碱性成纤维细胞生长因子的研究进展

?综 述?

碱性成纤维细胞生长因子的研究进展

伊海英　孙晓艳　付小兵　任明姬　张广田

【关键词】　成纤维细胞生长因子2;受体;成纤维细胞生长因子【中国图书资料分类号】　R349151

碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor ,

bFGF )是成纤维细胞生长因子蛋白(fibroblast growth factors ,

FGFs )家族中的一员。目前已发现至少22种FGF ,其中FGF 21(aFGF )、FGF 22(bFGF )及FGF 27的研究较为深入。bFGF 是哺

乳动物和人体中一种非常微量的活性物质,因其具有广泛的生理功能和重要的临床应用价值而被国内外学者高度重视。bF 2

GF 不仅能刺激新生血管形成,参与创伤愈合和组织再生,促进

胚胎组织发育和分化等,此外还与肿瘤的发生发展密切相关。近年来,重组bFGF 已被应用于临床治疗创伤、溃疡及神经系统等疾病。

1　bFG F 的发现及其体内分布

1974年,G ospodarowicz 等[1]

从牛脑垂体中分离纯化一种对

成纤维细胞系Balb/c3T3的分裂增殖具有促进效应的多肽,命

名为成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor ,FGF ),其等电点为916,后来发现脑组织中尚有另外一种与其同源性较强、功能相似但等电点为516的FGF ,故将前者命名为碱性成纤维细胞生长因子(bFGF ),后者命名为酸性成纤维细胞生长因子(a 2

cidic fibroblast growth factor ,aFGF )。

bFGF 在体内分布极为广泛,在垂体、下丘脑、视网膜、肾上

腺、胸腺、黄体、肾、心、肝、胎盘及多种肿瘤组织中均有分布。现已证实所有的器官、肿瘤和体外培养的细胞中都能检测到bFGF 的表达。其中以垂体含量最高(015mg/kg ),而其他组织的含量较低,约为垂体中的1/10～1/50,而在血清和体液中浓度极低。

bFGF 具有能促进多种来自中胚层和神经外胚层的细胞生长、增

殖和分化的生物学活性,可能是其分布广泛的重要原因[2]

。

2　bFG F 的种类及生物结构

bFGF 是一种碱性多肽,等电点916～918,其基因具有高度

保守性,人、鼠、牛的bFGF cDNA 序列已分析清楚,均为单拷贝基因,核苷酸序列高度同源。人源性bFGF 基因定位于染色体

4q27

[3]

,长度为34～38kb ,有2个内含子及3个外显子,其转录产

物RNA 有多个拼切位点,由此产生多种分子量的bFGF 。目前已经发现5种形式的bFGF ,其分子量分别为18、22、2215、24和

34kD 。18kD 的bFGF 含有146个氨基酸,从bFGF 编码序列上

游AU G 密码子起始翻译,定位于细胞质内,能够促进细胞迁移、分裂和增殖。而由CU G 密码子起始翻译形成的22、2215、24和

34kD 的bFGF 则定位于细胞核,可能与细胞生长和凋亡有关。分泌到胞外的主要是18kD 的bFGF ,是其活性的主要形式,也是现今研究最多的bFGF [4]。

与其他生长因子不同,bFGF 缺少典型的信号肽序列,不能通过经典的高尔基2内质网途径分泌到胞外,却能以自分泌或者

旁分泌的形式出现在胞外,迄今仍没有明确的解释。

3　bFG F 受体的种类及其结构

bFGF 受体可分为高亲和力和低亲和力受体两种,高亲和力

受体即成纤维细胞生长因子跨膜受体(fibroblast growth factor

receptors ,FGFRs ),低亲和力受体即硫酸肝素蛋白多糖(Heparan

sulfate proteoglycans ,HSPG )。bFGF 发挥其生物学效应主要通

过细胞膜上的FGFR ,但要依赖于HSPG 的作用[4]。

FGFRs 是一类穿膜的酪氨酸激酶受体,介导FGF 信号传递

入细胞中,其基本结构包括胞外区、跨膜区和酪氨酸激酶区[5]。目前发现脊椎动物的FGFRs 共有4种,分别为FGFR 21、FGFR 2

2、FGFR 2

3、FGFR 24。其中FGFR 21和FGFR 22对bFGF 有较高

的高亲和力。FGFRs 的胞外部分含有3个免疫球蛋白样结构域和1个肝素结合结构域,在第1和第2个免疫球蛋白样结构域之间是一段由酸性氨基酸组成的序列,是FGFRs 统一的保守结构,这一保守结构与FGFRs 的功能有着重要关系,而第3个免疫球蛋白样结构域决定着其配体的特异性。FGFRs 的胞内部分含有一段较长的近膜区和一个分离的酪氨酸激酶结构域。各种

FGFRs 的C 末端序列稍有不同,被认为是与胞内各种激酶发生

特异性作用的部位[6]。

HSPG 是一组蛋白聚糖,广泛存在于细胞外基质和细胞表

面。细胞基质中的HSPG 与bFGF 结合形成复合物,保护其免受热、p H 值变化等各种因素所导致的蛋白变性和降解;同时由于HSPG 能够与bFGF 快速、可逆地结合,故可形成活性bFGF 的储存池。细胞膜上的HSPG 以穿膜蛋白或与细胞膜紧密结合的形式存在,能够促进bFGF 与FGFR 的结合[7]。

此外,近年来研究发现,FGFRs 的分布具有组织/细胞特异性,这与它们在胚胎形成过程中分别发挥不同的作用有关,且其在特异组织/细胞中的分布缺陷可导致某些先天性疾病[8]。

FGFR 21分布于中胚层起源的组织,主要在中胚层形成早期和神

经外胚层形成过程中的细胞迁移方面起作用,参与早期器官发生时的细胞分化;FGFR 22分布于内胚层起源的组织,主要在器官形成晚期表达而发挥作用;FGFR 23主要分布于神经组织,主要参与中枢神经系统少突胶质细胞和星形胶质细胞的分化,同时也参与骨组织的形成;FGFR 24分布于肌肉、肝、胆、肺和肾等组织,主要在内胚层形成的终末阶段和胚胎肌节中高表达。

4　bFG F 相关的信号转导途径

研究表明,bFGF 诱导的信号途径是正常细胞分化所必需

【作者单位】　100037　北京　解放军总医院第一附属医院全军创伤修复重点实验室(伊海英、孙晓艳、付小兵);内蒙古医学院组织胚胎学教研

室(伊海英、任明姬、张广田)

【通讯作者】　付小兵,E 2mail :fuxb @cgw 1net 1cn

【基金项目】　国家重点基础研究规划项目(2005C B522603)

的[9],参与血管新生、胚胎发育、骨骼形成和伤口愈合等生理过程。该途径具体为:bFGF通过HSPG结合到FGFR上,导致FGFR的酪氨酸激酶活性增强,进而与具有Src原癌基因家族同源区(SH2)的蛋白结合,并使自身的酪氨酸残基发生磷酸化,分别激活不同的信号转导途径[10]。

