定，而液相色谱-飞行时间质谱联用法（LC-TOF-MS）可用于蛋白质、多肽等生物大分子类药物或内源性生物活性物质的测定与分析；免疫分析法主要有放射免疫分析法
（RIA）、酶免疫分析法（EIA）、荧光免疫分析法（FIA）等，适用于体内样品中生物大分子类药物的测定；生物学或微生物学方法适用于体内样品中抗生素类药物的测定。
建立可靠的和可重复的定量分析方法是进行体内样品分析的基础。为了保证分析方法的可行性与可靠性，体内样品分析方法在用于实际样品的分析之前，必须对方法进行充分的方法学验证。体内样品分析方法的验证分为全面验证和部分验证两种情况。对于首次建立的体内样品分析方法、新的药物或新增代谢物定量分析，应进行全面的方法验证。分析方法验证的内容包括分析方法的效能指标（即：特异性、标准曲线和定量范围、定量下限、精密度与准确度）与样品（包括：体内样品、制备样品及标准储备液）稳定性及提取回收率的验证。
第一节常用体内样品的制备与贮藏
一、体内样品的种类
体内药物分析采用的体内样品包括血液、尿液、唾液、头发、脏器组织、乳汁、精液、脑脊液、泪液、胆汁、胃液、胰液、淋巴液、粪便等样品。但其中最常用的是血浆或血清，因为它们可以较好地体现药物浓度和治疗作用之间的关系。当药物在体内被迅速代谢，且其代谢物大量排泄至尿中时，也采用尿液样品，使在血样中不易检出的药物，以代谢物形式在尿液中被检测。尿液可用于生物利用度、尿药排泄量等的测定。某些药物，如苯妥英等的唾液浓度被认为可以代表血浆中游离药物的浓度，所以唾液也可用于某些药物的临床治疗监测；如果怀疑药物可损伤血脑屏障，脑脊液的药物浓度偶尔也进行测定；头发作为体内样品可用于药物滥用的监测或微量元素的测定。在进行动物试验研究药物体内吸收、分布状态以及药物过量中毒死亡患者的解剖检验，常采用胃、肠、肝、肾、肺、脑、肌肉、组织等作为体内样品。在特殊情况下亦有采用乳汁、精液、泪液等生物体液。
二、体内样品的采集与制备
（一）血样
血药浓度通常是指血浆（plasma）或血清（serum）中的药物浓度，而不是指全血药物浓度。因为当药物在体内达到稳态血药浓度时，血浆中药
物浓度被认为与药物在作用部位（靶器官）的浓度紧密相关，即血浆中的药物浓度可以反映药物在体内作用部位的状况。所以，血浆和血清是体内药物分析最常用的样本，其中选用最多的是血浆。
1．血样的采集供测定的血样应代表整个血药浓度，所以应待药物在血液中分布均匀后取样。通常从静脉采集血样，并根据血中药物浓度和分析方法灵敏度的要求，一般每次采血1~5ml；动物实验时，采血量不宜超过动物总血量的十分之一。血样通常从肘静脉采集，有时从毛细血管采血（成人多从手指或耳垂取血，小儿多从脚趾取血）用于临床化验。
2．血浆的制备将采集的静脉血液置含有抗凝剂的试管中，混合后，以约1000?g离心力，离心5~10分钟，使与血细胞分离，所得淡黄色上清液即为血浆。
最常用的抗凝剂是肝素（heparin）。肝素是体内正常生理成分，因此不致改变血样的化学组成或引起药物的变化，一般不会干扰药物的测定。其他抗凝剂是一些能与血液中的Ca2+结合的试剂，如：EDTA、枸橼酸盐、氟化钠、草酸等。目前，采血常用的负压式采血管通常预加有抗凝剂。
3．血清的制备将采集的静脉血液置离心试管中，放置30分钟~1小时。然后以约1000?g离心力，离心5~10分钟，上层澄清的淡黄色液体即为血清。
因药物与纤维蛋白几乎不结合，所以血浆与血清中的药物浓度通常是相同的。作为血药浓度测定的样品，血浆和血清可任意选用。但无论是采用血浆还是血清，现有的文献、资料所列的血药浓度，均系指血浆或血清中药物的总浓度（游离的和与血浆蛋白结合的总浓度）。
血浆比血清分离得快，而且制取的量约为全血的50％~60％（血清只为全血的20％~40％），多数研究者使用血浆样品。若血浆中含有的抗凝剂对药物浓度测定有影响时，则应使用血清样品。
4．全血的制备将采集的血液置含有抗凝剂的试管中，但不经离心操作，保持血浆和血细胞处于均相，则称为全血（whole blood）。全血样品放置或自贮存处取出恢复室温之后，可明显分为上、下两层，上层为血浆、下层为血细胞，但轻微摇动即可混匀。
若需专门测定平均分布于血细胞内、外的药物浓度，则应使用全血样
品；某些情况下由于血浆内药物浓度波动太大，且又难以控制，或因血浆药物浓度很低而影响测定，也应考虑使用全血样品。如：氯噻酮可与红细胞结合，在血细胞中的药物浓度比血浆中药物浓度大50~100倍，且其动力学行为亦与在血浆中不同，因此宜用全血样品测定。再如：三环降压药物，对个别病人来说，在血浆和红细胞的分配比不是一个常数，故宜采用全血样品进行药物动力学的研究。
血样主要用于药物动力学、生物利用度、临床治疗药物监测等研究与实际工作中，其测定方法大都采用测定原形药物总量的方法。
（二）尿样
采用尿样测定药物浓度的目的与血液、唾液样品不同。尿药测定主要用于药物的剂量回收、尿清除率研究。同时，当药物在血中浓度过低难以准确测定时，尿药测定亦用于药物制剂的生物利用度研究，以及根据药物剂量回收研究可以预测药物的代谢过程及测定药物的代谢类型（代谢速率，metabolic rate，MR）等。
1．尿样的特点体内药物的清除主要是通过尿液排出体外，药物可以原形（母体药物）或代谢物及其缀合物等形式排出。尿液中药物浓度较高，收集量可以很大（成人一日排尿量为1~5L）。但由于易受食物种类、饮水多少、排汗情况等影响，常使尿药浓度变化较大，一般以某一时间段或单位时间内尿中药物的总量（排泄量或排泄率）表示。
2．尿样的采集采集的尿是自然排尿。尿包括随时尿、晨尿、白天尿、夜间尿及时间尿几种。因尿液浓度变化较大，所以应测定一定时间内排入尿中的药物总量。即应测定在规定的时间内采集的尿液（时间尿）体积和尿药浓度。采集一定时间段（如服药后-1~0.25、0.25~1、1~2、2~3、3~4、4~6、6~8、8~10、10~12、12~16、16~24、24~36、36~48小时）尿液时，用量筒准确测量每一时间段内尿液的总体积后，留取适量（如10ml）置于试管中，以供分析用，其余弃去，并做好记录。
3．尿样的贮藏健康人排出的尿液是淡黄色或黄褐色的，pH在4.8~8.0之间。放置后会析出盐类，并有细菌繁殖、固体成分的崩解，因而使尿液变混浊。因此，尿液必须加入适当防腐剂后保存。
第二节体内样品分析的前处理
在测定体内药物及其代谢物时，除少数情况将体液作简单处理后直接测定外，一般在最后一步测定之前要对样品进行适当的预处理，即实施分离、浓集或改性等，为药物的测定创造良好条件。
样品的预处理是体内药物分析中极为重要的环节，也是分析中最困难，最繁复的工作。由于药物自身的理化特性和在体内的存在形式以及生物介质的差异，对于体内样品的预处理很难规定统一方法和固定的程序，而必须结合后续的测定方法对分析样品的要求，采取恰当的分离、净化、浓集或化学衍生化等样品处理步骤。图5-1大致反映了测定方法与样品前处理要求的相互关系。
一、体内样品预处理的目的
（一）使待测药物游离
药物进入体内后，即与血浆蛋白结合，同时部分经生物转化生成代谢物及缀合物。即体内样品中的药物通常以多种形式存在，须先进行预处理，使待测药物或代谢物从结合物或缀合物中释放出来，以便测定药物或代谢物的总浓度。
（二）满足测定方法的要求
体内样品介质组成复杂、干扰多，而待测药物组分浓度低，须先经预处理，使其分离及浓集。如，血清中既含有高分子的蛋白质和低分子的糖、脂肪、尿素等有机物，也含有Na+、K+、Cl-等无机物，而其药物含量低（一般为μg/ml或ng/ml水平）。因此，需将样品进行适当处理，使组分得到净化和富集，以满足测定方法对分析样品的要求。
（三）改善分析环境
为了防止分析仪器的污染、劣化，提高测定灵敏度和选择性等。体内样品的预处理法由于各种分析仪器的耐受程度不同而不同。如高效液相色谱仪，为防止蛋白质在色谱柱上的沉积、堵塞，至少需要进行除去血浆蛋白质的预处理工作。可以说，体内样品的预处理是色谱分析中必不可少的操作步骤。体内样品的预处理不仅可以延长色谱柱的寿命；也可以改善方法的选择性（排除生物介质的干扰）和组分的可测性或组分的色谱行为（待测组分的化学衍生化）。
二、常用体内样品预处理方法
不管分析目的是什么，其选择性分离是相当重要的。这是因为内源性物质、代谢产物或其他共存药物的干扰能影响分析结果。
对于大多数药物而言，体内样品的分析通常由两步组成：样品的前处理和对最终提取物的测定。前处理是为了除去生物介质中含有的大量内源性及外源性干扰物质；提取出低浓度的待测药物或代谢产物，或同时加以浓集；或进行化学衍生化处理，使其在所用分析技术的检测范围之内。分析方法的专属性部分取决于分析方法的特点，但主要取决于分析样品的前处理与制备技术。
常用体内样品的预处理方法大致分为去除蛋白质法、分离与浓集法、缀合物的水解、化学衍生化法及微波萃取和微透析技术等。
（一）去除蛋白质法
在测定血样时，首先应去除蛋白质。去除蛋白质可使结合型的药物释放出来，以便测定药物的总浓度。去除蛋白法有以下几种方法。
1、溶剂沉淀法加入与水相混溶的有机溶剂（亲水性有机溶剂），溶液的介电常数下降，蛋白质分子间的静电引力增加而聚集；同时亲水性有机溶剂的水合作用使蛋白质水化膜脱水而析出沉降，并使与蛋白质以氢键及其他分子间力结合的药物释放出来。常用的水溶性有机溶剂有乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃等。含药物的血浆或血清与水溶性有机溶剂的体积比为1∶(2~3)时，可以将90%以上的蛋白质除去。上清液偏碱性，pH为8.5~9.5。操作时，将水溶性有机溶剂与血浆或血清混合后离心分离，取上清液作为供试溶液。通常用于分离血浆或血清的离心力（～1000?g）不能将蛋白质沉淀完全，而采用高速离心（离心力～15000?g）~5分钟便可将析出的蛋白质沉淀完全。高速离心最好采用控温离心机，否则由于摩擦温度升高，蛋白质的溶解度增加，并可能导致药物分解。
