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生物化学仪器分析答案合成版

《生物仪器分析原理与方法》复习题

一、《绪论》复习题

1.谈谈科学仪器在生命科学中的重要性。

科学仪器促进科学技术的发展

科学仪器是经济发展的推动力倍增器

科学仪器是可持续发展的保证和指路标

科学仪器是打破贸易壁垒的强有力工具

科学仪器是确保国家安全的利剑

科学仪器是打击犯罪的有力手段

科学仪器是开展生命科学研究的支撑

2.什么是标准曲线?如何制作标准曲线?

标准曲线是被测物质的浓度或含量与仪器响应信号的关系曲线。

标准曲线是依据标准系列(或含量)和其相应的响应信号测量值来绘制的。

一元线性回归法 y = a + bx

3.什么是相关系数?如何计算?相关系数大小具有什么意义?

在分析化学上,相关系数是用来表征被测物质的浓度(或含量)x 与其响应信号值y 之间线性关系好坏程度的一个统计参数。

当|r|=1时,y 与x 之间存在着严格的线形关系。|r|越接近1,则y 与x 之间的线形关系就越好。相关性也就越高。

4.什么是灵敏度?灵敏度的意义?

物质单位浓度或单位质量的变化引起响应信号值变化的程度,称为方法的灵敏度,用 S 表示

灵敏度也就是标准曲线的斜率,斜率越大,方法的灵敏度就越高。

5.什么是精密度?精密度的意义?

精密度是指使用同一方法,对同一试样进行多次测定所得测定结果的一致程度。

精密度常用测定结果得标准偏差 s 或相对标准偏差(sr )量度。

6.什么是准确度?什么是仪器的检出限?如何计算?

试样含量的测定值与试样含量的真实值(或标准值)相符合的程度称为准确度。准确度常用相对误差量度。 Σn i =1()x y x y i i )(Σn i =1(x i x )Σn i =1(y i y )12/2[]+r =S dx dc dm 或S ==dx S )i x x (i =1n Σ2n 1=r S =S x ×%

100

某一方法在给定的置信水平上可以检出被测物质的最小质量,称为这种方法对该物质的检出限,以浓度表示的称为相对检出限,以质量表示的称为绝对检出限。

二、《PCR 仪》习题

1.什么是RT-PCR?现拟检测细胞中X 基因mRNA 水平表达,给你如下试剂:AMV 逆转录酶(带5×RT buffer 等)、10mM dNTP ,热启动Taq DNA 聚合酶、上下游引物,请编写出在PCR 仪用一步法扩增该基因的程序。

RT-PCR 为反转录RCR (reverse transcription PCR )和实时PCR (real time PCR )共同的缩写。逆转录PCR ,或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR),是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR 中,一条RNA 链被逆转录成为互补DNA ,再以此为模板通过PCR 进行DNA 扩增。

一步法,能克隆微量mRNA 而不需要构建cDNA 文库,即cDNA 合成与PCR 反应在同一Buffer 及酶中进行,一部分完成,省略了cDNA 与PCR 之间的过程。扩增具体操作可按RT-PCR 反应试剂盒说明书进行。可做25μL 反应体系:总RNA0.5μL ,5×RT buffer 5μL ,AMV 逆转录酶1.25μL ,10mM dNTP 0.5μL ,上下游引物各1μL ,Taq DNA 聚合酶0.5μL ,其余用超纯水补齐。

反应条件:58℃30min ,94℃2min,94℃30s,55℃30s,72℃1min,35个循环,72℃7min,4℃-∞

2.什么是热启动Taq DNA 聚合酶?实现Taq DNA 聚合酶热启动常采用哪些方法?

存在于水生嗜热菌(Thermus aquaticus)的嗜热DNA 聚合酶,可在74℃复制DNA ,在95℃仍具有酶活力。该酶可在离体条件下,以DNA 为模板,延伸引物,合成双链DNA 。这个酶只有5′→3′DNA 聚合酶活性和5′→3′的外切酶活性,缺少3′→5′的外切酶活性。

第一代热启动Taq 酶往往直接在Taq 酶上做一些修饰,比如用抗体抑制,蜡封等,如Clontech 、Stratagen 、Gibcol-LTI 的一些产品,由于抗体、蜡等异物的掺入,对实验造成一定的影响,也给试验者带来一些不便。新一代的热启动Taq 酶是通过内部改造的重组酶,真正实现便利的热启动,代表产品如QIAGEN 公司的HotStar 系列,无需别的辅助抑制物,也不用担心抑制不稳定,使用起来方便、高效。

3.什么是Touch down PCR? Touch down PCR 有什么用途?请编写出在PCR 仪进行Touch down PCR 扩增的程序。

Touchdown PCR 是指每隔一个循环降低1°C 反应退火温度,直至达到―Touchdown‖退火温度,然后以此退火温度进行10个左右的循环。

该方法最初出现是为了避开确定最佳退火温度而进行的复杂的反应优化过程。正确和非正确退火温度之间的任何差异将造成每个循环PCR 产物量的两倍差异(每摄氏度造成4倍差异)。因此相对于非正确产物,正确的产物可以得到富集。该方法的另一个应用是在确定已知序列肽的DNA 序列。具体过程如下:使用两套与已知序列肽两末端可能配对的简并引物,这只需要知道一段长为13个氨基酸的肽段序列,5’和3’引物各长18个碱基(6个氨基酸),两者之间有一个碱基以上的间隔。使用简并引物即可以进行―Touchdown PCR‖。

94度预变性3分钟,

94度变性30秒,65度(Tm 若为55度)退火30秒,72度延伸1分钟。

X L b X D S s 3==b S

以后每个循环依次降低1度,直到50度,共15个循环。

94度变性30秒,50度退火30秒,72度延伸1分钟。15-20个循环。

72度延伸10分钟。

4.什么是Touch up PCR? Touch up PCR有什么用途?请编写出在PCR仪进行Touch up PCR扩增的程序。

Touch up PCR是指每隔一个循环升高1°C反应退火温度,直至达到―Touch up‖退火温度,然后以此退火温度进行10个左右的循环。

该方法最初出现是为了避开确定最佳退火温度而进行的复杂的反应优化过程。正确和非正确退火温度之间的任何差异将造成每个循环PCR产物量的两倍差异(每摄氏度造成4倍差异)。因此相对于非正确产物,正确的产物可以得到富集。

94度预变性3分钟,

94度变性30秒,50度退火30秒,72度延伸1分钟。

以后每个循环依次升高1度,直到65度,共15个循环。

94度变性30秒,65度退火30秒,72度延伸1分钟。15-20个循环。

72度延伸10分钟。

5.什么是梯度PCR?梯度PCR有什么用途?请编写出在PCR仪进行梯度PCR扩增的程序。梯度PCR其实就是将多个的PCR反应放在一起做,不用一次一次的作很多次,温度梯度PCR可以很快的找出最适合的退火温度,或者说可以在最适合的退火温度下扩增出目的条带。

梯度PCR简单、直观、快速,适用于各种核酸分子的扩增,具有高效率、高通量的优点,有着广阔的应用前景。

在一台PCR仪上同时做多管PCR:

94度预变性3分钟,

94度变性30秒,退货温度设置梯度(退火温度50℃~60℃可以分6管,分别为50,52,54,56,58,60度)退火30秒,72度延伸1分钟。15-20个循环。

72度延伸10分钟。

6.某人在进行PCR扩增时,得不到扩增产物,经分析引物(Tm = 55℃)、模板、试剂均不存在问题,梯度PCR也没能解决问题,请用你所学的PCR知识帮他解决试验问题,并写出拟采用PCR仪扩增的程序。

用Touchdown PCR

7.某人在进行PCR扩增时,虽然扩增得到产物,但引物二聚体太多,经优化反应试剂浓度、PCR扩增条件后仍没能解决问题,请用你所学的PCR知识帮他解决试验问题,并写出你拟在PCR仪扩增的程序。

引物二聚体的产生原因比较多,其中很重要的一个就是引物自身的原因,也就是设计的引物特异性不好,不能有效的和模板进行结合,而出现引物自身配对结合的情况导致二聚提的出现;还有可能是退火温度的问题,可以做个梯度PCR或降落PCR,来摸索一个合适的退火温度,也可有效地减少二聚提的出现。

三、《荧光定量PCR仪》习题

1.什么是实时荧光定量PCR?其工作原理是什么?

所谓实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

工作原理:实时荧光定量PCR仪主要由样品载台、基因扩增热循环组件、微量荧光检测光学系统、微电路控制系统、计算机及应用软件组成。

样品载台的容量常见的是36孔、48孔、96孔、384孔。基因扩增热循环组件工作原理与传统基因扩增仪大致相同,不同厂家不同型号的产品分别采用空气加热、压缩机制冷、半导体加热制冷等工作方式。微量荧光检测系统由荧光激发光学部件、微量荧光检测部件、光路、控制系统组成。常用的荧光激发方式有两种:卤钨灯和LED;荧光检测元件常用两种方式:光电倍增管和冷光CCD摄像机,光单色元件有滤光片和光栅。探测光路设计,有的厂家采用步进电机加导轨的装置带动探测器的检测位置来测量每个样本的荧光,如博日公司的―Line-gene’实时定量PCR仪;有的产品采用光开关来转换荧光检测位置,如西安天隆科技有限公司的―TL998A’型实时定量PCR仪。配套的计算机和软件提供热循环编程、数据分析、热循环温度和荧光值实时监测图形显示、数据库管理等功能。

2.什么是SYBR Green I?用SYBR Green I进行实时荧光定量PCR的工作原理是什么?SYBR Green I是高灵敏的DNA荧光染料,适用于各种电泳分析,操作简单:无须脱色或冲洗。至少可检出20pg DNA,高于EB染色法25-100倍。SYBR Green I 与dsDNA 结合荧光信号会增强800-1000倍,用SYBR Green I染色的凝胶样品荧光信号强,背景信号低。SYBR Green I 是一种结合于小沟中的双链DNA 结合染料。与双链DNA 结合后,其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBR Green I 的最大吸收波长约为497nm ,发射波长最大约为520nm 。在PCR 反应体系中,加入过量SYBR 荧光染料,SYBR 荧光染料特异性地掺入DNA 双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR 产物的增加完全同步。

3.什么是Taqman探针?用Taqman探针进行实时荧光定量PCR的工作原理是什么?TaqMan 荧光探针是一种寡核苷酸探针,荧光基团连接在探针的5’末端,而淬灭剂则在3’末端。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。常用的荧光基团是FAM,TET,VIC,HEX。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析,又可分析基因突变(SNP),有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。

4.什么是分子信标探针?用分子信标探针进行实时荧光定量PCR的工作原理是什么?

分子信标探针(Molecular beacons probe) 可形成发夹结构的寡核苷酸探针,5′末端标记荧光素(EDANS),3′末端标记淬灭剂(DABCYL) ,探针噜扑环与目的DNA 碱基互补,噜扑环两侧为与目的DNA 无关的碱基互补的臂。当探针与靶序列相连,淬灭基团与报告基团逐渐远离,遂发出荧光。

5.什么是看家基因?为什么常在实时荧光定量PCR扩增目的片段同时扩增看家基因?

看家基因(house-keeping gene) 又称管家基因又称持家基因。是指所有细胞中均要表达的一类基因,其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的。如微管蛋白基因、糖酵解酶系基因与核糖体蛋白基因等。

在实时荧光定量PCR中,看家基因通常作为内参基因。实时荧光定量PCR是检测低丰度mRNA的敏感方法,为了去除不同标本在RNA的产量、质量以及逆转录效率上可能存在的差别而获得目标基因特异性表达的真正差异,通常选择一定的内参基因进行校正和标准化。内参基因扩增中的变化可以反映RNA 产量、质量和cDNA合成效率的变化。选择适当的内参

基因以减少检测标本间的差异是必须的。

四、《超净工作台与生物安全柜》习题

1.什么是超净工作台?其工作原理是什么?超净工作台能否用于生物安全二级以上的病原微生物操作?

答:答:1)在操作原代培养物、菌毒株以及诊断性标本等实验材料时,为避免实验材料受到环境中未经过滤的空气中污染而设计的一种为实验室工作提供无菌操作环境的洁净设备。2)原理:超净工作台的洁净环境是在特定的空间内,洁净空气(进滤空气)按设定的方向流动而形成的。以气流方向来分,现有的超净工作台可分为垂直式,由内向外式以及侧向式。从操作质量和对环境的影响来考虑,以垂直式较优越。由供气滤板提供的洁净空气以一个特定的速度下降通过操作区,在大约操作区的中间分开,由前端空气吸入孔和后吸气窗吸走,在操作区下部前后部吸入的空气混合在一起,并由鼓风机泵入后正压区,在机器的上部,30%的气体通过排气滤板从顶部排出,大约70%的气体通过供氧滤板重新进入操作区。为补充排气口排出的空气,同体积的空气通过操作口从房间空气中得到补充。这些空气绝对不会进入操作区,只是形成一个空气屏障。(国产的超净工作台许多只有供气滤板,过滤空气进入操作区形成一定的正压,空气从设置的排气孔和操作口排出进入环境空气中,这种空气流动方式对周围环境和操作者都没有保护作用。)

3)不能

2.什么是生物安全柜?其工作原理是什么?生物安全柜能否用于生物安全二级以上的病原微生物操作?

答:1)是为操作原代培养物、菌毒株以及诊断性标本等具有感染性的实验材料时,用来保护操作者本人、实验室环境以及实验材料,使其避免暴露于上述操作过程中可能产生的感染性气溶胶和溅出物而设计的一种安全防护设备。

2)用高效粒子过滤器(HEPA)对粒子进行过滤与滞留。HEPA高效粒子过滤器对大于等于0.3微米的颗粒的有效过滤可达到99.99%

层流:我们将气体沿着一个方向且以某一固定的速度流动定义为层流。实际上安全柜由上向下流动的层流,能捕捉住安全柜工作区域内产生的全部烟尘,并将他们引导到HEPA 过滤器。定向气流:定向流动也会对生物安全柜的性能起着关键的作用,空气从安全柜前面的栅格里引入安全柜。而空气导流板会阻止安全柜内的烟雾从工作区域跑到外部环境中去。

3)能,

3.超净工作台安装、使用和维护应该注意什么?

