蛋白质SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳配方

分离胶；一块胶配5mL

每一块胶需要约4mL, 留出约2-3cm的距离，用水封口，防止空气接触。室温放置30min后，可以看到水和胶的界面重新出现。弃去上层水，倒入凝缩胶。

凝缩胶：一块胶配2mL

10%(W/V)过硫酸铵

1 称取1g APS

2加入10mL去离子水

3储存于4℃可使用两周时间，过期失去催化作用。

5* Tris-Glycine Buffer (SDS-PAGE电泳缓冲液)

1.

Tris 15.1g

Gly 94g

SDS 5g

2加入800mL去离子水，搅拌溶解

3定容至1L，室温保存。

5*SDS-PAGE Loading Buffer

1.10ml 离心管

1M Tris-HCl (pH6.8) 1.25mL

SDS 0.5g

BPB 25mg

甘油 2.5ml

2加去离子水溶液后定容至5mL

3小份（500uL/份）分装后，于室温保存

4使用前将25uL的2-ME加到每小份中

5加入2-ME的Loading Buffer 可在室温下保存一个月左右。

(免费共享)SDS-PEGA聚丙烯酰胺凝胶电泳常见问题及分析

常见问题及分析 1. 配胶缓冲液系统对电泳的影响？ 在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH 环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。 所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。 2. 样品如何处理？ 根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。 1) 还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后，蛋白质构 象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。 2) 带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保 护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100ul样品缓冲液中10ul 20%的碘乙酸胺，并在室温保温30min。 3) 非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1%SDS沸水中煮3min， 未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。 3. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？ 聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关； 制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris－HCL系统，TEMED 与AP：AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基磺酸钠（SDS）：阴离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。 4. 提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？ 聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。 一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验原理和操作步骤

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实 验原理和操作步骤 实验原理： SDS-PAGE是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。该法是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的。 SDS是一种去垢剂，可与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后，电荷因素可被忽略。蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。 试剂和器材： 试剂：1. 5x样品缓冲液（10ml）:0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50%甘油，2ml 10%的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。可在4℃保存数周，或在－20℃保存数月。 2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月。 3. pH8.9分离胶缓冲液：Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，

加重蒸水80ml使其溶解，调pH8.9，定容至100ml，4℃保存。 4. pH6.7浓缩胶缓冲液：Tris 5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH 6.7，定容至100ml，4℃保存。 5. TEMED（四乙基乙二胺）原液 6.10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制） 7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存，临用前稀释10倍。 8. 考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。 器材：电泳仪，电泳槽，水浴锅，摇床。 实验操作

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤

【跑电泳的步骤】 1、取出电泳仪器和四个烧杯； 2、将超纯水倒入烧杯中，保鲜膜封口； 3、配制过硫酸铵溶液（AP）：0.1gAP+0.9g超纯水，保鲜膜封口； 4、取出所有药品。Tris-HCL(88,6.8)，TEMED，SDS，Acry-bis，按次序排好； 5、拿卷纸平铺，移液枪枪头：三个蓝，两个黄，一个白，移液枪3只； 6、先配分离胶 7、组装凝胶模具，插好板 （1）海绵用自来水润湿，插在下面槽里； （2）板：Bio-Rad前后玻璃板，注意前后顺序，夹子夹好，塞枪头于夹子上。 8、配胶见配方，用2号蓝混匀所有试剂； 9、加液至支架上方，用超纯水液封（不能用气泡）； 10、待界面清晰后，用滤纸将水吸干； 11、配浓缩胶； 12、插梳子：一个个斜着插，有字面朝向我； 13、拔下梳子，转移（有字朝里，白色架子垫黄纸，将玻璃板卡在绿卡下面，不要有空隙，装去离子水，不能漏（1h），等待。），样品煮沸3分钟； 14、用10uL移液枪移液，移液，每个依次加入梳槽内； 15、电压（浓缩胶）90V，电流20mV； 16、盖上盖子：红对红，黑对黑；插上电源插头：红对红，黑对黑。 【附配方】 分离胶separating gel (5mL) ( 1个板3.5mL)1板2板