bFGF/FGFR激活的信号转导途径主要包括以下几种:①蛋白激酶C(protein kinase C,PK C)途径。FGFR被激活后,可通过不断地与磷脂酶C(phospolipase C,PLC)分子上的SH2结构域结合来快速吸纳该分子,激活的PLC可水解其底物4,5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)形成二酰基甘油(DAG)和三磷酸肌醇(IP3)两个二级信号。IP3通过与细胞内特异受体结合而刺激细胞内的钙池释放Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶。此外,Ca2+与DAG都能激活PK C家族中的成员。由PIP2水解产生的二级信号除了磷酸化和激活转录因子外,还可激活多种细胞内的反应[11]。②Ras/Raf/MEK/ERK路径[3]。该途径的最初激活是鸟嘌呤核苷酸交换因子S os被移至胞膜使其靠近小G蛋白Ras,促进鸟嘌呤核苷酸在Ras面上交换而使Ras成为Ras2GTP 形式。Ras一旦处于与GTP连接的激活状态,便与一些效应蛋白如IP3、Raf反应而激活细胞内的一些生理过程。被激活的Raf通过将促分裂原激活的蛋白激酶的激酶(MEK)活性环上的丝氨酸残基磷酸化而将其激活[12]。MEK再将促分裂原激活的蛋白激酶(ERK)激活,进而磷酸化许多与胞质和胞膜相连的底物,ERK还可被快速地转运入细胞核,参与去磷酸化和激活转录因子的过程。③蛋白酪氨酸激酶(Janus kinase,JA K)/信号转导子及转录激活子(signal transducer and activator of transcrip2 tion,ST AT)途径。FGF与FGFR结合后,FGFR的自身磷酸化使JA K活化。活化的JA K使受体磷酸化,再活化ST AT蛋白。ST AT蛋白能使C端保存的酪氨酸残基磷酸化。ST AT s被磷酸化后即脱离它所在的受体形成稳定的同源或异源二聚体并定位于细胞核,与γ干扰素激活部位(G AS)增强子家族成员结合并激活靶基因的转录[13]。④磷脂酰肌醇232激酶(phosphatidyl inositol232kinase,PI3K)途径。bFGF结合FGFR后,引起FGFR 的自身磷酸化,然后与PI3K通过调节亚基结合,使PI3K活化,进而导致其磷酸化肌醇磷脂产物增加。PI3K的磷酸化磷脂产物与蛋白激酶B(protein kinase B,PK B)的PH结构域结合,使PK B向质膜转位,发生变构,在PI3K依赖激酶Ⅰ的作用下,引起其苏氨酸残基和丝氨酸残基磷酸化,使PK B活化后脱离质膜进入胞质和胞核,引起细胞生存、代谢、骨架重组等重要的生物学事件[14]。

除了以上途径,bFGF/FGFR信号传导还有其他的一些途径,这些途径之间及其与别的一些生长因子的途径之间可以互相作用,从而形成复杂的网络调节机制。

5　bFG F的生物学活性

自1986年Abraham等[15]首次测出了bFGF的cDNA以来, bFGF基因的克隆和表达研究取得了重大进展,在不同的实验室构建了多种载体,均表达出有活性的bFGF,且在体内和体外均表现出广泛的生物学活性。实验证明,人工重组的bFGF和天然的bFGF有着同样的生物功能。最近几年随着生物工程技术的发展,已能大批量生产重组人bFGF,并在临床用于治疗某些疾病。

511　促血管生成作用　bFGF在体内和体外均能明显促进新生血管形成,可趋化血管内膜的各类细胞,并促进其增殖和迁移,是主要的血管生成因子。在对移植血管及损伤血管的再生作用研究中发现,手术创面早期分泌的bFGF是促进血管形成的重要因素之一[16]。最新研究发现,bFGF在体外能与其他生长因子联合诱导外周单个核细胞定向分化为血管内皮细胞[17]。

512　损伤修复作用　组织损伤后,局部bFGF表达增加,不仅可通过趋化作用使单核细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、成纤维细胞等向损伤部位聚集,而且能促进血管和肉芽组织的生成,促进软组织和骨组织中各种与损伤修复重建有关的细胞分裂增殖[18],对组织的损伤修复起至关重要的作用。动物实验已证实bFGF 具有明显的促进创伤修复和组织再生作用,例如神经组织再生、炎症、溃疡、某些组织移植术后的修复等[19220]。另外,在临床研究中也已证实,外源性bFGF可通过对细胞的调控有效促进伤口愈合,同时通过部分重建基底膜结构而减轻瘢痕的形成[21]。513　诱导胚胎发育　在体内,bFGF作为早期胚胎发育的营养因子,能诱导中胚层的形成,并可作用于来自中胚层的多种细胞,刺激其增殖和分化。体内研究和体外实验均表明bFGF对多种胚胎细胞具有促分裂作用,对卵裂早期的胚胎发育具有重要意义[5]。

514　bFGF与肿瘤的关系　bFGF与肿瘤的关系一直是人们研究的热点。bFGF由于具有促进多种细胞生长、繁殖以及促血管生成等作用,与肿瘤的发生、发展及预后密切相关[22]。许多研究表明,bFGF及FGFR能促进肿瘤的血管形成及生长,与肿瘤的分期、转移、预后及疗效密切相关[23]。

515　神经营养作用　bFGF广泛存在于中枢及外周神经系统中,对神经组织具有促进生长分化、维持存活的作用。有研究表明,bFGF还能通过多种途径保护神经组织免受一些化学损伤[24],并可促进受损神经元的修复和再生。bFGF广泛的神经营养活性日益引起重视,并已在治疗神经损伤、神经退行性病变、脑血管病和脑外伤引发的缺血性中枢神经损伤等临床领域得到应用。

【参考文献】

[1]G ospodarowicz D,Jones K L,Sato G1Purification of a growth factor

for ovarian cells from bovine pituitary glands1Proc Natl Acad Sci

USA,1974,71(6):2295

[2]白秉学,徐东刚,范明1碱性成纤维细胞生长因子的研究进展1国

外医学遗传学分册,2004,27(4):197

[3]Xu C,Rosler E,Jiang J,et al1Basic fibroblast growth factor sup2

ports undifferentiated human embryonic stem cell growth without con2

ditioned medium1Stem Cells,2005,23(3):315

[4]Malkowski A,S obolewski K,Jaworski S,et al1FGF binding by ex2

tracellular matrix components of Wharton’s jelly1Acta Biochim Pol,

2007,54(2):357

[5]Itoh N1The Fgf families in humans,m ice,and zebrafish:their evo2

lutional processes and roles in development,metabolism,and disease1

Biol Pharm Bull,2007,30(10):1819

[6]Zhang X,Ibrahimi OA,Olsen SK,et al1Receptor specificity of the

fibroblast growth factor fam ily1The complete mammalian FGF fam i2

ly1J Biol Chem,2006,281(23):15694

[7]Schlessinger J1C omm on and distinct elements in cellular signaling via

EGF and FGF receptors1Science,2004,306(5701):1506

[8]C oumoul X,Deng CX1Roles of FGF receptors in mammalian devel2

opment and congenital diseases1Birth Defects Res C Embryo T oday, 2003,69(4):286

[9]Thisse B,Thisse C1Functions and regulations of fibroblast growth

factor signaling during embryonic development1Dev Biol,2005,287

(2):390

[10]Dvorak P,Hampl A1Basic fibroblast growth factor and its receptors

in human embryonic stem cells1Folia Histochem Cytobiol,2005,43

(4):203

[11]Schlessinger J1Cell signaling by receptor tyrosine kinases1Cell,

2000,103(2):211

[12]K im H J,Bar2Sagi D1Modulation of signalling by S prouty:a develo2

ping story1Nat Rev Mol Cell Biol,2004,5(6):441

[13]Ben2Zvi T,Y ayon A,G ertler A,et al1Suppressors of cytokine sig2

naling(SOCS)1and SOCS3interact with and modulate fibroblast growth factor receptor signaling1J Cell Sci,2006,119(pt2):380

[14]Lam othe B,Y amada M,Schaeper U,et al1The docking protein

G ab1is an essential component of an indirect mechanism for fibroblast

growth factor stimulation of the phosphatidylinositol32kinase/Akt antiapoptotic pathway1Mol Cell Biol,2004,24(13):5657

[15]Abraham JA,Whang JL,T umolo A,et al1Human basic fibroblast

growth factor:nucleotide sequence and genomic organization1EMBO J,1986,5(10):2523

[16]陈佳,罗成群1碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)与创伤愈合1中

国烧伤创疡杂志,2005,17(1):74

[17]吴维,胡何节,邓福生,等1血管内皮细胞生长因子和碱性成纤维

细胞生长因子体外联合诱导外周血单个核细胞定向分化为血管内皮细胞1中国组织工程研究与临床康复,2007,11(11):2094 [18]Chua KH,Aminuddin BS,Fuzina NH,et al1Basic fibroblast growth

factor with human serum supplementation:enhancement of human chondrocyteproliferation and prom otion of cartilage regeneration1S in2 gapore Med J,2007,48(4):324

[19]Z ittermann SI,Issekutz AC1Basic fibroblast growth factor(bFGF,

FGF22)potentiates leukocyte recruitment to inflammation by enhan2 cing endothelial adhesion molecule expression1Am J Pathol,2006, 168(3):835

[20]Cui HG,Li HY1E ffect of basic fibroblast growth factor(bFGF)on

the treatment of exposure of the orbital implants1J Zhejiang Univ Sci B,2007,8(9):620