调试:(1)在调试前应为机器选定一个较好的环境。将其置于一间有空气消毒设施的无菌室是最好的,如果条件不具备,就应将机器安放于人员走动少、较清洁的房间中。调整各脚的高度,以保证稳妥和操作面的水平。超净工作台的供电应采用一条专门电路,以避免电路过载造成空气流速的改变。(2)紫外线杀菌灯和照明用日光灯是超净工作台的标准配置,鼓风机提供空气流动的动力,这些部件是否正常工作是一目了然的。最困难也是最重要的是

检查空气滤板及其密封性,它直接关系到机器的正常使用。最简单的检查方法是营养琼脂平板法。(3)新购买的和久置未用的超净工作台除用紫外灯等照射外,最好能进行熏蒸处理,然后在机器处于工作状态时在操作区的四角及中心位置各放一个打开的营养琼脂平板,两小时后盖上盖并置37℃培养箱中培养24小时,计算出菌落数。平均每个平皿菌落数必须少于0.5个。

使用:(1)超净工作台使用前应用紫外灯照射30~40分钟,并检查操作区周围各种可开启的门窗处于工作时位置。操作最好在操作区的中心位置进行,在设计上,这是一个较安全的区域。(2)在进行操作前应对实验材料有一个初步的认识,同时了解自已所使用的设备的性能及安全等级。严格执行实验室安全规程。特定病原在任何超净工作台中的使用必须进行安全性评估。如果实验材料会对周围环境造成环境污染,就应避免在无排气滤板的型号内使用,因为在流动空气中操作与散毒无异。(3)任何先进的设备并不能保证实验的成功,动物检疫实验室超净工作台的使用是以无菌和避免交叉污染为目的,因此熟练的操作和明确的无菌要领是必不可少的。

维护:超净工作台是一台较精密的电气设备,对其进行经常性的保养和维护是非常重要的。首先要保持室内的干燥和清洁,潮湿的空气既会使制造材料锈蚀,还会影响电气电路的正常工作,潮湿空气还利于细菌、霉菌的生长。清洁的环境还可延长滤板的使用寿命。

另外,定期对设备的清洁是正常使用的重要环节。清洁应包括使用前后的例行清洁和定期的熏蒸处理。熏蒸时,应将所有缝隙完全密封。清洁应包括使用前后的例行清洁和定期的熏蒸处理。熏蒸时,应将所有缝隙完全密封,如操作口设有可移动挡板封盖的类型超净工作台,可用塑料薄膜密封。

超净工作台的滤板和紫外杀菌灯都有标定的使用年限,应按期更换

4.什么是超净工作台?按照其气流方向超净工作台可以分为几种类型?

答:1)在操作原代培养物、菌毒株以及诊断性标本等实验材料时,为避免实验材料受到环境中未经过滤的空气中污染而设计的一种为实验室工作提供无菌操作环境的洁净设备。

2)以气流方向来分,现有的超净工作台可分为垂直式,由内向外式以及侧向式。5.什么是生物安全柜?按其安全级别生物安全柜可分为几种类型?

答:1)是为操作原代培养物、菌毒株以及诊断性标本等具有感染性的实验材料时,用来保护操作者本人、实验室环境以及实验材料,使其避免暴露于上述操作过程中可能产生的感染性气溶胶和溅出物而设计的一种安全防护设备。

2)Ⅰ级生物安全柜,Ⅱ级生物安全柜,Ⅲ级生物安全柜

6.二级生物安全柜可分为几种类型?各具有什么特点?

答:Ⅱ级生物安全柜有四种不同的类型

(1)Ⅱ级A1 型生物安全柜,(2)外排风式Ⅱ级A2 型生物安全柜,

(2)Ⅱ级B1 型生物安全柜,(4)Ⅱ级B2 型生物安全柜

生物安全柜保护类型保护对象

Ⅱ级A1型第二、三和四类

病原微生物

操作者,环境和样品

外排风型Ⅱ级A2型第二、三和四类

病原微生物;痕量挥

发放射性核素/化学品

操作者,环境和样品

Ⅱ级B1型第二、三和四类

病原微生物;少量挥

发放射性核素/化学品

操作者,环境和样品

Ⅱ级B2型第二、三和四类

病原微生物;挥发放

射性核素/化学品

操作者,环境和样品

生物安全柜进风面速

率(m/s)

气流百分数

排风系统

重新循环

部分

排出部分

Ⅱ级A1型0.38~0.517030排到房间或套管连接处

外排风型Ⅱ级A2

0.517030套管连接处Ⅱ级B1型0.513070硬管

Ⅱ级B2型0.510100硬管

7.超净工作台和生物安全柜都可以用于微生物的操作,二者有何区别?

类别超净工作台生物安全柜

过滤效果初过滤,高效过滤高效粒子过滤

目的防止为过滤空气的污染阻止工作中所产生的气溶胶污染保护对象样品操作者,环境和样品

能否用于生

物安全二级

以上的病原

微生物操作

否是

超净工作台是为了保护实验材料而设计的,通过风机将空气吸入预过滤器,经由静压箱进入高效过滤器过滤,将过滤后的空气以垂直或水平气流的状态送出,使操作区域达到百级洁净度,保证生产对环境洁净度的要求,只能保护样品,不保护操作人员。生物安全柜是一种负压的净化工作台,正确操作生物安全柜,能够完全保护工作人员、受试样品并防止交叉污染的发生;而超净工作台只是保护操作对象而不保护工作人员和实验室环境的洁净工作台。因此,在微生物学和生物医学的科研、教学、临床检验和生产中,应该选择和使用生物安全柜,而不能够选择和使用超净工作台。从洁净级别看,生物安全柜也比超净工作台高级。

五、《多功能细胞电穿孔与电融合仪》习题

1.什么是细胞电穿孔?细胞电穿孔的原理是什么?

1)细胞电穿孔是利用脉冲电场的瞬时电脉冲使处于高压电场中的细胞膜穿孔产生可逆性孔径,从而使外源RNA、DNA蛋白分子和各种小分子进入细胞,产生具有新的生物性状的转化细胞株的一种生物物理技术。该技术具有高效率、低毒性、普适性和可控性的特点,在细胞工程和基因工程等方面具有广泛应用。

2)原理:细胞膜是一个绝缘体,在电场中类似一个电容。将细胞悬浮在含离子的电解质溶液中,当外加电场时,引起膜两边电解质离子极化,形成外加的膜电位差,这个电位差的形成时间常数由摸得等效电容充电时间决定。设细胞为球形,悬浮在溶液里并处于电场中。电场诱导的膜电位可由下式表示:V=1.5αE cosθ

●式中α是细胞的半径,E是外加电场强度,θ是经过细胞膜任意一点的径向与电场方向

之间的夹角。

●对于细胞的两个极点θ=0°或θ=180°,外加电场诱导的膜电位可进一步简化为:V dp=1.5αE ◆当外加电场超过细胞膜电容的集线电压时,细胞膜电容被击穿,从而在细胞膜的磷脂

双分子层上形成穿孔。

如果高压电脉冲的宽度在几百微秒之内,细胞膜的磷脂双分子层可复原。

2.什么是细胞电融合?细胞电融合的原理是什么?