Prescription12%10%7.5% 3.5 mL7.0 mL Del H2O 1.6 mL 1.9mL 2.3 mL 1.3 3mL 2.66mL 1.5M Tris-HCL pH8.8 1.3 mL 1.3 mL 1.3 mL0.91 mL 1.82 mL 30%Acry/bis 2 mL 1.7 mL 1. 3 mL 1.19mL 1.38 mL 单体胶（29.2g+0.8g/100mL） 10%SDS50uL50uL50uL35uL70uL 10%AP50uL50uL50uL35uL70uL 7uL(夏)~8 TEMED2uL2uL(5 uL)2uL 3.5uL uL 浓缩胶Stacking gel ( 2板3mL) Prescription Volume(2 mL)(2 mL) Del H2O 1.4mL 2.1mL 0.5M Tris-HCL pH6.8250uL375uL 30%单体胶330uL495uL 10%SDS20uL30uL 10%AP20uL30uL TEMED2uL(5 uL)3uL(8 uL冬，5 uL夏) 【附所需试剂配制】 1、30%单体胶（30%单体胶即30%T，2.67%C）配制50mL：丙烯酰胺Acry：14.6g，甲叉双丙烯酰胺bis：0.4g；(100mL：Acry 29.2g，bis 0.8g) 超纯水定容至50mL，0.45 uM膜过滤，4℃保存（一个月）；说明：单体浓度%T是指单体总质量（丙烯酰胺+双丙烯酰胺）在

聚丙烯酰胺凝胶电泳 (1)

聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE) 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(acrylamide,Acr)单体相互聚合成多条长链，再与N,N-甲叉双丙烯酰胺(methylene-bisacrylamide,Bis)在引发剂和加速剂的作用下交联而成的凝聚胶多孔聚合物。凝胶孔径的大小可通过控制单体和交联剂的浓度来调节，从而满足不同分子量物质的分离要求。不同浓度的聚丙烯酰胺非变性凝胶的有效分离范围如表所示： 表1 DNA在聚丙烯酰胺凝胶中的有效分离范围 丙稀酰胺[%(w/v)]a有效分离范围（bp）二甲苯青FF b溴酚蓝b 3.51000－2000 460 100 5.080－500 260 65 8.060－400 160 45 12.040－200 70 20 15.025－150 60 15 20.0 6－100 45 12 a．N,N′-亚甲双丙稀酰胺占丙稀酰胺浓度的1/30 b．给出的数字是迁移率与染料相同的双链DNA片段的粗略大小（核苷酸对）。 聚丙烯酰胺凝胶的制备和电泳都比琼脂糖凝胶更为费事。聚丙烯酰胺凝胶几乎总是铺于两块玻璃板之间，两块玻璃板由间隔片隔开冰封以绝缘胶布。在这种配置形式下，大多数丙烯酰胺溶液不会与空气接触，所以氧对聚合的抑制仅限于凝胶顶部的一个窄层里。聚丙烯酰胺凝胶一律是进行垂直电泳，根据分离的需要，其长度可以在10-100cm之间。聚丙烯酰胺凝胶与琼脂糖凝胶相比有3个主要优点：（1）分辨力强，长度仅仅相差０.2%（即500bp中的1bp）的DNA分子即可分开;(2)所能装载的DNA分子量远远琼脂糖凝胶：多达10μg的DNA可以加样于聚丙烯酰胺凝胶的一个标准样品槽（1cm×1mm）而不致显著影响分辨力；(3)从聚丙烯酰胺凝胶中回收的DNA 纯度很高，可适用于要求最高的实验（如鼠胚胎微注射）。 常用的是两种聚丙烯酰胺凝胶： （1）用于分离和纯化双链DNA片段非变性聚丙烯酰胺凝胶 （2）用于分离、纯化单链DNA的变性聚丙烯酰胺凝胶