2、中性盐析法加入中性盐，溶液的离子强度发生变化，部分蛋白质的电性被中和，蛋白质因分子间电排斥作用减弱而凝聚；同时中性盐的亲水性使蛋白质水化膜脱水而析出沉降。常用的中性盐有：饱和硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠、磷酸钠等。操作时，如按血清与饱和硫酸铵溶液的比例为1∶2混合，高速离心~2分钟，即可除去90%以上的蛋白质。所得
上清液近中性，pH为7.0~7.7。
3、强酸沉淀法当溶液pH低于蛋白质的等电点时，蛋白质以阳离子形式存在，可与酸根阴离子形成不溶性盐而沉淀。常用的强酸有：10%三氯醋酸或6%高氯酸溶液。含药物血清与强酸的比例为1∶0.6混合，高速离心~2分钟，就可以除去90%以上的蛋白质。因加入了强酸，上清液呈强酸性（pH 0~4），在酸性下分解的药物不宜用本法除蛋白。
4、热凝固法当待测物热稳定性好时，可采用加热的方法将一些热变性蛋白质沉淀。加热温度视待测组分的热稳定性而定，通常可加热至90℃：蛋白沉淀后可用离心或过滤法除去，这种方法最简单，但只能除去热变性蛋白。
（二）分离与浓集
液-液萃取法是传统的分离、浓集方法。样品在提取过程中，虽然待测组分得到了净化，但因微量的组分分布在较大体积（数毫升）的提取溶剂中，提取液往往还不能直接供分析用。一些分析方法，如GC和HPLC等都受进样量的限制，若将提取液直接注入仪器，待测组分的量可能达不到检测灵敏度要求。因此，常需要使待测组分浓集后再进行测定。方法是挥去提取溶剂，残渣复溶于小体积的溶剂。挥去提取溶剂的常用方法是直接通入氮气流吹干；对于易随气流挥发或遇热不稳定的药物，可采用减压法挥去溶剂。
溶剂蒸发所用的试管，底部应为尖锥形，这样可使最后数微升溶剂集中在管尖，便于待测组分的复溶与分取。
随着药物分析技术的不断提高，体内样品的前处理技术得到迅速发展，在液相萃取的基础上出现了许多分离与浓集的新方法和新技术。如：液相微萃取、固相萃取、自动化固相萃取、固相微萃取、超滤及微透析技术等。现分别就其基本原理、特点、适用性等叙述如下：
1．液相萃取法液相萃取法，也称液-液提取法（liquid-liquid extraction，LLE），是利用待测药物与内源性干扰物的分配系数不同而进行的液相分离技术。多数药物是亲脂性的，在适当的有机溶剂中的溶解度大于在水相的溶解度，而血样或尿样中含有的大多数内源性干扰物质是强极性的水溶性物质，因而可用有机溶剂提取法除去大部分内源性干扰物质。
应用本法时要考虑所选有机溶剂的特性、有机溶剂相和水相的体积及水相的pH等。
（1）溶剂的选择原则：选择合适的溶剂是使提取获得成功的主要条件，它一方面涉及提取效率和选择性，另一方面也涉及操作是否方便。
溶剂的选择应根据相似相溶的原则进行，选择溶剂时应注意以下几点：①对药物分子的未电离形式可溶，而对电离形式不溶；②沸点低、易挥发；
③与水不相混溶；④无毒、不易燃烧；⑤具有较高的化学稳定性和惰性；
⑥不影响紫外检测。某些溶剂，如乙醚萃取能力强，又易于挥散、浓集，为常用萃取溶剂。但乙醚萃取后可混入约1.2%的水分，在提取前于样品（水相）中加入适量固体氯化钠（中性盐，提高溶液离子强度），可减少乙醚中水的溶解度，以减少混入的水溶性干扰物质。
（2）溶剂的用量：提取时所用的有机溶剂量要适当。一般有机相与水相（体内样品）体积比为1∶1～5∶1。根据待测药物的提取回收率及前处理过程确定提取溶剂的最佳用量。
（3）水相的pH：采用LLE时，体内样品溶液（水相）pH的选择主要由待测药物的p K a确定。当pH与p K a相等时，50％的药物以非电离形式存在。对于碱性药物最佳pH为高于p K a1~2个pH单位；对于酸性待测药物，则要低于p K a 1~2单位。这样，就可使得90%的药物以非电离形式存在，而更易溶于有机溶剂中。
作为一般规则，碱性药物在碱性pH、酸性药物在酸性pH介质中提取；但一般多在碱性下提取，以减少内源性物质（多是酸性的）的干扰。一些碱性药物在碱性pH不稳定时，则可在近中性pH用三氯甲烷和异丙醇提取。
（4）提取操作：一般只提取一次。若提取回收率较低（如低于50%）时，可提取2~3次；若干扰物质为脂溶性，不易除去，则可将提取分离出的含药有机相再用一定pH的小体积水溶液反提取（back extraction）后测定，或将反提取液再用有机溶剂提取，如此反复提取可将药物与干扰物质有效分离。
液-液提取法的优点在于它的选择性和低廉的运行成本，以及可对样品进行净化和浓集的特点。所以本法在体内药物分析中，尤其是采用LC-MS
测定时被广泛应用。
2．固相萃取法由于高效液相色谱，尤其是反相高效液相色谱的成功应用，使人们利用色谱理论，采用装有不同填料的小柱进行体内样品处理的固相萃取（solid-phase extraction，SPE）技术日益受到重视。SPE技术亦称液-固萃取技术，它的应用大大缩短了样品处理时间，同时可避免乳化现象，而且便于自动化操作。
（1）固相萃取法的原理：将不同填料作为固定相装入微型小柱，当含有药物的体内样品溶液通过小柱时，由于受到“吸附”、“分配”、“离子交换”或其他亲和力作用，药物及内源性干扰物质同时被保留在固定相（填料）上，用适当溶剂洗除干扰物质，再用适当溶剂洗脱药物。其保留或洗脱的机制取决于药物与固定相表面的活性基团，以及药物与溶剂之间的分子间作用力。药物的洗脱方式有两种：①一种是药物比干扰物质与固定相之间的亲和力更强，因而在用冲洗溶剂洗去干扰物质时药物被保留，然后用一种对药物亲和力更强的溶剂洗脱药物；②另一种是干扰物质较药物与固定相之间的亲和力更强，则药物被直接洗脱，干扰物质被保留在萃取柱上。通常使用更多的是前一种洗脱模式的SPE。从市场上可得到含有不同填料的商品化的微型柱，如由美国Analytichem International公司生产的Bond Elut和由美国Waters公司生产的Sep-pak微型柱等，目前应用最广泛。
取体内样品（液体），加载到微型柱上端，在下端通过负压使溶剂通过微型柱。也可以通过在微型柱的上端利用注射器达到正压的方法使溶剂通过，洗脱出的分析样品在每一微型柱的正下方用试管收集。
SPE的填料种类繁多，可分成亲脂型（大孔吸附树脂、亲脂性键合硅胶）、亲水型（硅胶、硅藻土、棉纤维）和离子交换型三类，其中亲脂型用得最多。烷基、苯基、氰基键合硅胶都可用作固相萃取吸附剂，其中十八烷基硅烷键合硅胶（ODS或C
18
）最常用。亲脂性键合硅胶容易吸附水中的非极性物质，易用有机溶剂洗脱，适用于萃取、净化水基质体液中疏水性药物。
常见的商品SPE柱有Sep-Pak C
18、Bond-Elut C
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、CN（氰基）、C
2
（乙基）、
Ph（苯基）Baker 10 C
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等。
（2）固相萃取法的操作步骤：使用亲脂性键合相硅胶SPE柱的一般操作步骤如下。
第一步：用甲醇润湿小柱，活化填料，以使固相表面易于和待测组分发生分子间相互作用，同时可以除去填料中可能存在的干扰物质。
第二步：用水或适当的缓冲液冲洗小柱，去除过多的甲醇，但冲洗不
链弯曲折叠，对待测宜过分。否则会使甲醇含量过低（低于5%），导致C
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物的吸附能力下降，造成萃取回收率降低。
第三步：加样，使体内样品通过小柱，并弃去滤过废液。
第四步：用水或适当缓冲液冲洗小柱，去除吸附于固定相上的内源性物质或其他相关干扰物质。
第五步：选择适当的洗脱溶剂洗脱待测物，收集洗脱液，挥干溶剂备用或直接进行在线分析。
（3）注意事项：使用亲脂性键合硅胶SPE柱时，需注意如下几点。①体液样品（如血浆等）通过萃取柱的流速控制在1~2ml/min。②冲洗液和洗脱剂的强度、用量要适当，否则会导致药物的损失或洗脱选择性下降。通常选用可与水混溶的洗脱剂。③萃取碱性药物时，洗脱剂中常需加酸、有机胺或氨水、醋酸铵或离子对试剂。
（4）固相萃取法的特点与应用：用亲脂性键合硅胶SPE方便、省时，通常可以用小体积的甲醇、乙腈等洗脱剂（200~300μl）完全洗脱药物、净化并浓集样品，不需蒸干即可直接进样。
对于给定药物体内样品的处理方法的选用可概括如下：①较亲脂的药物，可用溶剂萃取，或用亲脂性键合硅胶为填料的SPE处理。但对于碱性药物，会产生强保留作用，故宜用大孔吸附树脂为填料的SPE。②较亲水且具有酸碱性、可解离的药物，可采用离子交换型填料SPE法处理。③较亲水但又不能解离的药物则不太容易萃取，可用沉淀蛋白后直接进样法。
（三）缀合物的水解
药物或其代谢物与体内的内源性物质结合生成的产物称为缀合物（conjugate）。内源性物质有葡萄糖醛酸（glucuronic acid）、硫酸、甘氨酸、谷胱甘肽和醋酸等，特别是前两种为最重要的内源性物质。一些含羟基、羧基、氨基和巯基的药物，可与内源性物质葡萄糖醛酸形成葡萄糖
醛酸苷缀合物；还有一些含酚羟基、芳胺及醇类药物与内源性物质硫酸形成硫酸酯缀合物。尿中药物多数呈缀合状态。由于缀合物较原形药物具有较大的极性，不易被有机溶剂提取。为了测定尿液中药物总量，需对缀合物进行水解，将缀合物中的药物释出。常用的方法如下：
1．酸水解法酸水解时，可加入适量的盐酸溶液。至于酸的用量和浓度、反应时间及温度等条件，随药物的不同而异。这些条件应通过实验来确定。
该法比较简便、快速，但有些药物在水解过程中会发生分解；与酶水解法相比，其专一性较差。
2．酶水解法对于遇酸及受热不稳定的药物，可以采用酶水解法。常用葡萄糖醛酸苷酶（glucuronidase）或硫酸酯酶（sulfatase）。前者可专一地水解药物的葡萄糖醛酸苷缀合物，后者水解药物的硫酸酯缀合物。而实际应用中最常用的是葡萄糖醛酸苷酶-硫酸酯酶的混合酶。一般控制pH 为4.5~5.5，37℃培育数小时进行水解。
酶水解比酸水解温和，一般不会引起待测物分解，且酶水解专属性强。其缺点是酶水解时间稍长及酶制剂可能带入的黏蛋白导致乳化或色谱柱阻塞。尽管如此，酶水解仍被优先选用。
在尿液中采用酶水解，应事先除去尿中能抑制酶活性的阳离子。