细胞电融合是通过非均匀电场的电泳作用使细胞间的接触变得非常紧密,进而发生融合的技术。

A.聚集:在交流电场中,细胞定向排列成行,互相紧密接触。

B.融合脉冲:采用仅仅15微秒的方波脉冲穿透细胞膜,细胞膜发生可逆穿孔。

C.异核体期:相邻的穿孔细胞膜之间发生融合,细胞质也随之混合。只有细胞核仍然保持分离状态。

D.完全融合:异核体中细胞核之间也发生融合。根据常识,染色体数量下降。

3.影响电穿孔和电融合的原理有哪些?

1、电脉冲的幅度、时间和脉冲波形

(1)临界电压:

◆是指使细胞膜不稳定而被击破的最低电压。

●1~4kV/cm的电场加在半径为10μm的动物细胞上,即可产生膜的临界电压。

●植物细胞必须先去掉细胞壁,形成的原生质体的穿孔和融合所需电压与动物细胞相近。

●细菌的外膜相当强韧,所需的临界电压比动植物细胞高1~2个数量级。

(2)电脉冲时间

◆脉冲的宽度必须比膜的充电时间和膜的弹性复原时间长,这样才能保证孔道在脉冲以后有机会继续开放一段时间。

◆宽度窄的脉冲,需要通过增加脉冲的幅度弥补。

◆太宽的脉冲往往击破融合区以外的细胞膜,导致细胞死亡。

◆交流脉冲或多次脉冲能够充分利用脉冲电场的相向电泳压力,往往比单个直流(方形)

脉冲有效。

◆穿孔用的电脉冲在以峰电压击破细胞膜后以较低的电压维持空岛的短时间开放,有利于

提高电穿孔效率。因此指数衰减的电脉冲往往比同能量的方形波有效。

2、胶体渗透压和细胞膨胀

避免细胞破裂:在细胞外的缓冲液中加入大分子维持细胞内外的渗透压平衡。

稍低渗透压的缓冲液:穿孔前把细胞放在稍低渗透压的缓冲液中,让细胞略微膨胀,细胞膜张力增高,有利于脉冲击穿细胞膜,以及有张力的膜容易扩大,利于电融合过程。

3、细胞膜复原

复原时间长有利于细胞外药物扩散进入细胞内。

影响细胞复原的因素:

温度:细胞复原期间温度越低,复原时间越长。

外液渗透压:细胞复原期间细胞膜上穿孔仍在,细胞内外渗透压需要仔细调节,而且细胞脆弱,要便面机械振荡,尽量避免使用移液管或离心操作。

外液中离子:一方面影响细胞的生存,一方面影响细胞膜复原的速度。

脉冲强度和宽度:脉冲强度和宽度越大,孔也越大,药物进入快,融合效率高,但细胞对胶体渗透压和离子平衡也更敏感。

4、离子

低钠缓冲液在电穿孔过程中,对稳定细胞膜内外的钠钾浓度梯度更加有利,有利于细胞膜静息电位的维持,因此对细胞存活率更为有利。

4.细胞电穿孔和电融合仪有哪些用途?

多功能细胞穿孔仪-Multiporator是为真核细胞的电穿孔设计的,在有适当配件的时候,也可用于细菌和酵母电穿孔,以及细胞融合。

六、《生物安全和生物安全实验室》习题

1.什么是实验室感染?发生实验室感染的原因有哪些?

实验室相关感染:由于从事实验活动而发生的与操作的生物因子相关的感染。在研究病原微生物中存在某种风险,如果在管理和操作病原体中一旦有所疏漏或错误就会发生实验室感染,造成威胁,进而可能造成病原体扩散或传染病的流行。

自然途径感染:呼吸道:吸入微生物气溶胶,消化道:食入,皮肤、黏膜污染

微生物直接接种:刺伤、割伤,感染的实验动物咬伤,媒介昆虫咬伤

……还有许多不明原因的实验室相关感染

2.世界卫生组织(WHO)根据危险度将微生物划分为那几个等级?

◆WHO将微生物按照危害性分为四个等级,Ⅰ级危害性最低,Ⅳ级危害性最高。

◆危险度Ⅰ级:无或极低的个体和群体危险,即不太可能引起人或动物致病的微生物;

◆危险度Ⅱ级:个体危险中等,群体危险低,即能够对人或动物致病,但对实验室工作人员、社区、牲畜或环境不易导致严重危害,其实验室暴露也许会引起严重感染,但对感染有有效的预防和治疗措施,并且疾病传播的危险有限的微生物;

◆危险度Ⅲ级:个体危险高,群体危险低,即通常能引起人或动物的严重疾病,但一般不会发生感染个体向其他个体的传播,并且对感染有有效的预防和治疗措施的微生物;

◆危险度Ⅳ级:个体和群体的危险均高,病原体通常能引起人或动物的严重疾病,并且很容易发生个体之间的直接或间接传播,对感染一般没有有效的预防和治疗措施。

3.中国国务院和卫生部根据危险度将微生物划分为那几个类别?

我国根据危害性将微生物分为四类,Ⅰ类危险性最高,Ⅱ类危险性次之,Ⅲ类仅具有一般危险性,Ⅳ类危险性最低。

◆第Ⅰ类:能够引起人类或者动物非常严重疾病的微生物,以及我国尚未发现或者已经宣布消灭的微生物,如鼠疫耶尔森氏菌、霍乱弧菌、天花病毒;

◆第Ⅱ类:能够引起人类或者动物严重疾病,比较容易直接或者间接在人与人、动物与人、动物与动物间传播的微生物,如炭疽芽孢杆菌、肉毒梭菌、结核分枝杆菌、狂犬病病毒、流行性出血热病毒、人类免疫缺陷病毒等;

◆第Ⅲ类:能够引起人类或者动物疾病,但一般情况下对人、动物或者环境不构成严重危害,传播风险有限,实验室感染后很少引起严重疾病,并且具备有效治疗和预防措施的微生物,如葡萄球菌、链球菌、沙门菌,志贺菌、致病性大肠埃希菌、副溶血弧菌、钩端螺旋体、流感病毒、麻疹病毒、柯萨奇病毒等;

◆第Ⅳ类:在通常情况下不会引起人类或者动物疾病的微生物,如生物制品、菌苗、疫苗生产用的各种减毒、弱毒菌种以及不属于上述Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类的各种低致病性微生物菌种。

4.请比较世界卫生组织(WHO)微生物危险度等级和中国国务院微生物危险度分类。

◆WHO将微生物按照危害性分为四个等级,Ⅰ级危害性最低,Ⅳ级危害性最高。

◆危险度Ⅰ级:无或极低的个体和群体危险,即不太可能引起人或动物致病的微生物;

◆危险度Ⅱ级:个体危险中等,群体危险低,即能够对人或动物致病,但对实验室工作人员、社区、牲畜或环境不易导致严重危害,其实验室暴露也许会引起严重感染,但对感染有有效的预防和治疗措施,并且疾病传播的危险有限的微生物;

◆危险度Ⅲ级:个体危险高,群体危险低,即通常能引起人或动物的严重疾病,但一般不会发生感染个体向其他个体的传播,并且对感染有有效的预防和治疗措施的微生物;