[21]卞徽宁,陈华德,郑少逸,等1外源性碱性成纤维细胞生长因子对

创面愈合病理变化的影响1感染、炎症、修复,2006,7(4):206 [22]邱垂源,洪岸,林剑1bFGF信号转导及其与肿瘤关系的新进展1

生命科学,2005,17(2):153

[23]许会彬,张代民,曹英林1碱性成纤维细胞生长因子及受体与肿

瘤的关系1临床军医杂志,2005,23(1):98

[24]Hsuan S L,K lintworth HM,X ia Z1Basic fibroblast growth factor

protects against rotenone2induced dopam inergic cell death through ac2 tivation of extracellular signal2regulated kinases1/2and phosphati2 dylinositol23kinase pathways1J Neurosci,2006,26(17):4481

(2008201210收稿　2008204225修回)

(责任编辑　胡全兵)

(上接第768页)

索。对于良性肿瘤,本文希望通过该研究进一步提高其治疗的安全性和方便性。研究结果证实了该方法对于良性肿瘤和恶性肿瘤都具有较好的有效性和安全性,进一步拓宽了HIFU技术的应用领域。有的良性肿瘤能够实现100%体积消融,病灶体积50%以上的累计消融率可以达到9714%(37/38)。更为重要的是,该方法有效提升了HIFU治疗的安全性,尤其在保护神经、皮肤、骨骼等方面。麻醉条件下,患者不具备对神经刺激的保护性反应,因而在治疗能量涉及到神经组织时,损伤神经的可能较大;而在镇静止痛条件下,患者的神经反射正常,医生可以通过与患者沟通,或观察神经系统受到刺激后产生的被动反射,有效地避免神经组织的严重损伤,皮肤、骨骼等既往容易受损伤的组织也可以得到有效保护。由于HIFU消融治疗主要为一次性治疗,有些治疗需时较长,既往麻醉条件下,患者长时间处于被迫体位,有可能导致血管、神经因受牵拉而损伤(主要是部分血管、神经已经受累的四肢肿瘤患者),部分软组织也有可能受到患者自身体重的压迫而损伤。在本研究中,患者仍然具有保持自我体位的保护能力。此外,这种方法在降低麻醉风险、减少治疗

费用以及开展与其他治疗联合应用的研究等方面,也具有积极的临床意义[7]。

【参考文献】

[1]Illing RO,K ennedy J E,Wu F,et al1The safety and feasibility of

extracorporeal high2intensity focused ultrasound(HIFU)for the treatment of liver and kidney tumours in a Western population1Br J

Cancer,2005,93(8):890

[2]黄志强1外科微创化:21世纪外科的趋向.解放军医学杂志,

2002,27(2):95

[3]朱辉,陈文直,伍烽,等1高强度聚焦超声对射频消融后肝癌残余

病灶的治疗1中国肿瘤临床,2007,34(19):1078

[4]金成兵,伍烽,王智彪,等1高强度聚焦超声联合动脉栓塞化疗

治疗晚期肝癌的初步临床研究1中华肿瘤杂志,2003,25(4):401 [5]周强,伍烽,朱学强,等1高强度聚焦超声对恶性肿瘤患者外周

血免疫抑制因子的影响1中国临床康复,2005,9(6):138

[6]邓建,伍烽,王智彪1HIFU治疗后肿瘤抗原对树突状细胞的活

化及其抗肿瘤效应1中华肿瘤防治杂志,2007,14(3):181

[7]曾庆东,吕丽红,张秀国,等1高强度聚焦超声联合健择治疗晚期

胰腺癌的临床研究1中华肝胆外科杂志,2006,12(11):748

(2008204220收稿　2008205204修回)

(责任编辑　沈宁)

细胞培养发展历史

1856年，实现红豆杉细胞培养生产紫杉醇的突破。 1885年，Roux温生理盐水培育鸡胚组织； 1887年，培养皿（英文：Petri dish）由在德国生物学家罗伯特·科赫手下工作的细菌学家朱利斯·理查德·佩特里（Julius Richard Petri，1852－1921）于1887年设计，故也称为“佩特里皿”。是一种用于细胞培养的实验室器皿，由一个平面圆盘状的底和一个盖组成，一般用玻璃或塑料制成。 1902年，植物细胞培养是在植物组织培养技术基础上发展起来的。1902年Haberlandt 确定了植物的单个细胞内存在其生命体的全部能力(全能性)，使成为植物组织培养的开端。 其后，为了实现分裂组织的无限生长，对外植体的选择及培养基等方面进行了探索。 1906年，Beebe和Ewing用盖片悬滴培养法，以动物血清做培养基，培养狗淋巴细胞存活了72 小时。现代细胞培养是从Harrison(1907)和Carrel(1912)两人开始的。Harrison参考前人经验，创建了盖片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法。 1907年，哈里森(Harrison)在无菌条件下用淋巴液作培养基，培养蛙胚神经组织存活数周，并观察到神经细胞突起的生长过程，由此创建了盖片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法，奠定了动物组织体外培养的基础。 1910-1912年，Carrel采用无菌操作、更新培养基、传代，完善了悬滴培养法； 1912年，Haberlandt的学生Kotte和美国的Robins在根尖培养中获得了组织培养的成功。Kotte采用了无机盐、葡萄糖、蛋白胨、天冬酰胺，及添加各种氨基酸的培养基。 1915年，昆虫细胞培养的鼻祖是德国人forhardBendict（1878—1958），发表了有关昆虫细胞培养的第一篇文章。 1923年，Carral设计创立了卡氏瓶培养法，用此法可根据需要随时更换培养液，既有利于组织不断生长，又可以运用不同种类的营养液培养不同的细胞，极大地推动了当时组织培养研究。 在培养基方面，Earle在1948年设计了含有碳酸氢钠等盐类的Earle氏盐溶液，Hank’s在1949年设计了Hank’s氏盐溶液。 Earle、Dulbecco等于1943年创建单层细胞培养法，首建长期传代的L-细胞系；1948年Sanford创建单细胞分离培养法，获L-细胞纯系。 1948年，体外细胞毒性试验细胞毒性实验它是利用体外细胞培养的方法，测定细胞溶解，抵制细胞生长的毒性作用来评价生物材料的潜在细胞毒性。 1948年，RosenBluth等首次报道利用鼠成纤维细胞培养来筛选聚合物，开始了细胞毒性试验评价生物材料的生物相容性的研究与应用工作。 1950年，Enders及其同事发表了第一篇关于在培养细胞中生长病毒的报告，开拓了以动物病毒为研究对象的新领域。作为大规模细胞培养，Copsik等人成功的进行了有关仓鼠肾细胞（BHK）的悬浮培养。