3．溶剂解法缀合物（主要是硫酸酯）往往可通过加入的溶剂在萃取过程中被分解，称作溶剂解（solvolysis）。例如尿中的甾体硫酸酯在pH 1时加醋酸乙酯提取，产生溶剂解，这时的条件也比较温和。
值得注意的是，目前对缀合物的分析逐渐趋向于直接测定缀合物的含量（如采用HPLC和RIA法），以获得在体内以缀合物形式存在的量，以及当排出体外时，缀合物占所有排出药物总量的比率，从而为了解药物代谢情况提供更多的信息。
第三节体内样品分析方法与方法验证
建立可靠的体内样品中微量药物及其代谢物的分析方法是体内药物分析工作的首要任务，本节将就体内样品分析方法建立的一般程序和分析方法验证的基本内容与要求进行论述。
分析方法初步拟定后，需进行一系列的试验工作，以选择最佳的分析条件，并对分析方法进行方法学验证，以确认是否适用于实际体内样品的分析。分析方法的建立和验证过程系同步进行的，是不能截然划分的。为便于讨论，在此将以色谱分析法为例分别叙述。首先分步讨论分析方法的建立过程。
1．色谱条件的筛选取待测药物或其特定的活性代谢产物、内标物质（必要时）的标准物质（对照品或标准品，或符合标准的原料药，或已知纯度化合物），照拟定的分析方法（不包括体内样品的预处理步骤）进行测定，并通过调整色谱柱的型号或牌号（填料的性状、粒径、柱长度等）、流动相（组分及其配比）及其流速、柱温、进样量、内标物质的浓度及其加入量等条件，使待测药物与内标物质具有良好的色谱参数（n、R、T）及峰面积比值，并具有适当的保留时间（t R）以避开内源性物质的干扰；选择适当的检测器，以获得足够的方法灵敏度（LOQ）。
2．色谱条件的优化
（1）试剂与溶剂试验：取待测药物的非生物介质溶液（通常为水溶液），按照拟定的分析方法进行衍生化反应、萃取分离等样品预处理后，进样分析以考察反应试剂对测定的干扰（方法特异性）。通过改变反应条件、萃取方法或萃取条件（萃取溶剂的极性、混合溶剂的配比，固相萃取填料性质、冲洗剂与洗脱剂及其用量等），使空白试剂色谱峰不干扰药物的测定（分离度应＞1.5）。
本步骤主要考察需经化学反应的预处理过程，若预处理过程仅为体内样品的提取分离，则可不进行该步骤，直接进行空白生物介质试验。
（2）生物介质试验：取空白生物介质，如空白血浆，按照拟定的体内样品预处理与样品分析方法操作。考察生物介质中的内源性物质（endogenous substances）对测定的干扰（方法特异性），在待测药物、特定的活性代谢产物、内标物质等的“信号窗”（色谱峰附近的有限范围）内不应出现内源性物质信号。
（3）质控样品试验：取空白生物介质，按照实际体内样品中药物的预期浓度范围，加入待测药物的标准物质制成标准样品和质控（quality control，QC）样品，照“生物介质试验”项下方法试验，建立分析方法的
定量范围与标准曲线，并进行方法的精密度与准确度、灵敏度、提取回收率，以及样品与溶液的稳定性等各项参数的验证和介质效应的评估；同时进一步验证待测药物、内标物质与内源性物质或其他药物的分离效能。例如，色谱峰的t R、n和T是否与水溶液的一致，色谱峰是否为单一成分，标准曲线的截距是否显著偏离零点等，均可说明内源性物质是否对待测药物或内标物质构成干扰。
3．实际样品的测试通过空白生物介质和质控样品试验，所建立的分析方法及其条件尚不能完全确定是否适合于实际样品（incurred samples）的测定。因为药物在体内可能与内源性物质结合（如与血浆蛋白结合），或经历各相代谢生成数个代谢产物及其进一步的结合物或缀合物。使得从体内获得的实际体内样品变得更为复杂。所以，在分析方法建立后，尚需进行实际体内样品的测试，考察代谢产物对药物、内标物质的干扰情况，以进一步验证方法的可行性。
二、分析方法的验证
为了保证所建立的分析方法的可行性与可靠性，分析方法在用于实际样品的分析之前，必须对方法进行充分的方法学验证（validation）。体内样品分析方法的验证分为全面验证（full validation）和部分验证（partial validation），在此着重介绍全面验证过程。
对于首次建立的体内样品分析方法、新的药物或新增代谢物定量分析，应进行全面的方法验证。以下将以色谱分析法为主讨论体内样品分析方法的全面验证过程。分析方法验证的内容包含分析方法的效能指标（即特异性、标准曲线和定量范围、定量下限、精密度与准确度）与样品（包括：体内样品、制备样品及标准储备液）稳定性及提取回收率的验证。方法验证通常采用QC样品和用药后的实际体内样品进行，具体的验证参数及其基本要求如下：
（一）特异性
方法的特异性（specificity），又称专属性或专一性，通常与选择性（selectivity）互用。方法的特异性系用以证明使用该方法所测定的物质是预期的待测物（原形药物或特定的活性代谢物），体内样品所含内源性物
质和相应代谢物、降解产物及其他共同使用的药物不得干扰对样品的测定。所以，验证一个分析方法是否具有特异性，应着重考虑以下几点：1．内源性物质的干扰通过比较待测药物或其特定的活性代谢产物的标准物质及至少6个不同个体的空白生物介质和QC样品（注明标准物质的浓度）的检测信号，如HPLC色谱图中各待测药物或其特定的活性代谢产物色谱峰的保留时间（t R）、理论板数（n）和拖尾因子（T）是否一致，以及与内源性物质色谱峰的分离度（R），确证内源性物质对分析方法无干扰。
对于以软电离质谱为基础的检测方法（LC-MS或LC-MS/MS）应注意考察分析过程中的介质效应，如离子抑制等。
2．未知代谢产物的干扰通过比较QC样品和至少6个不同个体用药后的实际体内样品的检测信号，如HPLC色谱图中各被测药物色谱峰的t R、n和T是否一致，以及与其他未知代谢产物（在实际样品的色谱中通常随用药后的时间延长而增加）色谱峰的R，确证其他代谢产物对分析方法无干扰。必要时可通过HPLC-DAD和LC-MS（或LC-MS/MS）确证被测定色谱峰的单纯性和同一性。
3．伍用药物的干扰在临床治疗药物监测时，还要考虑患者可能同时服用其他药物（通常为数有限）的干扰。可通过比较待测药物、同时服用药物、待测药物的QC样品和添加有同时服用药物的干扰样品的检测信号，如HPLC色谱图中各待测药物色谱峰与同时服用药物色谱峰的t R及其R，确证同时服用药物对分析方法无干扰。
4．与参比方法的相关性除上述方法外，有时还可使用参比方法对照法。参比方法一般选用特异性强、准确度高、线性关系良好的色谱法。如在治疗药物监测中使用UV（或FIA）法时，可与HPLC（或GC）法比较。即同时用两种方法测定不同浓度的系列标准样品，以参比方法测定结果为横坐标（x），以拟定方法测定结果为纵坐标（y），用最小二乘法计算回归方程y=a+bx（要求坐标标度相等）。回归方程的相关系数r表示两种方法测得结果的一致性；截距a表示拟定方法受到的恒定干扰的程度，如UV中具有紫外吸收的试剂或内源性物质可引起恒定干扰（a＞0）；斜率b表示拟定方法受到比例干扰的程度，如FIA中标记抗原不纯可引起比例干扰（b≠1）。
与参比方法的相关性比较，除显示分析方法的特异性外，还反映分析
方法的准确度。斜率b表示两种方法测得结果的一致性，当截距a≈0时，若参比方法准确度良好，则拟定方法的准确度（回收率）等于100b（%）。
（二）标准曲线与定量范围
标准曲线（standard curve），亦称校正曲线（calibration curve）或工作曲线（working curve），反映了体内样品中所测定药物的浓度与仪器响应值（如HPLC峰面积）的关系，一般用回归分析法所得的回归方程来评价。除少数方法（如IA）外，标准曲线通常为线性模式。最常用的回归分析法为最小二乘法（least squares）或加权最小二乘法（weighted least squares）。回归方程的自变量（x）为体内样品中待测药物的浓度，因变量（y）为响应信号的强度。标准曲线的高低浓度范围为定量范围（quantification range），在定量范围内QC样品浓度测定结果应达到试验要求的精密度和准确度。
1．标准曲线的建立标准曲线应用标准样品建立，标准样品的配制应使用与待测体内样品相同的生物介质。测定不同体内样品时应建立各自的标准曲线，用于建立标准曲线的标准浓度个数取决于待测物的预期浓度范围和待测物/响应值关系的性质。定量范围要能覆盖全部待测的体内样品浓度范围，不得用定量范围外推的方法求算未知体内样品的浓度。建立标准曲线时应随行测定空白体内样品（生物介质），但计算时不包括该点，仅用于评价干扰。当线性范围较宽的时候，推荐采用加权的方法对标准曲线进行计算，以使低浓度点计算得比较准确。
标准曲线建立的一般步骤如下：
（1）系列标准溶液的制备：精密称取待测药物的标准物质适量，用甲醇或其他适宜溶剂溶解并定量稀释制成一定浓度（较高浓度）的标准贮备液，冰箱保存备用；精密量取标准贮备液适量，用水或其他适宜溶剂定量稀释制成系列标准溶液。
依据待测物的预期浓度范围和待测物与响应值的关系性质确定标准曲线的浓度个数，线性模式的标准曲线至少应包含6个浓度点（不包括零点，即空白样品），非线性模式的浓度点应适当增加。标准溶液的浓度系列一般为等比梯度模式，通常比例常数约为2，这样可以有限的浓度点覆盖较宽泛的浓度范围。如：1、2、5、10、20、50、100。在此系列中，若体内平均
达峰浓度为50，其1/20为 2.5，考虑到个体差异，设定最高浓度为100，最低浓度为1，可覆盖全部待测体内样品中的药物浓度。
（2）内标溶液的制备：精密称取内标物质适量，用甲醇及其他适宜溶剂溶解并定量稀释制成一定浓度的内标贮备液，冰箱保存备用；精密量取内标贮备液适量，用水及其他适宜溶剂定量稀释制成内标溶液。
内标溶液的浓度一般选择与系列“标准溶液”的几何平均浓度，即标准曲线的中间浓度（如系列标准溶液浓度为1、2、5、10、20、50和100时，中间浓度为10）相当。即按拟定方法加入中间浓度的标准溶液与内标溶液时，样品的检测信号（如HPLC的峰面积）的比值约为1。
（3）系列标准样品的制备：取空白生物介质数份，分别加入系列标准溶液适量，涡旋混匀，即得系列浓度的标准样品（standard samples），其浓度范围可覆盖全部待测体内样品预期浓度。同时制备空白样品（待测药物浓度为零的标准样品）。