◆危险度Ⅳ级:个体和群体的危险均高,病原体通常能引起人或动物的严重疾病,并且很容易发生个体之间的直接或间接传播,对感染一般没有有效的预防和治疗措施。

◆根据2004年国务院颁布的《病原微生物实验室生物安全管理条例》,我国根据危害性将微生物分为四类,Ⅰ类危险性最高,Ⅱ类危险性次之,Ⅲ类仅具有一般危险性,Ⅳ类危险性最低。

◆第Ⅰ类:能够引起人类或者动物非常严重疾病的微生物,以及我国尚未发现或者已经宣布消灭的微生物,如鼠疫耶尔森氏菌、霍乱弧菌、天花病毒;

◆第Ⅱ类:能够引起人类或者动物严重疾病,比较容易直接或者间接在人与人、动物与人、动物与动物间传播的微生物,如炭疽芽孢杆菌、肉毒梭菌、结核分枝杆菌、狂犬病病毒、流行性出血热病毒、人类免疫缺陷病毒等;

◆第Ⅲ类:能够引起人类或者动物疾病,但一般情况下对人、动物或者环境不构成严重危害,传播风险有限,实验室感染后很少引起严重疾病,并且具备有效治疗和预防措施的微生物,如葡萄球菌、链球菌、沙门菌,志贺菌、致病性大肠埃希菌、副溶血弧菌、钩端螺旋体、流感病毒、麻疹病毒、柯萨奇病毒等;

◆第Ⅳ类:在通常情况下不会引起人类或者动物疾病的微生物,如生物制品、菌苗、疫苗生产用的各种减毒、弱毒菌种以及不属于上述Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类的各种低致病性微生物菌种。

5.什么是生物安全实验室?它分为哪几个级别?

由一级防护屏障(安全设备)和二级防护屏障(实验室设施)组合构成四级生物安全水平。生物安全1级(Biosafety Level-1,BSL-1)

生物安全2级(BSL-2)

生物安全3级(BSL-3)

生物安全4级(BSL-4)

6.什么是BSL-1级生物安全实验室?它适用于哪些微生物的操作?应该具有何种一级、二级安全屏障?

BSL-1适合于已知其特征的、在健康成人中不引起疾病的、对实验室工作人员和环境危害性

最小的生物因子(对应于我国的第四类危害的微生物)的工作。BSL-1实验室属于基础实验室,适用于基本的教学和科研。

一级屏障:BSL-1不需要特殊的一级屏障,依靠标准的微生物操作即可获得基本的防护水平。

二级屏障:BSL-1实验室不必和建筑物中的一般行走区分开,但要求具有实验室安全运行、清洁和维护的足够空间,保证实验室内所有活动的照明,避免不必要的反光和闪光。实验室墙壁、天花板和地板应当光滑、易清洁、防渗漏并耐化学品和消毒剂的腐蚀,地板应当防滑;而且为安全操作及储存溶剂、放射性物质、压缩气体和液化气提供足够的空间和设施。实验台面应是防水的,并可耐消毒剂、酸、碱、有机溶剂和中等热度的作用,在出口处安装有用自来水的洗手池。实验室的门应有可视窗,并达到适当的防火等级,最好能自动关闭。实验室工作区外有存放外衣和私人物品的设施,以及进食、饮水和休息的场所。

7.什么是BSL-2级生物安全实验室?它适用于哪些微生物的操作?应该具有何种一级、二级安全屏障?

生物安全2级(BSL-2):BSL-2适合于对人和环境有中度潜在危险的病原,如伤寒杆菌、霍乱弧菌、各型肝炎病毒以及弓形体等工作中一般不引起气溶胶传播的微生物。BSL-2级实验室与BSL-1实验室类似,也属于基础实验室,适用于初级卫生服务、诊断和研究。Measles virus (麻疹病毒)

Salmonellae (沙门氏菌)

Toxoplasma spp. (弓形体)

Hepatitis B virus(乙型肝炎病毒)

Blood borne pathogens(血液传播病原)

Human body fluids/particularly when visibly contaminated with blood(各种体液)

一级屏障:(1)防护设备:生物安全柜、高压灭菌器、离心机安全罩、洗眼器(2)个人防护:在实验室工作时必须穿着连体衣、隔离服或工作服;在进行可能直接或意外接触血液体液或其它具有潜在感染性的材料时应戴上合适的手套(手套用完后应先消毒再摘除,随后必须洗手。);在处理完感染性实验材料和动物后,及在离开实验室工作区域前必须洗手;为了防止眼睛或面部受到溅泼物、碰撞物或人工紫外线辐射的伤害,必须戴眼镜、面罩或其它眼部面部防护设备。严禁穿着实验室防护服离开实验室(去餐厅、咖啡厅、办公室、图书室、员工休息室和卫生间);不得在实验室穿露脚趾的鞋子;禁止在实验室进食、饮水、吸烟、化妆和处理隐形眼镜;禁止在实验室区域储存食品和饮料;在实验室用过的防护服不得和日常服装放在一起。

二级屏障:

1. BSL-2 实验室房间必须有可锁住的门。

2. 实验室具备洗手和洗眼装置。

3. 实验台面是防水的,并且能够耐受中等程度的热、有机溶剂、酸碱及其它用于净化处理台面和设备的化学药品。

4. 能够提供实验室设施预期的安装和使用情况。桌凳、柜子和设备间的空间应易于清理。

实验室里用的椅子和其它设施上应盖上一层易净化处理的非编织材料。

5. 生物安全柜应以下列方式进行安装:空间的波动和排出的空气不能够引起生物安全柜在运作时超出其控制参数。生物安全柜要放在远离门、开放的窗户、走动比较频繁的实验室区域以及其它具潜在破坏性的设备处,以维持生物安全柜的气流参数。

6. 所有的活动中的照明应充足,避免妨碍视力的反射和眩目的光。

不需要特殊的通风换气。但是,计划新的设施时应考虑配有机械通风换气系统,用于提供不需要循环到实验室外的内向气流。如果实验室有向外开放的窗户,窗户上应安装防蚊蝇的纱窗。

8、什么是BSL-3级生物安全实验室?它适用于哪些微生物的操作?应该具有何种一级、二级安全屏障?

生物安全三级(BSL-3)BSL-3应用于临床、诊断、教学、研究、或者生产设施,在该级别中开展有关内源性和外源性病源的工作,若因暴露而吸入该病源,会引发严重的、可能致死的疾病。实验人员应在处理致病性的和可能使人致死的病源方面受过专业训练,并由对该病源工作有经验的、有资格的科学工作者监督。所有与传染源操作有关的步骤,都在生物安全柜或其他物理遏制装置中进行,或由穿戴合适防护服及设施的实验人员进行。实验室经过特殊设计和施工。

一级屏障:

l、进入实验室时,要穿上实验防护服,如,前襟一体或后系式大褂、干净的外套或连裤服。不得在实验室外穿防护服。重复使用的衣服在清洗前要消毒,衣服被明显污染后应更换。

2、在处理传染源、感染动物及被污染的仪器时,必须戴手套。

3、建议经常更换手套和洗手,一次性手套不能重复使用。

4、有关传染源的所有操作、感染动物的验尸、从感染动物或胚胎卵采集组织或液体等,都应在II级或III级生物安全柜中进行(见附4)(另发)。

5、当操作不能在生物安全柜中进行时,应适当的综合使用个人防护设施(如,口罩,面罩等)和物理遏制设施(如:带安全罩或密封转头的离心机)。

6、当进入内有感染动物的房间时,应采取呼吸和面部保护措施。

二级屏障:

1、实验室要离开建筑物内的行走区,禁止随便进入实验室。进入走道后,至少需要经过两道自动门,才能进入实验室。所有的门都应有锁(见附录F)(另发)。过道里可以设计一个更衣室。

2、每个实验室有一个洗手池,洗手池的操作应该是免接触式或全自动的,洗手池应安装在门口附近。

3、处理BSL-3病源的区域,墙面、地面、天花板应易于清洗、消毒;若有接缝,应密封;表面应光滑防水;对实验室常用化学试剂和消毒剂具有耐腐蚀性。地板应整体、防滑,建议在地板凹处使用掩蔽罩。墙面、地面、天花板都不应留有缝隙,或在设施消毒时能够密封。

4、实验台表面应能防水、耐热、耐有机溶剂、耐酸碱和用于工作台面及设施消毒的其他化学物质。

5、实验室的操作台应能承受预期的重量。实验台、安全柜以及设备间的空间便于打扫。实验室使用的椅子及其它器具,应覆盖易于清洗的非织物。

6、所有的窗门必须关闭和密封。

7、有实验垃圾处理设施及其使用方法,该设施最好设在实验室内(即,高压锅、化学消毒剂、焚烧炉、其他可行的消毒方法)。应有消毒设备使用方法。若垃圾运出实验室,应适当密封,并不应通过公共通道运送。

8、应配置生物安全柜,安全柜放置地点应远离门、房间通风百叶窗、实验室内行走区。

9、应有管道化的排气系统,该系统进入实验室的风向应从"洁净区"到"污染区"。排出的空气不再循环至建筑物内的任何其他区域。排出的空气不需要过滤或作其他处理,但也要依所处场所的要求、特殊病源操作、使用条件而定。外部排气口要远离有人区、进风口,否则需经过HEPA过滤。实验人员必须证实进入实验室的风向是正确的。建议在实验室的入口处设置可视的监视装置,表明和证实进风的风向。要考虑安装HV AC控制系统。防止实验室持续正向增压。应安装声音报警装置,警告实验人员HV AC系统出了问题。

10、若生物安全柜至少每年经过测试和确证,则二级生物安全柜排出的、经过HEPA过滤的空气,可进入实验室循环。当二级生物安全柜通过建筑物排气系统排出空气时,安全柜的排气管路的连结,应避免对安全柜的空气平衡或建筑物排气系统的空气平衡产生干扰(如,在安全柜排气管和排气管道间形成空气隙)。当使用三级生物安全柜时,要和排气系统直接连结。若三级安全柜和供气系统相连,应避免安全柜正向增压(见附A)。

11、会产生气溶胶的连续流离心机及其他设备应在一个装置中,该装置通过HEPA过滤器排出空气,而避免直接排入实验室中。至少每年测试HEPA系统。另外,当远离有人区或进风口时,该设备排出的空气可以排到外面。

12、真空管路由液体消毒剂汽水阀和HEPA过滤器及类似设备保护。需要时,要更换过滤器。另外,可以使用手提真空泵(也需要由汽水阀和过滤器正确保护)。

13、实验室内应有眼睛冲洗装置。

14、光线适宜于开展所有的工作,避免反光和闪光,以免妨碍视觉。

15、BSL-3设施的设计和操作程序必须文件化。设施必须经过测试以确证设计和操作参数在系统运转前已达到要求。因操作经验,会修改操作程序,所以设施必须反复测试,每年至少一次。

16、若有关病源陈述(根据风险分析、场所条件、其他有关联邦/州/地方法规而定)中要求,则应采取其他环境保护措施(如,实验人员淋浴、排出空气的HEPA过滤、其他管道设施的遏制处理、液体消毒剂的供应)。

9.什么是BSL-4级生物安全实验室?它适用于哪些微生物的操作?BSL-4级生物安全实验室有哪两种类型?

生物安全四级(BSL-4)有些危险的外源性病源,具备因气溶胶传播而致实验室感染和导致生命危险疾病的高度个体风险,有关工作应在BSL-4实验室中开展。和BSL-4病源有相近或特定抗原关系的病源,也应在该级别中开展工作,在该级别的连续工作和低级别的工作中得到足够数据的病源除外。实验室成员应在处理特别危险的传染源方面受过特殊和全面的训练,应了解标准和特殊操作中一级和二级遏制的作用、遏制设备、实验室设计性能。实验由在有关病源方面受过训练、并有工作经验的、有资格的科学工作者监督。实验室主任严格控制进入实验室。设施应在独立的建筑物内;或在建筑物的一个控制区内,但和建筑物内的其他区域完全隔离。应制定、实施特殊设施操作手册。在设施的工作区内,所有工作应限制在三级生物安全柜中;或在二级生物安全柜中,但得使用装备生命支持系统的一体正压防护服。BSL-4实验室经过特殊设计,是一个特殊的工程,可以防止微生物向环境中扩散。BSL-4级实验室有两种模式;

①安全橱实验室,即所有病原体处理均在三级生物安全橱内进行;

②防护服实验室,即实验人员着防护服。BSL-4级实验室可以采取任一种模式或将

两者联合应用。假如联合应用,应遵守各自的所有规定。

七、离心机

1.生科院的一台离心机,其中一个转头的参数为JS-24.38 24,000 rpm, 103,900 g, 6 x 38.5ml ,K=334请解释以上参数的意义?分离某种样品在另外一个k=600的转头上需时10分钟,那么在这个转头上需要多少时间?

JS-24.38——该转头型号;

24,000 rpm——该转头最高转速每分钟24000转;

103,900 g——该转头最大相对离心力为103900g;

6 x 38.5ml——该转头的最大容量;

K=334——该转头在装满样品后在最高转速时的转子离心效率指标。

根据t = K/S K1/t1 = K2/t2

t2 =K2·t1/K1=344*10/600=5.73≈6分钟

(t:时间,k:k因子,s:沉降系数)

2.密度梯度离心分为哪两种方法?比较两者的差别?

