聚合酶链式反应
聚合酶链式反应
聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。
PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。
PCR原理
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶
耐热DNA聚合酶--Taq酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
反应准备
其中dNTP、引物、模板DNA、Taq DNA聚合酶以及Mg2+的加量（或浓度）可根据实验调整。
PCR反应五要素：
引物(PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链）、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。
PCR所用的酶主要有两种来源：Taq和Pfu，分别来自两种不同的噬热菌。其中Taq扩增效率高但易发生错配。Pfu扩增效率弱但有纠错功能。
模板即扩增用的DNA，可以是任何来源，但有两个原则，第一纯度必须较高，第二浓度不能太高以免抑制
缓冲液的成分最为复杂，除水外一般包括四个有效成分：缓冲体系，一般使用HEPES或MOPS缓冲体系；一价阳离子，一般采用钾离子，但在特殊情况下也可使用铵根离子；二价阳离子，即镁离子，根据反应体系确定，除特殊情况外不需调整；辅助成分，常见的有DMSO、甘油等，主要用来保持酶的活性和帮助DNA解除缠绕结构
聚合酶链式反应PCR引物设计
PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。
引物设计的基本原则
①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。
②引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。
③引物内部不应出现互补序列。
④两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠。
⑤引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。
⑥引物3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G 和C。
⑦引物的5 ′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。
模板的制备
PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。
模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。
标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS 和蛋白酶K处理。难以破碎的细菌，可用溶菌酶加EDTA处理。所得到的粗制DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。
聚合酶链式反应反应的控制
①PCR反应的缓冲液提供合适的酸碱度与某些离子关于PCR反应条件控制
②镁离子浓度总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5mmol/L
③底物浓度dNTP以等摩尔浓度配制，20～200umol/L
④TaqDNA聚合酶2.5U(100ul）
⑤引物浓度一般为0.1 ～0.5umol/L
⑥反应温度和循环次数
变性温度和时间95℃，30s
退火温度和时间低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃
延伸温度和时间72℃，1min/kb(10kb内）
Tm值=4(G+C) +2(A+T)
循环次数：一般为25 ～30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”。
PCR reaction volume
1.PCR条件
94℃2minutes initial denaturation
94℃30s denaturation
57℃20s 34 Cycle annealing
72℃1minute extension
72℃5minutes final extension
14℃forever refrigeration
聚合酶链式反应循环参数
聚合酶链式反应预变性
模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要，建议加热时间参考试剂说明书，一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。
聚合酶链式反应变性步骤
循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性，可能的情况下可缩短该步骤时间.变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。
聚合酶链式反应引物退火
退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。退火温度对PCR的特异性有较大影响。
聚合酶链式反应引物延伸
引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略
延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1min/kbp。
聚合酶链式反应循环数
大多数PCR含25-35循环，过多易产生非特异扩增。
聚合酶链式反应最后延伸
在最后一个循环后，反应在72℃维持10-30分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。
聚合酶链式反应步骤
标准的PCR过程分为三步：
聚合酶链式反应DNA变性
（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA
聚合酶链式反应退火
（60℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。
聚合酶链式反应延伸
（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳梯度PCR仪）的作用下，以dNTP 为原料，从引物的3′端开始以从5′→3′端的方向延伸，合成与模板互补的DNA链。
每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。
聚合酶链式反应检测
PCR反应扩增出了高的拷贝数，下一步检测就成了关键。荧光素（溴化乙锭，EB）染色凝胶电泳是最常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的，因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行，成为了主流检测方法.
聚合酶链式反应反应特点
聚合酶链式反应
PCR反应的特异性决定因素为：
①引物与模板DNA特异正确的结合；
②碱基配对原则；
③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；
④靶基因的特异性与保守性。
其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及TaqDNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合（复性）可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。
聚合酶链式反应灵敏度高
PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12）量级的起始待测模板扩增到微克（μg=-6）水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR 的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位）；在细菌学中最小检出率为3个细菌。
聚合酶链式反应简便、快速
PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析.
聚合酶链式反应纯度要求低
不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。
常见问题
PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚至消失。
不出现扩增条带。
PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及溴乙锭的使用，④PCR循环条件。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
聚合酶链式反应阴性
需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质,电泳检测,降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性；退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。
靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
聚合酶链式反应假阳性
出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。
出现非特异性扩增带
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法（93℃变性，65℃左右退火与延伸）。
出现片状拖带或涂抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓度。增加模板量，减少循环次数。
聚合酶链式反应克隆PCR产物
1）克隆PCR产物的最优条件是什么？
2）最佳插入片段：载体必需实验确定。1：1（插入片段：载体）常为最佳比，摩尔数比1：8或8：1也行。应测定比值范围。连接用5ul 2X连接液，50ng质粒DNA,1Weiss 单位的T4连接酶，插入片段共10ul。室温保温1小时，或4℃过夜。在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。室温保温1小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需4℃过夜。
2)PCR产物是否需要用凝胶纯化？
如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。
3）如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？
A）涂布未转化的感受态细胞。
如有菌落，表明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄抗型的菌落。
B）转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。
例如，将1ug/ul质粒1:100稀释，1ul用于100ul感受态细胞转化。用SOC稀释到1000ul 后，用100ul铺板。培养过夜，产生1000个菌落。转化率为：产生菌落的总数/铺板DNA 的总量。
铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用10ng DNA，用SOC稀释到1000u后含10 ng DNA，用1/10铺板，共用1 ng DNA。转化率为：
1000克隆X103 ng /铺板1 ng DNA ug=106cfu/ ug
转化pGEM-T应用108cfu/ ug感受态细胞
如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。
C）如用pGEM-T正对照，或PCR产物，产生>20-40蓝斑（用指定步骤108cfu/ug感受态细胞），表明载体失去T。可能是连接酶污染了核酸酶。T4DNA连接酶（M1801，M1804，M1794）质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来源的T4 DNA连接酶替换。
D）用pGEM-T或pGEM-T Easy载体，连接pGEM-T正对照，转化高频率感受态细胞（108cfu/ug），按照指定的实验步骤，可得100个菌落，其中60%应为白斑，如产生>20-40蓝斑，没有菌落或少有菌落，连接有问题。
4）对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？
A）连接用室温保温1小时，能满足大多数克隆，为提高效率，需4℃过夜。
B）插入片段带有污染，使3`-T缺失，或抑制连接，抑制转化。为此，将插入片段和pGEM-T正对照混合，再连接。如降低了对照的菌落数，插入片段需纯化，或重新制备。如产生大量的蓝斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy载体3`-T缺失。
C）插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段，因受UV过度照射，时有发生。UV 过度照射会产生嘧啶二聚体，不利于连接，DNA必需重新纯化。
D）带有修复功能的耐热DNA聚合酶的扩增产物末端无A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy载体克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。详情查pGEM-T pGEM-T Easy载体技术资料（TM042）。
E）高度重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如发现插入片段高频率地产生缺失和重排，需用重组缺陷大肠杆菌菌株，如SURE细胞
PCR反应体系与反应条件
标准的PCR反应体系：
10×扩增缓冲液10ul
4种dNTP混合物各200umol/L
引物各10～100pmol
模板DNA 0.1～2ug
Taq DNA聚合酶2.5u
Mg2+1．5mmol/L
加双或三蒸水至100ul
PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
聚合酶链式反应原则：
①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：参照引物设计的基本原则
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
聚合酶链式反应酶及其浓度
目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U（指总反应体积为100ul 时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
dNTP的质量与浓度
dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP 降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。
模板（靶基因）核酸模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。
Mg2+浓度Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。
聚合酶链式反应反应条件选择