碱性成纤维细胞生长因子

碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）神经再生 1975年Gospodarowicz首先报道运用理化方法从牛的大脑和垂体中分离纯化出碱性成纤维细胞生长因子（Basic Fibroblast Growth Factor，bFGF）。80年代，bFGF的氨基酸序列得到澄清。90年代，国内外相继运用基因工程方法成功获得重组bFGF，有力推动了关于bFGF的研究。系列研究证实，bFGF能刺激和调节血管内皮细胞、上皮细胞、成肌细胞、成骨细胞和神经胶质细胞等多种起源于中胚层、神经外胚层的细胞分化增殖，在胚胎发育、组织愈合中起重要作用。神经方面，关于bFGF的研究集中在中枢神经，发现其神经活性广泛，能保护神经元，促进突起增生，提示在周围神经再生方面的研究意义。现参考近年来bFGF与神经再生的相关文献作一综述。 一、内源性bFGF正常情况下的表达和神经损伤后的变化 (一)中枢神经：正常情况下，内源性bFGF以微量分布于脑、垂体和下丘脑等器官，已证实星形胶质细胞、垂体滤泡及部分神经细胞能分泌bFGF，在海马皮质、中脑、纹状体和小脑颗粒细胞均有其受体。神经损伤后，早期就能观察到内源性bFGF表达增多，是神经损伤后早期反应之一。 叶诸榕用原代培养的大鼠大脑星形胶质细胞作成机械损伤模型，观察发现bFGF在损伤后2小时开始表达，12小时达高峰，2天后开始回落，星形胶质细胞胞体肥大，突起粗大。崔建忠运用Northern杂交、组织学方法动态观察大鼠颅脑弥漫性损伤后bFGF的基因表达和组织学改变，结果发现轻度损伤后12小时，重度损伤后4小时，bFGF基因表达增加，均于第3天达到高峰。Grothe〔1〕研究脊髓神经节bFGF及其Ⅰ型受体（FGFR-1)的表达时发现，正常情况下，bFGF和FGFR-1的mRNA在脊神经节均有表达，原位杂交显示星形胶质细胞产生bFGF，而感觉神经元表达FGFR-1，提示旁分泌作用；坐骨神经损伤后，L4～6感觉神经元bFGF的表达在1天内即上调，7天达高峰，28天后恢复，FGFR-1的变化则不明显。 (二)周围神经：Grothe〔1〕和Meisinger〔2〕1997年报道了bFGF及其受体在周围神经的表达和损伤后变化的研究结果，而此前该领域未见报道。该研究发现，正常情况下，大鼠坐骨神经FGFR-1 mRNA表达高于bFGF mRNA。坐骨神经损伤后，FGFR-1和bFGF的mRNA 在损伤远、近端均于不同的时相点上调，并有时间依赖性；bFGF的表达具有自身正反馈特点，且不影响FGFR-1。这一实验说明，与在中枢神经一致，内源性bFGF表达增多同样是外周神经损伤后的早期反应。 神经损伤后bFGF表达上调的意义是什么?不少学者将bFGF运用于神经细胞培养和神经损伤模型，发现bFGF具有广泛的促神经再生作用，提示bFGF表达增多是神经损伤后的修复反应，且可能具有始动意义。 二、外源性bFGF促进神经再生 (一)中枢神经 (1)离体试验：端礼荣在原代培养的大鼠胚胎中脑神经细胞中加入bFGF，观察发现细胞微团集落形成率明显增加，不同剂量的bFGF表现量效关系，图像分析见神经细胞突起增多，连接丰富呈网状。Miyagawa运用bFGF于原代培养的海马神经元轴突损伤模型，观察发现实验组较对照组轴突增生、突起增多。Himmelseher〔3〕进一步研究了不同浓度的bFGF对如上模型的作用，结果未用bFGF的对照组神经元存活65%，运用不同剂量bFGF的试验组神经元变性均减少，10 mg／L组存活神经元达85%，神经突起亦增多、增长。 由上述试验可见，bFGF能促进培养的神经细胞增生，神经细胞损伤后运用bFGF，变性死亡减少，神经突起增生，说明bFGF在体外具有促进、保护神经细胞的作用。Malgrane 〔4〕研究大鼠背根神经节神经元对神经毒性药物的反应时发现：bFGF不但能刺激轴突再

成纤维细胞原代培养

利用组织块可以成功地培养得到原代培养的人皮肤真皮成纤维细胞。培养中应该注意以下事项： ①一般皮肤主要取白手术过程中切除的部分组织，方法似外科取断层皮片手术操作，但组织一般2—3cm 即可，注意取材时不要用碘酒消毒．此外，不要切取太厚，要尽量去除皮下组织，如果皮下脂肪太厚会影响组织块的贴壁，不易于日后细胞的游出． ②尽量去除表皮，如有表皮未被完全剔除，则可能造成表皮细胞竞争生长，最为常见的为角质形成细胞的污染，它可以和成纤维细胞共同生长．虽说在今后的传代培养时可通过细胞纯化方法适当去除，但这种混和生长状态会对后续实验产生影响．所以，一旦发现细胞污染，应立即停止实验，重新培养． ③在剪切组织块时要注意保持组织块湿润，可向其表面滴加几滴培养液，要始终保持其成湿润状态，这一点要特别注意而且十分重要．剪切时要掌握好时间，尽量在短时间内完成． ④组织块在最初贴壁时不是很牢固，所以开始加液不应太多，以刚刚浸没组织块为易，特别要注意，在最初几天时要减少移动培养瓶次数，避免过多晃动而造成组织块脱壁，最好在开始3 d内不换液．⑤文献报告成纤维细胞培养多在CO 培养箱内进行，培养箱内环境为CO 浓度50 ml／L，湿度95％，培养瓶为开放式．因其湿度，温度及氧气与人体内实际情况较为接近，所以适合成纤维细胞的成长．但开放式培养的同时也增加了细胞培养污染的机率，所以，可以根据

自己实验室的条件选用合适的培养方法，如半开放式和充气后密闭瓶口，其效果也十分理想．但同时要密切观察培养液的pH变化，以保持适宜的酸碱度． ⑥细胞培养失败的最常见原因是污染，其中以微生物污染最常见，污染一旦明确，多数将无法救治，应尽快弃之，以防止污染扩大，影响其他细胞．因此，应在各个阶段严格遵守无菌操作原则，把好每一关口，尽可能禁止其他污染的物品进入操作环节，以避免造成时间、人力、物力的浪费．

大规模细胞培养技术

大规模细胞培养技术简介 大规模培养技术应用简介通过大规模体外培养技术培养哺乳类动物细胞是生产生物制品的有效方法。上世纪60-70 年代，就已创立了可用于大规模培养动物细胞的微载体培养系统和中空纤维细胞培养技术。近十数年来，由于人类对生长激素、干扰素、单克隆抗体、疫苗及白细胞介素等生物制品的需求猛增，以传统的生物化学技术从动物组织获取生物制品已远远不能满足这一需求。随着细胞培养的原理与方法日臻完善，动物细胞大规模培养技术趋于成熟。 所谓动物细胞大规模培养技术( large-scale culture technology )是指在人工条件下(设定ph、温度、溶氧等) ，在细胞培养工厂 (Cosmo Cat.No. 1101-400 or 1101-800 )或生物反应器( bioreactor )中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。目前可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、cho(中华仓鼠卵巢) 细胞、BHK-21( 仓鼠肾细胞)、Vero 细胞(非洲绿猴肾传代细胞，是贴壁依赖的成纤维细胞)等，并已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、单克隆抗体等产品。 在过去几十年来，该技术经有了很大发展，从使用转瓶(roller bottle) 、CellCube 等贴壁细胞培养，发展为一次性细胞培养工厂( Made by Cosmo )或生物反应器 (Bioreactor )进行大规模细胞培养。第一代细胞培养技术核心问题是难以产业化或者说是规模化生产：一是在工艺生产时不能大规模制备产品；二是非批量生产容易导致产品质量的不均一性；三是难以对同批生产进行生产和质量控制。 随着生物技术的发展，迫切需要大规模的细胞培养，特别是培养表达特异性蛋白的哺乳动物细胞，以便获得大量有用的细胞表达产物。采用玻璃瓶静置或旋转瓶的培养方法，已不能满足所需细胞数量及其分泌产物。因而必须为工业化生产开创一种新的技术方法。自70 年代以来，细胞培养用生物

小鼠成纤维细胞原代培养.docx

实验-小鼠成纤维细胞的原代培养 一.实验目的 1. 掌握哺乳动物细胞原代培养与传代培养中的取材、消化及无菌操作等基本实验技术和操作过程。 2 ?熟悉在倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况的方法。 3?了解细胞原代培养与传代培养的原理和方法。 二.实验原理 自17世纪下半叶Robert Hooke提出"细胞”概念直至20世纪中叶，细胞培养(CeIl CUltUre )才逐渐发展起来。现代生命科学以及相关领域的研究前提是细胞的维持和增殖，因此，细胞培养不仅是细胞生物学的密不可分的组成部分，而且已经成为生物化学、生物物 理学、遗传学、免疫学、肿瘤学、生理学、分子生物学和神经科学、甚至临床医学的重要内容。细胞培养也是细胞生物学延伸至相关学科的一条主要途径。 如今，细胞培养已经成为生命科学和医学研究最常用的基础技术之一。 细胞培养是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下，使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。细胞培养的直接目的是维持或扩增细胞数量。依据取材于动物组织或培养细胞，细胞培养分为原代培养和传 代培养。 1 .原代培养(Primary CUItUre )是从供体取得组织或细胞后在体外进行首次培养直至成功地进行首次传代之前的培养。但实际上通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。原代培养是建立细胞系的第一步，其最基本的方法有两种：组织块培养法和消化 培养法。 组织块培养法是指直接从机体取下组织和器官，通过组织块直接长出单层细胞，该培养法是最常用的原代培养方法，其将刚刚离体的、生长活力旺盛的组织剪成小块接种在培养瓶 中作为实验材料，一天后细胞可从贴壁的组织块四周游出并生长。组织块培养法操作过程简 便、易行，培养的细胞较易存活，适用于一些来源有限、数量较少的组织的原代培养。 消化培养法利用酶或机械方法将组织分散成单个细胞后，在不加任何粘附剂的情况下，直接移植在培养瓶壁上，加入培养基立即进行培养的方法。该方法主要使用生物化学手段将 较小体积的动物组织中妨碍细胞生长的间质加以分解、消化，使组织中结合紧密的细胞连接 松散、相互分离，细胞失去与间质的连接，活细胞从组织中释放出来形成含单细胞或细胞团的悬液，分散的细胞易与外界进行新陈代谢互动，在短时间内即可贴壁生长成片。胰蛋白酶

