RT-PCR名解
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逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。
实时PCR(real-time PCR)，属于定量PCR（Q-PCR）的一种，以一定时间内DNA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。
real time PCR 的定量使用荧光色素，目前有二种方法。一种是在ds DNA中插入特异的荧光色素，例如SYBR Green荧光染料；另一种使用一种能与增幅DNA序列中特定寡核酸序列相结合的一种荧光探针（probe），如Taqman探针。两种方法原理不同。
SYBR Green荧光染料游离时不发光，当反应体系中存在双链DNA时，SYBR Green与双链DNA结合，此时才发光。
Taqman探针带有一个荧光基团和一个淬灭基团，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭基团则在3’末端。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，此时荧光基团发出的荧光信号可以被检测到。
real time PCR 与 reverse transcription PCR 相结合，能用微量的RNA来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。这两种RT PCR的组合又被称之为“定量RT-PCR （quantitative RT-PCR）”
精品资料
rtpcr(rt pcr)
rt-pcr（rt - pcr） I. Experimental apparatus and materials: 1, transfer guns: 1ml, 200 L, 20 L, 10 L, 2 L 2, suction head: 1ml, 200 L, 20 L 3, homogenate tube: 5ml 4, suction head table: put 1ml suction head one, put 20 l suction head one 5, EP tubes: 1.5ml, 0.2ml, 100 L 6, reagent bottle: 2 60ml Brown reagent bottle (wide mouth, with cover) 1 125ml white reagent bottles (with absolute ethanol) 7, 50ml, 250ml, 500ml: a 8, capacity bottle: 250ml, 500ml, 1000ml 9, test tube rack: 5ml, 1.5ml, 20 L 10, salt water bottles: 250ml, 500ml each 2 spare, one with absolute ethanol, another with DEPC water 11, aluminum lunch box: 4 12, plastic small lunch box: 1
13, large porcelain cylinder: 2 14, tin paper: a roll 15 rolls of paper: 2 rolls 16, triangle flask: with a cap, slightly larger Two, the processing and preparation of experimental equipment 1, plastic products: (including gun head, EP tube, homogenate tube, etc.) The DEPC of water from the flask into the ceramic cylinder, the plastic products by soaking them, which requires a small tip Straw DEPC into the water, and then dried overnight, high pressure, spare, before the experiment will first put the gun suction head, and a high pressure (EP tube) 2, glass products: acid soaking overnight, washed clean, dry spare foil Mongolia (DEPC blister) (wash after the first bubble 1 per thousand DEPC overnight, and then dried) 3, homogenizer: (including scissors, tweezers) first wash, and then high pressure (do not need to bubble DEPC) Three. Reagent preparation: 1, DEPC water: suck 1ml, placed in 1000ml double steamed water, with 1 per thousand DEPC water, placed in the 1000ml capacity
鼻饲饮食的操作流程和注意事项
鼻饲饮食操作流程及注意事项 鼻饲的目的：对昏迷病人或不能由口进食者,从胃管供给食物和药物,以维持病人的营养和治疗。 适应症：常用于不能由口进食者,如昏迷、口腔疾患、口腔手术后的病人;早产婴儿和病情危重的病人;拒绝进食的病人。 鼻饲的操作步骤要点 1、插管前物品准备齐全（治疗盘、一次性胃管包、无菌注射器、医用纱布、石蜡 固定胶条、手电筒、无菌棉签) 2、向病人解释，取适当卧位，清洁一侧鼻腔，润滑胃管前端。 3、插管长度:前发际至剑突或耳垂至鼻尖再至剑突,约45-55CM。 4、昏迷病人插管前应将头部梢向后仰,插至会厌部14--16cm时将病人头部托起,使其下 颌靠近胸骨柄、再缓缓插入。 5、插管中特殊情况的处理:如插入不畅时应检查胃管是否盘在口中;如病人出现恶心,嘱 患者深呼吸,可稍停片刻再插入;如病人出现呛咳、紫绀、呼吸困难时,立即将管拔出、休息片刻再重插。 6、固定好胃管后先注入少量(10ml)的温开水，再注入鼻饲液，鼻饲液温度38℃-40℃, 每次量不超过200ml,间隔时间不少于2h。食物注入完后再注人少量（20ml)的温开水，防止食物存积胃管内阻塞管腔。 7、防止鼻饲液存积在管腔中变质,造成胃肠炎或堵塞管腔;药片应研碎溶解后灌入;灌入 速度不可过快,鼻饲液不可过冷或过热;若灌入新鲜果汁,应与奶液分别灌入,防止凝块产生;鼻饲过程中,避免灌入空气,以防造成腹胀。 8、将胃管开口端反折，用纱布包好，固定于病人枕边。 9、长期鼻饲者,应每天进行口腔护理。 10、每次抽鼻饲液时应反折或夹住胃管末端、鼻饲完毕应再注入温开水,并将胃管提起, 使全部流入胃内。 11、拔管：用于病人停止鼻饲或长期鼻饲为减少鼻黏膜刺激，每周或每月需要更换一次 胃管。拔管时胃管开口端用夹子夹紧，边拔边用纱布擦胃管，拔管余14cm左右, 嘱病人屏气,快速拔管,以防管内液体滴入气。拔管后帮助病人清洁鼻孔、面部及漱 口。
RT-PCR实验方法总结大全.