PCR反应条件为温度、时间和循环次数。
温度与时间的设置：基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因（长度为100～300bp时）可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸（此温度Taq DNA 酶仍有较高的催化活性）。
①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃1min足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。
②退火（复性）温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
Tm值（解链温度）=4(G+C)+2(A+T)
复性温度=Tm值-(5～10℃）
在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。
③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃ 60核苷酸/S/酶分子
55℃ 24核苷酸/S/酶分子
高于90℃时，DNA合成几乎不能进行。
PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb 以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
聚合酶链式反应各种变体
1.递减PCR(touchdown PCR)：前几循环温度逐渐下降。
2.逆转录PCR(RT-PCR)：以由mRNA逆转录而来的DNA为模板，由此产生出来的DNA不带有内含子(基因中不具意义的段落)，常应用于分子克隆技术。
3.热启动PCR(hot start PCR)：以高热活化型核酸聚合酶进行反应，减少非专一性产物。
4.即时PCR(real-time PCR)：PCR过程中利用萤光探针或染料定量检测，又称定量PCR(quantitative PCR)。
5.巢式PCR(nested PCR)：先用低特异性引物扩增几个循环以增加模板数量，再用高特异性引物扩增。
6.多重PCR(multiplex PCR)：在同一个管中使用多组引物。
7.复原条件PCR(reconditioning PCR)：PCR产物稀释10倍后重新放入原浓度的引物和dNTP等循环3次，以消除产物中的异二聚体。
8.dsRNA合成(dsRNA replicator)：合并使用high-fidelity DNA polymersae、T7RNA
聚合酶与Phi6 RNA replicase；从双股DNA转录为对应的双股RNA(dsRNA)。可应用于RNAi实验操作。
9.COLD-PCR(co-amplification at l ower d enaturation temperature-PCR):用以检测突变或特殊等位基因的PCR应用技术。
聚合酶链式反应临床应用
用于治疗感染性疾病，肿瘤及遗传病
聚合酶链式反应感染性疾病
PCR在医学检验学中最有价值的应用领域就是对感染性疾病的诊断。理论上，只要样本有一个病原体存在，PCR就可以检测到。一般实验室也能检出10~100基因拷贝，而目前病原体抗原检测方法一般需要105-7个病原体才可检测到。PCR对病原体的检测解决了免疫学检测的“窗口期”问题，可判断疾病是否处于隐性或亚临床状态。
定量PCR研究资料已表明，病原体数量与感染性疾病病情的轻重程度、传染性及治疗效果均有相关性。许多研究表明，人类免疫缺陷病毒(HIV)感染后，潜伏期长短和临床症状轻重与血液中的病毒量显著相关；也有研究表明，HIV病毒载量低于一定值时，没有传染性。
在乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒定量研究中发现，病毒的数量与某些药物的疗效相关。例如，干扰素治疗对肝炎病毒高拷贝者不敏感，低拷贝者敏感；而有些药物则具有显著降低病毒高拷贝的作用。
聚合酶链式反应肿瘤
癌基因的表达增加和突变，在许多肿瘤早期和良性的阶段就可出现。PCR技术不但能有效的检测基因的突变，而且能准确检测癌基因的表达量，可据此进行肿瘤早期诊断、分型、分期和预后判断。
几乎所有慢性骨髓性白血病患者都可检测到原癌基因易位导致的BCR/ABL融合基因形成，定量PCR技术可通过检测BCR/ABL融合基因的表达确定微量残余恶性细胞存在的数量，以此作为治疗效果和估计复发的危险性的依据。
一些病毒致癌作用也与病毒载量有关，EB病毒载量的FQ-PCR检测结果已被用于鼻咽癌早期发现和随访。
聚合酶链式反应遗传病
PCR技术首次临床应用就是从检测镰状细胞和β-地中海贫血的基因突变开始的。基因的突变和缺失均会引起各种珠蛋白的表达不平衡，用FQ-PCR检测各种珠蛋白基因表达差异，是地中海贫血诊断的有效手段。
聚合酶链式反应试验污染
PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。
聚合酶链式反应污染原因
一、标本间交叉污染：标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染；标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染；有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。
二、PCR试剂的污染：主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。
三、PCR扩增产物污染：这是PCR反应中最主要最常见的污染问题。因为PCR产物拷贝量大（一般为1013拷贝/ml），远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可形成假阳性。还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染。在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。
四、实验室中克隆质粒的污染：在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比较常见。因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力。其污染可能性也很大。
聚合酶链式反应污染的监测
对照试验
一、阳性对照：在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高（100个拷贝以下）。但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大。因而当某一PCR试剂经自己使用稳定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照。
二、阴性对照：每次PCR实验务必做阴性对照。它包括：
1.标本对照：被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照；被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照。
2.试剂对照：在PCR试剂中不加模板DNA或RNA,进行PCR扩增，以监测试剂是否污染。
三、重复性试验。
四、选择不同区域的引物进行PCR扩增。
聚合酶链式反应
