Caspase 2 活性检测试剂盒(比色法)

Caspase 2活性检测试剂盒(比色法)

简介：

Caspase(Cysteine-requiring Aspartate Protease)家族在介导细胞凋亡过程的起着极其重要的作用，其成员包括Caspase1～11等，均属于蛋白酶家族。Caspase 2又称Ich-1、Nedd-2或caspase-2，在细胞凋亡信号转导过程中被激活。Caspase 2活性检测试剂盒(比色法) (Caspase 2 Colorimetric Assay Kit) 的检测原理是利用Caspase 2催化底物 (Ac-VDQQD-p NA)产生黄色的游离硝基苯胺p NA(p -nitroaniline)，通过分光光度比色法测定p NA 在400～410nm 处吸光值，从而间接获得caspase 2的活性。

组成：

操作步骤(仅供参考)：

1、 制备标准曲线：

①_x0001_ 按照Caspase Lysis buffer ：Assay buffer=1:9的比例配制适量的标准品稀释液。

②_x0001_ 用标准品稀释液稀释p NA(10mM)，另外设置一管不加p NA 仅含标准品稀释液作为零管，把以上系列浓度物质作为标准品。

③_x0001_

取p NA 浓度分别为200μM 、100μM 、50μM 、25μM 、12.5μM 、6.25

μM 、0的标准品各100 μl 加入至96孔板或取适量体积加入至容量不超过100μl 的比色杯，测定405nm 处吸光值即A 405。 ④_x0001_

用每一个标准品的A 405减去不含p NA 的空白对照的A 405，计算出实际

的吸光值。以每个浓度的标准品A 405为x 轴，以对应的p NA 浓度为y 轴，用Excel 制作p NA 浓度对A 405值的标准曲线。

2、 样品裂解：

①_x0001_

悬浮细胞：取实验样品和对照样品，离心收集细胞，小心吸除上清，同

时确保尽量没有细胞被吸除，PBS 洗涤一次，再次小心吸除上清。按每2~10×106细胞加入 Caspase Lysis buffer 的比例加入Caspase Lysis buffer ，重悬细胞沉淀冰浴裂解。

编号 名称

CT0106 50T CT0106 100T Storage

试剂(A): Caspase Lysis buffer 10ml 20ml 4℃ 试剂(B): Assay buffer 10ml

20ml

4℃

试剂(C): Ac-VDQQD-p NA(2mM) 0.25ml ×2

0.25ml ×4 -20℃ 避光 试剂(D): p NA(10mM) 0.25ml ×2

0.25ml ×4 -20℃ 避光

使用说明书

1份

②_x0001_贴壁细胞：弃细胞培养液，用胰蛋白酶消化贴壁细胞，收集至细胞培养

液离心，小心吸除上清，同时确保尽量没有细胞被吸除，PBS洗涤一次，再次小心吸除上清。按照每2~10×106细胞加入Caspase Lysis buffer的比例加入Caspase Lysis buffer，重悬细胞沉淀冰浴裂解。

③_x0001_组织样品：按每3～10mg组织加入100μlCaspase Lysis buffer的比例

加入Caspase Lysis buffer，冰浴上用玻璃匀浆器匀浆并转移至1.5ml离心管中冰浴裂解。

④_x0001_离心取上清至新的1.5ml离心管。立即测定Caspase 2的酶活性或-70℃

保存样品。

⑤_x0001_蛋白定量：由于Caspase Lysis buffer含还原剂不宜采用BCA法，可采

用Bradford法测定蛋白浓度。以蛋白浓度达到1～3mg/ml为佳，否则应增加细胞或组织的量。

3、样品检测：

①按照下表设置96孔板反应体系，溶液应按照顺序依次加入，即Assay buffer→待

测样品→Ac-VDQQD-p NA(2mM)，大多数情况下，每个反应体系加入10～15μl 待测样品即可，并注意避免产生气泡。

空白对照高酶活性样品低酶活性样品Assay buffer 90μl 85μl 65μl

待测样品0μl 5μl 25μl

Ac-VDQQD-p NA(2mM) 10μl 10μl 10μl

总体积100μl 100μl 100μl

②孵育：盖紧96孔板37℃孵育。肉眼可见颜色发生变化时，即可进行A405检测；如

果颜色变化不明显，可适当延长孵育时间甚至过夜。

③待测样品A405分别减去空白对照A405即为样品Caspase 2水解底物产生的p NA

吸光值，根据标准曲线即可获得酶的含量。

④用Bradford法检测待测样品中的蛋白浓度(由于裂解液中含有较高浓度的DTT，不

适合采用BCA法进行蛋白浓度测定)，进而计算出一个样品单位重量蛋白中所含的caspase 2的酶活力单位即Caspase 2酶活力单位/mg protein。

计算结果：

①Caspase 2酶活力单位的定义：即当底物饱和时，在37℃一个小时内可以剪切

1nmol Ac-VDQQD-p NA产生1nmol p NA的caspase 2的酶量。根据p NA标准曲线和样品A405值，可计算出Caspase 2酶活力单位。