RT-PCR实验方法总结大全 RT-PCR实验有三步:抽提RNA,RT,PCR。 要求: 1.做RT前必需测RNA浓度,逆转录体系对RNA量还是有一些要求,常用500ng 或1ug。 2. RT按要求做,一般不会出太大问题。 3. PCR,按常规。但如需扩长片段,则对前两步要求较高,需要有完整的cDNA 存在,不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。 1RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列?必须 在RT时,引物设计有3种方法即a:Random 9mers;b:Oligo dT-Adaptor Primer;和c:特异的下游引物。如果用a和b方法,是扩增的所有的cDNA(理论上,还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。 如果用c方法,那么要去那里查它的序列呢?https://www.wendangku.net/doc/2e14759833.html,问题: 在做RT-PCR遇到一怪现象,即对同一动物不同组织扩增同一段基因,结果从一种组织中可以扩出我的目的基因,条带非常的好,而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带,尝试其他条件同样无法得到满意的结果,百思不得其解!(注:已肯定该基因在两种组织中都表达,且内参照在两种组织都可扩增出来 从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的,我测过吸光度,差异还很大,会不会和这有关呢?请高手指教! 解答: 1.RT-PCR有两种做法:
条件具备的话可用kit进行一步法进行;若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。但后来发现两步法的结果更加理想,条带特异性强且无拖尾现象,我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行,当然也可能是我买的kit不太好。(promega。 2.RT-PCR应具备的条件 高质量的RNA(保留后可做5‘,3’RACE;引物的(最好产物短点;若涉及粗略定量的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度(如果由内标分子更好,但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样;体系的均一性等。 3.RACE 我做过RACE(3’RACE是宝生物的Kit;5‘RACE是Gibico,但现在再进行另一个同源基因的3‘RACE时却怎么也P不出来,这两个基因是由同一对引物扩增出来的,其中一个已经获得了全序列(RACE的方法,而另一个基因的3’UTR 却增么也扩不出来,我推测是不是该基因的3‘UTR太长的缘故,我都快绿了,有无 RT-PCR的常用内标b-actin 和GAPDH的使用有选择性吗?比如不同的细胞,不同的刺激。 有关内参: RT-PCR内参照可以在一个管子里做(那样也是图好看一些,最好分开两管,把除了引物之外的mixture统一配,拍照后,算目的基因和内参的比值,这就是基因表达的相对浓度。 问:我曾经作过同一管的PCR,内有actin 和目的基因引物。虽然可见到两条均一条带但图片质量不理想(而且酶量、Mg2+加倍。请教mxbdna2003 ,你是如何处理同一管的PCR的各成分的浓度? 答: it should determined the amount of RNA. but it not for the quantitity of the PCR. it just was convienent to guess the amount ot the template<(for RT and PCR and bettrer for publication and editor if he don not know the preocedure much. but the amount just
RNA提取,RT-PCR实验报告
RNA制备及其鉴定 实验目的初步掌握组织总RNA制备的原理及其基本方法，掌握RNA纯度鉴 定的基本方法。 实验原理 细胞内的RNA通常与蛋白质结合，以核蛋白（RNP）的形式存在。分离制备RNA时，首先必须破碎细胞，使RNP释放到溶液中并与蛋白质分离，然后将RNA同其他的细胞成分分离开并保证RNA的完整性。本次实验我们选用了Trizol法分离提取小鼠肝组织的总RNA，Trizol法分离提取的RNA产率高、纯度好且不易降解。 评价RNA质量的标准是RNA的均一性和完整性。均一的RNA取决于有效的去除RNA提取物中的DNA、蛋白质和其他杂质；完整的RNA取决于最大限度地避免纯化过程中内源性及外源性RNA酶对RNA的降解。通常采用紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度，纯RNA的A260/A280=2.0，但由于所用的标本不同，此比值有一定的变化，一般在1.8~2.0之间，低于改值表明有蛋白污染，需进一步用酚/氯仿抽提。RNA的完整性可通过琼脂糖电泳法进行鉴定。完整的RNA电泳时，28S和18SrRNA经EB染色后，两条电泳条带的显色强度近似为2比1。 本实验中几个重要试剂的作用： Trizol试剂：Trizol的主要成分是苯酚、异硫氰酸胍、十二烷基肌氨酸钠、β-巯基乙醇、醋酸钠、柠檬酸钠。它的主要作用是1、裂解细胞，使细胞中的蛋白、核酸物质解聚得到释放。2、使蛋白质变性，有利于DNA和RNA与蛋白质的分离。3、抑制内源和外源RNase。 氯仿：氯仿的作用有多个方面，一、作为有机溶剂变性蛋白，使其沉淀并通过离心除去。二、通过变性作用抑制RNase活性；三、通过氯仿把水相里参与的苯酚抽提掉；四、作为溶剂抽提样品中的一些脂溶性杂质（比如油脂、脂溶性色素等），起到一定除杂作用。 异丙醇：异丙醇是沉淀核酸用的，作用和乙醇一样。只不过用量要比乙醇少。异丙醇是等体积，而乙醇一般需要2.5倍体积。在水相很多，离心管容积有限，加不下太多乙醇的时候一般会用异丙醇沉淀。 75%乙醇：应用无水乙醇+DEPC水制备。用乙醇洗涤沉淀，可去除所有残留的蛋白质和无机盐.RNA样品中如果含有无机盐,有可能对后续实验操作中的一些酶促反应产生抑制作用。 实验步骤按规定的操作步骤进行操作，特别注意创造一个无RNA酶的环境。实验结果 经RNA琼脂糖电泳后，紫外灯下观察RNA分离情况如下图：
鼻饲的注意事项.