聚合酶链式反应 聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。 PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。 PCR原理 DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶 耐热DNA聚合酶--Taq酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 反应准备 其中dNTP、引物、模板DNA、Taq DNA聚合酶以及Mg2+的加量（或浓度）可根据实验调整。 PCR反应五要素： 引物(PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链）、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。 PCR所用的酶主要有两种来源：Taq和Pfu，分别来自两种不同的噬热菌。其中Taq扩增效率高但易发生错配。Pfu扩增效率弱但有纠错功能。 模板即扩增用的DNA，可以是任何来源，但有两个原则，第一纯度必须较高，第二浓度不能太高以免抑制
聚合酶链式反应
实验9 聚合酶链式反应（PCR）技术 【实验目的】 掌握PCR反应的原理及操作技术。 【实验原理】 PCR 技术实际上是在模板DNA、引物和4 种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于耐高温DNA 聚合酶的体外酶促合成反应。PCR 技术的特异性取决于引物和模板DNA 结合的特异性。反应分为三步：1 热变性：在高温条件下，DNA 双链解离形成单链DNA；2 退火：当温度突然降低时引物与其互补的模板在局部形成杂交链；3 延伸：在DNA 聚合酶、dNTPs 和Mg2+存在的条件下，聚合酶催化以引物为起始点的DNA 链延伸反应。以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，几十个循环之后，介于两个引物之间的特异性DNA 片段得到了大量复制，数量可达到10 6~7个拷贝。 【器材与试剂】 1．器材 DNA 扩增仪（PCR 仪）、台式离心机、微量取液器、硅烷化的PCR 小管、琼脂糖凝胶电泳系统 2．材料 模板DNA，单、双链DNA均可作为PCR的样品。 3．试剂 (1) 10×PCR 缓冲液 (2) MgCl2 15mmol/L (3) dNTP 混合物：每种2.5mmol/L (4) Taq DNA 聚合酶：5U/μl (5) 引物1和引物2：2 μmol/L (6) 琼脂糖凝胶电泳试剂 【操作步骤】 1. 在0.2ml Eppendorf 管内依次混匀下列试剂，配制20μl 反应体系。
ddH2O 7.8 μl 10×PCR 缓冲液 2 μl MgCl2（15mmol/L） 2 μl dNTP（2.5mmol/L） 2 μl 引物1 (2μmol/L) 2 μl 引物2 (2μmol/L) 2 μl 模板DNA 2 μl Taq DNA 聚合酶（5U/μL）0.2 μl 总体积20 μl 2．按下述循环程序进行扩增 程序阶段程序名称温度时间循环数 1 预变性94℃ 3 min 1 变性94℃30 sec 2 退火52℃30 sec 30 延伸72℃30 sec 3 保温4℃∞ 1 3．扩增结束后，取10μl 扩增产物进行电泳检测。 【要点提示】 1．在90~95℃下可使整个基因组的DNA变性为单链。一般94~95℃下30~60sec。时间过长使TaqDNA聚合酶失活。 2．退火温度一般在45~55℃。退火温度低，PCR特异性差；退火温度高，PCR特异性高，但扩增产量低。。 3．延伸温度一般在70~75℃。此温度下TaqDNA聚合酶活性最高。一般扩增产物长度小于1 kb，延伸时间30 sec即可。当扩增产物长度大于1 kb时，可适当延长延伸时间。
RNA的聚合酶链式反应
RNA的聚合酶链式反应：目前常用的RNA检测方法有原位杂交，点杂交，Northern印记杂交以及核酸酶保护试验等。这些方法的普遍缺点是难以检测低丰度的信使RNA，并且操作繁琐，将RNA反转录和PCR结合起来建立RNA聚合酶链式反应（RT-PCR）则可以克服上述缺点。 RT-PCR先在反转录酶的作用下以信使RNA为模板合成cDNA，再以CDNA为模板进行PCR反应。此法快速，简便，并且灵敏度高。此法可以检测单个细胞中少于10个拷贝的特异RNA。 RT-PCR 应用：分析基因的转录产物 克隆cDNA及合成cDNA探针， 改造cDNA序列等 RT-PCR中的关键步骤是RNA的反转录，要求RNA模板必须是完整。并且不含DNA，蛋白质等杂质。若RNA模板中污染了微量DNA，扩增后会出现特异DNA的PCR产物。而cDNA扩增产物却很少，必要时可用无ＲＮａｓｅ的ＤＮａｓｅ处理反转录产物，消除ＤＮＡ后在进行ＰＣＲ。如果蛋白质未除尽可与ＲＮＡ结合，从而影响反转录和ＰＣＲ反应。 常用的反转录酶有二种，也就是ＡＭＶ，和ＭｏＭＬＶ的反转录酶 ＡＭＶ反转录酶由二个不同亚基组成，具有较强的ＲＮａｓｅＨ活性。可水解ＲＮＡ模板，以ＲＮＡ模板合成单链ＤＮＡ的酶活性最适作用温度为４２摄氏度。ＭｏＭＬＶ反转录酶由一条多肽链组成，最适作用温度为３７摄氏度。ＲＮａｓｅＨ活性较低，适于合成大片段
全长ｃＤＮＡ 但是当模板ＲＮＡ的二级结构影响反转录反应时，用ＡＭＶ反转录酶更合适，因为较高的反应温度会消除ＲＮＡ二级结构的影响。此外ｉａ这二种反转录酶的缓冲液有所不同。 最近，从嗜热栖热菌ＨＢ８中分离得到Ｔｔｈ耐热ＤＮＡ聚合酶，此酶还具有反转录酶活性，９５摄氏度时该酶的半衰期为２０分钟具有５—３外切酶活性，无３—５外切酶活性，利用Ｔｔｈ耐热ＤＮＡ聚合酶同时具有反转录酶的特点，可以简化ＲＴ－ＰＣＲ，并且比Ｔａｑ聚合酶反应敏感度高１００倍。所以更优越。Ｔｔｈ聚合酶作用温度高，可消除ＲＮＡ的二级结构对反转录反应的影响，增加ＴｔｈＤＮＡ聚合酶的反转录的活性，可增加ＲＴ－ＰＣＲ反应灵敏性。 ＴｔｈＤＮＡ聚合酶的缺点：反转录酶活性需要二价锰离子，而二价锰离子会降低ＤＮＡ聚合酶的忠实性， ＴｔｈＤＮＡ聚合酶催化聚合反应的错误掺入率为１／５００
PCR(聚合酶链式反应)原理
PCR(聚合酶链式反应)原理 PCR 是体外酶促合成特异DNA片段的方法，主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成：即在高温（95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～55℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在T aq酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。 1971年Kleppe等人在Journal of molecular biology上发表文章首次准确、精炼、客观的阐述了PCR方法，1976年一种从嗜热水生菌(Thermus aquaticus)分离得到的热稳定的DNA依赖的DNA聚合酶的应用大大增加了PCR的效率。而现今所发展出来的PCR则是源于由Saiki和Mullis等人于1988年发表在Science上的一篇论文，Mullis当时服务于Perkin Elmer（PE）公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。后来PE被Applied Biosystems Inc.（ABI）公司收购、分拆、再转卖，而PCR的专利和倍受信赖的PCR仪器生产和销售就留在ABI名下。到如今，PCR方法愈发趋向自动化，并从中衍生出更多的新技术方法，可以说，PCR技术是支撑现代分子生物学发展的一块重要基石。这种技术的广泛应用催生了一个庞大的市场，多个公司均有各种类型的商品化PCR仪出售。PCR 的专利目前依然掌握在ABI和Roche（罗氏）两大公司手中，去年业界颇为引人瞩目ABI 诉MJ公司侵犯侵犯PCR仪知识产权案最终以MJ败诉并宣布破产、最终被Bio-rad收购暂告一段落。其后还会不会有后继的故事还需拭目以待。 PCR原理 DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶的作用下，以单链为模版，根据碱基互补配对原则复制成新的单链，与模版配对成为双链分子挎贝。在体外实验中发现，DNA 在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计与模板DNA的5’端结合的两条引物，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制，多次重复“变性解链—退火—合成延伸”的循环就可以以几何级数大量扩增特定的基因。 发现耐热DNA聚合酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该类酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。 从PCR原理可以看出，PCR仪的关键是升降温的步骤。现在偶尔还能听到一些前辈们笑谈早年的PCR实验如何在3个水浴锅中完成的趣闻。经过不断改进，今天的PCR 已经越来越完善和智能化。出于市场推广的战略需要，各厂家的PCR仪型号不同，着力宣传的技术指标和参数也不尽统一，编者在这里简单列出选购时我们认为应该考虑的常用指标，希望有助于大家选购PCR仪的选购技巧。 PCR仪介绍及其选购 P CR仪的种类总体来说可以分为两大类：PCR扩增仪和实时荧光定量PCR仪，普通的PCR扩增仪又衍生出带梯度PCR功能的梯度PCR仪、和带原位扩增功能的原位PCR仪等等。1996年由ABI公司首先推出将扩增和检测融为一体的实时荧光定量