聚丙烯酰胺凝胶电泳

一、目的要求 1．学习电泳原理和技术 2．学习和掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质技术 二、实验原理 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate，简称SDS），则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。因此可以利用SDS-PAGE测定蛋白质分子量。 三、试剂与器材 试剂：10%SDS、30%凝胶贮液（29%ACr-1%Bis）、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、10%过硫酸铵、TEMED、pH8.3Tris-Gly电极缓冲液、上样缓冲液、蛋白质maker、0.25%考马斯亮兰R250染色液、甲醇：醋酸脱色液、异丙醇、tris-HCl（PH6.8）缓冲液、二硫苏糖醇、去离子水 器材：垂直板电泳槽、稳压稳流电泳仪、脱色摇床、50ml小烧杯、移液枪、枪头、玻璃棒、滤纸、表面皿、手套、 四、实验步骤 1 SDS聚丙烯酰胺的灌制 ⑴按说明安装玻璃板，橡胶条放在两玻璃板之间，确定不漏液，玻璃板放入电泳槽时，有凹槽的一侧向里，时刻保持玻璃片间的压力。 ⑵根据表1制备分离胶溶液，加入TEMED后迅速旋转混合物，用1ml移液枪将其注入两块玻璃板之间的间隙中（灌制红色板的上边缘）。用枪在聚丙烯酰胺溶液上小心的覆盖一层异丙醇。将凝胶垂直放于室温下。（丙烯酰胺有神经毒性，故操作时应注意不要吸入其粉末，实验时应戴手套，剩余的聚丙烯酰胺溶液不要乱扔，待聚合后再处理） ⑶待聚合后（40min），倒掉覆盖层，用去离子水清洗凝胶顶部，尽可能倒掉凝胶上的液体，用滤纸吸干水分。 ⑷按表1配置浓缩胶，加完TEMED后迅速旋转混合，注满玻璃板间隙，插入梳子（写有1.5mm 的一侧向里，先插入一侧，在从一侧向另一侧压着插入，以排除气泡）将胶垂直放置于室温下。约30min聚合完成，拔出梳子（平行拔出），用去离子水冲洗胶孔，再用滤纸吸干水。取出玻璃板，取下橡胶条。 表1分离胶与浓缩胶配制

聚丙烯酰胺凝胶电泳原理及方法

聚丙烯酰胺凝胶电泳原理及方法 发布时间：11-06-01 来源：点击量：10032 字段选择：大中小聚丙烯酰胺凝胶电泳原理及方法 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。在这种支持介质上可根据被分离物质分子大小和分子电荷多少来分离。 聚丙烯酰胺凝胶有以下优点： ①聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和N，N'甲叉双丙烯酰胺聚合而成的大分子。凝胶有格子是带有酰胺侧链的碳-碳聚合物，没有或很少带有离子的侧基，因而电渗作用比较小，不易和样品相互作用。 ②由于聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的物质，在聚合前可调节单体的浓度比，形成不同程度交链结构，其空隙度可在一个较广的范围内变化，可以根据要分离物质分子的大小，选择合适的凝胶成分，使之既有适宜的空隙度，又有比较好的机械性质。一般说来，含丙烯酰胺7-7.5%的凝胶，机械性能适用于分离分子量范围不1万至100 万物质，1万以下的蛋白质则采用含丙烯酰胺15-30%的凝胶，而分子量特别大的可采用含丙烯酰胺4%的凝胶，大孔胶易碎，小孔胶则难从管中取出，因此当丙烯酰胺的浓度增加时可以减少双含丙烯酰胺，以改进凝胶的机械性能。 ③在一定浓度范围聚丙烯酰胺对热稳定。凝胶无色透明，易观察，可用检测仪直接测定。 ④丙烯酰胺是比较纯的化合物，可以精制，减少污染。合成聚丙

的总克数称凝胶浓度，常用T%表达；凝胶溶液中交联剂占单体和交联体总量的百分数称为交联度，常用C%表示，可用下式计算： 公式 a：丙烯酰胺克数；b：甲撑双丙烯酰胺克数；m：缓冲液体积（毫升）凝胶浓度过高时，凝胶硬而脆，容易破碎；凝胶浓度太低时，凝胶稀软，不易操作。 交联度过高，胶不透明并缺乏弹性；交联度过低，凝胶呈糊状。聚丙烯酰胺凝胶具有较高的粘度，它不防止对流减低扩散的能力，而且因为它具有三度空间网状结构，某分子通过这种网孔的能力将取决于凝胶孔隙和分离物质颗粒的大小和形状，这是凝胶的分子筛作用。由于这种分子筛作用，这里的凝胶并不仅是单纯的支持物，因此，在电泳过程中除了注意电泳的基本原理以外，还必须注意与凝胶本身有关的各种性质（网孔的大小和形状等）。可通过下式计算来选择适当的凝胶网孔。 公式 式中：P为网孔平均直径，C为多聚体浓度，d为该多聚体分子直径（若不是卷曲的分子应为5A），K为常数，K值取决于涨胶的几何构型，假如多聚体的链是以近似于直角交联的，则约为1.5根据此式，我们可以通过多聚体浓度C近似地计算出网孔直径，例如已知多聚体浓度为5%，其网孔平均直径应为： 公式