鼻饲的注意事项 鼻饲饮食的注意事项： ①鼻饲饮食的量应遵医嘱，从少量开始逐步增加，一般每天1200～1500ml，6～7次/天，每次200ml； ②鼻饲饮食的温度为38℃，温度过高烫伤粘膜，温度过低引起胃部不适； ③鼻饲饮食应现配现用，未用完的冰箱保存，24小时内用完，用时温水浸泡后使用； ④滴注时不能加入粉状物，以防堵管。不能加入酸性较强的食物（如西红柿）或药物（维生素C），以防凝块。 2.鼻饲操作时的注意事项： ①插管时遇到阻塞，应停止插管，检查原因，不能强插，以免组织损伤。 ②注入食物后，不得搬动病人，可稍抬高床头，防止呕吐。 ③每次放入、取出胃管、注食前后都应夹闭胃管末端，防止空气进入。 ④长期鼻饲的病人，每1-2周更换胃管一次(夏天);每3-4周更换胃管一次(冬天)。 （1）根据病人情况和需求制定膳食种类。 （2）家庭自备鼻饲膳食要注意餐具卫生并用清洁纱布过滤。 （3）配制鼻饲液时最好现用现配。
（4）鼻饲液温度控制在38～40℃。可将鼻饲液滴在上肢前臂内侧试温。 （5）灌注药液前先核对药物，确认准确无误再研碎，用温开水融解后灌入胃内。 （6）每次灌入后用少量温开水冲洗胃管，以免堵塞胃管。 （7）加强口腔护理，预防并发症。 （8）一般胃管每周更换一次，换管时先将管子轻柔、迅速拔出，冲洗后晾干消毒以备以后使用，经济情况允许可更换新的鼻饲管。3．1 防止误吸 鼻饲时要抬高床头，使之成30°～60°的角。在病情允许的情况下，可采取半卧位，头偏向健侧，防止返流误吸。鼻饲后30min 不要翻身和搬动病人。 3．2 避免胃潴留和腹胀 严重脑卒中时，中枢神经系统功能障碍，影响迷走神经对胃运动的调节；下丘脑调节失衡，血管收缩常引发胃黏膜缺血、缺氧，从而影响胃的正常消化功能；过多的胃内容物刺激十二指肠肠壁上的脂肪和渗透压感受器，通过胃肠反射抑制胃排空。因此，脑卒中的病人要多餐少量，必要时给予胃黏膜保护的药或胃动力药。
鼻饲的注意事项
鼻饲 目的 1、通过胃管提供食物及药物 2、对不能由口进食者,如昏迷、口腔疾患等 3、拒绝进食的患者 4、早产儿及病情危重的患者 操作要点 ⒈首先就是注入少量温开水,然后给膳食,最后再用温开水冲管。 ⒉两次膳食之间可加用果汁、菜汁、温开水等,以增加水分。 ⒊每次注入膳食前应用纱布过滤,以防胃管堵塞。 ⒋膳食与饮料的温度应在摄氏38-40度,流经胃管的速度不宜过快,每次注入量不超过200毫升。 ⒌每次抽吸鼻饲液后应反折胃管末端,避免灌入空气,引起腹胀。 ⒍鼻饲完最后应用温水冲洗胃管,防止鼻饲液寄存变质造成胃肠炎或堵塞胃管、 7、灌注完毕,将胃管末端反折,用线绳扎紧,纱布包好,整理用物,并做好记录。 注意事项 ⒈注意预防鼻饲引起的腹泻:①患者对鼻饲要有一段适应过程,开始时膳食宜少量、清淡,逐渐加量,中午食量稍高于早晚,每日5-6次。②灌注的饮料过冷、过热,均可引起腹泻或胃肠反应。因此,灌注前可以手背侧皮肤测试饮料温度,以不感觉烫为宜。③食物、餐具与灌注时应注意卫生,膳食应新鲜配制。④注意膳食的调节,如排便次数多,大便酸臭,可能就是进入过多的糖类所致;大便稀臭,呈碱性反应,可能为蛋白质消化不良。 ⒉胃管保留时间:一般7-10天更换1次,硅胶胃管每月更换一次,在末次灌注后拔出,次晨更换,插入另一侧鼻孔。每日应清洁鼻腔,加强口腔卫生,以预防并发症。 ⒊注意观察:胃管就是否在胃中。在为病人吸痰时可刺激气管造成剧烈咳嗽,或同时出现呕吐反射,使胃内压上升而发生返流现象,有可能使胃管脱出而盘绕在口腔内。 ⒋拔管:动作宜轻柔而迅速,以免引起呕吐或返流液被吸入气管。 5、每次注入量200ML,间隔时间2个小时,注射前后用温开水冲管。
护理资格知识禁忌使用鼻饲法的患者解析
1.禁忌使用鼻饲法的患者是(E) A．口腔手术后 B．破伤风患者 C．昏迷患者 D人工冬眠患者 D．食管静脉曲张出血者 2.不适合昏迷患者口腔护理的用物是(D) A．石蜡油 B．压舌板 C．弯血管钳 D．吸水管 E．治疗碗 3.溃疡病患者出现下列哪项病情提示有穿孔发生(D) A．饮量突然减少 B．嗳气反酸加重 C．恶心、腹胀明显 D．上腹剧痛、腹肌紧张 E．常发生“午夜痛” 4.王某下楼时不慎致踝关节扭伤，2小时后来医院就诊，正确的处理方法是：(B) A．局部用热水袋 B．局部用冰袋 C．局部按摩
D．冷热敷交替使用 5.下列哪项不是清洁的目的：(C) A．去除潜在病原微生物 B．减少接触感染的机会 C．保持物品美观 D．预防医院感染 6.急性结膜炎的临床症状是(C) A．视力减退 B．角膜混浊 C．眼分泌物增多呈脓性 D．眼分泌物结痂 E．睑结膜、穹窿结膜不充血 7.红细胞膜上含有A抗原者其血型为：(C) A．A型 B． B型 C．A型或A B型 D． B型或A B型 8.精神病患者的特殊法不包括下列哪项(C)
A．心理治疗 B．药物治疗 C．休克疗法 D．激素治疗 E．康复训练 9.麻醉前应用抗胆碱能药物的主要作用是：(B) A．减少麻醉药的不良反应，消除不利的神经反射B．抑制唾液腺、呼吸道腺体的分泌 C．镇静，缓解焦虑 D．提高痛阈，增强麻醉镇痛效果 10.心力衰竭概念的最重要的内容是(A) A．心排血量不能满足机体需要 B．心排血量相对降低 C．心排血量绝对降低 D．心肌舒张功能障碍 E．心肌收缩功能障碍 11.大咯血病人首要的护理措施是：(A) A．保持呼吸道通畅 B．高浓度氧疗 C．防止大出血休克 D．使用呼吸兴奋剂 12.结核菌素试验的原理是(D)
鼻饲注意事项