因为加入的标准溶液体积较小，为防止在其加入及涡旋混合时造成损失，也可在适宜的容器（如离心玻璃试管或EP管）内先加入标准溶液后，再加入空白生物介质并涡旋混匀。
当标准溶液中含有高浓度的有机溶剂（如甲醇、乙腈等）、且加入体积较大时，为防止因标准溶液的加入而造成部分生物介质（如血浆蛋白）变性，使标准样品与用药后的实际体内样品不一致，进而造成分析结果的偏差。也可先将标准溶液加至适宜的容器内，挥干溶剂后，再加入空白生物介质并涡旋溶解、混匀。
（4）标准曲线的绘制：取系列标准样品，按拟定方法预处理后分析，以待测药物的检测响应（如色谱峰面积）或与内标物质（内标法）的响应的比值（因变量，y）对标准样品中的药物浓度（自变量，x），用最小二乘法或加权最小二乘法进行线性回归分析，求得回归方程（y=a+bx）及其相关系数（γ），并绘制标准曲线。
标准样品中的待测药物浓度，以单位体积（液态介质，如血浆）或质量（脏器组织，如肝脏）的生物介质中加入标准物质的量表示，如μg/ml 或μg/g等。例如，取空白血浆0.5ml，加入标准溶液（100μg/ml）10μl。即在0.5ml的生物介质中加入标准物质1μg，则标准样品中的待测药物浓
度为2μg/ml。若生物介质为脏器匀浆溶液，则以所取匀浆体积所相当的脏器的重量中加入标准物质的量计算。
2．限度要求用于建立标准曲线的标准浓度个数取决于待测物的预期浓度范围和待测物/响应值关系的性质。在药代动力学或生物利用度研究中，必须至少用6个浓度建立标准曲线，对于非线性相关（如IA）可能需要更多浓度点。
标准曲线的定量范围要能覆盖全部待测的体内样品浓度范围，定量上限（upper limit of quantification，ULOQ，标准曲线的最高浓度点）应高于用药后生物介质中药物的峰浓度（C m a x）；定量下限（lower limit of quantification，LLOQ，最低浓度）应低于C m a x的10%~5%（1/10~1/20）。
标准曲线各浓度点的计算值（依据回归方程推算的浓度）与标示值之间的偏差〔bias = [(计算值－标示值)/标示值]×100%〕在可接受的范围之内时，可判定标准曲线合格。可接受范围一般规定为最低浓度点的偏差在±20%以内，其余浓度点的偏差在±15%以内。只有合格的标准曲线才能对体内样品进行定量计算。
标准曲线回归方程的截距应接近于零，若显著偏离零点，应确证其对方法的准确度无影响；斜率应接近或大于1（与坐标的标度选择有关），使具有较高的灵敏度；相关系数应接近于1，即具有良好的相关性，如色谱法γ≥0.99。
（三）定量下限
定量下限（LLOQ）是标准曲线上的最低浓度点，表示方法的灵敏度，即测定样品中符合准确度和精密度要求的最低药物浓度。
1．测定法取同一生物介质，制备至少5个独立的标准样品，其浓度应使信噪比（S/N）大于5，依法进行精密度与准确度验证。
2．限度要求其准确度应在标示浓度的80%～120%范围内，相对标准差（RSD）应小于20%。在药代动力学与生物利用度研究中，LLOQ应能满足3~5个消除半衰期时体内样品中的药物浓度或C m a x的1/20～1/10的药物浓度的测定。
（四）精密度与准确度
精密度（precision）是指在确定的分析条件下相同生物介质中相同浓
度样品的一系列测量值的分散程度，通常用QC 样品的相对标准差（RSD ）表示。
在体内药物分析过程中，无论是药代动力学参数的获得或是治疗药物的监测，通常在1个分析批（analytical run ）内难以完成全部体内样品的分析。而在不同的分析批之间的实验条件（如仪器性能、参数、试剂来源、实验温度、湿度等）有可能发生小的改变，进而对分析结果可能产生影响。所以在体内药物分析中，方法精密度除要评价批内（within-run 或intra-batch ）RSD 外，同时还应评价批间（between-run 或inter-batch ）RSD 。
准确度（accuracy ）是指在确定的分析条件下测得的体内样品浓度与真实浓度的接近程度，通常用QC 样品的实测浓度与标示浓度的相对回收率（relative recovery, RR ）或相对偏差（relative error, RE ）表示。准确度可通过重复测定已知浓度的待测物样品获得。
1．测定法 使用QC 样品进行考察，一般选择高、中、低3个浓度的QC 样品同时进行方法的精密度和准确度考察。低浓度通常选择在LLOQ 的3倍以内；高浓度接近于ULOQ ；中间浓度选择平均浓度（通常为几何平均浓度，即以几何级数排列的标准曲线的中部）附近。与随行的标准曲线同法操作，每个样品测定1次。
在测定批内RSD 时，每一浓度至少制备并测定5个样品。为获得批间RSD ，应在不同天（每天1个分析批）连续制备并测定，至少有连续3个分析批（analytical run ），不少于45个样品的分析结果。
2．结果计算与限度要求 每批的测定数据（待测药物的色谱峰面积或与内标物质的峰面积比值）用该批随行标准曲线的回归方程计算QC 样品浓度X 。
准确度以多次测定结果的平均值M 与标准值（制备时的加入量）S 比较计算，一般准确度RR 应在85%~115%范围内（RE 不超过±15%），在LLOQ 附近应在80%~120%范围内（RE 不超过±20%）。RR 或RE 的计算式分别如下：
%100?=S M RR
%100%100-=?-=RR S
S RE 精密度一般要求RSD 不超过15%，在LLOQ 附近RSD 应不超过20%。批
内和批间RSD 计算式分别如下：
100%100%RSD ????
==批内()()%10012211?----=??=???==??∑∑∑I N X X n X X I i i I i n j ij
批间式中，SS e 批内方差；SS A 值；?X i .为第i 批n 次测定批数（通常I =3）；n 为总测定次数(总样品数，（五）样品稳定性
在体内药物分析中后转移至分析实验室进行体内样品的数量一般较大通常需在多个工作日内完品（processed samples 样品一般测定1次，但复，分析过程中样品的稳样品稳定性验证内容包括在1个分析批内含药体内样品和制备样品的短期稳定性和在整个样品分析期间含药体内样品及标准物质储备溶液的长期稳定性。
1．短期稳定性 在1个分析批内的操作过程中，含药体内样品在室温等待处理、体内样品的处理过程（如提取、净化及浓缩）中，以及制备样品（处理后的样品溶液）在室温或特定温度下（如HPLC 自动进样时设定进样室温度）等待进样测试期间，样品中待测物的稳定性应予以考察，以保证检测结果的准确性和重现性。
2．长期稳定性 在整个样品分析期间，含药体内样品的长期储藏、冻融，以及标准储备液的稳定性也将影响着分析结果准确和重现。所以，需对含药体内样品在冰冻（?20℃或?80℃）和冻融条件下、标准储备液在特
药剂学-第22章生物技术药物制剂
第十九章生物技术药物制剂 一、概念与名词解释 1．生物技术药物 2．生物活性检测 3．蛋白质分子的构象 4．BCA测定法 二、判断题(正确的划A，错误的打B) 1．生物技术药物结构稳定，不易变质。( ) 2．生物技术药物对酶比较敏感，而且不易穿透胃黏膜，故一般只能注射给药。( ) 3．蛋白质的肽链结构包括氨基酸组成、氨基酸排列顺序、肽链数目、末端组成、二 硫键的位置及其空间结构。( ) 4．蛋白质结构可分为一、二、三、四级结构，其中一、二级结构为初级结构，三、四级结构为高级结构。( ) 5．形成稳定的蛋白质分子构象的作用力有氢键、疏水作用力、离子键、范德华力、二硫键与配位键。( ) 6．维持蛋白质二级结构中仅螺旋和B折叠的作用力是疏水键。( ) 7．圆二光谱可用于测定蛋白质的二级结构。( ) 8．超临界溶液快速膨胀技术(RESS)系将药物与高分子材料溶解于有机溶剂中，将此溶液与液态二氧化碳混合，载有药物的高分子材料则析出形成微球。( ) 9．超临界气体反溶剂技术(GAS)系将药物与高分子材料溶解于有机溶剂中，将此溶液与液态二氧化碳混合，载有药物的高分子材料则析出形成微球。( ) 10．鼻黏膜给药常会产生肝脏首过效应。( ) 11．两个氨基酸缩合成的肽称为二肽，由三个以上氨基酸组成的肽称多肽。( ) 三、填空题 1．现代生物技术主要包括、、与。2．生物技术药物主要有、和类药物。 3．蛋白质分子旋光性通常是，蛋白质变性，螺旋结构松开，则其增大。 4．由于共价键引起的蛋白质不稳定性主要包括、、 和。 5．蛋白质类药物评价分析方法主要包括、、、和。 6．液体剂型中蛋白质药物的稳定剂有、、和 等类型。 7．蛋白质类药物冻干过程中常加入某些冻干保护剂，如、、、等，以改善产品的外观和稳定性。 8．PLGA叫作，其结构中改变与的比例或分子量，可得到不同时间生物可降解性质的材料。 9．蛋白质和多肽类药物的非注射给药方式主要包括、、、等给药。 四、单项选择题 1．以下哪一种不是常用的蛋白类药物的稳定剂
2014年生物碱类药物分析考试试题
生物碱类药物分析考试试题 一、X型题（本大题12小题．每题1.0分，共12.0分。以下每题由一个题干和 A、B、C、D、E五个备选答案组成，题干在前，选项在后。要求考生从五个备选答案中选出二个或二个以上的正确答案，多选、少选、错选均不得分。） 第1题 生物碱类药物的测定方法有 A 提取中和法 B 非水溶液滴定法 C 碘量法 D 酸性染料比色法 E 阴离子表面活性剂滴定法 【正确答案】：A,B,D,E 【本题分数】：1.0分 第2题 生物碱常用的含量测定方法有 A 碱量法 B 非水碱量法 C 离子对比色法 D 紫外分光光度法 E 色谱法 【正确答案】：A,B,C,D 【本题分数】：1.0分 第3题 非水滴定法测定硫酸奎宁含量的反应条件为 A 冰醋酸-醋酸为溶剂 B 高氯酸滴定液(0.1mol/滴定
C 1mol的高氯酸与1/3mol的硫酸奎宁反应 D 仅用电位法指示终点 E 溴酚蓝为指示剂 【正确答案】：A,B,C 【本题分数】：1.0分 第4题 提取中和法中所用提取溶剂应具备的条件是 A 与水不相混溶 B 对生物碱及其他物质的溶解度均大 C 与生物碱不起反应 D 与碱化试剂不起反应 E 沸点高，不易挥发 【正确答案】：A,C,D 【本题分数】：1.0分 第5题 非水溶液滴定法测定硫酸奎宁含量的反应条件为 A 冰醋酸-醋酐为溶剂 B 高氯酸滴定液(0.1mol/滴定 C 1mol的硫酸奎宁与3mol的高氯酸反应 D 电位法指示终点 E 溴酚蓝为指示剂 【正确答案】：A,B,C,D 【本题分数】：1.0分 第6题 酸性染料比色法中常用的酸性染料有 A 亚甲蓝