鸡胚成纤维细胞的制作及培养

鸡胚成纤维细胞培养 1、准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、 75%酒精擦拭手至肘部。 2、布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3、选胚：取9-10日龄鸡胚，（注：鸡胚日龄越小，形成细胞活力越好，但产量较低）用新 洁尔灭消毒蛋壳10分钟后放净化台。用碘酒、酒精消毒蛋壳。用镊子打开气室。 4、用另一套镊子将壳膜打开将鸡胚夹起去头、爪、眼，放灭菌生理盐水中。 5、把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先 置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 6、剪切：用眼科剪把组织切成1~2毫米大小的块，以便于消化。 7、处理组织：将已剪碎的组织碎片倒入一个带玻璃珠的灭菌三角瓶中，其中加入0.25%的 胰酶，10个胚约7ml，或加组织消化液，一个胚1ml（组织消化液以及胰酶的配置见微生物指导）结扎瓶口或塞以胶塞。 8、消化：将其置入37℃水浴箱中或用恒温水浴，消化中应不停摇动，如用电磁恒温搅拌器 消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。消化10－15分钟。一般约12分钟。视鸡胚日龄大小而定。越小消化时间越短。见组织松软即可。一般不可消化时间太长否则容易导致细胞活力不足。 9、分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织 已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，加入0.5％的含5％犊牛血清双抗的的水解乳蛋白Hank，s液少许。（制法见微生物试验实习指导），用力震摇，或用吸管吹打。 使细胞分散，脱落。然后用纱布过滤或随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清（可以不离心吸掉上清），加入适量含有血清的培养液。 10、计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培 养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。分装在细胞培养瓶中。视细胞多少而定加入培养基。 培养基为0.5％的含5％犊牛血清双抗的的水解乳蛋白Hank，s液. 11、将其置入co2细胞培养箱中，37度。瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易 生霉菌，每次换液时需要换新塞。培养24小时进行观察。一般在24－48小时可形成单层细胞。 传代 1. 倾倒培养瓶内旧培养液。 2. 向瓶内加入胰蛋白酶和EDTA混合液少许，以能覆满瓶底为限。 3. 置温箱中2~5分钟，当发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，立即终止消化。 4. 吸除消化液，向瓶内注入Hanks液数毫升，轻轻转动培养瓶，把残余消化液冲掉。注意加Hanks液冲洗细胞时，动作要轻，以免把已松动的细胞冲掉流失，如用胰蛋白酶液单独消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用Hanks液冲洗，直接加入培养液。 5. 用吸管吸取营养液轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。 6. 计数板计数后，把细胞悬液分成等份分装入数个培养瓶中，置温箱中培养。

成纤维细胞生长因子及其与受体作用机制的研究进展

成纤维细胞生长因子及其与受体作用机制 的研究进展1 姜媛媛，任桂萍，王文飞，郝建权，李德山 东北农业大学生命科学学院生物制药教研室，哈尔滨（150030） E-mail：deshanli@https://www.wendangku.net/doc/2114726929.html, 摘要：成纤维细胞生长因子(FGF)是一类多肽类物质，其中大多数成员可与肝素结合发挥作用。目前已知FGF至少包括23个因子，即FGF1～23。部分FGF家族成员N末端有大约3O个氨基酸残基组成的典型信号肽序列，可以分泌到细胞外。FGF家族成员是一类生理功能较广泛的生长因子，功能包括促进细胞有丝分裂、趋化与血管生成、促进中胚层和神经外胚层细胞的存活与生长等。本文根据最近的研究成果对 FGF因子及其受体研究进展做一综述，并主要对FGF因子特征及其研究趋势进行了探讨。 关键词：FGF，FGF受体，肝素 中图分类号:Q74 引言： 成纤维细胞生长因子最早是从脑和垂体的提取液中发现的，该物质是一种能促进成纤维细胞生长的多肽类活性物质，可以通过与细胞膜特异性受体结合对细胞生长进行调节。从70年代中期到目前已进行了大量广泛的研究，目前已知FGF至少包括23个因子，它们在一级氨基酸序列上有一定的同源性，并有类似的生物学功能，且广泛存在于体内多种组织中。FGF对中胚层和神经外胚层来源的细胞具有十分明显的促细胞分裂增殖作用，并且在机体内的胚胎发育、细胞生长分化、创伤组织愈合及肿瘤发生发展中起着十分重要的作用。 1. 成纤维细胞生长因子（FGF）家族 成纤维生长因子（Fibroblast growth factor, FGF）又被称为肝素亲和生长因子(Heparin binding growth factor, HBGF)，是一类通过与细胞膜特异性受体结合发挥作用的多肽分子。现已知FGF家族至少包括23个成员，即FGF1～FGF23。FGF家族成员之间的氨基酸序列同源性约为25%～50%，其每个成员都有140个氨基酸的中轴，该中轴在不同的成员中有高度的同源性。结构分析表明，此中轴折叠成12条逆向平行的β链，它们又进一步形成圆柱状的结构。部分FGF家族成员N末端有大约3O个氨基酸残基组成的典型信号肽序列，使得它们可通过内质网一高尔基复合体的经典(即自分泌和旁分泌)途径被分泌到细胞外，但其中也有部分FGF则因本身缺乏信号肽结构，不能向外分泌，只能在细胞受损时释放[1]。多数FGF（如FGF3～8、10、15、17～19、21～23）的N末端具有典型的信号肽序列。而FGF16和FGF20虽然没有明确的信号肽序列却也能高效地分泌到细胞外[12]。FGF1 和FGF2也缺乏信号肽序列和正常的分泌途径，却也能出现在胞外基质，推测两者可能来自受伤的细胞，或者通过与内质网-高尔基体通路不同的细胞脱颗粒机制释放至胞外的。此外，FGF 11～14没有典型的信号肽序列，因此认为这些FGF是在胞内发挥作用[13]。由于FGF家族成员之间的氨基酸序列有25％～50％的同源性，分子结构有一定的共性，故FGF不同分子之间的生物学效应既有相似性，又有各自的特点[1-3]。 FGF1(aFGF)和FGF2(bFGF)是最先被发现，也是迄今为止研究最充分的两个成员，因其1本课题得到黑龙江省科技厅重点攻关项目（编号：2006G0461-00）的资助。

原代培养中成纤维细胞的抑制

成纤维型细胞：在培养中的细胞凡形态与成纤维细胞类似时，皆可称之为成纤维细胞。本型细胞由形态与体内成纤维细胞的形态相似而得名，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞中央有卵园形核，胞质向外伸出2-3 厘米个 长短不同的突起，除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间质起源的组织细胞常呈本类形态生长。 培养细胞的纯化 【我是小米2】培养细胞的纯化： 1、自然纯化 即利用某一种类细胞的增殖优势，而排挤其他细胞生长，靠自然的增值潜力最后留下生长优势细胞，去除其他细胞。有些恶性肿瘤细胞可以通过此方法，自然纯化建立细胞系。 2、人工纯化 （1）酶消化法 在消化培养细胞时，常是成纤维细胞先脱壁，而上皮细胞要消化相当长的时间才脱壁，特别是在原代培养和培养早期这种差别尤为明显，因而可以利用这种差异采用多次差别消化方法将上皮细胞和成纤维细胞分开。 （2）机械划除法 原代培养成功后，上皮细胞和成纤维细胞所数都同时出现，混杂生长。这种混杂生长常常分区成片，每种细胞都以小片或区域性分布的方式生长在瓶壁上。因此可以采用机械的方法去除不需要的细胞。 （3）反复贴壁法 成纤维细胞与上皮细胞相比，其贴壁过程快，大部分细胞常能在短时间内大约 10－30min完成附着过程，而上皮细胞大部分在短时间内不能附着或附着不稳定，稍加振荡即浮起，这样可以利用此差别来纯化细胞。 （4）克隆法 采用细胞克隆法将细胞分成单个细胞，使之分别生长成克隆，选择出所需要的克隆。 （5）培养及限定方法 某些细胞在生长过程中必须存在或必须去除某种物质，否则无法生长，可以利用这种技术来纯化细胞。