7、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR,rtpcr)
逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR，rtpcr） 逆转录-聚合酶链反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）可以：（1）分析基因的转录产物；（2）获取目的基因；（3）合成cDNA探针；（4）构建RNA高效转录系统。 逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA 高效转录系统。 实验材料：组织、细胞 试剂、试剂盒：RNA提取试剂、dNTP混合物、Taq DNA聚合酶、第一链cDNA合成试剂盒仪器、耗材：离心管、离心机、水浴锅、PCR管、电泳仪、凝胶图像分析系统、移液管、移液枪、离心管盒 一、反转录酶的选择 1．Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。 2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。 3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。 4．MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为Superscript 和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。 二、合成cDNA引物的选择 1．随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。 2．Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。3．特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR 反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。 三、试剂准备 1．RMA提取试剂 2．第一链cDNA合成试剂盒 3．dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM 4．Taq DNA聚合酶
1聚合酶链式反应PCR技术
实验1 聚合酶链式反应（PCR）技术 【实验目的】 掌握PCR反应的原理及操作技术。 【实验原理】 PCR 技术实际上是在模板DNA、引物和4 种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于耐高温DNA 聚合酶的体外酶促合成反应。PCR 技术的特异性取决于引物和模板DNA 结合的特异性。反应分为三步：1 热变性：在高温条件下，DNA 双链解离形成单链DNA；2 退火：当温度突然降低时引物与其互补的模板在局部形成杂交链；3 延伸：在DNA 聚合酶、dNTPs 和Mg2+存在的条件下，聚合酶催化以引物为起始点的DNA 链延伸反应。以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，几十个循环之后，介于两个引物之间的特异性DNA 片段得到了大量复制，数量可达到10 6~7个拷贝。 【器材与试剂】 1．器材 DNA 扩增仪（PCR 仪）、台式离心机、微量取液器、硅烷化的PCR 小管、琼脂糖凝胶电泳系统 2．材料 模板DNA，单、双链DNA均可作为PCR的样品。 3．试剂 (1) 10×PCR 缓冲液 (2) MgCl2 15mmol/L (3) dNTP 混合物：每种2.5mmol/L (4) Taq DNA 聚合酶：5U/μl (5) 引物1和引物2：2 μmol/L (6) 琼脂糖凝胶电泳试剂 【操作步骤】 1. 在0.2ml Eppendorf 管内依次混匀下列试剂，配制20μl 反应体系。
ddH2O 7.8 μl 10×PCR 缓冲液 2 μl MgCl2（15mmol/L） 2 μl dNTP（2.5mmol/L） 2 μl 引物1 (2μmol/L) 2 μl 引物2 (2μmol/L) 2 μl 模板DNA 2 μl Taq DNA 聚合酶（5U/μL）0.2 μl 总体积20 μl 2．按下述循环程序进行扩增 程序阶段程序名称温度时间循环数 1 预变性94℃ 3 min 1 变性94℃30 sec 2 退火52℃30 sec 30 延伸72℃30 sec 3 保温4℃∞ 1 3．扩增结束后，取10μl 扩增产物进行电泳检测。 【要点提示】 1．在90~95℃下可使整个基因组的DNA变性为单链。一般94~95℃下30~60sec。时间过长使TaqDNA聚合酶失活。 2．退火温度一般在45~55℃。退火温度低，PCR特异性差；退火温度高，PCR特异性高，但扩增产量低。。 3．延伸温度一般在70~75℃。此温度下TaqDNA聚合酶活性最高。一般扩增产物长度小于1 kb，延伸时间30 sec即可。当扩增产物长度大于1 kb时，可适当延长延伸时间。
聚合酶链式反应及其在基因诊断中的应用
聚合酶链式反应及其在基因诊断中的应用 聚合酶链式反应于1983年由美国Cetus公司的发明，并和定点突变的发明者一起荣获1993年度诺贝尔化学奖，为生命科学领域的研究开创了崭新时代。 一、PCR反应原理和反应过程 DNA的体外复制包括3个步骤： 变性（denaturation）:94 ?C ~95 ?C 退火（annealing）:40 ?C ~70 ?C 延伸（extension）:72 ?C 3个步骤作为PCR的一个循环，每当完成一个循环，一个分子的模板被复制为二个，产物量以指数形式增长。 二、PCR的反应体系和反应条件 （一）PCR反应体系 参与PCR反应的主要成份: 模板、引物、dNTP、Taq DNA聚合酶和缓冲液等。 1 模板 包括基因组DNA、RNA、质粒DNA、线粒体DNA等。RNA作为模板时，须先将RNA 逆转录为cDNA，再以 cDNA作为扩增的模板。模板量：1000ng、500ng、100ng、50ng? 2、引物（Primers） 引物决定PCR扩增产物的特异性和长度，是化学合成的寡核苷酸片段。引物的 合成可以采用化学方法。引物设计时必须遵循一些原则。 设计引物的原则： 1）二条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板正负链序列互补 2）长度为18 ~ 25个核苷酸 3）二条引物之间避免形成引物二聚体 4）引物的碱基组成应平衡 5）引物退火温度计算：Tm=2（A+T）+（C+G）