②Caspase 2酶活性的另外一种表示方法是Caspase活性增加的百分比即实验处理

组A405/实验对照组A405×100%，简单而可靠，可粗略的反应酶活性情况。

注意事项：

1、建议每次测定时都做标准曲线，以使标准更准确，另外标准品需避免反复冻融。

2、如果没有酶标仪，也可以使用普通的分光光度计测定，但应考虑根据比色杯的最小检

测体积，尽量采用100μl体积以内的比色杯。

3、所测样本的值高于标准曲线的上限，应用裂解液稀释样品后重新测定。

4、样品蛋白有效含量过低或Caspase激活水平过低都会导致实际测得的A405过低，应注

意使蛋白浓度尽量达到1～3μg/ml，调整诱导凋亡的时间和条件。

5、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

线粒体呼吸链复合物I活性比色法定量检测试剂盒产品说明书

线粒体呼吸链复合物活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版） 主要用途 线粒体呼吸链复合物（－辅酶还原酶）活性比色法定量检测试剂是一种旨在使用合成辅酶同功类似物和特异性抑制剂，通过反应系统测定样品中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（）氧化后峰值的降低，即采用比色法测定样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适合于各种纯化线粒体样品（动物、人体、酵母）以及细胞或组织裂解悬液样品的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（）－辅酶还原酶的特异性活性检测。其用于衰老、能量代谢、蛋白组学、病理生理学、神经病变等研究。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。 技术背景 线粒体呼吸链复合物，通常称为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸辅酶还原酶（；），又称为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶（；），是线粒体电子传递链中最大的结构成分：含有至多个多肽结构。其特征性的酶活性是鱼藤酮敏感的－辅酶还原酶（）。复合物催化线粒体内电子由供体传递到内膜上辅酶受体（泛醌；）的能量转移反应，为整个呼吸链反应系统的第一步。基于辅酶底物，在鱼藤酮存在与否的情况下，通过－辅酶还原酶的催化，转化成还原型泛醌（），同时还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（；）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（；），在分光光度仪下产生吸收峰值的变化（波长），由此定量测定－辅酶还原酶的特异活性。其反应系统是： 产品内容 缓冲液（）毫升 反应液（）毫升 阴性液（）毫升 底物液（）微升 专性液（）微升 产品说明书份 保存方式 保存在－℃冰箱里，避免反复冻融；反应液（）含有毒性物质，避免直接用手接触；反应液（）和底物液（），避免光照，有效保证月 用户自备 比色皿：用于比色分析的容器 双波长分光光度仪：用于比色分析 培养箱：用于孵育反应物 实验步骤

色度铂钴标准比色法

色度 （铂钴标准比色法） 方法原理 用氯铂酸钾与氯化钴配成标准系列，与水样进行目视比色。 干扰及消除 如水样浑浊,则放置澄清，也可用离心法或用孔径为0.45滤膜过滤以去掉悬浮物。但不能用滤纸过滤,因滤纸可吸附部分溶解于水的颜色。 仪器 50ML具塞闭塞管，其刻线高度应一致。 试剂 铂钴标准溶液：称取1.246g氯铂酸钾K2PCL6（相当于500铂）及1.000氯化钴 步骤 标准色列的配置: 向50ML比色管中加入0、0.5、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00、4.50、5.00、6.00及7.000铂钴标准溶液，用水稀释至标线，混匀。各管的色度依次为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60和70度。密封保存。 水样的测定: 1、分取50.0ML澄清透明水样于比色管中，如水样色度较大，可酌情少取水样，用水稀释至50.0ML。 2、将水样与标准色列进行目视比较。观测时，可将比色管至于白瓷板或白板上，使光线从关底部向上透过液柱，目光自管口垂直向下观察。记下与水样色度相同的铂钴标准色列的色度。 计算 色度=A×50/B 式中： A------稀释后水样相当于铂钴标准比色法的色度 B------水样得体积（ML） 注意事项 可用重铬酸钾代替氯铂酸钾配置标准色列。方法是：称取0.0437g重铬酸钾 和1.000g硫酸钴(CoSo 4.7H 2 O)溶于少量水中，加入0.50ml硫酸，用水稀释至 500ml。此溶液的色度为500度。不宜久存, 如果样品中有泥土或其它分散很散狠细的悬浮物，虽经处理而得不到透明水样时，则只测“表面颜色”。