（6）流式分选 brdu 【sxtyzyq2】除了Brdu能用于抑制成纤维细胞的生长，便宜易买到的 【snany】阿糖孢苷效果不是特别理想 【cl1202】我在SD大鼠胃粘膜壁细胞原代培养的文献中看到的：成纤维细胞大量生长是壁细胞分离培养失败的常见原因。培养基中加入血清会刺激成纤维细胞而抑制壁细胞生长，对壁细胞可能还有一定的毒性作用。为了减少成纤维细胞的生长，先加入含有胎牛血清（100ml/L）的培养液，时差贴壁30-45分钟，除去成纤维细胞，然后再换用无血清的培养液进行培养。不知道你有没有用？试试吧。 【sxtyzyq2】买sigma公司的brdu然后把它配成终浓度为1 mmol/l然后1ml 培养液中加入5微升就可抑制成纤维细胞 【gfeng8078】我是养心肌原代，也需要抑制成纤维细胞，请问各位大侠，5-brdu 用多大的浓度？ 【cheerfulness】养心肌原代最初24h培养液中加入终浓度为0.1mmol/L的brdu 【gfeng8078】你是怎么样达到0.1mmol/L的浓度呀，由于有培养液的存在，加了Brdu进去，自然就稀释了？我想把Brdu溶解于DMEM中然后一起抽滤，可是有报道说这对Brdu的药效有影响 【jiangbin1230】请问用组织块贴壁法能培养出肠的成纤维细胞吗？我试过很多次了，一个皿就只有零散的一二十个成纤维细胞，都是柱状上皮细胞，是否由于正常组织太少不能培养出啊？能帮帮忙吗？ 【sdf771214】请问成纤维细胞的帖壁时间一般是多少?我养的是内皮细胞,如何时差帖壁啊? 【victoh】不同来源的成纤维细胞在不同培养支撑介质上的贴壁时间应该是不一样的，此外也还受到其他一些因素的影响，至于上皮细胞，其本身种类就更加复杂了 上皮细胞 【warmbull】我现在正在做的培养，但发现有几瓶细胞可能是被成纤维细胞（长梭形、透明细胞）污染了，后来成纤维细胞抑制了色素上皮细胞的生长。现在又出现了这种情况，请问各位大侠，有什么办法可以除去杂细胞？还有，我养的色素上皮细胞生长增殖很缓慢，有的甚至慢慢萎缩，会是什么原因呢？

鸡胚成纤维细胞培养doc

一、鸡胚成纤维细胞的体外培养 鸡胚成纤维细胞在病毒学研究中十分常用。孵化8－12d的鸡胚可用作培养的材料来源。 （一）实验材料 1. 鸡胚：孵化10d的受精蛋数个。孵化方法是将受精蛋放到38.5℃孵卵箱或恒温箱中，静置。每日翻动1—2次，以防止鸡胚粘连到蛋壳上影响发育。箱内湿度(40～70％)可通过在箱底放一盛水盘来维持。鸡胚的孵化期为2ld。孵化前，如遇蛋壳表面污物较多，可用刀片等器具刮除，不要用湿布擦拭，更不能用酒精棉球消毒或者用水洗蛋。孵育前可将受精蛋保存在10℃左右，保存期一般不超过10d。也有人将受精蛋保存在4℃冰箱中。 2. 消化液：含0.25％胰蛋白酶、青霉素100 1U／ml、链霉素100 μg/ml混合消化液。用Hanks 液或HEPES液配制。 3. 培养液：DMEM培养液，添加10％－20％的胎牛血清（FCS）、青霉素100 IU/ml、链霉素100 μg/mL。 4. 其它培养用品：手术器械、平皿、三角瓶或15ml血清瓶、离心管、100目不锈钢筛网、培养瓶或培养板、振荡水浴箱、离心机等。 （二）操作步骤 1)取孵化10d的鸡胚，分别用碘酒与酒精棉球擦拭消毒，晾干。用一已消毒金属器具将受 精蛋大头端击破，用镊子小心夹去破碎蛋壳，然后撕去气室外面的膜，暴露出尿囊绒膜及附着的血管。开口大小以受精蛋内容物不溢出为宜，但不宜太小。用镊子轻轻夹住鸡胚的颈部，小心取出鸡胚，放于无菌培养皿中，除去头部、四肢、内脏和皮肤。 2)胚体用Hanks液或生理盐水清洗3次，切成1－2 mm3的小块，然后转移到容积适中的 三角瓶或15ml血清瓶内。 3)加入适量消化液，一般每10个鸡胚加20 m1消化液，用胶塞密封瓶口。 4)在振荡水浴箱上37℃慢速搅拌5－10 min。加入少量血清钝化胰蛋白酶。然后通过100 目不锈钢筛网，制备细胞悬液，将细胞悬液转移到离心管中。 5)离心（800 rpm，10 min），弃上清液，将细胞沉淀用培养液洗2次。 6)加入培养液，用吸管吹打制成细胞悬液。用血球计数板计数细胞。 7)以0.2～1X06个细胞/ml的密度接种细胞。于37℃、5％CO2培养箱中培养。每2－3d换 液1次。待细胞汇合成片后，可行传代培养。 （三）结果 在倒置显微镜下观察，用8～12d龄鸡胚培养的细胞主要为具有长突起的梭形、星形或三角形的成纤维细胞。用I型和Ⅲ型胶原的抗体作免疫细胞化学分析，培养物以呈阳性反应的成纤维细胞为主。 （四）讨论 鸡胚成纤维细胞在普通培养液中具有生长优势，一般不需特殊处理，经几次传代后就可逐渐排除其它细胞，得到较纯的成纤维细胞。体外培养的胚胎细胞的形态与所取鸡胚的胚龄有关。若用体节前期的胚胎，培养的细胞不是典型的长的或星形的成纤维细胞，而为宽扁的细胞，这可能与胚胎细胞的分化状态有关。

细胞原代培养细胞生物学实验报告

细胞生物学实验报告 细胞原代培养 姓名： 学号： 班级： 专业： 同组成员： 一、实验原理

细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养。由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。同时也为以后传代培养创造条件。 原代培养的方法： 1、组织块法在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大小。用Hanks 液洗涤2—3次，自然沉淀。用吸管吸去上清液。将组织块贴于培养瓶进行培养。 2、酶消化法将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的%的胰蛋白酶。370C磁棒搅拌消化20－30分钟。然后终止消化。用几层无菌纱布过滤。取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养。 取材注意事项： 取材要注意新鲜和保鲜。取材应严格无菌。取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。 二、实验目的 1、理解细胞原代培养原理 2、熟悉细胞原代培养方法与过程 3、了解细胞原代培养的应用 4、独立进行细胞原代培养操作 三、实验材料 手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶、试管、移液管、巴斯德吸管、废液缸、75%酒精棉球、酒精灯。 动物：9-12日龄的鸡胚蛋 四、实验步骤

成纤维细胞

成纤维细胞 科技名词定义 中文名称：成纤维细胞 英文名称：fibroblast 定义： 普遍存在于结缔组织中的一种中胚层来源的细胞。分泌前胶原、纤连蛋白和胶 原酶等细胞外基质成分，伤口愈合过程中可迁移到伤口进行增殖。 所属学科：细胞生物学（一级学科）；总论（二级学科） 本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 百科名片 疏松结缔组织中的成纤维细胞 成纤维细胞（fibroblast）是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的 间充质细胞(mesenchymalcell) 分化而来。成纤维细胞较大，轮廓清楚， 多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，其细胞核呈规则的卵圆形，核仁

大而明显。根据不同功能活动状态，可将细胞划分成成纤维细胞和纤维细胞，成纤维细胞功能活动旺盛，细胞质弱嗜碱性，具明显的蛋白质合成 和分泌活动，在一定条件下，它可以实现跟纤维细胞的互相转化。成纤维 细胞对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损以及骨创伤的修复有着十分 重要的作用。 目录 细胞的功能活动状态划分 来源 特征 创伤修复 分离培养 原代培养 展望 展开 编辑本段 细胞的功能活动状态划分