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 实验报告

一、实验目的 1.学习SDS-PAGE分离蛋白质的原理； 2.掌握垂直板电泳的操作方法。 二、实验原理 1、电泳： (1)定义：是指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。 (2)影响电泳效果的因素： ①带电颗粒的大小和形状：颗粒越大，电泳速度越慢，反之越快； ②颗粒的电荷数：电荷越少，电泳速度越慢，反之越快； ③溶液的粘度：粘度越大，电泳速度越慢，反之越快； ④溶液的pH值：影响被分离物质的解离度，离等电点越近，电泳速度越慢，反之越快； ⑤电场强度：电场强度越小，电泳速度越慢，反之越快； ⑥离子强度：离子强度越大，电泳速度越慢，反之越快； ⑦电渗现象：电场中，液体相对于固体支持物的相对移动； ⑧支持物筛孔大小：孔径小，电泳速度慢，反之则快。 2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） (1)定义 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。 SDS-PAGE:是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠） (2)SDS的作用 SDS是一种阴离子去垢剂，可与蛋白质结合，形成SDS-蛋白质复合物。 由于SDS带有大量负电荷，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖,即消除了蛋白质分子之间电荷差异。 因此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质分子大小 (3) SDS-PAGE分类： ?SDS-PAGE按照缓冲液pH值和凝胶孔径差异分为连续系统和不连续系统两大类： 连续系统：电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。 不连续系统：缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度均不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳 (4)聚丙烯胺凝胶的生成： 聚丙烯胺凝胶由丙烯酰胺单体（Acr）和N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成。在具有自由基时，Acr和Bis就会聚合。 引发产生自由基的方法有两种：

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳 该技术首先在1967年由Shapiro建立，1969年由Weber和Osborn进一步完善。 一、原理 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr) 和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。由于SDS-PAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDS—PAGE 后，就只出现一条蛋白质区带。SDS—PAGE 可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统。本实验采用垂直板状不连续系统。所谓“不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、pH 和凝胶孔径等所组成。 1．样品的浓缩效应 在不连续电泳系统中，含有上、下槽缓冲液(Tris—Gly，pH8.3)、浓缩胶缓冲液(Tris—HCl，pH6.8)、分离胶缓冲液(Tris—HCl，pH8.8)，两种凝胶的浓度(即孔径)也不相同。在这种条件下，缓冲系统中的HCl 几乎全部解离成Cl－，两槽中的Gly (pI＝6.0，pK a=9.7)只有很少部分解离成Gly 的负离子，而酸性蛋白质也可解离出负离子。这些离子在电泳时都向正极移动。C1—速度最快(先导离子)，其次为蛋白质，Gly 负离子最慢(尾随离子)。由于C1—很快超过蛋白离子，因此在其后面形成一个电导较低、电位梯度较陡的区域，该区电位梯度最高，这是在电泳过程中形成的电位梯度的不连续性，导致蛋白质和Gly 离子加快移动，结

聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理及常见问题分析

聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理及常见问题分析 聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。 PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。

蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果加入一种试剂使电荷因素消除，那电泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。1967年，Shapiro等发现阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）具有这种作用。当向蛋白质溶液中加入足够量SDS 和巯基乙醇，SDS可使蛋白质分子中的二硫键还原。由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别，SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改变，蛋白质—SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，约为18A，这样的蛋白质—SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小由于蛋白质－SDS复合物在单位长度上带有相等的电荷，所以它们以相等的迁移速度从浓缩胶进入分离胶，进入分离胶后，由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，小分子的蛋白质可以容易的通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度快；大分子蛋白质则受到较大的阻力而被滞后，这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而被分离。因而SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳知识讲解