细胞凋亡与衰老

细胞凋亡与衰老 （作者:___________单位: ___________邮编: ___________） 【关键词】细胞凋亡；衰老 衰老是指增龄过程中机体出现的多器官渐进性功能减退，其确切机制并不清楚，有多种学说，如自由基学说、端粒学说和细胞凋亡学说等。以啮齿类动物为研究对象，肌肉、脑、心脏等多种衰老组织中均存在细胞凋亡异常〔1〕。细胞凋亡参与多种与衰老相关的病理过程，如骨质疏松、阿尔茨海默病等。目前细胞凋亡在衰老中的作用成为国内外研究热点，本文就二者的最新研究进展作综述。 1 细胞凋亡 细胞凋亡涉及一系列基因的激活、表达及调控，是机体为更好地适应环境采取的主动死亡，其参与许多重要生命活动，如胚胎发育、免疫防御和维持组织稳态等，对维持细胞增殖与死亡的平衡有重要意义。 1.1 细胞凋亡途径 1.1.1 外源性途径又称死亡受体途径，是由膜受体介导的细胞死亡过程。死亡受体是属于肿瘤坏死因子受体超家族的跨膜受体，其中研究较透彻的是Fas/FasL系统。Fas广泛分布于胸腺、肝、心、肾等

组织细胞表面。当Fas与其配体FasL结合后发生多聚化，与胞浆内死亡结构域结合蛋白（FADD）结合，活化胞浆caspase8，再活化凋亡执行者caspase3，水解蛋白质，启动核酸内切酶剪切DNA，造成凋亡。这是发育过程和免疫系统中最主要的凋亡途径。通过该途径可清除发育过程及免疫反应中活化的淋巴细胞。增龄过程中Fas表达呈上升趋势。衰老大鼠胸腺细胞和脾细胞凋亡速度加快，可能造成衰老机体免疫功能下降。 1.1.2 内源性途径以线粒体为核心，又称线粒体途径。该途径凋亡信号来自体内各种应激，如DNA损伤、氧化应激、紫外线、生长因子缺乏等。凋亡信号引起前凋亡蛋白Bax活化，Bax诱导线粒体释放细胞色素c（Cyt c）。进入胞质的Cyt c与凋亡蛋白激活因子（Apaf1）、caspase9前体组成凋亡体，激活caspase9，再活化caspase3引起细胞凋亡。线粒体也可释放凋亡诱导因子(AIF)和内切核酸酶G进入胞浆，二者转移到细胞核，断裂DNA。随着年龄增长，内源性凋亡途径逐渐变得活跃。 1.1.3 内质网应激介导的细胞凋亡内质网(ER)参与蛋白质合成及翻译后加工修饰。当非折叠或错折叠蛋白质在ER内堆积超过处理能力时，引起ER应激。ER应激的一个后果是细胞凋亡。位于ER膜上的Bak、Bax发生构象变化形成多聚体，使Ca2+进入ER，活化caspase12，引起下游级联反应，活化caspase9和caspase3。机体具有应对ER应激的保护措施，如使翻译起始因子eIF2去磷酸化，减少蛋白质合成。但衰老机体应对ER应激能力降低，eIF2磷