1、必须通过三种方法验证胃管是否在胃内。 2、操作前评估：患者年龄、生命体征、神志、血氧饱和 度（大于74%）、伴随症状（如肺部炎症、慢支、肺气肿等） 3、不可反复试插，必须有间隔。 4、无论患者清醒与否，在胃管插入15cm时须将患者头 部抬起，使下颌贴近胸骨柄，便于胃管置入。 5、听气过水声时听诊器放置位置为剑突下稍篇左侧，并 注意与肠鸣音的区别。 6、胃管插入长度为成人45—55cm，应根据患者的身高等 确定个体化长度。为防止反流、误吸，插管长度可在55cm以 上，若需经胃管注入刺激性药物，可将胃管再向深部插入 10cm.。 7、体位：能配合者取半卧位或坐位，无法坐起者取右侧 卧位，昏迷患者取去枕平卧位，头向后仰。 8、鼻饲液温度应保持在38—40℃，避免过冷或过热，新 鲜果汁与奶液应分别注入，防止产生凝块，药片应研碎溶解后 注入，每次鼻饲量不超过200ml，间隔时间大于2小时。 9、拔管时用纱布包裹近鼻孔处的胃管，嘱患者深呼吸， 在其呼气时拔出，边拔边用纱布擦胃管，到咽喉处快速拔出， 避免管内残留液体滴入气管。 10、食管静脉曲张、食管梗阻的患者禁忌使用鼻饲法。 11、每次鼻饲前应证实胃管在胃内且通畅，并用少量温水 冲管后再进行喂食，鼻饲完毕后再次注入少量温开水，防止鼻 饲液凝结。 12、长期鼻饲者应每天进行2次口腔护理，并定期更换胃 管。 13、每次抽吸鼻饲液后应反折胃管末端，避免灌入空气， 引起腹胀。 14、鼻饲完毕后应冲净胃管，防止鼻饲液积存于管腔中变 质造成胃肠炎或堵塞管腔。 15、鼻饲前应将床头抬高30-35°，可避免进食过程中及进食后的呛咳、返流、呕吐等情况，减少肺炎的发生。 16、回抽有胃液时，观察有无消化道出血或胃潴留（如血性、咖啡色胃液或空腹胃液大于1000ml），此时应停止鼻饲，待症状好转后再行鼻饲。如无异常可缓慢注入少量温开水，然后再灌注鼻饲药物或流食。
PCR和RT-PCR区别
PCR和RT-PCR PCR和RT-PCR基础 PCR基础 聚合酶链式反应（PCR）过程利用模板变性，引物退火和引物延长的多个循环来扩增DNA序列。这是一个指数增长的过程，因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板，使其成为检测核酸的一种非常灵敏的技术。一般，经过20-30个循环得到的扩增产物就足够在溴化乙锭染色的凝胶上观察到。反应包括几个成分（表1）。模板可以为纯化的基因组或质粒DNA；由RNA转化得到的cDNA；或未经纯化的粗制生物样品，如细菌克隆或噬菌斑。引物确定了扩增产物的序列和长度。最常用的热稳定聚合酶是Taq DNA聚合酶。这种酶适用于常规扩增，但是使用其他热稳定聚合酶会改善结果。扩增反应还包括缓冲液，三磷酸脱氧核苷及镁离子。镁离子浓度影响酶的活性、引物退火、模板和PCR产物的熔点（Tm），忠实性以及引物二聚体的形成等。在随后的章节中将讨论这些成分、循环参数以及其他参与作用的因子相互间各种作用对于成功PCR的影响。 表1.反应成分 Component Final Concentration Template 10^4-10^6 copies of DNA template Primer 1 0.1-0.5μM Primer 2 0.1-0.5μM 10X Reaction buffer 1X Magnesium 1.0-3.0mM dNTP mix 200 mM each dNTP Thermostable DNA polymerase 1-4 units/100 ml reaction RT-PCR基础 RT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成同PCR结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶
rtpcr注意事项
RT-PCR技术 RT-PCR简介 RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。 RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。（检测基因表达的方法，参见Northern Blot法。） RT-PCR有时候也会指代实时PCR(real-time PCR)。为了与逆转录PCR 相区别，通常被写作“定量PCR”(quantitative PCR)或者 RTQ-PCR(real-time quantitative PCR)。 实时PCR 实时PCR(real-time PCR)，属于定量PCR（Q-PCR）的一种，以一定时间内DNA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。 real time PCR 的定量使用萤光色素，目前有二种方法。一种是在ds DNA （双链DNA）中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅DNA序列中特定寡核酸序列相结合的一种萤光探针（probe）。 real time PCR 与reverse transcription PCR(反转录PCR) 相结合，能用微量的RNA来找出特定 时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。这两种RT PCR的组合又被称之为“定量RT-PCR（quantitative RT-PCR）” RT-PCR技术相关试剂 oligo: 多聚体，相当于mRNA引物 AMV（M-MLV）：逆转录酶 dNTP：脱氧核苷酸 RNase：RNA酶抑制剂