S D S-聚丙烯酰胺凝胶 电泳

SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳 该技术首先在1967年由Shapiro建立，1969年由Weber和Osborn进一步完善。 一、原理 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺 (简称Acr) 和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。由于SDS-PAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDS—PAGE 后，就只出现一条蛋白质区带。SDS—PAGE 可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统。本实验采用垂直板状不连续系统。所谓“不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、pH 和凝胶孔径等所组成。 1．样品的浓缩效应

在不连续电泳系统中，含有上、下槽缓冲液(Tris—Gly，pH8.3)、浓缩胶缓冲液(Tris—HCl，pH6.8)、分离胶缓冲液(Tris—HCl，pH8.8)，两种凝胶的浓度(即孔径)也不相同。在这种条件下，缓冲系统中的HCl 几乎全部解离成Cl－，两槽中的Gly (pI＝6.0，pK a=9.7)只有很少部分解离成Gly 的负离子，而酸性蛋白质也可解离出负离子。这些离子在电泳时都向正极移动。C1—速度最快(先导离子)，其次为蛋白质，Gly 负离子最慢(尾随离子)。由于C1—很快超过蛋白离子，因此在其后面形成一个电导较低、电位梯度较陡的区域，该区电位梯度最高，这是在电泳过程中形成的电位梯度的不连续性，导致蛋白质和Gly 离子加快移动，结果使蛋白质在进入分离胶之前，快、慢离子之间浓缩成一薄层，有利于提高电泳的分辨率。 2．分子筛效应 蛋白质离子进入分离胶后，条件有很大变化。由于其pH 升高(电泳进行时常超过9.0)，使Gly 解离成负离子的效应增加；同时因凝胶的浓度升高，蛋白质的泳动受到影响，迁移率急剧下降。此两项变化，使Gly 的移动超过蛋白质，上述的高电压梯度不复存在，蛋白质便在一个较均一的pH 和电压梯度环境中，按其分子的大小移动。分离胶的孔径有一定的大小，对不同相对分子质量的蛋白质来说，通过时受到的阻滞程度不同，即使净电荷相等的颗粒，也会由于这种分子筛的效应，把不同大小的蛋白质相互分开。 二、注意事项 1. SDS与蛋白质的结合按质量成比例（即：1.4gSDS/g蛋白质），蛋白质含量不可以超标，否则SDS结合量不足。

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原

聚丙烯酰氨凝胶电泳 作用原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应，它有两种形式，一种是非变性聚丙烯酰胺凝胶，蛋白质在电泳中保持完整的状态，蛋白在其中依三种因素分开：蛋白大小，形状和电荷。 而SDS-PAGE仅根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白。这个技术首先是1967年由shapiro建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，电荷因素可以忽视。 SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的蛋白量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。 SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，于连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。 浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 采用十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE，polyacrylamide gel electrophoresis）方法可对蛋白质的组分进行分离，并可精确测得蛋白质的分子量。常用的方法为SDS-PAGE不连续系统。 基本原理：聚丙稀酰胺是由丙稀酰胺（acrylamide）和N,N’-亚甲基双丙稀酰胺（N,N’-methylene bis acrylamide）经共聚合而成。此聚合过程是由四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，TEMED）和过硫酸胺（ammonium persulfate，AP）激发的。被激活的单体和未被激活的单体开始了多聚链的延伸，正在延伸的多聚链也可以随机地接上双丙稀酰胺，使多聚链交叉互连成为网状立体结构，最终多聚链聚合成凝胶状。

聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶的配方

溶液成分 不同体积（ml ）凝胶液中各成分所需体积（ml ） 5 10 15 20 25 30 40 50 6% SDS-PAGE 水 2.6 5.3 7.9 10.6 13.2 15.9 21.2 26.5 30% 丙烯酰胺溶液 1 2 3 4 5 6 8 10 10% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 10% 过硫酸氨 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 TEMED 0.00 4 0.008 0.012 0.016 0.02 0.024 0.032 0.04 8% SDS-PAGE 水 2.3 4.6 6.9 9.3 11.5 13.9 18.5 23.2 30% 丙烯酰胺溶液 1.3 2.7 4 5.3 6.7 8 10.7 13.3 1.5 mol/L Tris (pH8.8) 1.3 2.5 3.8 5 6.3 7.5 10 12.5 10% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 10% 过硫酸氨 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 TEMED 0.00 3 0.006 0.009 0.012 0.015 0.018 0.024 0.03