根据不同的功能活动状态，将细胞分为成纤维细胞和纤维细胞二型：成纤维细胞乃是功能活动旺盛的细胞，细胞和细胞核较大，轮廓清楚，核仁大而明显，细胞质弱嗜碱性，具明显的蛋白质合成和分泌 活动；纤维细胞（fibrocyte）功能活动不活跃，细胞轮廓不明显，核 小着色深，核仁不明显，细胞质少。此二型细胞可互相转化。[1] 编辑本段 来源 成纤维细胞：数目最多，胞体大，为多突的纺锤形或星形的扁平 细胞，细胞核呈规则的卵圆形，细胞轮廓不清。 成纤维细胞摄取所需的氨基酸，如脯氨酸和赖氨酸等，在粗面内质网的核蛋白体上合成前α多肽链（proalphapolypeptidechain ），多肽链输送到高尔基复合体后，组成前胶原分子（procollagen ）。前 胶原分子由分泌囊泡带到细胞表面，然后通过胞吐作用释放到细胞 外。在前胶原肽酶催化下，将每一前α多肽链的尾段除去，成为原胶 原分子（tropocollagen ）。许多原胶原分子成行平行排列，结合成具 有周期性横纹的胶原原纤维。由胶原原纤维互相结合形成胶原纤维。 编辑本段 特征 成纤维细胞是结缔组织中最常见的细胞，由胚胎时期的间充质细 胞(mesenchymalcell)分化而来。在结缔组织中，成纤维细胞还以其成熟状态—纤维 细胞(fibrocyte)的

成纤维细胞生长因子的信号通路概要

中国组织工程研究 第20卷 第15期 2016–04–08出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research April 8, 2016 Vol.20, No.15 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 2255 ·综述· www. CRTER .org 苏钰涵，女，1986年生，内蒙古自治区人，汉族，医师，内蒙古医科大学在读硕士。 通讯作者：翁立新，硕士，教授，研究生导师，内蒙古医科大学病理教研室，内蒙古自治区呼和浩特市 010059；内蒙古医科大学附属医院病理科，内蒙古自治区呼和浩特市 010050 中图分类号:R318 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2016)15-02255-10 稿件接受：2016-02-09 https://www.wendangku.net/doc/2114726929.html, 成纤维细胞生长因子的信号通路 苏钰涵1 ，杜 华2 ，牛广明3 ，王 静4 ，翁立新1，2(1 内蒙古医科大学病理教研室，内蒙古自治区呼和浩特市 010059；内蒙古医 科大学附属医院，2病理科，3影像科，内蒙古自治区呼和浩特市 010050；4 内蒙古包头市第四医院ICU ，内蒙古自治区包头市 014030) 引用本文：苏钰涵，杜华，牛广明，王静，翁立新. 成纤维细胞生长因子的信号通路[J].中国组织工程研究，2016，20(15):2255-2264. DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.15.018 ORCID: 0000-0002-2684-4178(翁立新) 文章快速阅读： 文题释义： 成纤维细胞生长因子：成纤维细胞生长因子可以由内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞分泌。它的作用是促进内皮细胞的游走和平滑肌细胞的增殖，不能使平滑肌细胞游走。能够促进新血管形成，修复损害的内皮细胞。成纤维细胞生长因子被认为是病灶形成促进因子，但从修复角度看它也有有利的一面。 成纤维细胞生长因子亚科：分泌的信号成纤维细胞生长因子基于生化功能、序列相似性和进化关系可以分为一些亚科：旁分泌的成纤维细胞生长因子的5亚科，内分泌的成纤维细胞生长因子的一个亚科，和细胞内成纤维细胞生长因子的一个亚科。 摘要 背景：在最早的胚胎发育阶段和器官形成期间，成纤维细胞生长因子家族成员的功能是维持祖细胞并介导祖细胞的生长、分化、存活和形态。成纤维细胞生长因子常在成熟的组织通过重新激活信号通路介导代谢功能、组织修复和再生。 目的：总结并讨论成纤维细胞生长因子信号通路对组织和器官的作用。 方法：由第一作者用计算机检索中国期刊全文数据库(CNKI ：2010至2016年)和Medline 数据库(2000至2016年)，检索词分别为“成纤维细胞生长因子，信号通路”和“Fibroblast growth factor ，signaling pathway ”语言分别设定为中文和英文。全面阐述成纤维细胞生长因子的信号通路的研究进展。 结果与结论：①共纳入47篇文献；②哺乳动物成纤维细胞生长因子家族的信号是由18个分泌蛋白组成，这18个分泌蛋白与4个信号酪氨酸激酶成纤维细胞生长因子受体相互作用；③成纤维细胞生长因子配体与受体的相互作用是由蛋白质或辅助因子蛋白多糖和胞外结合蛋白来调节的；④活化的成纤维细胞生长因子受体使特定的酪氨酸残基磷酸化，调节与细胞质接头蛋白、RAS-MAPK 、PI3K-AKT 、磷脂酶C γ和STAT 细胞内信号通路的相互作用，4个结构相关的细胞内非信号的成纤维细胞生长因子相互作用来调节电压门控钠离子通道；⑤结果说明，成纤维细胞生长因子存在所有的组织和器官中，成纤维细胞生长因子信号通路异常与发育缺陷、损害对损伤的反应、导致代谢紊乱和癌症发病相关联。 关键词： 组织构建；组织工程；成纤维细胞生长因子；成纤维细胞生长因子受体；信号通路；Klotho 细胞；硫酸乙酰肝素蛋白多糖；成纤维细胞生长因子结合蛋白1；细胞外调节蛋白激酶；微小RNA ；肺动脉高压；原发性乳腺肿瘤；内蒙古自治区自然科学基金 主题词： 组织工程；成纤维细胞生长因子；肿瘤 基金资助： 内蒙古自治区自然科学基金(NJZY12151)

心脏成纤维细胞原代细胞培养

乳鼠心肌成纤维细胞分离与培养 一、实验动物 1~3日龄C57小鼠乳鼠10只。 二、试剂及配制 高糖DMEM(gibco)、Ⅰ型胶原酶（MP）、0.25%胰蛋白酶(solarbo公司), 胎牛血清（gibco 160000-044）、青霉素-链霉素混合液（solarbo）。 培养液:DMEM培养基：FBS：双抗100：10：1（45ml：5ml：0.5ml） 酶消化液:将胰蛋白酶用PBS缓冲液(pH7.2 ～7.4)稀释,配成0.1%胰蛋白酶消化液;将Ⅰ 型胶原酶溶于PBS缓冲液(pH7.2～7.4) 中,配成0.1%的胶原酶消化液。0.1%胰蛋白酶及 01%Ⅰ型胶原酶以2∶1混合, 现配现用。 三、实验仪器 超净工作台、CO2培养箱、光学倒置显微镜、离心机?? 四、组织消化和分离细胞 1、将乳鼠于75%乙醇缸中浸泡5ｓ, 转移至超净台。 用大头针将其固定在无菌的泡沫板上, 用聚维酮碘消毒胸、腹部皮肤。 2、取2把弯镊子撕开皮肤, 充分撕拉开, 再用乙醇棉签消毒。用眼科虹膜剪在剑 突处正中线 稍偏左向上开胸后用剪子压住胸骨右缘, 使心脏自然跳出, 用弯镊子勾住心脏根部 , 取 出心脏, 置于盛预冷PBS液的培养皿中。 3、将鼠心脏全部取出后 , 剪去心房、剔除心脏上结缔组织、脂肪及血管, 预冷ＰＢＳ液清 洗3次, 去除血污。 4、将心脏剪成约1mm×1mm×1mm的组织块, 刮入加有搅拌子的锥形瓶中, 酶消化液冲洗剪 刀及培养皿, 转移至锥形瓶中。 5、加入孵育过的酶消化液为心肌组织的5倍,37 ℃水浴, 打开磁力搅拌器 ,60r/min 搅拌 10min, 吸管轻轻吹打组织块 1min分散细胞, 自然沉降2min后遗弃上清液。 6、再次加入消化酶液8～15ml消化8min。 五、培养细胞 1、吸取上清液入离心管, 加入预冷培养液2ml, 吹打均匀后,1200r/min离心4min, 弃上清, 细胞沉淀加预冷的培养液吹打后成细胞悬液用封口膜封口放于冰中备用。