PCR Buffer：RT-PCR缓冲液 MgCl2：2价镁离子 （一）预变性： 破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。使DNA充分变性，减少DNA 复杂结构对扩增的影响，以利于引物更好的和模板结合，特别是对于基因组来源的DNA模板，最好不要吝啬这个步骤。此外，在一些使用热启动Taq酶的反应中，还可激活Taq酶，从而使PCR反应得以顺利进行。 （二）变性--退火--延伸循环： ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为 反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。 （三）PCR仪扩增循环后72度延伸10分钟 用PCR仪扩增时,(变性.退火,延伸)循环完成后,继续72度延伸了10分钟的原因： 1.延伸时间取决于待扩增DNA片段的长度。（当然是在反应体系一定的条件下）例如，使用taqDNA聚合酶，72度时的碱基掺入率为35-100bp/s，因此延伸速率为1kb/min。 2.根据延伸速率推得，扩增1kb以内的dna片段1min即可，而3-4kb 则需要3-4min，依次照推。通常在最后一轮要适当的将延伸时间延长至 4-10min，这样做是使pcr反应完全以提高扩增产量。 3.继续72度延伸了10分钟除了可以使pcr反应完全以提高扩增产量外，还有一个作用是：在用普通taq酶进行PCR扩增时在产物末端加A尾的作用，可以直接用于TA克隆的进行。 RT-PCR的注意事项
RT-PCR实验报告
逆转录pcr rt-pcr 为反转录rcr（reverse transcription pcr ）和实时pcr（real time pcr）共同的缩写。逆转录pcr，或者称反转录pcr(reverse transcription-pcr, rt-pcr)，是聚合酶链式反应(pcr)的一种广泛应用的变形。在rt-pcr 中，一条rna链被逆转录成为互补dna，再以此为模板通过pcr进行dna扩增。 由一条rna单链转录为互补dna(cdna)称作“逆转录”，由依赖rna的dna聚合酶（逆转 录酶）来完成。随后，dna的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖rna的dna聚合酶完成， 随每个循环倍增，即通常的pcr。原先的rna模板被rna酶 h降解，留下互补dna。 rt-pcr的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的rna。rt-pcr广泛应用 于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种rna的含量。（检测基因表达的方法，参见 northern blot法。） rt-pcr有时候也会指代实时pcr(real-time pcr)。为了与逆转录pcr相区别，通常被写 作“定量pcr”(quantitative pcr)或者rtq-pcr(real-time quantitative pcr)。 实时pcr 实时pcr(real-time pcr)，属于定量pcr（q-pcr）的一种，以一定时间内dna的增幅量 为基础进行dna的定量分析。 real time pcr 的定量使用萤光色素，目前有二种方法。 一种是在ds dna中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅dna序列中特定寡核酸序 列相结合的一种萤光探针（probe）。 real time pcr 与 reverse transcription pcr 相 结合，能用微量的rna来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。这两种rt pcr 的组合又被称之为“定量rt-pcr（quantitative rt-pcr）” rt-pcr技术相关试剂 oligo: 多聚体，相当于mrna引物 amv（m-mlv）：逆转录酶 dntp：脱氧核苷酸 rnase：rna酶抑制剂 pcr buffer：rt-pcr缓冲液 mgcl2：2价镁离子 pcr各步骤的目的 （一）预变性： 破坏dna中可能存在的较难破坏的二级结构。使dna充分变性，减少dna 复杂结构对 扩增的影响，以利于引物更好的和模板结合，特别是对于基因组来源的dna模板，最好不要 吝 啬这个步骤。此外，在一些使用热启动taq酶的反应中，还可激活taq酶，从而使pcr 反应得以顺利进行。 （二）变性--退火--延伸循环： ①模板dna的变性：模板dna经加热至93℃左右一定时间后，使模板dna双链或经pcr 扩增形成的双链dna解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板dna与引物的退火(复性)：模板dna经加热变性成单链后，温度降至55℃左右， 引物与模板dna单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：dna模板--引物结合物在taqdna聚合酶的作用下，以dntp为反应原料， 靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板dna 链互补的半保留复 制链。 （三）pcr仪扩增循环后72度延伸10分钟 用pcr仪扩增时,(变性.退火,延伸)循环完成后,继续72度延伸了10分钟的原因：
鼻饲的注意事项
鼻饲的注意事项 IMB standardization office【IMB 5AB- IMBK 08- IMB 2C】