分为:速率区带法,等密度离心法

速率区带法基本原理:根据样品中不同粒子所具有的不同尺寸大小及沉降速度(S)来分离。样品粒子的密度必须大于梯度溶液中任一点的密度,而离心过程必须在区带到达管子底部前停止。

等密度离心法基本原理:根据粒子的不同密度来分离。离心过程中,粒子会移至与它本身密度相同的地方形成区带。在分离开始前,样品可与梯度介质混合在一起,或铺在密度梯度液上面。在离

心力的作用下,梯度物质在离心管中重新分布,因而形成了所需要的浓度(和密度)梯度。同时,样品颗粒,开始时就分布在整个管子中的,沉降或悬浮到它们的等密度位置上。

区带速度离心等密度梯度离心

通常应用蔗糖通常应用氯化铯

最大的梯度密度低于最小密度的沉降样品最大的梯度密度大于密度最大的沉降样品

在最高的沉降物质达到管底前停止,短时间,低速度使各组分沉降到其平衡的密度区,长时间,高速度

3. 例举两种超速离心机的转头类型,并图示其最大半径,最小半径,以及主要应用范围?水平转头:

生物化学仪器分析答案合成版

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在离心过程中,离心管与轴之间的角度从开始0?变成90?,停止时又为0?。

优点:由于长通径,因此可以得到最好的纯度;可以使用开口离心管,因此装卸样品量较大。基本应用范围:病毒和亚细胞器的区带分离;蛋白和RNA的梯度分离;有时也用于脂蛋白的小体积区带分离。

垂直转头:

分离机理与固定转头相似,但与轴之间的角度为0°

优点:沉降效率高;非常好的适用性,容量范围也很广,从几拾微升到几百毫升的样品都可理。

应用范围:亚细胞组份及病毒分离

利用蔗糖梯度作蛋白区带离心

脂蛋白分离

利用氯化铯梯度作RNA沉淀

质粒DNA 等密度分离

八、毛细管电泳

1.毛细管电泳依据哪三种原理进行分离?分别简单解释之。

Zeta电势:电解质溶液中,任何带电粒子都可被看成是一个双电层系统的一部分,离子自身的电荷被异号的带电离子中和,这些异号离子中有一些被不可逆的吸附到离子上,而另一些则游离在附近,并扩散到电介质中进行离子交换。―固定‖离子有一个切平面,它和离得最近的离子之间的电势则被称之为离子的Zeta电势。

淌度:带电粒子在直流电场作用下于一定介质中所发生的定向运动称为电泳。单位电场下的电泳速度称为淌度。电场中带电离子运动除了受到电场力的作用外,还会受到溶剂阻力的作用。一定时间后,两种力的作用就会达到平衡,此时离子作匀速运动,电泳进入稳态。实际溶液的活度不同,特别是酸碱度的不同,所以样品分子的离解度不同,电荷也将发生变化,这时的淌度可称为有效电泳淌度。一般来说,离子所带电荷越多、离解度越大、体积越小,电泳速度就越快。

电渗:电渗是推动样品迁移的另一种重要动力。所谓电渗是指毛细管中的溶剂因轴向直流电场作用而发生的定向流动。电渗是由定域电荷引起。定域电荷是指牢固结合在管壁上、在电场作用下不能迁移的离子或带电基团。在定域电荷对溶液中的反号离子吸引下形成了所谓的双电层,致使溶剂在电场作用(以及碰撞作用)下整体定向移动而形成电渗流(毛细管中的电渗流为平头塞状)。

2.从原理,特点和应用范围等方面比较一下毛细管电泳与液相色谱的差别。

驱动力介质容器分离原理

毛细管电泳电压,压力缓冲液,凝胶,

胶束,柱填料裸管,涂层管,

毛细管色谱柱

电泳,电渗,分

液相色谱压力柱填料色谱柱分配

毛细管电泳液相色谱

分离效率高(通常>105)较低

分析范围最广广

样品量~nl ~ul

检测灵敏度高很高

样品处理简单复杂

运行成本以分人民币计算贵的色谱柱,流动相

环保基本无有机相有机流动相

方法开发简单繁琐

连接质谱Y Y

九、色谱

1.已知物质A和B在一根30.00 cm长的柱上的保留时间分别为16.40 min和17.63 min。不被保留组分通过该柱的时间为1.30 min。峰底宽度分别为1.11 min和1.21 min,计算:(1)柱的分离度;

(2)柱的平均塔板数;

(3)达到1.5分离度所需的柱长度。

(1)柱的分离度

R = 2(17.63 - 16.40)/(1.11 + 1.21)

= 1.06

(2)柱的平均塔板数

n = 16 (16.40 /1.11)2 = 3493

n = 16 (17.63 /1.21)2 = 3397

n平均= (3493 + 3397)/ 2 = 3445

(3)达到1.5分离度所需的柱长度

R1 / R2 = ( n1 / n2 )1/2

n2 = 3445 (1.5 / 1.06)2 = 6898

L = nH = 6898 (300 /3445)

= 60 cm

2.气相色谱采用双柱双气路流程有什么用?

气相色谱采用双柱双气路流程主要用于程序升温分析,它可以补偿由于升温过程中载气流量不稳、固定液流失等使检测器产生的噪声及基线漂移,从而提高稳定性。

3用热导池检测器时,为什么常用H2和He作载气而不常用氮气作载气?

根据热导池检测器的检测原理,载气与待测组分的导热系数相差愈大,则灵敏度愈高,有一般组分的导热系数都比较小,而氢气、氦气导热系数最大,,故选用热导系数大的H2和He 作载气,灵敏度比较高。

另外载气热导系数大,在相同的桥电路电流下,热丝温度较低,桥电流可以升高.如果用氮气作载气,除了由于氮和被测组分导热系数差别小(0℃时)使热导池检测灵敏度低以外,还常常由于二元体系导热系数呈非线性等原因,有时会出现不正常的色谱峰如倒峰,W峰等。

4.在气相色谱分析中, 色谱流出曲线的宽度与色谱过程的哪些因素无关?(A)

A.热力学因素;B.色谱柱长度;C.动力学因素;D.热力学和动力学因素。

5.在一定的柱温下, 下列哪个参数的变化不会使比保留体积(Vg)发生改变?(A)

A.改变检测器性质;B.改变固定液种类; C.改变固定液用量;D.增加载气流速。6使用热导池检测器时, 应选用下列哪种气体作载气, 其效果最好?(A)

A.H2;

B. He;C.Ar;D.N2。

7.检测器的"线性"范围是指(B)

A.标准曲线是直线部分的范围;

B.检测器响应呈线性时最大和最小进样量之比;

C.检测器响应呈线性时最大和最小进样量之差;

D.最大允许进样量与最小检测量之差。

8.进样0.5μL纯苯,得色谱峰高h=6.25cm.半峰宽W1/2=0.25cm苯的密度为0.88g·cm-3,记录纸走速C1=0.5cm·min-1,检测器入口处载气流速Fc′=30cm3.min-1,记录仪满量程为10mV,满量程宽度25cm,求热导检测器的灵敏度。

解: wi=0.5×10-3cm3×0.88×103mg·cm-3=0.44mg

C2=10mV/25cm=0.4mV·cm-1

Ai=1.065h·W1/2=1.065×6.25cm×0.25cm

=1.065×6.25×0.25cm2

将以上各式代人(19-6)式,得

S=1.065×6.25×0.25cm2×0.4mV·cm- 1×

30cm3·min-1/(0.44mg×0.5cm·min-1)

=90.8mV·cm3·mg-l

9.电导检测器怎样消除流动相电导的干扰?

(监测系统,用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置。在液相色谱中,有两种基本类型的检测器。一类是溶质性检测器,它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应,属于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等。另一类是总体检测器,它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应,属于这类检测器的有示差折光,电导检测器等。)例如,采用阳离子交换色谱分离碱金属离子时,通常用HCl作为流动相。

10.现需分离分析一氨基酸试样,拟采用哪种色谱?

高效液相色谱

11.提高液相色谱中柱效的最有效途径是什么?