《已上市化学药品变更研究的技术指导原则(一)》
已上市化学药品变更研究的技术指导原则 （一） 二OO八年一月
目录 一、概述 (2) 二、已上市化学药品变更研究工作的基本原则 (3) 三、变更原料药生产工艺 (7) 四、变更药品制剂处方中已有药用要求的辅料 (15) 五、变更药品制剂的生产工艺 (24) 六、变更药品规格和包装规格 (31) 七、变更药品注册标准 (37) 八、变更药品有效期和／或贮藏条件 (41) 九、变更药品的包装材料和容器 (44) 十、改变进口药品制剂的产地 (50) 十一、变更进口药品制剂所用原料药的产地以及单独改变 进口的原料药的产地 (54) 十二、变更国内生产药品制剂的原料药产地 (58) 附录一、药物溶出/释放比较研究基本方法 (63) 附录二、免除人体生物等效性研究的一般考虑 (72) 附录三、属于治疗窗窄的部分药物目录 (75) 参考文献 (77) 名词解释 (80) 著者 (81)
一、概述 本指导原则主要用于指导药品生产企业开展已上市化学药品的变更研究。变更是指对已获准上市化学药品在生产、质控、使用条件等诸多方面提出的涉及来源、方法、控制条件等方面的变化。这些变化可能影响到药品的安全性、有效性和质量可控性。变更研究是针对拟进行的变化所开展的研究验证工作。 目前本指导原则涵盖的变更及变更研究包括以下项目：原料药生产工艺变更、药品制剂处方中已有药用要求的辅料和制备工艺变更、注册标准变更、规格变更、有效期和贮藏条件变更、药品的包装材料和容器变更、进口药品产地变更、进口原料药产地和进口药品所用原料药产地变更、变更国内生产药品制剂的原料药产地等研究。 本指导原则仅从技术角度阐述对产品进行变更时，应进行的相关研究验证工作。药品生产企业需按照本指导原则的相关技术要求，开展变更研究验证工作，在完成相关工作后，应根据《药品注册管理办法》中的有关要求，向各级食品药品监管部门提出补充申请。 为便于把握变更可能对产品安全性、有效性和质量可控性产生的影响，本指导原则对所述及的变更划分为三类：I类变更属于微小变更，对产品安全性、有效性和质量可控性基本不产生影响；II类变更属于中度变更，需要通过相应的研究工作证明变更对产品安全性、有效性和质量可控性不产生影响；III类变更属于较大变更，需要通过系列的研究工作证明变更对产品安全性、有效性和质量可控性没有产生负面影响。变更类别划分考虑了目前药品注册管理对补充申请的有
第十六章 生物技术药物制剂习题
第十六章生物技术药物制剂 一、A型题(最佳选择题) 1．现代生物技术是（） A. 以基因工程为核心以及具备基因工程和细胞工程内涵的发酵工程和酶工程 B. 以发酵工程和酶工程为核心的基因工程 C. 以细胞工程为核心发酵工程和酶工程 D. 以基因工程为核心的细胞工程 E. 以细胞工程为核心的基因工程 2．现代生物技术的核心是（） A. 细胞工程 B. 发酵工程 C. 酶工程 D. 基因工程 E. 克隆技术 3．以下不属于生物技术药物特点的是（） A. 分子量大，不易吸收 B. 结构复杂 C. 易被消化道内酶及胃酸等降解 D. 从血中消除慢 E. 在酸碱环境不适宜的情况下容易失活 4．1982年，第一个上市的基因工程药物是（） A. 乙肝疫苗 B. 重组人胰岛素 C. 白细胞介素-2 D. EPO E. 尿激酶 5．关于蛋白质多肽类药物的理化性质错误的叙述是（） A. 蛋白质大分子是一种两性电解质 B. 蛋白质大分子在水中表现出亲水胶体的性质 C. 蛋白质大分子具有旋光性 D. 蛋白质大分子具有紫外吸收 E. 保证蛋白质大分子生物活性的高级结构主要是由强相互作用，如肽键来维持的6．通过注射给药的蛋白多肽类药物可以分成两大类，分别是（） A. 溶液型注射剂和注射用无菌粉末 B. 溶液型注射剂和混悬型注射剂 C. 缓释微球和缓释植入剂 D. 注射用无菌粉末与缓释微球 E. 普通注射剂与缓释控释型注射给药系统 7．蛋白质药物的冷冻干燥注射剂中最常用的填充剂是（） A. 甘露醇 B. 氨基酸 C. 十二烷基硫酸钠 D. 氯化钠 E. 麦芽糖 8．被FDA批准，可用于制备缓释微球注射剂的生物降解骨架材料是（） A. PLGA B. 壳聚糖 C. 淀粉 D. 乙基纤维素 E. HPMC 9．蛋白多肽药物的非注射制剂分为两大类，它们是（） A．口服制剂与黏膜制剂 B．黏膜制剂与经皮制剂 C．鼻腔制剂与经皮制剂 D．肺部制剂与口腔制剂 E．口服制剂与直肠制剂 二、X型题(多项选择题) 1．属于生物技术药物的是（）
化学药物制剂研究基本技术指导原则
指导原则编号： 【H】G P H4-1化学药物制剂研究基本技术指导原则 （第二稿） 二ΟΟ四年三月十八日
目录 一、概述 (3) 二、制剂研究的基本内容 (3) 三、剂型的选择 (5) 四、处方研究 (7) （一）、原料药 (7) （二）、辅料 (7) （三）、处方设计 (10) （四）、处方筛选和优化 (11) （五）、处方的确定 (13) 五、制备工艺研究 (14) （一）、工艺设计 (14) （二）、工艺研究 (14) （三）、工艺放大 (16) 六、药品包装材料的选择 (17) 七、质量研究和稳定性研究 (19) 【附录】 (20) 【参考文献】 (22) 【起草说明】 (23) 【著者】 (28)
一、概述 药物必须制成适宜的剂型才能用于临床。制剂研发的目的就是要保证药物的药效，降低毒副作用，提高临床使用的顺应性。如果剂型选择不当，处方、工艺设计不合理，对产品质量会产生一定的影响，甚至影响到产品疗效及安全性。因此，制剂研究在药物研究与开发中占有十分重要的地位。 本指导原则是在参考国内外有关制剂研究的技术指导原则的基础上，根据药品研究开发的自身规律，结合国内药物研发实际状况，并考虑到目前制剂研究中容易被忽视的影响制剂质量、有效性、安全性的重点问题进行制订的。 由于制剂的剂型及生产工艺纷繁复杂，且各种新剂型和新工艺也在不断出现，制剂研究中具体情况差异很大。本指导原则主要阐述制剂研究的基本思路和方法，为制剂研究提供基本的技术指导和帮助。关于各种剂型研究的详细技术要求，不在本指导原则中详述，药物研发者可参照本指导原则阐述的制剂研究的基本思路开展相应的研究工作。 二、制剂研究的基本内容 制剂的剂型种类繁多，生产工艺也有着各自的特点，研究中会面临许多具体情况和特殊问题。但制剂研究的总体目标是一致的，即通过一系列研究工作，保证制剂剂型选择依据充分，处方合理，工艺稳定，生产过程得到有效控制，适合工业化生产。制剂研究的基本内容是相同的，一般包括以下方面：
药剂学生物技术药物制剂考点归纳
第十八章生物技术药物制剂 第一节概述 一、基本概念和特点 生物技术又称生物工程，是利用生物有机体（动物、植物和微生物）或其组成部分（包括器官、组织、细胞或细胞器等）发展各种生物新产品或新工艺的一种技术体系。生物技术一般包括基因工程（含蛋白质工程）、细胞工程、发酵工程和酶工程。其中以基因工程为核心以及具备基因工程和细胞工程内涵的发酵工程和酶工程才被称为现代生物技术，以示与传统的生物技术相区别。 生物技术药物是指采用现代生物技术，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的药品。运用DNA重组技术和单克隆抗体技术生产的蛋白质、多肽、酶、激素、疫苗、单克隆抗体和细胞生长因子等类药物，也称为生物技术药物。 生物技术药物绝大多数是生物大分子内源性物质，即蛋白质或多肽类药物。临床使用剂量小，药理活性高，副作用少，很少有过敏反应。但这类药物稳定性差，在酸碱环境或体内酶存在下极易失活；分子量大，时常以多聚体形式存在，很难透过胃肠道黏膜的上皮细胞层，故吸收很少，不能口服给药，一般只有注射给药一种途径，这对于长期给药的病人而言，是很不方便的；另外很多此类药物的体内生物半衰期较短，从血中消除较快，因此在体内的作用时间较短，没有充分发挥其作用。 二、生物技术药物的研究概况 生物技术药物多数易受胃酸及消化酶的降解破坏，其生物半衰期也普遍较短，需频繁注射给药，造成患者心理与身体的痛苦。即使皮下或肌内注射，其生物利用度也较低。另外多数多肽与蛋白质类药物不易被亲脂性膜所摄取，很难通过生物屏障。因此生物技术药物的新剂型发展十分迅速，如对药物进行化学修饰，制成前体药物，应用吸收促进剂，添加酶抑制剂，增加药物透皮吸收及设计各种给药系统等。 主要方向是研究开发方便合理的给药途径和新剂型：①埋植剂缓释注射剂，尤其是纳米粒给药系统具有独特的药物保护作用和控释特性，②非注射剂型，如呼吸道吸入直肠给药、鼻腔、口服和透皮给药等。研究和开发新剂型也是解决生物技术药物生物利用度、稳定性等诸多问题的重要途径。 三、生物技术药物的结构特点与理化性质 为了研究生物技术药物制剂或新的给药系统，必须了解其主要组成部分——蛋白多肽类药物的结构与性能。 （一）蛋白多肽类药物的结构特点 氨基酸是组成蛋白质的基本单元。根据电荷不同分为正电性与负电性氨基酸。 蛋白质结构中的化学键包括共价键与非共价键，前者包括肽键（一个氨基酸的氨基与另一氨基酸的羧基失水而成的酰胺键）和二硫键（二个半胱氨酸的-SH脱氢而成的-S-S-键），后者则包括氢键、疏水键、离子键、范德华力和配位键等。蛋白质的结构分为四级。 一级结构（初级结构）是指多肽链中氨基酸的排列顺序，其维系键是肽键，蛋白质的一级结构决定其空间结构；二级结构为多肽链的折叠方式，包括（螺旋与（折叠结构等；三级结构是指螺旋或折叠的肽链的空间排列组合方式；每条多肽链都具备固有的三级结构，称为蛋白质的亚基，四级结构则是指二个以上的亚基通过非共价键连接而形成的空间排列组合方式。蛋白质的二、三、四级结构统称为高级结构，主要是由非共价键和二硫键来维持。 （二）蛋白多肽类药物的理化性质 蛋白质大分子是一种两性电解质，在水中表现出亲水胶体的性质，还具有旋光性和紫外吸收等。蛋白多肽药物结构复杂，特别是保证其生物活性的高级结构主要是由弱相互作用来维持的，因此了解蛋白质的