二.鼻饲的注意事项 1.鼻饲饮食的注意事项：①鼻饲饮食的量应遵医嘱，从少量开始逐步增加，一般每天1200～1500ml，6～7次/天，每次200ml；②鼻饲饮食的温度为38℃，温度过高烫伤粘膜，温度过低引起胃部不适；③鼻饲饮食应现配现用，未用完的冰箱保存，24小时内用完，用时温水浸泡后使用；④滴注时不能加入粉状物，以防堵管。不能加入酸性较强的食物（如西红柿）或药物（维生素C），以防凝块。 2.鼻饲操作时的注意事项：①插管时遇到阻塞，应停止插管，检查原因，不能强插，以免组织损伤。②注入食物后，不得搬动病人，可稍抬高床头，防止呕吐。③每次放入、取出胃管、注食前后都应夹闭胃管末端，防止空气进入。④长期鼻饲的病人，每1-2周更换胃管一次(夏天);每3-4周更换胃管一次(冬天)。 （1）根据病人情况和需求制定膳食种类。 （2）家庭自备鼻饲膳食要注意餐具卫生并用清洁纱布过滤。 （3）配制鼻饲液时最好现用现配。来源：考试大 （4）鼻饲液温度控制在38～40℃。可将鼻饲液滴在上肢前臂内侧试温。 （5）灌注药液前先核对药物，确认准确无误再研碎，用温开水融解后灌入胃内。 （6）每次灌入后用少量温开水冲洗胃管，以免堵塞胃管。 （7）加强口腔护理，预防并发症。 （8）一般胃管每周更换一次，换管时先将管子轻柔、迅速拔出，冲洗后晾干消毒以备以后使用，经济情况允许可更换新的鼻饲管。 3．1防止误吸
鼻饲时要抬高床头，使之成30°～60°的角。在病情允许的情况下，可采取半卧位，头偏向健侧，防止返流误吸。鼻饲后30min不要翻身和搬动病人。 3．2避免胃潴留和腹胀 严重脑卒中时，中枢神经系统功能障碍，影响迷走神经对胃运动的调节；下丘脑调节失衡，血管收缩常引发胃黏膜缺血、缺氧，从而影响胃的正常消化功能；过多的胃内容物刺激十二指肠肠壁上的脂肪和渗透压感受器，通过胃肠反射抑制胃排空。因此，脑卒中的病人要多餐少量，必要时给予胃黏膜保护的药或胃动力药。 3．3预防腹泻 腹泻是鼻饲中常见的并发症，本组24例出现腹泻，原因多为消化不良，其次是灌注器俱被污染引发。所以应注意：①鼻饲前要给试餐液20～30ml，待胃肠功能适应后再给予正常的鼻饲液。②每次的鼻饲量一次不得超过200ml，做到量少多餐。③鼻饲液必须是当日配制，一切容器要进行消毒处理。 3．4防止便秘 患者长期卧床，肠蠕动减弱，鼻饲液又多为少纤维食物，对胃肠的刺激减弱，致使食物在肠内停留时间过长，水份过多吸收，造成粪便干结。因此，适时进行腹部按摩，促进肠蠕动；定时给以缓泻药；适当调整食物纤维含量，防止和减少便秘的发生。3．5杜绝发生高血糖 病人常因应激反应儿茶酚胺增高，代谢加快，使胰血糖素及胰岛素失衡。鼻饲液中的含糖高也是导致高血糖的重要原因。所以，鼻饲期间要密切监测血糖、尿糖，并及时调整鼻饲液的糖量。 五、应用鼻饲管的告知程序
RTPCR原理和实验步骤
RT—PCR原理与实验步骤 一、知识背景： 1、基因表达：DNA RNA Protein 单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因 104个丝心蛋白mRNA（每个mRNA存活4d,可以合成105个丝心蛋白) 共合成109个丝心蛋白。因此单拷贝基因的mRNA表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。 2、PCR技术(Polymerase chain reaction）：即聚合酶链式反应。 在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。反应分三步： A。变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA； B.退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合. C。延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2＋存在下，退火引物沿5’3’方向延伸。以上三步为一个循环,如此反复。 3、逆转录酶和RT-PCR 逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶,至少具有以下三种活性： 1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链; 2、Rnase水解活性：水解RNA：DNA杂合体中的RNA； 3、依赖DNA的DNA聚合酶活性:以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA。 二、RT—PCR的准备: 1。引物的设计及其原则： 1）引物的特异性决定PCR反应特异性.因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型,不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA对引物的特异性的影响。尽量选择覆盖相连两个内含子的引物,或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。 2) 引物设计原则的把握 引物设计原则包括： a、引物长度：一般为15～30bp ，引物太短会影响PCR的特异性，引物太长PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最适温度,也影响反应的特异性。 b、碱基分布:四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现3个以上的单一碱基。GC含量（Tm值）:40％～60％，PCR扩增的复性温度一般是较低Tm值减去5～10度.