鸡胚成纤维细胞的制备

鸡胚成纤维细胞的制备 一、材料和试剂 1、鸡胚：9-10日龄发育良好的SPF胚 2、试剂：0.25％胰酶，MEM培养基，新生牛血清，1万IU双抗，3%谷氨酰胺，7.5%碳酸氢钠 3、仪器和器材：，带6-8层纱布的100ml烧杯两个，直径9cm的平皿两个，中号镊子四把，倒置显微镜，培养箱，50ml细胞培养瓶，10ml刻度吸管两根、5ml刻度吸管，250ml生理盐水瓶两个，无菌的细胞培养瓶，灭菌好的PBS，酒精棉球，废液缸等 二、操作步骤 1、操作前的准备： ○1预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。 ○2用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。 ○3正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。 ○4点燃酒精灯：注意火焰不能太小。 ○5准备好将要使用的消毒后的培养瓶。 ○6取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。 2、成纤维细胞制备： ①将选好的9-10日龄的发育良好的SPF胚用5%的碘棉消毒蛋壳气室部位，再用酒精棉脱碘。 ②无菌取出鸡胚，放入灭菌的玻璃皿内，用PH7.2的PBS冲洗一次，去头，四肢和内脏。 ③再用PH7.2的PBS冲洗两次。 ④用镊子捏成小块（2-3mm3）, 用PH7.2的PBS冲洗两次。 ⑤鸡胚约加4ml0.25%胰酶溶液，38℃消化30min，期间15min轻摇一次。 ⑥期间配制细胞培养液： 培养基：MEM 双抗：2% 7.5% 碳酸氢钠：2% 牛血清：6% 3% 谷氨酰胺：1% ⑦消化结束，弃掉胰酶消化液，用PH7.2的PBS冲洗两次，再用细胞生长液冲洗一次。 ⑧加入适量的细胞生长液，用刻度吸管反复吹打（使细胞充分分散）。 ⑨将细胞分散液倒入带6-8层纱布的100ml烧杯中（过滤之前先用少许细胞培养液润湿纱布），加入适量培养液（40ml/胚），过滤。 ⑩重复步骤⑨的操作重虑一遍。 11计数，要求每1ml滤液中约含活细胞100万-150万个。 ○ 12分装置个培养瓶中（7-8ml/瓶），置37℃培养箱培养。 ○

bFGF-重组人碱性成纤维细胞生长因子

重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh-bFGF) 品牌：Robustnique? INCI：Rh-Polypeptide-1 (Human oligopeptide-2) CAS No.：106096-93-9 别名：成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，成纤维细胞生长因子-β (FGF-β) 概述： 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)属于FGF家族(23个已知成员)，是一种肝素结合生长因子，能够促进包括间叶细胞、神经外胚层和血管内皮细胞在内的一系列细胞的增殖。碱性成纤维细胞生长因子在体内还具有潜在的促血管生成活性。此外，碱性成纤维细胞生长因子是胚胎干细胞培养基中的一个重要组成成分，使细胞在无血清培养基中保持未分化的形态。重组人碱性成纤维细胞生长因子是由155个氨基酸残基组成的蛋白质，分子量17.2 KDa。 机制： 成纤维细胞生长因子(FGF)的信号转导经由成纤维细胞生长因子受体(FGFRs)。FGFR是一个带酪氨酸激酶的跨膜受体家族，包含四个成员(FGFR1-4)每个成员都有多个剪接变异体。碱性成纤维细胞生长因子可以同多种FGFRs(但不是全部)高亲和力的结合。碱性成纤维细胞生长因子和硫酸乙酰肝素糖胺聚糖(HSGAG)同FGFRs的结合导致FGFRs二聚，并随后激活FGFR胞质激酶结构域。由碱性成纤维细胞生长因子激活的信号转导通路包括RAS-RAF-MAPK、PLCγ/PKC和PI3K/AKT途径。

规格： 产品重组人碱性成纤维细胞生长因子(原液) 货号E0031 包装100 mL (可订制) 性状无色液体 浓度 1 mg/mL 成份纯化后的蛋白溶于：10 mM 柠檬酸柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0)， 300 mM NaCl，1 mM EDTA，5%甘露醇，2 mg/ml羧甲基纤维 素(CMCNa) 氨基酸序列MAAGSITTLPALPEDGGSGAFPPGHFKDPKRLYCKNGGFFLR IHPDGRVDGVREKSDPHIKLQLQAEERGVVSIKGVCANRYL AMKEDGRLLASKCVTDECFFFERLESNNYNTYRSRKYTSW YV ALKRTGQYKLGSKTGPGQKAILFLPMSAKS 分子量17.2 kDa 纯度≥ 95% (SDS-PAGE和HPLC) 活性0.8 × 106 IU/mg (Balb/c 3T3细胞增殖法检测) 无菌处理0.22 μm滤膜过滤 内毒素≤ 0.5 EU/μg 来源大肠杆菌(E. coli)表达的重组蛋白 存储-80°C/-20°C 保质期36 个月(-80°C); 24 个月(-20°C) 产地中华人民共和国 运输条件干冰运输 产品重组人碱性成纤维细胞生长因子(冻干粉) 货号E0032, E0033 包装60 μg, 1 mg (可订制) 性状白色冻干粉 赋形剂柠檬酸/柠檬酸钠，5%甘露醇，0.2%羧甲基纤维素(CMCNa) 氨基酸序列MAAGSITTLPALPEDGGSGAFPPGHFKDPKRLYCKNGGFFLR IHPDGRVDGVREKSDPHIKLQLQAEERGVVSIKGVCANRYL AMKEDGRLLASKCVTDECFFFERLESNNYNTYRSRKYTSW YV ALKRTGQYKLGSKTGPGQKAILFLPMSAKS 分子量17.2 kDa 纯度≥ 95% (SDS-PAGE和HPLC) 活性0.8 × 106 IU/mg (Balb/c 3T3细胞增殖法检测) 无菌处理0.22μm滤膜过滤 内毒素≤ 0.5 EU/μg 来源大肠杆菌(E. coli)表达的重组蛋白 存储室温(25°C) 保质期24个月(室温, 25°C) 复溶无菌去离子水, 存于低温环境防止微生物污染 产地中华人民共和国 运输条件常温运输

一 人皮肤成纤维细胞培养

Ist. Nazionale Neurologico Carlo Besta Laboratory Procedures for Human Cell Culture August 2004 _______________________________________________________________ PRIMARY FIBROBLAST CULTURE FROM HUMAN SKIN BIOPSY This protocol describes the steps for obtaining a primary fibroblast cell line from human skin biopsies. Fibroblasts are derived directly from excised skin as explants; enzyme digestion by collagenase may help obtain cells in a shorter time. This protocol describes the different steps for obtaining a primary cell line from a skin biopsy. Equipment and materials ?Laminar flow hood ?CO2 incubator ?Inverted microscope ?Sterile surgical Instruments for microdissection ?BME fibroblast medium +2 or Mg+2 ?PBS 10x without Ca ?Collagenase type II (4mg/ml) ?Petri dishes 100 mm ?Pasteur pipettes 2 ?Culture flask, 25 cm ?15 ml sterile plastic tube BME Fibroblast medium BME 80 ml Foetal bovine serum 20 ml Penicillin-streptomycin solution 100x 1 ml Filter and store at +4°C, up to 1 month. The skin biopsy sample should be shaped as a diamond and about 5-10 mm in diameter. Collect the tissue sample in sterile BME fibroblast medium. Procedure 1 1.Rapidly wash the skin biopsy in PBS in a Petri dish, cut into small fragments and transfer these to a flask. https://www.wendangku.net/doc/2114726929.html,ing a sterile Pasteur pipette with flame-rounded tip, distribute the small tissue fragments over the bottom surface of the culture flask. 3.Pass the flask rapidly and carefully through the Bunsen flame in order to evaporate the medium so that the minced tissue pieces adhere to the plastic surface, but so as not to heat-damage the minced tissue. Take care not to cook the tissue! 4.Carefully add BME medium for fibroblast growth, firmly close the lid of the flask and place in CO2 incubator. 5.The next day, slightly unscrew the lid of the flask so that the tissue can “breathe.” 6.Replace the culture medium after two days and, from this point on, replace it three times a week.