6）引物的5`端可被修饰（引入酶切位点、引入突变位点、生物素等标记） 3、脱氧核苷三磷酸（dNTP） 是dATP、dCTP、dGTP和dTTP4种脱氧核苷三磷酸的混合物。反应体系中各种核苷酸的浓度必须一致，浓度过高虽能加快反应速度，但非特异性扩增也随之增加 dNTP浓度：20 ~ 200umol/L,浓度升高增加非特异性扩增。 4、DNA聚合酶 从一种生活在热泉（80℃~90℃）中的水栖噬热菌（Thermus aquaticus, Taq）中提取，有很高的耐热稳定性。 Taq 酶的作用:模板指导下，以dNTP为原料，在引物3’-OH末端加上脱氧单核苷酸，形成3’, 5’ -磷酸二酯键，使DNA链沿5’→3’方向延伸，催化DNA合成。 最适酶量：（酶量过多，导致非特异性扩增） Taq DNA聚合酶复制的保真性，Taq DNA聚合酶无3’→5’外切酶活性，因而无校正功能，在复制新链的过程中会发生碱基错配。Taq DNA聚合酶在每次循环中产生的移码突变率为1/30000，碱基替换率为1/8000，故扩增的片段越长，错配的机率越高。 耐热的 DNA多聚酶有Pwo DNA polymerase、Tth DNA polymerase、Pfu DNA polymerase具有较高的热稳定性，较高的保真性，降低碱基错配率2 ~ 10倍。 5、镁离子浓度 镁离子浓度是一个至为关键的因素，对于反应系统本身、稳定核苷酸和提高Taq 酶的活性有直接影响。虽然Taq 酶的活性只与游离的Mg2+浓度有关，但PCR反应体系中dNTP、引物、模板DNA及鳌合剂的存在均可与Mg2+结合而降低游离Mg2+的浓度从而影响酶的活性。 当dNTP浓度为200umol/L时，MgCl2的浓度为L较宜。 6、其它反应因素 pH：调节至酶反应所需的最适pH（ pH =左右） 盐：合适的盐浓度有利于稳定杂交体，有利于引物与模板杂交 基质：BSA、gelatin 、Tween20、DTT等（牛血清白蛋白或明胶等基质可以保护Taq 酶的活性） （二）PCR的反应条件 反应温度（变性、退火、延伸） 反应时间（变性、退火、延伸）
逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)
逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成 cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。 详细 实验方法 ?逆转录-聚合酶链反应实验方法 实验材料 ?组织或细胞样品 试剂、试剂盒 ?RNA提取试剂 ?dNTP 混合物 ?Taq DNA聚合酶 ?第一链cDNA合成试剂盒 仪器、耗材 ?离心管 ?离心机 ?水浴锅 ?PCR管 ?电泳仪 ?凝胶图像分析系统 逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，R T-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。
一、反转录酶的选择 1．Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H 活性相对较弱。最适作用温度为37℃。 2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。 3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。4．MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为Superscript 和SuperScript Ⅱ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。 二、合成cDNA引物的选择 1．随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。 2．Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA 仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。 3．特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。 三、试剂准备 1．RMA提取试剂 2．第一链cDNA合成试剂盒 3．dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM 4．Taq DNA聚合酶 四、操作步骤 1. 总RNA的提取：见相关内容。
第五章聚合酶链式反应
第五章聚合酶链反应及其相关技术 PCR技术从Mullis最初建立到现在共约20多年时间，因为此技术具有高特异性、高敏感性和简便快捷等特点而备受人们广泛应用，许多新型的PCR技术或由PCR衍生的新技术正不断出现，使PCR技术由最初的单一技术体系逐步发展成为一系列的技术综合。PCR技术在体外快速特异地复制目的DNA序列，理论上能将极其微量的（pg DNA）目的基因在较短的时间内（通常1-3h）扩增达到纳克、微克甚至毫克级水平，使产物极易被检测。因此PCR技术目前已经成为人们获取目标基因的最常用的方法之一，Mullis因其杰出的贡献，于1993年获得了诺贝尔化学奖。 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR) 是体外酶促扩增DNA或RNA序列的一种方法，它是一种不需要借助于分子克隆而可以在体外快速繁殖、扩增DNA的技术,它与分子克隆（molecular cloning）、DNA测序（DNA sequencing）一起构成了分子生物学的三大主流技术。在这三项技术中，PCR技术自1983年由美国Cetus公司Kary.Mullis提出并于两年后建立以来，得到了快速的发展，成为最常用的分子生物学技术之一。这项技术使人们能够在数小时内通过试管中的酶促反应将特定的DNA片断扩增数百万倍，给生命科学领域的研究手段带来了革命性的变化。由于PCR技术的实用性和极强的生命力，PCR技术成为生物科学研究的一种重要方法，极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展。目前，一系列的PCR方法被设计开发出来，并广泛应用于基因扩增与分离、医疗诊断、基因突变与检测、分子进化研究、环境检测、法医鉴定等诸多领域。 5.1 PCR技术原理 聚合酶链式反应（PCR）是利用DNA片段旁侧两个短的单链引物，在体外快速扩增特异DNA片段的技术。它应用热稳定的聚合酶，通过双链DNA模板的热变性、引物退火和引物延伸的重复循环，DNA片段以指数方式增加了百万倍。从非常微量的DNA甚至单个细胞所含有的DNA起始，可产生ug量的PCR产物（见图5-1）。 在PCR反应中，欲扩增的目的DNA片段由两条单链组成。首先合成出与两条链两端互补的寡聚核苷酸引物(约含20个核苷酸)，然后将起始反应液中的模板DNA加热而变性解链。在降低温度复性时，引物分别与A，B链两端的互补序列配对结合。最后，在DNA聚合酶的催化下，以目的DNA片段为模板进行聚合反应。第一轮反应结束后，目的DNA增加了一倍。新合成的DNA片段本身又能作为下一轮反应的模板。如此反复进行，DNA片段的数目可以呈
聚合酶链式反应PCR实验报告
实验二聚合酶链式反应（PCR） 一、实验原理 聚合酶链式反应（PCR）是利用DNA片段旁侧两个短的单链引物，在体外快速扩增特异DNA片段的技术。它应用热稳定的聚合酶，通过双链DNA模板的热变性、引物退火和引物延伸的重复循环，DNA片段以指数方式增加了百万倍。从非常微量的DNA甚至单个细胞所含有的DNA起始，可产生ug量的PCR产物。 二、器材与试剂 1.器材：移液器，EP管，热盖PCR仪，电泳仪，量筒，锥形瓶，微波炉，电子天平，紫外照色仪 2.试剂：引物，模板，Taq DNA聚合酶，原料（dNTPs），缓冲液与Mg2+，H2O, 2*PCRmix溶液，DNA染料 三、实验步骤 PCR反应体系的建立 取离心管，依次加入试剂混匀 1．H2O 12μl 2．模板1μl 3．引物T7 1μl 4．引物sp6 1μl 5．2*PCRmix 15μl PCR仪的热循环反应 把离心管放入PCR仪中，由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成