鼻饲病人的饮食护理(范文)精选
鼻饲病人的饮食护理 一、胃管留置时间： 普通胃管每周更换1次，硅胶管每月更换1次，于晚间末次喂食后，将管快速拔除，同时夹紧管口，以免液体流入气管，次日晨换管由另一侧鼻孔插入。 二、鼻饲时的体位： 脑血管意外患者由于咳嗽、吞咽反射低下及贲门括约肌处于开放状态胃液易返流而造成误吸，甚至合并肺炎。鼻饲前应将床头抬高30-40度，可避免进食过程中及进食后的呛咳、返流、呕吐等情况，减少肺炎的发生。同时，在脑卒中时由于肢体健侧吞咽功能好于患侧，鼻饲时头偏向健侧，可明显降低胃反流的食物误吸入气管。特别应注意的是鼻饲后保持半卧位30-60分钟后再恢复平卧位，以免吸气时将食物吸入肺部，造成窒息。 三、温度： 食物要冷却至38-40度，放于前臂内侧而不觉烫，方可注入。鼻饲温度过高或过低，可能烫伤或冻伤黏膜。 四、常用鼻饲饮食及量 常用鼻饲饮食包括混合奶和匀浆饮食。混合奶的可用食物包括：牛奶、豆浆、熟鸡蛋、浓米汤、肉汤、蔗糖、植物油、食盐等。匀浆饮食的可用食物包括：米饭、米粥、面条、馒头、鸡蛋、鱼、虾、鸡肉、瘦肉、猪肝、蔬菜、油、盐等。
鼻饲病人需要一个适应过程，开始时鼻饲量应少而清淡，以后逐渐增多。昏迷或较长时间未进食者，第一、二天以混合奶为主，每次50~100毫升，4小时喂一次，如无特殊不适，从第3天开始，即可进食匀浆膳。长期进食匀浆膳的病人，每次灌注量包括水在内一般应在200-400毫升，每日3～4次，加水数次，每日总量在1500~2000毫升之间。 五、鼻饲时需注意事项： 1、灌注饮食前后要注意观察胃管是否在胃中。在病人剧烈咳嗽，或出现呕吐反射时，可使胃内压上升而发生返流现象，有可能使胃管脱出而盘绕在口腔内。 2、每次鼻饲前应先回抽。有胃液时，观察有无消化道出血或胃潴留（如血性、咖啡色或空腹胃液大于1000毫升），此时应停止鼻饲，待症状好转后再行鼻饲。如无异常可缓慢注入少量温开水（30毫升），然后再灌注鼻饲药物或流食。药物应将药片研碎，溶解后灌入。鼻饲速度应缓慢，并随时观察病人的反应。每次抽吸鼻饲时应将胃管返折，返折胃管可避免空气进入胃内造成腹胀。 3、鼻饲后用温水30毫升冲洗胃管，避免食物残留在胃内发酵或变质，引起病人胃肠炎或堵塞管腔。将胃管末端返折并用纱布包好，皮筋系紧，如用三通的应每天冲洗三通。 4、主动与被动活动，如床上肢体运动、坐轮椅在室内、外活动，主要是促进肠蠕动利于消化吸收。 5、注意口腔清洁每日做口腔护理。可以保持口腔清洁、湿润、预防口腔的溃疡以及感染等并发症；还可以防止口臭、口
RTPCR
RT-PCR 试剂配制 (1)O.1％DEPC水：l ml DEPC+1000 ml双蒸水，高压灭菌后用于配制RNA提取的相关试剂。如果浸泡RNA提取的相关器皿，则应在DEPC水配制后立即使用。(2)10 mg·ml-1溴乙锭：1 g溴乙锭溶于100 ml去离子水中，避光保存，溴乙锭的工作浓度为0.5μg·ml-1。 (3)5×TBE储存液:Tris 54g,硼酸 27.5g，EDTA pH8.0(固体NaOH调,先配100ml) 20ml，定容到1L。(每种药品都用蒸馏水先溶解，都比较难溶，再互溶效果好点。) 0.5×TBE工作液是5×TBE储存液稀释10倍。 (4)1％琼脂糖凝胶：0.3 g琼脂糖溶于30 ml 0.5×TBE溶液中，在微波炉中加热充分溶解琼脂糖，待溶液冷却至60℃左右，加入10 mg·ml-1溴乙锭溶液1μL(终浓度为O.5μg·ml-1)，将琼脂糖溶液倒入制胶模中，在适当位置处插上梳子。凝胶的厚度一般在3-5mm之间。在室温下使胶凝固，然后点样放置于电泳槽中进行电泳。 RNA提取前的准备 1.组织保存：小鼠处死后脏器迅速冻存于液氮罐中。 2. 研钵，剪刀及镊子的处理 1) 自来水反复冲洗；2) 去污剂或者洗涤灵冲洗；3) 自来水反复冲洗；4) 用锡箔纸包裹研钵研棒等，180度干烤4－8小时，除去RNAase 3. 枪头及EP管（0.5ml,1.5ml，5ml）的处理 1) 0.1%DEPC水浸泡1～2天；2) 用镊子夹起枪头一一装入枪头盒中，用镊子夹起EP管放入饭盒中；3) 高压灭菌50min，45度烘箱烘干（需几天）。 RT-PCR方法 总RNA的提取： 1.组织匀浆：先放入液氮入碾钵内，把分装放入液氮中的一份肝脏入碾钵内，碾磨，边加液氮边碾磨。用DEPC水处理的1.5ml的EP管刮下碾钵上的肝脏，加入1ml RNAVzol混匀。裂解产物应呈澄清的透明粘稠液体。室温放置5分钟。对于多糖、蛋白等杂质丰富的组织样品，匀浆后仍会存留有不溶物质，可12,000 g 4℃离心10分钟，然后吸取上清至一新的DEPC水处理的1.5ml离心管中。 2.分离： 在装有裂解物的离心管中加入0.2倍体积的氯仿（1 ml RNAVzol加入0.2 ml氯仿），振荡器上充分振荡混匀30 秒，室温放置2-3分钟。12,000 g 4℃离心10分钟，然后吸取含总RNA的上层水相至一新的DEPC水处理的1.5ml离心管中，每毫升RNAVzol约可吸取0.5～0.55 ml。有机相和中间层含有DNA和蛋白质，应避免触及。 3.沉淀： 按每毫升最初的RNAVzol加入0.5 ml异丙醇，颠倒数次混匀，室温沉淀10分钟。12,000 g4℃离心10分钟，在管底可见RNA沉淀。弃上清，每毫升最初的RNAVzol
实时荧光定量PCR(qPCR)技术简介