caspase-3

(一)caspase家族 Caspases是近年来发现的一组存在于胞质溶胶中的结构上相关的半胱氨酸蛋白酶，它们的一个重要共同点是特异地断开天冬氨酸残基后的肽键。Caspase一词是从Cysteine aspartic acid specific protease 的字头缩写衍生而来，就反映了这个特征，而这种高度的特异性，在蛋白酶中是很少见的。由于这种特异性，使caspase能够高度选择性地切割某些蛋白质，这种切割只发生在少数（通常只有1个）位点上，主要是在结构域间的位点上，切割的结果或是活化某种蛋白，或使某种蛋白失活，但从不完全降解一种蛋白质。 Caspase的研究源于线虫（C. elegans）细胞程序化死亡的研究。线虫在发育过程中，有131个细胞将进入程序化死亡；研究发现有11个基因与PCD 有关，其中ced3和ced4基因是决定细胞凋亡所必需的，ced9基因抑制PCD。线虫细胞程序化死亡的研究促进了其他动物特别是哺乳类动物中细胞凋亡的研究。人们发现哺乳类细胞中存在着Ced3的同源物ICE（interleukin-1b converting enzyme），它催化白介素-1b的活化，即从其前体上将IL-1b 切割下来。在大鼠成纤维细胞中过量表达ICE和Ced3都会引起细胞凋亡，表明了ICE和Ced3在结构和功能上的相似性；然而敲除ICE基因的小鼠其表现型正常，并未发现细胞凋亡发生明显改变。进一步的研究发现，另一个ICE成员，后来被称为apopain，CPP32或Yama的半胱氨酸蛋白酶，催化poly（ADP-ribose）Polymerase（PARP），即聚（ADP-核糖）聚合酶的裂解，结果导致细胞的凋亡，因而认为apopain执行着与线虫中的ced3相同的功能。Apopain被称为是“死亡酶”，而PARP被认为是“死亡底物”。 Apopain/CPP32/Yama是在1995年由两个实验室分别同时报导，时间上只有两周之差。Ced4的哺乳类同源物则迟迟未能发现，直到1997年，才被证明是Apaf-1（即一种细胞凋亡蛋白酶活化因子apoptosis protease activating factor）。而Ced 9的哺乳类对应物则较早地被证明是BCL-2，这一问题将在以后的部分述及。 现已确定至少存在11种caspase： 这些caspases中，caspase 1和caspase 11，以及可能还有caspase 4被认为不直接参与凋亡信号的转导，它们主要参与白介素前体的活化；而caspase 2，caspase 8，caspase 9和caspase 10参与细胞凋亡的起始；参与细胞凋亡执行的则是caspase 3，caspase 6和caspase 7，其中caspase 3和7具有相近的底物和抑制剂特异性，它们降解PARP，DFF-45（DNA fragmentation factor-45），导致DNA修复的抑制并启动DNA的降解。而

蒽酮法测还原糖

总糖的含量的测定（蒽酮法） 一、实验目的 掌握蒽酮比色法测定糖的原理与方法。 二、实验原理 蒽酮比色法是一个快速而简便的测定糖方法。蒽酮可以和游离的己糖或多糖中的己糖基、戊醛糖及己糖醛酸起反应，反应后溶液呈蓝绿色，在620 nm 处有最大吸收。蒽酮可与其他一些糖类发生反应，但显现的颜色不同。当样品中存有含有较多色氨酸的蛋白质时，反应不稳定，呈红色。对于以上特定的糖类反应较稳定。 三、实验器材 1.吸管 2.试管 3.分光光度计 4.水浴锅 5.电炉 6.电子分析天平 四、实验试剂 1．蒽酮试剂：取2 g蒽酮溶于1000 ml体积分数为80 %的硫酸中，当时配制使用。 2．标准葡萄糖溶液（0.1 mg/ml）：100 mg葡萄糖溶于蒸馏水并稀释至1000 ml（可滴加几滴甲苯作防腐剂）。 3． 6 mol/l HCl溶液。

4．10 % NaOH溶液：称取10 g NaOH固体，溶于蒸馏水并稀释至100 ml。 五、实验操作 1.制作标准曲线 取干净试管7支，按下表进行操作。 表蒽酮比色法测定糖含量的标准曲线制作 2.样品的处理（见实验四） 取上述实验四的水解液，冷却后用10 % NaOH溶液中和至pH呈中性，然后用蒸馏水定容至100 ml，过滤，取滤液10 ml，用蒸馏水定容于100 ml成稀释1000倍的总糖水解液，用于糖含量的测定。 测定时取1 ml总糖水解液测定还原糖的含量（同标准曲线）。

样品中糖含量的计算： w —糖的质量分数（%）； C —从标准曲线上查出的糖质量浓度(mg/ml)； V —样品稀释后的体积（ml ）； m —样品的质量（mg ）。 ｗ＝ CV ｍ ×100%