1.模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 2.模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至 56℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 3.引物的延伸：经加热至72℃左右DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶 的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复该循环30次，每次需要2-3分钟。 电泳检测结果 扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中，电泳结束后，放到紫外照射仪中进行透射，电泳明胶显示清晰的条带，如下图所示加入的为1号样，出现在500bp左右条带，而预算结果为扩增出492bp条带，故实验成功。
聚合酶链式反应技术
聚合酶链式反应技术 引言：聚合酶链式反应（PCR）是20世纪80年代后期由K.Mullis 等建立的一种体外酶促扩增特异DNA片段的技术。PCR是利用针对目的基因所设计的一对特异寡核苷酸引物，以目的基因为模板进行的DNA体外合成反应。由于反应循环可进行一定次数，所以在短时间内即可扩增获得大量目的基因。PCR技术具有灵敏度高、特异性性强、操作简便等特点。虽然PCR技术也存在出错倾向高、产物大小受到限制和必须预先有目标DNA序列等缺点，但仍被誉为20世纪分子生物学研究领域最重大的发明之一。Mullis也因贡献卓著而获得1993年度诺贝尔奖。目前，PCR技术已广泛应用于分子生物学的各个领域，在分子克隆、法医学鉴定、DNA序列分析、致病基因的检测及考古学等方面都发挥着重要作用。 操作过程： 聚合酶链式反应用于扩增一小段已知的DNA片断，可能是单个基因，或者仅仅是某个基因的一部分。与活体生物不同的是，PCR 只能复制很短的DNA片断，通常不超过10kbp。DNA是双链分子，因此用互补DNA双链的构造单位（核苷酸）来度量其大小，单位为碱基对（base pair, bp）。某些特定的方法可以扩增40kbp左右的片断，但是这种大小与真核细胞的染色体DNA相比仍然是很少的。例如，人的体细胞DNA含有大约30亿个碱基对。目前应用的聚合酶链式反应需要几个基本组成： 1、DNA模板（template），含有需要扩增的DNA片断。
2、2个引物（primer），决定了需要扩增的起始和终止位置。（见下面引物一节） 3、DNA聚合酶（polymerase），复制需要扩增的区域。 4、脱氧核苷三磷酸（dNTP），用于构造新的互补链。 5、缓冲体系，提供适合聚合酶行使功能的化学环境。 聚合酶链式反应在热循环设备中进行。PCR仪可以将反应管加热或冷却到每步反应所需的精确的温度。为防止反应体系中液体产生蒸气，通常在反应管上加盖加热的盖子（比加热板温度来的高），或者在反应体系表面加入一层石蜡油。 引物 特定的引物决定了所扩增的DNA片断。引物是人工合成的短DNA片断，一般不超过50个碱基（通常18－25个），它们与所要扩增的DNA片断的起始和终止区域完全互补。在“黏合”时引物结合于DNA模板的起始和终止点，DNA聚合酶结合到这两个位置，开始合成新的DNA链。 选择引物的长度和熔点（Tm）要考虑许多条件。引物的熔点与聚合酶链式反应第一步中DNA的熔点不同，是指50％的引物与模板结合的温度，高于这个温度引物与模板就不能有效结合。这个温度随着引物长度的增加而升高。如果引物长度太短，就有可能与DNA模板的几个位置结合，造成非特异性复制。另一方面，引物长度也受限于Tm。如果Tm太高，即高于80℃，也会导致问题，因为DNA聚合酶在此温度下活性较低。引物最优长度通常为20到40个碱基，熔
聚合酶链式反应
定义 （英文全称：Polymerase Chain Reaction），
性的分析方法发展到定量测定；从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段。到目前为止，PCR技术已有十几种之多，例如，将PCR与反转录酶结合，成为反转录PCR，将PCR与抗体等相结合就成为免疫PCR等。 编辑本段技术原理 复制成同样的两分子挎贝。在
简便、快速 PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。 对标本的纯度要求低 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。 编辑本段反应五要素
4种dNTP混合物各200umol/L 引物各10～100pmol 模板DNA0.1～2ug TaqDNA聚合酶2.5u Mg2+1.5mmol/L 加双或三蒸水至100ul PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+) 编辑本段PCR反应条件的选择
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子 70℃ 60核苷酸/S/酶分子 55℃ 24核苷酸/S/酶分子 高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。 PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。 编辑本段酶及其浓度
第二篇第八章 多聚酶链式反应
第二篇技术篇 第八章多聚酶链式反应 1、基本原理 PCR技术是在模板DNA、引物（人工合成）、Mg2+和4种脱氧核糖核苷酸（dNTP）存在的条件下，利用DNA聚合酶（Taq酶）催化作用，经过DNA变性、引物与模板结合（复性）和延伸的循环过程，体外大量扩增特异DNA片段。 （1）引物设计与合成 设计合成一对与目的DNA片段两侧翼序列分别互补的寡核苷酸引物。其中一引物与目的区段上游一条模板链的序列相互补，而另一引物与目的区段下游另一条模板链的序列相互补。 （2）DNA模板的变性 加热或强酸、碱性作用可以使DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为DNA 的变性。 （3）模板与引物的结合（退火或复性） 解除变性的条件后, 变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性, 也叫退火。 （4）引物延伸 将反应体系温度升到72℃左右，在Mg2+存在的条件下，Taq聚合酶催化dNTP按碱基互补原则连接在DNA引物3ˊ端（5’→3’方向延伸），使引物延伸，形成两条与模板互补的新链。 以上为一次PCR循环（变性、复性和延伸），新合成的链可作为下一轮循环的模板 PCR原理Flash 演示 2、PCR反应体系与反应条件 （1）PCR反应体系 ◆模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 DNA模板一般100ng /100μL。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。 ◆引物浓度 0.1-0.5 μmol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降 ◆Taq DNA聚合酶 0.5-2.5 U/50 μl 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。 ◆dNTP 1
高中生物聚合酶链式反应技术