水 1.9 4 5.9 7.9 9.9 11.9 15.9 19.8 30% 丙烯酰胺溶液 1.7 3.3 5 6.7 8.3 10 13.3 16.7 1.5 mol/L Tris (pH8.8) 1.3 2.5 3.8 5 6.3 7.5 10 12.5 10% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 10% 过硫酸氨 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 TEMED 0.00 2 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.016 0.02 12% SDS-PAGE 水 1.6 3.3 4.9 6.6 8.2 9.9 13.2 16.5 30% 丙烯酰胺溶液 2 4 6 8 10 12 16 20 1.5 mol/L Tris (pH8.8) 1.3 2.5 3.8 5 6.3 7.5 10 12.5 10% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 10% 过硫酸氨 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 TEMED 0.00 2 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.016 0.02

(完整版)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告

分子生物学实验报告 实验名称：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 班级：生工xxx 姓名：xxx 同组人：xxx 学号：xxxx 日期：xxxx

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 1 引言 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是目前分离蛋白质亚基并测定其分子量的常用方法，为检测电泳后凝胶中的蛋白质，一般使用考马斯亮蓝（CBB）染色[1]。本次实验的目的在于学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，并掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质的操作技术。 2 材料和方法 2.1实验原理 2.1.1 聚丙烯酰胺凝胶的性能及制备原理 2.1.1.1 性能 聚丙烯酰胺凝胶的机械性能好，有弹性，透明，相对地化学稳定，对pH和温度变化比较稳定，在很多溶剂中不溶，是非离子型的，没有吸附和电渗作用。通过改变浓度和交联度，可以控制孔径在广泛的范围内变动，并且制备凝胶的重复性好。由于纯度高和不溶性，因此还适于少量样品的制备，不致污染样品。2.1.1.2 制备原理 聚丙烯酰胺凝胶是用丙烯酰胺（Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下聚合而成。聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化系统有化学聚合和光聚合两种。本实验是用化学聚合。化学聚合的催化剂通常多采用过硫酸铵（AP）或过硫酸钾，此外还需要一种脂肪族叔胺作加速剂，最有效的加速剂是N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）。在叔胺的催化下，由过硫酸铵形成氧的自由基，后者又使单体形成自由基，从而引发聚合反应。叔胺要处于自由碱基状态下才有效，所以在低pH时，常会延长聚合时间；分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用；一些金属也能抑制聚合；冷却可以使聚合速度变慢。通常控制这些因素使聚合在1小时内完成，以便使凝胶的性质稳定。 聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳有两种系统，即只有分离胶的连续系统和有浓缩胶与分离胶的不连续系统，不连续系统中最典型、国内外均广泛使用的是著名的Ornstein-Davis高pH碱性不连续系统，其浓缩胶丙烯酰胺浓度为4％，pH = 6.8，分离胶的丙烯酰胺浓度为12.5％，pH = 8.8。电极缓冲液的pH = 8.3，用Tris、SDS和甘氨酸配制。配胶的缓冲液用Tris、SDS和HCl 配制。 样品在电泳过程中首先通过浓缩胶，在进入分离胶前由于等速电泳现象而被浓缩。这是由于在电泳缓冲液中主要存在三种阴离子，Cl－、甘氨酸阴离子以及蛋白质－SDS复合物，在浓缩胶的pH值下，甘氨酸只有少量的电离，所以其电泳迁移率最小，而Cl－的电泳迁移率最大。在电场的作用下，Cl－最初的迁移速度最快，这样在Cl－后面形成低离子浓度区域，即低电导区，而低电导区会产生较高