药物非临床药代动力学研究技术指导原则
附件5 药物非临床药代动力学研究技术指导原则 一、概述 非临床药代动力学研究是通过体外和动物体内的研究方法，揭示药物在体内的动态变化规律，获得药物的基本药代动力学参数，阐明药物的吸收、分布、代谢和排泄（Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion, 简称ADME）的过程和特征。 非临床药代动力学研究在新药研究开发的评价过程中起着重要 作用。在药物制剂学研究中，非临床药代动力学研究结果是评价药物制剂特性和质量的重要依据。在药效学和毒理学评价中，药代动力学特征可进一步深入阐明药物作用机制，同时也是药效和毒理研究动物选择的依据之一；药物或活性代谢产物浓度数据及其相关药代动力学参数是产生、决定或阐明药效或毒性大小的基础，可提供药物对靶器官效应（药效或毒性）的依据。在临床试验中，非临床药代动力学研究结果能为设计和优化临床试验给药方案提供有关参考信息。 本指导原则是供中药、天然药物和化学药物新药的非临床药代动力学研究的参考。研究者可根据不同药物的特点，参考本指导原则，科学合理地进行试验设计，并对试验结果进行综合评价。 本指导原则的主要内容包括进行药物非临床药代动力学研究的 基本原则、试验设计的总体要求、生物样品的测定方法、研究项目（血
药浓度-时间曲线、吸收、分布、排泄、血浆蛋白结合、生物转化、对药物代谢酶活性及转运体的影响）、数据处理与分析、结果与评价等，并对研究中其他一些需要关注的问题进行了分析。附录中描述了生物样品分析和放射性同位素标记技术的相关方法和要求，供研究者参考。 二、基本原则 进行非临床药代动力学研究，要遵循以下基本原则： （一）试验目的明确； （二）试验设计合理； （三）分析方法可靠； （四）所得参数全面，满足评价要求； （五）对试验结果进行综合分析与评价； （六）具体问题具体分析。 三、试验设计 （一）总体要求 1. 受试物 中药、天然药物：受试物应采用能充分代表临床试验拟用样品和/或上市样品质量和安全性的样品。应采用工艺路线及关键工艺参数确定后的工艺制备，一般应为中试或中试以上规模的样品，否则应有充分的理由。应注明受试物的名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件、有效期及配制方法等，并提供质量检验报告。由于中药的特殊性，建议现用现配，否则应提供数据支持配制后受试物的质量稳定性及均匀性。当给药时间较
生物技术药物制剂
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第十八章生物技术药物制剂 第一节概述 一、生物技术的基本概念 1、生物技术或称生物工程（biotechnology），是应用生物体（包括微生物、动物细胞， 植物细胞）或其组成部分（细胞器和酶），在最适条件下，生产有价值的产物或进行有益过程的技术。 2、现代生物技术主要包括基因工程、细胞工程与酶工程、发酵工程（微生物工程）与生 化工程。 二、生物技术药物的结构特点与理化性质 （一）蛋白质的结构特点 蛋白质的组成和一般结构（一、二、三、四级结构） （二）蛋白质的理化性质 1．蛋白质的一般理化性质：旋光性、紫外吸收、蛋白质两性本质与电学性质 （1）旋光性：蛋白质分子总体旋光性由构成氨基酸各个旋光度的总和决定，通常是右旋，它由螺旋结构引起。蛋白质变性，螺旋结构松开，则其左旋性增大。 （2）紫外吸收：大部分蛋白质均含有带苯核的苯丙氨酸、酪氨酸与色氨酸，苯核在紫外280nm有最大吸收。氨基酸在紫外230nm显示强吸收。 （3）蛋白质两性本质与电学性质：蛋白质除了肽链N-末端有自由的氨基和C-末端有自由的羧基外，在氨基酸的侧链上还有很多解离基团，如赖氨酸的 -氨基，谷氨酸的γ羧基等。这些基团在一定 pH条件下都能发生解离而带电。因此蛋白质是两性电解质，在不同 pH条件下蛋白质会成为阳离子、阴离子或二性离子。 2．蛋白质的不稳定性 （1）由于共价键引起的不稳定性：水解、氧化和消旋化，此外还有蛋白质的特有反应，即二硫键的断裂与交换 （2）由非共价键引起的不稳定性：聚集（aggregation）、宏观沉淀、表面吸附与蛋白质变性 （三）蛋白质类药物的评价方法： 多种分析方法：液相色谱法、光谱法、电泳、生物活性测定与免疫测定
生物碱类药物在医学领域的应用
生物碱类药物在医学领域的应用 (Application of alkaloid drugs in medicine) 王尚乾 河南工业大学化学化工学院化学工程与工艺1302 摘要生物碱为生物体内一类蛋白质、肽类、氨基酸及维生素B以外含氮化合物的总称，是结构复杂具有生理活性的植物碱。生物碱是科学家研究得最早的，具有生物活性的一类天然有机化合物，它们大多具有生物活性，往往是许多药用植物，包括许多中草药的有效成分。天然碱是天然有机化合物中最大一类化合物，各类生物碱的结构千差万别，变幻无穷，科学家在阐明化学结构的同时亦研究它们的结构与疗效的关系，同时进行结构的改造，寻找疗效更高，结构更简单并且可以大量生产的新型化合物。例如人们对吗咖的研究导致了镇痛药度冷丁的发现，对可卡因的研究发展导致了局部麻醉药普鲁卡因的产生，由此可见对生物碱的研究大大促进了天然有机化学与药物化学的发展。 关键词：生物碱类药物医学领域应用 前言 生物碱的理化性质：生物碱具有具有环状结构，难溶于水，与酸可以生成盐，具有一定的旋光性和吸收光谱，大多数有苦味。呈无色结晶状，少数为液体。生物碱有几千种，由不同的氨基酸和其衍生物合成而来，是次级代谢产物之一，对生物体有毒性或强烈的生理作用。生物碱有多种生物活性，在植物体内有良好的分布和较强的输导能力，是高效、低毒、无污染、对人畜安全的天然产物在医药和农药领域有
着广泛的的应用前景。 1生物碱的分类 1.1有机胺类生物碱 在植物体内来源于苯丙氨酸和酪氨酸代谢的衍生物，但其化学结构的特点是氮原子不在环内的生物碱。主要有麻黄碱类、秋水仙碱、益母草碱。例如L—麻黄碱它是毒品之一，具有兴奋中枢神经、升高血压、扩大支气管作用、可治哮喘病，有镇痛和抗菌的。秋水仙碱对急性痛风性关节炎有选择性消炎作用。益母草碱是唇型科益母草属植物中含有的生物碱，具有活血化瘀、利水消肿的作用，是中医妇科良药。 1.2吡咯烷衍生物类生物碱 由吡咯及四氢吡咯衍生物的生物碱，包括简单吡咯烷类和双稠吡咯烷类。最简单的生物碱如古豆碱，是从古柯叶中分出的液体生物碱，沸点195℃。从一叶萩的叶与根中分离出的一叶秋碱，有兴奋中枢神经作用，临床可用于治疗脊髓灰白质炎及某些植物神经系统紊乱所引起的头晕的病症。 1.3吡啶衍生物类生物碱 由吡啶衍生出的生物碱，该类生物碱源于植物体内赖氨酸衍生物。代表性化合物有苦参碱、金雀花奥豆碱、羽扇豆碱、烟碱和石松碱。槐属植物羽扇豆类植物碱具有抗癌、抗微生物、抗溃疡、升高白细胞等多方面的药理作用。苦参碱和氧化苦碱具有抗炎、镇痛、抗癌、抗心律失常等药理作用。
国家标准化学药品研究技术指导原则
已有国家标准化学药品研究技术指导原则（第二稿草稿） 二OO 五年三月 1 目录 一、前言 (2) 二、已有国家标准药品研究的基本原则 (2) （一）安全、有效和质量可控原则 (2) （二）等同性原则 (3) （三）仿品种而不是仿标准原则 (5) 三、质量控制研究 (7) （一）制备工艺研究 (8) （二）结构确证研究 (9) （三）制剂处方筛选及工艺研究 (10) （四）质量研究与质量标准 (13) （五）稳定性研究 (18) 四、安全性、有效性研究 (20) （一）口服给药制剂 (22) （二）注射给药制剂 (25) （三）局部给药制剂 (27)
五、参考文献 (29) 六、已有国家标准化学药品研究技术指导原则起草说明 (30) 七、著者 (35) 2 一、前言 根据《药品注册管理办法》（试行），已有国家标准药品的申请是指境内注册申请人提出的生产国家食品药品监督管理局已经颁布正式标准的药品的注册申请。 我国已经颁布的化学药物研究技术指导原则，涵盖了已有国家标准药品研究的一般性技术要求。本指导原则在此基础上，结合我国已有国 家标准药品研制的现状，针对其不同于新药的特点，较为系统地提出了 已有国家标准药品研究过程中有关安全性、有效性和质量控制研究的一 般性原则，并重点阐述了在已有国家标准药品研制中相关技术要求之间 的内在联系及其科学内涵，旨在指导注册申请人在研制已有国家标准药 品时，能够科学、合理地运用已有的化学药物研究技术指导原则，达到 研究的系统性、科学性要求。
本指导原则适用于已有国家标准药品申请中的化学药品。在已有国家标准药品研发和评价中，需要在本原则指导下，以科学性为根本，对 具体问题作具体分析。 二、已有国家标准药品研究的基本原则 在已有国家标准药品的研究中应注意遵循如下原则，以保证研究的科学性。 （一）安全、有效和质量可控原则 无论创新药还是已有国家标准药品，对其安全性、有效性和质量可3 控性的要求是一致的，研发的根本原则都是要围绕安全、有效和质量可 控进行充分的研究。而已有国家标准药品的研究有别于创新药之处在于， 可以利用已上市产品的可获得资料，因此有可能减少相应部分的研究工 作。 如果研制的已有国家标准药品与已上市产品的药学基础相同，即原料药的合成路线、工艺条件以及所用原材料、试剂和溶剂的来源、规格 等均一致；制剂的处方工艺相同，包括其中所用原料药、辅料的来源、规格等一致；并经验证研制产品与已上市产品质量一致、生物等效，
药物生殖毒性研究技术指导原则
【 Z H 】 G P T 1 - 1 指导原则编号： 药物生殖毒性研究技术指导原则 (第二稿) 二○○六年一月 目录 一、概述 (3) 二、基本原则 (3) （一）实验管理 (3) （二）具体问题具体分析 (4) （三）随机、对照、重复 (4) 三、基本内容 (4) （一）总体考虑 (4) 1、受试物 (4) 2、受试物药代动力学研究 (5) 3、试验系统 (5) 3.1 试验动物 (5) 3.2 其他试验系统 (6) 4、给药 (6) 4.1 剂量选择 (6) 4.2 给药途径 (7) 4.3 给药频率 (7) 4.4对照组 (7)