细胞沉默调节蛋白1(SIRT1)活性比色法定量检测试剂盒(中文

细胞沉默调节蛋白1 （SIRT1）活性比色法定量检测试剂盒（中文版） 主要用途 细胞沉默调节蛋白1 （SIRT1）活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过比色探针对硝基苯胺标记人工合 成的乙酰化p53多肽底物，经过SIRT1脱乙酰基后，被位点特异性氨基肽酶水解，释放黄色对硝基苯胺， 即采用比色法来测定细胞裂解萃取样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实 验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取液样品（动物、人体）、核蛋白样品、部分或完全纯化酶样品中SIRT1 的活性定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。 技术背景 人体组蛋白脱乙酰基酶（histone deacetylase；HDAC）家属分成三类共20多个蛋白：种类I（class I）与酵母 Rpd3蛋白同源，包括HDAC1、2、3、8，存在于细胞核中；种类II（class II）与酵母Hda1蛋白同源，包括 HDAC4、5、6、7、9a、9b、10和HDRP/MITR，存在于细胞核和细胞浆里；上述两大种类的蛋白分子催化 结构域含有锌，且曲古菌素A（trichostatin A；TSA）敏感。种类III（class III）为NAD+辅助因子必需，又 称为sirtuins，与酵母Sir2（Silent Information Regulator 2）同源，包括SIRT1至7等，为曲古菌素A（trichostatin A；TSA）不敏感型赖氨酸脱乙酰基酶（lysyl-deacetylase）。催化赖氨酸脱乙酰基反应，以及由NAD+和乙酰（acetyl）基团转化产生的烟酰胺（nicotinamide）和O-乙酰ADP核糖（O-acetyl-ADP-ribose）。SIRT1位于细 胞核内，与酵母Sir2同源性最高。其功能在于调节p53活性和抑制细胞凋亡。基于人工合成的乙酰化p53（379 至382氨基酸位点）多肽底物Ac-Arg-His-Lys-Lys（Ac）具有抗氨基肽酶切离的功能，首先使用比色染料对 硝基苯胺（p-Nitroaniline；p-NA）来标记乙酰化p53多肽底物，其次进行脱乙酰化，最后底物进一步在氨基 肽酶的催化酶解，释放出具有强烈吸光值的黄色对硝基苯胺（波长405nm），由此来定量测定沉默调节蛋 白1的活性。其反应系统为： Sirt1 Ac-Arg-His-Lys-Lys（Ac）-p-NA + NAD →Ac-Arg-His-Lys-Lys-p-NA + nicotinamide + O-acetyl-ADP-ribose 氨基肽酶 Ac-Arg-His-Lys-Lys-p-NA →Ac-Arg-His-Lys-Lys +p-NA 产品内容 裂解液（Reagent A）20毫升 分离液（Reagent B）80毫升 清理液（Reagent C）80毫升 萃取液（Reagent D）5毫升 缓冲液（Reagent E）3毫升 底物液（Reagent F）100微升 终止液（Reagent G）200微升 酶解液（Reagent H）200微升 补充液（Reagent I）500微升 产品说明书1份 保存方式

细胞衰老和凋亡教学设计.docx

第六章细胞的生命历程 第3节细胞的衰老和凋亡教学设计 一、教材分析 细胞像生物体一样也要经历出生、生长、成熟、繁殖、衰老、死亡的过程，所以细胞的分裂、分化、衰老、死亡是生命的必然。那么个体衰老与细胞衰老的关系呢？细胞衰老有哪些表现呢？细胞衰老的原因是什么？细胞的衰老和凋亡是生命活动中必不可少的过程，衰老和凋亡有什么关系？这一连串的问题构成本节内容的主线。对于细胞衰老和凋亡的学习，能使学生对细胞的整个生命过程有个完整的认识。同时细胞衰亡机制的研究与生物科技的发展息息相关。对细胞衰 亡知识的学习，有助于培养学生的科学兴趣，培养学生的创新意识。 二、教学目标 1.知识与技能 (1)个体衰老与细胞衰老的关系。 (2)描述细胞的衰老的特征和原因。 (3)简述细胞凋亡的含义及与细胞坏死的区别。 2.过程与方法 (1)培养学生联系实际灵活应用知识的能力。 (2)学会进行与社会老龄化相关问题的分析。 3?情感态度与价值观 (1)探讨细胞的衰老和凋亡与人体健康的关系，关注老年人健康状况和生活状况