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 实验目的:测定蛋白质亚基的分子量及纯度 实验原理：在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的点泳迁移率主要取决于亚及分子量的大小，而电荷因素可以 被忽略。当蛋白质的分子量在15KD到200KD之间时，电泳迁移率 与分子量的对数呈线性关系，可以用来测定蛋白质亚基的分子量。 基本过程：制胶、电泳、检测 试剂：（储液由专业人员配置）30%丙烯酰胺单体储液、10%过硫酸铵、TEMED、1.5mol/L Tris-HCl, pH8.8、1.0mol/L Tris-HCl, pH6.8、10%SDS、10XTris-甘氨酸系统的电泳缓冲液、2Xloading buffer、水饱和正丁醇 器材：灌胶支架、玻璃板、梳子、电源、加热器、电泳槽、扫描仪 实验操作程序： 1．安装灌胶模具，依照说明书进行 2．按照配方配置一定量（7cm模具配置1mm厚的胶配置5ml）的分离胶溶液和浓缩胶溶液（2ml），过硫酸铵和TEMED在用前加入。 3．分离胶溶液充分混匀后从一侧加入灌胶模具，上方留约1.5-2cm用于加浓缩胶，小心的在分离胶的表面加一层水饱和正丁醇（或水饱和的异丙醇、水），封住胶面，以促使聚合并保持胶面平整。 4．室温放置40分钟到1小时后，可以看到一个界面，去掉上层覆盖液，用浓缩胶缓冲液淋洗胶面，然后灌制浓缩胶，并插入与模具大小相同，凝胶厚度相当的梳子。 5．静止放置40-60分钟使凝胶聚合，电泳液清洗样品孔。 6．制备好的蛋白质样品用2Xloading buffer 1：1混合，与分子量marker 一起100℃煮3-5min, 12000rpm离心5-10min，（7cm模具、1mm厚度、10孔、考

聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作方法

聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作方法 (一)管型盘状电泳 1.仪器和设备 图8 管型盘状电泳槽结构 A为正面B为剖面 (1)分离胶PH8.9 (2)浓缩胶PH6.7 (3)电极缓冲液PH8.3 电泳槽：盘状电泳槽国内有很多单位生产，也可因地制宜，自己制造，槽大多为圆筒形(图9)，也有长方形的，上、下槽分别接铂金丝电极，要注意电极到各胶管的距离相等，以保持各凝胶管的电场一致。 电泳仪：国内生产的型号很多，如北京六一仪器厂的DYY-Ⅲ型，电压在0～600v内任意调节，电流输出0～100mA，这类电泳仪比较恰当。 玻璃管：选择粗细均一的圆玻璃管，内径5～7mm左右，管长70～100mm。管口用金刚砂磨平，电泳管的清洁很重要，需浸入10%重铬酸盐-硫酸溶液中清洗，再用蒸馏水彻底淋洗干净，在管中滴入丙酮而后干燥备用。 聚胶架：普通试管架式样，有机玻璃制成，架的孔洞内装一乳胶管，要求乳胶管孔内径与玻璃管外径相同或略小。 微量注射器或微量进样器：加样时，由于需样品量极小，作定量分析时要求样品量准确，因此最好用25.50或100μl的微量进样器加样，也可用50或100μl加液器代用。 普通注射器：主要用于灌胶和剥胶，20～30ml，附加10号不锈钢长针头(约10cm长)。 其他：日光台灯，PH计，恒温水浴，烧杯，容量瓶，量筒，试管，漏斗，滤纸，电炉，电子天平等。 2.试剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)；丙烯酰胺(Acr)；四甲基乙二胺(TEMED)；过硫酸铵；核黄素(V B2)；三羟甲基氨基甲烷(Tris)；蔗糖；甘氨酸；盐酸等。 丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺产品不纯时需要纯化后才能使用。

(1)丙烯酰胺纯化法：70g丙烯酰胺溶于500ml氯仿中(50℃)，热滤，滤液凉后置-20℃冰箱，即有结晶析出，砂芯漏斗过滤，收集结晶。结晶置于真空干燥器中减压干燥，贮棕色瓶中备用。 (2)甲叉双丙烯酰胺纯化法：12g甲叉双丙烯酰胺溶于100ml 40～50℃丙酮，加热过滤，滤液置-20℃冰箱，结晶析出后过滤，并置于真空干燥器中干燥，保存于棕色瓶中备用。 3.试剂配制 (1)凝胶及缓冲液配制系统 有关资料很多，可以根据需要选择适宜的系统。列表4供参考。最常用的是系统1(所谓Davis的标准状态)。各种贮存液配制后，盛于棕色瓶中，贮冰箱备用。用时需测PH值，以检查是否失效。TEMED要密封贮藏。过硫酸铵溶液最好现用现配，不宜超过一周。 表4 几种适用电泳的聚丙烯酰胺凝胶系统