（二）试验方案 (7) 1、试验方案选择的一般考虑 (7) 2、常用的试验方案 (8) 2.1生育力与早期胚胎发育毒性试验（I段） (8) 2.1.1试验目的 (8) 2.1.2动物选择 (9) 2.1.3 给药期 (9) 2.1.4 动物处理 (9) 2.1.5 观察指标 (9) 2.2胚胎-胎仔发育毒性试验（II段） (10) 2.2.1试验目的 (10) 2.2.2动物选择 (10) 2.2.3 给药期 (10) 2.2.4 动物处理 (11) 2.2.5 观察指标 (11) 2.3 围产期毒性试验（III段） (12) 2.3.1试验目的 (12) 2.3.2动物选择 (12) 2.3.3 给药期 (12) 2.3.4 动物处理 (12) 2.3.5 观察指标 (12) 3、其他试验方案 (13) 3.1 单一（全程）试验设计（啮齿类动物） (14) 3.2 两段试验设计（啮齿类动物） (14) （三）毒代动力学 (14) 四、结果分析与评价 (15) （一）统计分析 (15) （二）数据报告 (16) （三）结果分析 (16) 1、生殖毒性 (16) 2、发育毒性 (17) 3、其他 (17)
化学药物非临床药代动力学研究技术指导原则
指导原则编号： 【H】G P T 5-1 化学药物非临床药代动力学研究 技术指导原则 二○○五年三月
目 录 一、概述 (1) 二、基本原则 (2) 三、试验设计 (2) （一）总体要求 (2) （二）生物样本的药物测定方法 (3) （三）研究项目 (4) 四、数据处理与分析 (9) 五、结果与评价 (9) 六、常见问题与处理思路 (10) 七、参考文献 (13) 八、附录（生物样品的分析方法） (15) 九、著者 (21)
化学药物非临床药代动力学研究技术指导原则 一、概述 非临床药代动力学研究是通过动物体内、外和人体外的研究方法，揭示药物在体内的动态变化规律，获得药物的基本药代动力学参数，阐明药物的吸收、分布、代谢和排泄的过程和特点。 非临床药代动力学研究在新药研究开发的评价过程中起着重要作用。在药效学和毒理学评价中，药物或活性代谢物浓度数据及其相关药代动力学参数是产生、决定或阐明药效或毒性大小的基础，可提供药物对靶器官效应（药效或毒性）的依据；在药物制剂学研究中，非临床药代动力学研究结果是评价药物制剂特性和质量的重要依据；在临床研究中，非临床药代动力学研究结果能为设计和优化临床研究给药方案提供有关参考信息。 本指导原则是供药物研究开发机构进行化学药品新药的非临床药代动力学研究的参考，而不是新药申报的条框要求。研究者可根据不同药物的特点，参考本指导原则，科学合理地进行试验设计，并对试验结果进行综合评价。 本指导原则的主要内容包括进行非临床药代动力学研究的基本原则、试验设计的总体要求、生物样品的药物分析方法、研究项目（血药浓度-时间曲线、吸收、分布、排泄、血浆蛋白结合、生物转化、对药物代谢酶活性的影响）、数据处理与分析、结果与评价等，并对研究中的一些常见问题及处理思路进行了分析。
生物的技术药物制剂
新疆医科大学教案首页编号：_1－33_
第十八章生物技术药物制剂 第一节概述 一、生物技术的基本概念 1、生物技术或称生物工程（biotechnology），是应用生物体（包括微生物、动物细胞， 植物细胞）或其组成部分（细胞器和酶），在最适条件下，生产有价值的产物或进行有益过程的技术。 2、现代生物技术主要包括基因工程、细胞工程与酶工程、发酵工程（微生物工程）与生 化工程。 二、生物技术药物的结构特点与理化性质 （一）蛋白质的结构特点 蛋白质的组成和一般结构（一、二、三、四级结构） （二）蛋白质的理化性质 1．蛋白质的一般理化性质：旋光性、紫外吸收、蛋白质两性本质与电学性质 （1）旋光性：蛋白质分子总体旋光性由构成氨基酸各个旋光度的总和决定，通常是右旋，它由螺旋结构引起。蛋白质变性，螺旋结构松开，则其左旋性增大。 （2）紫外吸收：大部分蛋白质均含有带苯核的苯丙氨酸、酪氨酸与色氨酸，苯核在紫外280nm有最大吸收。氨基酸在紫外230nm显示强吸收。 （3）蛋白质两性本质与电学性质：蛋白质除了肽链N-末端有自由的氨基和C-末端有自由的羧基外，在氨基酸的侧链上还有很多解离基团，如赖氨酸的 -氨基，谷氨酸的γ羧基等。这些基团在一定pH条件下都能发生解离而带电。因此蛋白质是两性电解质，在不同
pH条件下蛋白质会成为阳离子、阴离子或二性离子。 2．蛋白质的不稳定性 （1）由于共价键引起的不稳定性：水解、氧化和消旋化，此外还有蛋白质的特有反应，即二硫键的断裂与交换 （2）由非共价键引起的不稳定性：聚集（aggregation）、宏观沉淀、表面吸附与蛋白质变性 （三）蛋白质类药物的评价方法： 多种分析方法：液相色谱法、光谱法、电泳、生物活性测定与免疫测定 第二节蛋白质类药物制剂的处方与工艺（注射剂型） 一、蛋白质类药物的一般处方组成：一类为溶液型注射剂，另一类是冻干粉注射剂 二、液体剂型中蛋白质类药物的稳定化：①改造其结构；②加入适宜辅料 蛋白类药物的稳定剂：缓冲液、表面活性剂、糖和多元醇、盐类、聚乙二醇类、大分子化合物、组氨酸、甘氨酸、谷氨酸和赖氨酸的盐酸盐等、金属离子 1．缓冲液因为蛋白质的物理化学稳定性与pH值有关，通常蛋白质的稳定pH值范围很窄，应采用适当的缓冲系统，以提高蛋白质在溶液中的稳定性。例如红细胞生成素采用枸橼酸钠-枸橼酸缓冲剂，而α-N3干扰素则用磷酸盐缓冲系统，人生长激素在5mmol／L 的磷酸盐缓冲液可减少聚集。缓冲盐类除了影响蛋白质的稳定性外，其浓度对蛋白质的溶解度与聚集均有很大影响。组织溶纤酶原激活素在最稳定的pH条件下，药物的溶解度不足以产生治疗效果，因此加入带正电荷的精氨酸以增加蛋白质在所需pH值下的溶解度。 2．表面活性剂由于离子型表面活性剂会引起蛋白质的变性，所以在蛋白质药物，
化学药品补充申请研究技术指导原则
指导原则编号： 【H】 已上市化学药品变更研究的技术指导原则 二OO五年十一月
目录 一、概述 (2) 二、已上市化学药品变更研究工作的基本原则 (3) 三、变更原料药生产工艺 (7) 四、变更药品处方中已有药用要求的辅料 (15) 五、变更药品生产工艺 (23) 六、变更药品规格和包装规格 (31) 七、变更原料药及药品注册标准 (36) 八、变更药品有效期和／或贮藏条件 (40) 九、变更药品的包装材料和容器 (43) 十、变更进口药品的产地 (49) 十一、变更进口药品生产所用原料药的产地以及变更单独 进口的原料药的产地 (53) 附录一、药物溶出/释放比较研究基本方法 (58) 附录二、免除人体生物等效性研究的一般考虑 (67) 附录三、属于治疗窗窄的部分药物目录 (70) 参考文献 (72) 名词解释 (75) 著者 (76)
一、概述 本指导原则主要用于指导药品生产证书或进口证书持证人（以下简称持证人），开展已上市化学药品的有关变更研究。变更是指对已获准上市化学药品在生产、质控、使用条件等诸多方面提出的涉及来源、方法、控制条件等方面的变化。这些变化可能影响到药品的质量控制以及安全性和有效性。变更研究是针对拟进行的变化所开展的研究验证工作。 目前本指导原则涵盖的变更及变更研究包括以下项目：原料药生产工艺变更、药品处方和制备工艺变更、注册标准变更、规格变更、有效期和贮藏条件变更、药品的包装材料和容器变更、进口药品产地变更、进口原料药产地和进口药品生产所用原料药产地变更等研究。 本指导原则仅从技术角度阐述当持证人拟考虑对产品进行变更，并拟向管理当局提出相应的变更申请时，应考虑或组织进行的相关研究验证工作。在完成相关工作后，申办人向各级药品监管部门提出的补充申请，应根据《药品注册管理办法》中的有关要求进行。 为便于把握变更可能对产品质量、安全性、有效性产生的影响，本指导原则对所述及的变更划分为三类：I类变更属于微小变更，对产品品质基本不产生影响；II类变更属于中度变更，需要通过相应的研究工作证明变更对产品品质不产生影响；III类变更属于较大变更，需要通过系列的研究工作证明变更对产品的品质没有产生负面影响。类别划分是根据目前药品注册管理对补充申请的有关要求，并参考了国外的有关文献而确立的，目的是为了帮助持证人有效地开展变更研
化学药物制剂研究技术指导原则
二○○四年十一月
目录 一、概述 (1) 二、制剂研究的基本内容 (1) 三、剂型的选择 (3) 四、处方研究 (4) 五、制剂工艺研究 (9) 六、药品包装材料（容器）的选择 (12) 七、质量研究和稳定性研究 (13) 八、附录 (13) 九、参考文献 (15) 十、著者 (16) 化学药物制剂研究基本技术指导原则起草说明 (17)
化学药物制剂研究基本技术指导原则 一、概述 药物必须制成适宜的剂型才能用于临床。制剂研发的目的就是要保证药物的安全、有效、稳定、使用方便。如果剂型选择不当，处方、工艺设计不合理，对产品质量会产生一定的影响，甚至影响到产品的药效及安全性。因此，制剂研究在药物研发中占有十分重要的地位。 本指导原则是根据国内药物研发实际状况，在参考国内外有关制剂研究的技术指导原则的基础上，考虑到目前制剂研究中容易被忽视的关键问题进行制订的。 由于药物剂型及生产工艺众多，且各种新剂型和新工艺也在不断出现，制剂研究中具体情况差异很大。本指导原则主要阐述制剂研究的基本思路和方法，为制剂研究提供基本的技术指导和帮助。关于各种剂型研究的详细技术要求，不在本指导原则中详述，药品申请人可参照本指导原则阐述的制剂研究的基本思路开展相应的研究工作。 二、制剂研究的基本内容 药物剂型种类很多，制剂工艺也各有特点，研究中会面临许多具体情况和特殊问题。但制剂研究的总体目标是一致的，即通过一系列研究工作，保证剂型选择的依据充分，处方合理，工艺稳定，生产过程能得到有效控制，适合工业化生产。制剂研究的基本内容一般包括以下方面： （一）剂型的选择 药品申请人通过对原料药理化性质及生物学性质的考察，根据临床治疗和
生物碱类药物的分析