答:液相色谱中提高柱效的途径主要有:1.提高柱内填料装填的均匀性;2.改进固定相,减小粒度; 选择薄壳形担体; 选用低粘度的流动相; 适当提高柱温;3.增加理论塔板数,其值越大,色谱峰越窄,分离效果越好。其中,减小粒度是最有效的途径

12. 何谓反相液相色谱?何谓正相液相色谱?

正相色谱:流动相的极性小于固定液的极性

反相色谱:流动相的极性大于固定液的极性

正相色谱比较多用于高极性物质的分离

反相色谱比较多用于低极性物质的分离

13.在液相色谱法中,梯度淋洗适用于分离何种试样?

两种或两种以上不同极性的溶剂

14.在液相色谱中,范氏方程中的哪一项对柱效能的影响可以忽略不计?(p369)

范式方程其简单表达式为:。式中项为*涡流扩散项,是指气流碰到填充物颗粒时,不断地改变流动方向,使试样组分在气相中形成紊乱的类似―涡流‖的流动,与填充物的粒度大小有关,粒度小,值小;还与填充物填充的均匀度有关,越均

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匀,值越小。对于空心毛细管柱,值为零。/项为*分子扩散项,指导组分分子沿载气运动方向运动产生的扩散,与组分在柱内的*保留时间有关,保留时间越长,该项的影响就越大,此外还与组分在流动相中的分子扩散系有关,为一定柱温和柱压下的线流速。项为传质项,包括气相传质项和液相传质项两部分。

其中α对柱效影响不大

15. 对下列试样,用液相色谱分析,应采用何种检测器:

(l)长链饱和烷烃的混合物(2)水源中多环芳烃化合物。

(l)长链饱和烷烃的混合物

紫外光度检测器(UV)

(2)水源中多环芳烃化合物。

荧光检测器

16. 对聚苯乙烯相对分子质量进行分级分析,应采用哪一种液相色谱法?

凝胶渗透色谱

17.什么是化学键合固定相?它的突出优点是什么?

18.什么叫梯度洗脱?它与气相色谱中的程序升温有何异同?

梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例,从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相应地变化,达到提高分离效果,缩短分析时间的目的。

梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度,来调整混合样品中各组分的k值,使所有谱带都以最佳平均k值通过色谱柱。它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的程序升温,所不同的是,在梯度洗脱中溶质k值的变化是通过溶质的极性、pH值和离子强度来实现的,而不是借改变温度(温度程序)来达到。

19.指出下列各种色谱法,最适宜分离的物质。

(l)气液色谱;(2) 正相色谱;(3)反相色谱;(4)离子交换色谱;(5)凝胶色谱;(6)气固色谱;(7)液固色谱。

(1)气液色谱适于分离易挥发,受热不稳定的物质(2)正相色谱适于分离极性亲水性化合物(3)反向色谱适于分离疏水性化合物(4)离子交换色谱适于样品中包含离子型或可离子化的化合物,或者能与离子型化合物相互作用的化合物分离。(5)凝胶色谱适于高分子聚合物分离。(6)气固色谱适于分离气体烃类,永久性气体(7)液固色谱适于异构体的分离。

20.怎样装柱才能使色谱柱的效率提高?

答:液相色谱中提高柱效的途径主要有:1.提高柱内填料装填的均匀性;2.改进固定相,减小粒度; 选择薄壳形担体; 选用低粘度的流动相; 适当提高柱温;3.

增加理论塔板数,其值越大,色谱峰越窄,分离效果越好其中,减小粒度是最有效的途径

十、流式细胞仪

1.简述流式细胞仪的分析原理。

待测细胞被制成单细胞悬液,经特异性荧光染料染色后加入样品管中,在气体压力推动下进入流动室,流动室内充满鞘液,在鞘液的约束下,细胞排成单列出流动室喷嘴口,并被鞘液包绕形成细胞液柱。这种同轴流动的设计,使得样品流和鞘液流形成的流束始终保持着一种分层鞘流的状态。鞘液和样品流组成一个圆形的流束,一起自喷嘴的圆形宝石孔喷射出来,进入流动室,与水平方向的激光光束垂直相交。该区称为测量区。利用样品流和鞘流的气压差的层流原理,使细胞依次排列成单行,每个细胞以均等的时间依次通过测量区,被荧光染料染色的细胞受到强烈的激光照射后发出荧光,同时产生散射光。细胞发出的荧光信号和散射光信号,同时被荧光光电倍增管接收,被积分放大反转换为电子信号输入电子信息接收器、通过计算机快速而精确地将所测数据计算出来,结合多参数分析,从而实现了细胞的定量分析。

2.举例说明一种采用流式细胞仪检测细胞凋亡方法的原理,并图示凋亡细胞与活细胞,死细胞在流式双参数图上的分区;

Annexin V/PI双染色法

基本原理:细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面,目前早期识别仍有困难。这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内转移到细胞膜外,使PS暴露在细胞膜外表面。PS是一种带负电荷的磷脂,正常主要存在于细胞膜的内面,在细胞发生凋亡时细胞膜上的

这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。Annexin V是一种Ca+依赖的磷脂结合蛋白,最初发现是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白,Annexin V具有易于结合到磷脂类如PS的特性。对PS有高度的亲和性。因此,该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的,也可发生在细胞坏死中。这两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的,而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就被破坏了。因此,可以建立一种用Annexin V结合在细胞膜表面作为凋亡的指示并结合一种染料排除试验以检测细胞膜的完整性的检测方法。

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Q2 dead cells ;Q3 live cells; Q4 apoptotic cells

3.简述电荷法流式细胞分选的原理,以及它是如何来分选肿瘤干细胞SP的?

原理:当经荧光染色或标记的单细胞悬液放入样品管中,被高压压入流动室内。流动室内充满鞘液,在鞘液的包裹和推动下,细胞被排成单列,以一定速度从流动室喷口喷出。在流动室的喷口上配有一个超高频的压电晶体,充电后振动,使喷出的液流断裂为均匀的液滴,待测细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正、负不同的电荷,当液滴流经过带有几千伏的偏转板时,在高压电场的作用下偏转,落入各自的收集容器中,没有充电的液滴落入中间的废液容器,从而实现细胞的分离。

利用Hoechst SP细胞流式细胞仪分选肿瘤干细胞。

、Hoechst 33342的激发:要观察到SP,必须用紫外激光器来激发Hoechst 33342 染料和PI。紫外激光也会有较好的效果(Simpson et al., 2006)。Hoechst在350 nm波长被激发,另外的激光如激发FITC 和PE 的488激光可以用来激发其他的荧光染料。

、Hoechst发散的探测:Hoechst染料的发散用两个探测器来测量:Hoechst Blue 和 Hoechst Red。Hoechst Blue用450/20滤光片测量,Hoechst Red用675LP滤光片测量。用一种分色镜(我们用610 DMSP)来分离发散波长,PI荧光亦用675LP通道来测量。但他的阳性信号要较Hoechst Red信号更亮。可以用488激光同时激发和发散PI,用来将死细胞从发红色荧光的活的Hoechst染色的细胞中分离出来。同时,别的滤光片也可以应用,但这里推荐的是做好的。

还有,一种高能的紫外激光(50–100 mW)可以最好的分选SP。低能也许够用,但群不一定很清楚。最关键的是,SP可以被其阻断剂—维拉帕米,一种抗体共染,特异性的针对SP鉴定。