高中生物聚合酶链式反应技术2019年3月21日 （考试总分：100 分考试时长： 120 分钟） 一、单选题（本题共计 20 小题，共计 100 分） 1、（5分）下列对于相关实验共性的叙述，错误的是 A．“分离绿叶中的色素”和“胡萝卜素粗品的鉴定”都要用到纸层析法 B．“分离土壤中分解尿素的细菌”和“菊花的组织培养”都要使用琼脂 C．“果酒制作”和“探究酵母菌细胞呼吸方式”都用重铬酸钾检测酒精 D．“分离纯化大肠杆菌”和“分离纯化血红蛋白”都要使用差速离心法 2、（5分）下列关于生物技术应用的叙述，正确的是 A．从酶的固定方式看，物理吸附法比化学结合法对酶活性影响小 B．作为消化酶使用时，蛋白酶制剂只能以注射的方式给药 C．加酶洗衣粉中酶制剂可以被重复利用，提高了酶的利用率 D．将海藻酸钠凝胶珠用自来水冲洗，可洗去多余的CaCl2和杂菌 3、（5分）下列关于PCR技术的叙述，错误 ．．的是 A．PCR技术的基本原理是DNA双链复制 B．每次循环可分为变性、复性和延伸三步 C．参与PCR的物质有引物、酶、脱氧核糖、模板等 D．一个模板DNA分子第n次循环需要2n-1对引物 4、（5分）平板划线法和稀释涂布平板法是接种微生物的两种常用方法，下列描述正确的是 A．采用平板计数法获得的菌落数往往多于实际的活菌数 B．平板划线法是将不同稀释度的菌液通过接种环连续划在固体培养基表面 C．稀释涂布平板法是将不同稀释度的菌液倒入液体培养基中进行培养 D．与平板划线法相比，稀释涂布平板法形成单菌落的效果更好 5、（5分）关于电泳的说法不．正确的是 A．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 B．带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动 C．蛋白质在醋酸纤维薄膜上的移动速度取决于它所带净电荷的多少 D．电泳后需经染色、漂洗和脱色，才可长期保存 6、（5分）下列关于“DNA粗提取和鉴定”实验的叙述，正确的是 A．酵母菌、菜花和猪的成熟红细胞都可作为提取DNA的材料 B．在酒精溶液中，某些蛋白质的溶解度比DNA大 C．在研磨植物细胞时加入洗涤剂是为了溶解DNA D．在50～60 ℃的水浴中，DNA遇二苯胺试剂后即呈蓝色 7、（5分）PCR(多聚酶链式反应)技术是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，如图表示合成过程。下列说法错误的是 A．甲过程高温使DNA变性解旋，该过程不需要解旋酶的作用 B．丙过程用到的酶在高温下失活，因此在PCR扩增时需要再添加 C．如果把模板DNA的两条链用15N标记，游离的脱氧核苷酸不做标记，循环3次后，在形成的子代DNA 中含有15N标记的DNA占25% D．PCR中由碱基错配引起的变异属于基因突变 8、（5分）下列哪些是进行PCR扩增所必需的条件 A．限制酶 B．DNA连接酶 C．Taq酶 D．解旋酶 9、（5分）下列关于生物工程中常见的几种酶的叙述，正确的是 A．DNA连接酶可把目的基因与载体的黏性末端的碱基黏合，形成重组DNA B．纤维素酶是细胞工程中常用的工具酶，可获得单个动物细胞 C．Taq酶是用PCR仪对DNA分子扩增过程中常用的一种耐高温的DNA聚合酶 D．纤维素酶和果胶酶处理植物细胞获得原生质体，便于植物杂交育种 10、（5分）“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在P CR反应中加入两种引物，两种引物及其与模板链的结合位置如图1所示。经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，如图2所示，其中第⑤种DNA分子有几个： A．2 B．4 C．6 D．8 11、（5分）生物产品的分离、纯化是现代生物技术中一种常见的技术。下列关于物质提取、纯化原理的叙述中，不正确的是 A．采用凝胶色谱法分离果胶酶的原理是蛋白质分子的相对分子质量不同，在色谱柱中的移动速度不同B．使用透析法可以去除样品中相对分子质量较大的杂质 C．电泳法是利用样品中各种分子带电性质和数量以及样品分子大小不同，产生的迁移速度不同而实现样品中各种分子的分离 D．离心法分离蛋白质的依据是不同大小的分子离心时沉降速度不同 12、（5分）要将菊花茎段细胞培养成完整的植株，无需 A．选用生长旺盛的嫩枝 B．离体状态并且具有完整细胞核的细胞 C．导入外源基因
逆转录PCR原理及步骤
逆转录PCR RT-PCR和逆转录PCR是同义词，已合并。 RT-PCR 为反转录PCR（reverse transcription PCR）和实时PCR（real time PCR）共同的缩写。逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。 目录 1mode逆转录PCR 2实时PCR 3RT-PCR技术相关试剂 4PCR各步骤的目的 1 4.1 预变性 1 4. 2 三种循环 1 4.3 延伸时间原因 1 4.4 PCR引物的选择 1 4.5 注意事项 1mode逆转录PCR 由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶 H降解，留下互补DNA。 RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。（检测基因表达的方法，参见Northern Blot法。 RT-PCR的关键步骤是在RNA的反转录，要求RNA模版为完整的且不含DNA、蛋白质等杂质。常用的反转录酶有两种，即鸟类成髓细胞性白细胞病毒（avian myeloblastosis virus,AMV）反转录酶和莫罗尼鼠类白血病病毒（moloney murine leukemia vrius,MMLV）反转录酶。 RT-PCR有时候也会指代实时PCR(real-time PCR)。为了与逆转录PCR相区别，通常被写作“定量PCR”(quantitative PCR)或者RTQ-PCR(real-time quantitative PCR)。 2实时PCR 实时PCR(real-time PCR)，属于定量PCR（Q-PCR）的一种，以一定时间内DNA的增幅
临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用
WS/T 230-2002 临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用 Guidelines for use of polymerase chain reaction (PCR) technique in clinical diagnosis 1范围 本标准规定了临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用准则。 本标准适用于各级，各类的医疗、卫生、保健机构应用PCR技术进行临床诊断。 2定义 本标准采用下列定义。 2.1引物primer 与待扩增靶DNA片段两端互补的寡核昔酸，其本质是单链DNA(ssDNA)，在DNA聚合酶的作用下能进行延伸，从而合成新的互补链。 2.2模板template 待扩增的靶DNA或RNA链，包括人类基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、eDNA和mRNA、 扩增后的DNA产物等几乎所有形式的DNA或RNA。 2.3变性denaturation DNA或RNA由双链转变为单链状态，加热、提高pH或加入甲酰胺、脲等试剂都可使双链DNA或RNA发生变性。 2.4 退火annealing 引物与互补的核苷酸序列在合适的温度下通过氢键形式相互结合的过程。 2.5 延伸 extension 在合适的条件下，由DNA聚合酶（如：Taq酶）催化引导引物DNA链延伸的合成过程。 2.6 污染 contamination 由来源子非待测样品的核酸所引起的一个样品、一系列样品或试剂的非特异性扩增或扩增后在产物分析过程中造成的样品之间的污染，污染通常引起假阳性结果。 2.7 遗留污染 carry-over contamination 同一类靶序列上一次PCR扩增产物对以后扩增反应的后续污染。 2.8 内对照 internal control 在同一反应混合物体系中与待测靶核酸同时进行扩增反应的已知对照物。 2.9 Taq DNA聚合酶 Taq DNA polymerase