生物碱类药物的分析 一、最佳选择题 1. 非水溶液滴定法测定硫酸奎宁原料药的含量，1摩尔硫酸奎宁可消耗高氯酸的摩尔数为 A.1 B.2 C.3 D.4 E.5 答案：C [解答] 本题考查重点是对生物碱盐用高氯酸滴定液滴定时两者反应分子关系的掌握。 2. 硫酸阿托品中莨菪碱的检查是利用了两者 A.旋光性质的差异 B.溶解度差异 C.酸碱性的差异 D.紫外吸收光谱差异 E.吸附性差异 答案：A [解答] 本题考查重点是药物为外消旋体时，即使有不对称碳原子，也无旋光性。阿托品为莨菪碱的外消旋体，故无旋光性。利用阿托品中引入的莨菪碱具有旋光性的特点，采用旋光度法检查。 3. 具有苯烃胺结构的药物 A.麻黄碱 B.奎宁 C.阿托品 D.可待因 E.吗啡
[解答] 本题考查重点是对生物碱药物结构特点的掌握。麻黄碱具有苯烃胺结构；阿托品属于托烷类生物碱；吗啡和可待因属于异喹啉类生物碱；奎宁为喹啉的衍生物。 4. 硫酸奎宁中其他金鸡纳碱检查采用的方法是 A.PC B.GC C.HPLC D.TLC E.UV 答案：D 5. 能发生绿奎宁反应的药物是 A.盐酸吗啡 B.硫酸李宁 C.盐酸麻黄碱 D.磷酸可待因 E.硫酸阿托品 答案：B [解答] 本题考查重点是对硫酸奎宁的专属鉴别反应的掌握。硫酸奎宁在微酸性水溶液中与溴试液作用生成醌式结构，再与氨试液作用生成翠绿色化合物。该反应为硫酸奎宁的专属鉴别反应。 6. 盐酸吗啡中检查的特殊杂质有 A.阿扑吗啡和罂粟酸 B.阿扑吗啡 C.阿扑吗啡、莨菪碱和其他生物碱 D.阿扑吗啡、罂粟酸和有关物质 E.阿扑吗啡和其他生物碱
[解答] 本题考查重点是对盐酸吗啡特殊杂质检查项目的掌握。特殊杂质的来源与特定药物的生产和贮藏过程有关。 7. 硫酸阿托品注射液含量测定的《中国药典》方法是 A.紫外分光光度法 B.有机溶剂提取后采用紫外分光光度法 C.可见分光光度法 D.双波长法 E.高效液相色谱法 答案：C [解答] 本题考查重点是对硫酸阿托品注射液含量测定方法的掌握。硫酸阿托品属于生物碱类药物，在一定的pH条件下，生物碱类药物与氢离子结合成为生物碱的阳离子，酸性染料解离成为染料阴离子，阴阳离子定量地结合形成有色的离子对，可以定量地用三氯甲烷提取离子对，用比色法测定提取液的吸光度，即可计算出生物碱的含量 8. 取供试品约0.5g，精密称定，加冰醋酸与醋酐各10ml，加结晶紫指示液1～2滴，用高氯酸滴定液 (0.1moL/L)滴定。用此方法测定含量的药物是 A.磺胺嘧啶 B.硫酸阿托品 C.盐酸麻黄碱 D.丙酸睾酮 E.阿司匹林 答案：B 9. 供试品与硝酸共热，得黄色产物，放冷后加醇制氢氧化钾少许，即显深紫色。此反应可鉴别的药物是 A.盐酸麻黄碱
第八篇 生物碱类药物分析
第八章生物碱类药物的分析 Pharmaceutical Analysis of alkaloids 一、概述 （一）定义：生物碱是一类存在于生物体内的含氮有机化合物。（二）分类 1.芳烃胺类 硫酸苯丙胺，精神振奋药pK b= 9.9 盐酸麻黄碱，肾上腺受体激动药pK b= 9.6 2.异喹啉类 盐酸吗啡，镇痛药pK b1= 8.0，pK b2= 9.9 磷酸可待因，镇痛镇咳药；盐酸黄连素，抗菌药；度冷丁等3.喹啉类 硫酸奎宁，抗疟药；异构体硫酸喹尼丁，抗心率失常药； pK b1= 5.07，pK b2= 9.7 4.托烷类 硫酸阿托品，抗胆碱药pK b= 9.9 氢溴酸东莨菪碱，抗胆碱药pK b= 7.6； 5.黄嘌呤类 咖啡因，pK b= 14.15（碱性极弱）； 茶碱，平滑肌松弛药，含活泼氢酸性； 6.吲哚类 硝酸士的宁，中枢神经兴奋药pK b1= 6.0，pK b2= 11.7（酰胺） 硫酸长春新碱，抗肿瘤药；利血平，抗高血压药； 7.其他类 硝酸毛果芸香碱，缩瞳药。 由上可知，生物碱类药物有如下特点。 （三）特点 1.数量多，绝大多数存在于植物体内； 已发现3000多种，100多种有效，中成药中富含生物碱。 2.生理活性强，但大都有毒性
因此，质量控制和临床应用尤应慎重，许多为特殊管制药物，并已超出药物分析的范畴，体育运动中的兴奋剂问题，世界关注的毒品问题，许多是生物碱类成分。该类药物的质量应严格控制，以保证用药的安全和有效。 我们药物分析学所关注的是其结构特征和利用这些特征，建立相应的鉴别、检查和含量测定。 （四）结构特征和分析方法间的关系 1.碱性：N原子的存在，强弱从N上的取代基是供电子还是吸电子基团，空间位阻两方面考虑。 1）一般情况：季铵>仲铵>伯铵>叔铵>NH3>环酰铵 2）脂肪铵>脂环铵>芳铵 3）个别两性化合物如吗啡有酸性（酚羟基），茶碱只有酸性（活泼氢） 2.存在状态多数以盐的形式存在 1）植物中多与有机酸成盐如吗啡罂粟酸盐，鞣酸奎宁盐； 2）药用多为多为无机酸盐如盐酸、硫酸、磷酸和硝酸盐。 含量测定应考虑上述2个因素，碱性强弱选择滴定溶液和指示剂，成盐的情况在非水滴定时要考虑对滴定的干扰。 3.溶解性 1）共性：游离生物碱易溶于CHCl3等中等极性有机溶剂，难或不溶于水，溶于稀酸溶液；成盐易溶于水； 2）个性：两性和酸性化合物易溶于稀碱溶液（吗啡和茶碱）；麻黄碱和咖啡因能溶于水；咖啡因和利血平碱性极弱，不能与酸结合成稳定的盐。 溶解性可以用于提取分离和鉴别时的重要依据。 4.光谱特点 1）旋光性多含不对称碳原子，故有旋光性，药效学研究表明许多手性药物一般效用不同，或药效有强弱、或效价低、或无效，甚至有毒副作用。如今手性合成和分离是药学研究的热点和难点之一； 2）紫外吸收多含不饱和双键。 5.与生物碱沉淀试剂和显色试剂反应 上述是生物碱类药物的一般共性。 6.取代基的性质（个性）
已上市化学药品工艺变更研究技术指导原则(征求意见稿)
已上市化学药品工艺变更研究技术指导原则(征求意见稿)
已上市化学药品生产工艺变更研究 技术指导原则 （征求意见稿） 2017年1月
目录 一、概述 ....................................................................................................... - 2 - 二、已上市化学药品生产工艺变更研究工作的基本原则....................... - 3 - （一）药品生产企业是生产工艺变更研究和研究结果自我评估的主体................................. - 3 -（二）全面、综合评估生产工艺变更对药品安全性、有效性和质量可控性的影响............. - 4 -（三）研究用样品的选择原则..................... - 6 -（四）关联变更的研究原则......................... - 6 -三、变更原料药生产工艺 ........................................................................... - 7 - （一）总体考虑 ............................................ - 8 -（二）变更分类 .......................................... - 12 -四、变更药品制剂生产工艺..................................................................... - 15 - （一）总体考虑 .......................................... - 15 -（二）处方变更分类 .................................. - 17 -（三）工艺变更分类 .................................. - 26 -五、原料药生产工艺变更研究及信息要求............................................. - 30 - （一）品种概述 .......................................... - 31 -（二）立题合理性 ...................................... - 31 -（三）变更内容及变更理由....................... - 31 -（四）变更研究 .......................................... - 33 -
《中药新药质量研究技术指导原则(征求意见稿)》起草说明
中药新药质量研究技术指导原则（征求意见稿） 起草说明 一、起草背景 质量研究是中药新药研究的重要内容，对生产过程控制、确定药品关键质量属性、建立质量标准和保障药品质量稳定可控具有重要意义。目前，我国尚未有专门的中药新药质量研究技术指导原则，为进一步规范和指导中药新药质量研究，满足药品安全、有效、质量可控的要求，促进中药产业高质量发展，国家药品监督管理局药品审评中心（以下简称CDE）组织研究制定了《中药新药质量研究技术指导原则（征求意见稿）》（以下简称指导原则）。 二、起草过程 2018年5月，CDE启动了本指导原则制定工作，成立了指导原则起草专家组。随后召开了专家参加的指导原则启动会，确定了指导原则的框架和基本要求。会后由专家起草了指导原则初稿。
2018年11月，召开了第一次指导原则专家讨论会，对指导原则初稿进行了充分地讨论和修订，会后形成了指导原则修订稿。通过广泛征求企业、研发单位等业界专家意见，经多次讨论修改，形成了本指导原则的征求意见稿。 三、主要起草思路 本指导原则是在中医药理论指导下，以保证药品安全、有效、质量可控为目标，指导研究者通过对药材/饮片、关键中间体和制剂及全过程的质量研究，构建符合中药特点的质量控制体系，保证中药新药质量稳定可控。 四、需要说明的问题 （一）药品质量研究的主体责任意识 本指导原则旨在为中药质量研究提供参考，药品上市许可持有人或生产企业对药品的质量负有主体责任，应加强中药生产全过程的质量研究和质量控制。 （二）坚持传承与创新 中药新药在进行质量研究时应尊重传统中医药理论与实践，创新研究思路和方法，重视基于传统经验的质量识别方法的应用和传承。鼓励采用新技术、新方法开展中药新药