实时荧光定量 PCR 技术简介 实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是一项以PCR 反应为基础的DNA 定量技术，通过对目标基因在扩增过程中产生的拷贝数进行实时的定量，从而达到对目的基因 的定性和定量分析。现有两种常用的方法对PCR 产物进行荧光定量：一种是利用荧光染料 与双链DNA 结合，通过荧光强度进行定量；另一种是利用携带了荧光报告基团的特异DNA 探针对目标基因进行定量。 一、利用荧光染料进行定量 一种最为常用的定量方法就是在PCR 反应体系中加入荧光染料，此类荧光染料会与所 有的双链DNA 结合，并产生荧光。游离的荧光分子不会产生荧光信号，只有与双链DNA 结合的荧光分子才会释放荧光，随着DNA 拷贝数的增加，测得的荧光强度也会增强。 利用荧光染料进行定量的优势就是成本低廉，只需要一对普通的引物就能完成定量。然而，常用的诸如SYBR Green 染料会与所有的双链DNA 无差别地结合，包括引物二聚体，因 此有可能会导致对目标基因的定量不精确，灵敏度偏低。 二、利用荧光探针进行定量 荧光探针只能检测出与自身序列互补的DNA 片段，因此用探针法定量可以有效地避免引物二聚体的干扰，使定量结果更加精确。此外，通过使用携带不同荧光信号的多种探针，我 们可以同时对一个样品中的多个靶序列进行定量。 荧光探针的5’端携带有一个荧光报告基团，3’端则为淬灭基团，在正常情况下两个 基团间的距离很近，淬灭基团会抑制报告基团使其无法发出荧光。在PCR 反应过程中，引 物和荧光探针在退火阶段都会与目的片段结合；在延伸阶段，Taq 酶因为具有5’-3’核酸 外切酶活性，会将探针，使得报告基团和淬灭基团相互分开，从而释放出荧光。每增加一条目 的基因的拷贝，就会有一个探针被切开并释放荧光信号，因此随着PCR 反应的进行，荧光 信号会逐渐增强。 1 / 2
rtpcr原理
RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。 首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在一只管中顺次进行。 逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性： 1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链 2、 Rnase水解活性：水解RNA杂合体中的RNA； 3、依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA. 用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。 试验前注意： 1. 做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug 2. RT按要求做，一般不会出太大问题。 3. PCR如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。 引物合成
实时荧光定量PCR(RT-qPCR)完全手册
实时荧光定量PCR（RT-qPCR）完全手册 所谓的实时荧光定量PCR就是通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。RT-qPCR是由三个步骤组成 RT-qRCR影响分析可靠性关键点(Key porint) 关键词：荧光实时实时荧光定量PCRRT-qPCRRT-PCR反转录定量PCRQRT-PCR 方法简介 所谓的实时荧光定量PCR就是通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。 RT-qPCR是由三个步骤组成: 1.反转录:依赖反转录酶将RNA反转录成cDNDA; 2. 扩增:用PCR的方法扩增cDNA; 3.检测:实时检测和定量扩增的产物. RT-qRCR影响分析可靠性关键点(Key porint): 1.分析结果依赖于模板的数量、质量以及合理的检测方法设计 2.反转录反应的非标准化影响试验的稳定性 3.数据分析应该高度客观，如果不合理的分析，从分析结果中会得到混淆的错误结果，因此通过对RT-qPCR的每一组分进行质量评价以达到最小化变异性，最大化可重复性，而且还需要沿用一个通用的数据分析的指南。对基因表达分析的标准化的需要是与人类临床诊断分析相适应的。
存在的问题 由于各个学术团体和科研机构使用不同的操作流程，必然导致大家使用不同定量的来源物以及数据分析： 1.新鲜、冰冻、甲醛固定的样品 2.整个组织样本，显微切割样本，单个细胞，组培细胞 3.总RNA或者mRNA 4.RNA反转录成cDNA的不同的引发策略 5.不同的酶以及酶的不同组合 6.变异系数、灵敏度 7. 多类型的检测化学方法，反应的条件，热循环仪的分析以及汇报方式。 8.每一步骤缺乏标准化分析流程造成了在样品的处理，内参的使用，归一化的方法，质量控制等等因素严重影响RT-qPCR的可信度，重复性。 RNA 质量评价 现在RNA 定量的程序很多。最近EMBO qPCR course (http://www-db.embl.de/jss/Embl GroupsOrg/conf_28) 比较了用Ribogreen, Agilent BioAnalyser, spectrophotometer,Nan odrop and the BioRadExperion来定量同样的样品。结果显示没有哪两种方法得到同样的