(2)通过有关衰老问题的讨论，树立科学的发展观。 三、教学重点难点 学习重点：1?细胞衰老的概念及特征。2?细胞凋亡的含义。 学习难点：细胞衰老与细胞凋亡的区别和联系。 四、学情分析 学生已经学习了细胞的增殖、分化的内容，对本节的内容已经有了初步的认识和理解，明确了细胞的分化、衰老和凋亡是一个自然的生命过程。本节的内容接近现实生活，可利用现实生活中的例子加以说明，培养学生知识的应用能力和知识的迁移能力。 五、课型：新授课教学方法：教学基本环节：情境导入、展示目标→合作探究、精讲点拨→反思总结、当堂检测→布置作业及预习 六、课前准备布置学生在课前预习细胞衰老与凋亡内容。教师制作课件。 七、课时安排：1课时 八、教学过程 【情景导入、展示目标】 教师展示刘德华的电影一一童梦奇缘的剧照：谁曾经没有幻想过一夜长大？谁又在垂暮之年没有产生过如果生命可以重来的念头？但是如果真的有那么一种方式，可以让你体验一下一夜长大的感觉，你会为此付出青春的代价嘛？ 问题1:人的一生必然要经历哪些生命历程：出生→生长→成熟→繁殖→→的生命历程。(学生思考回答)

caspase家族及在细胞凋亡中的作用

caspase家族及在细胞凋亡中的作用 admin 注:本文仅是基础知识，目前这方面进展十分快，需要更新更多的知识。如caspase家族目前发现至少14种。这里仅介绍几种常见的成员。目的是让大家了解到caspase家族的概况，以及在细胞凋亡中的作用。 一caspase家族蛋白酶的组成 未活化的caspase家族蛋白酶是以酶原形式存在的，酶原的氨基端有一段被称为“原结构域”(pro-domain)的序列。酶原活化时不但要将原结构域切除，并且要将剩余部分剪切成一大一小两个亚基，分别称为P20和P10，活性酶就是由这两种亚基以(P20/P10) 2 的形式组成的。这种活化反应也是Asp特异的，剪切发生在酶原中保守序列的Asp与其后的氨基酸残基之间，一般是先切下羧基端的小亚基，然后再从大亚基的氨基端切去原结构域。这种剪切可以是酶原及中间活性酶自我催化，也可以是其它ICE家族蛋白酶的作用，还有其它酶类如颗粒酶B 参与。 表5. caspase家族蛋白酶的识别序列及作用底物 蛋白酶名称别名识别序 列 底物 caspase 1ICE YVAD pro-IL-1 , pro-caspase 3, pro-caspase 4 caspase 4TX, ICH-2, ICErel-II pro-caspase 1 caspase 5ICErel-III, TY mICH3 mICH4 caspase 2ICH-1PARP caspase 9ICE-LAP6, Mch6PARP

caspase 3CPP32, Yama, apopain DEVD PARP, DNA-PK, SRE/BP, rho-GDI, KCθ caspase 6Mch2VEID lamin A caspase 7Mch3, ICE-LAP3, CMH-1 DEVD PARP, pro-caspase 6 caspase 8MACH, FLICE, Mch5DEVD pro-caspase3,4,7,9,10 caspase 10Mch4YVAD caspase 11ICH3, FLICE2 CED-3 已命名的caspase家族成员均已克隆成功，它们不但在氨基酸序列上具有同源性，而且在空间结构上也很相似。目前已经获得了caspase-1(ICE)和caspase-3(CPP32)的X线结晶图像，结果显示它们具有相似的空间结构，在P20的C端和P10的N端有200多个氨基酸残基的序列尤为保守，在空间结构上组成相似的β折叠中心和相邻的α螺旋，保守的、对蛋白酶活性有特殊意义的氨基酸残基均位于这一段，并形成特定的结构。不同源的序列主要存在于P20的N 端和P20与P10交界处，这两个部位的氨基酸残基在蛋白酶活化过程中一般被全部或部分切除。 所有的成员都保守性地包含有与底物P 1 Asp作用的氨基酸残基，如在ICE中，它们是催化中心的Cys285，与酶/抑制剂复合物的巯基半缩醛以氢键结合的His237，以及可以稳定反应中间物氧 阴离子的Gly238。另外，Arg179、Arg341、Gln383和Ser347形成容纳P 1 Asp的“口袋”，Ser339靠近 Cys285的巯基，以氢键结合P 1位的酰胺。与P 2 ~P 4 作用的氨基酸残基则变异比较大，这可能是各 个成员识别不同底物的特异性之所在。在活性Cys周围的氨基酸序列也很保守，一般都有Gln-Ala-Cys-Arg-Gly(QACRG)五肽序列，在caspase-8、caspase-10中为QACQG，在caspase-9中是QACGG，这三个成员都有一个氨基酸残基的变异，但这种变异不影响蛋白酶的剪切活性和特异性。

蒽酮比色法测总糖

[1] 姚立虎,徐茜. 蒽酮比色法测食品总糖含量的简化研究[J]. 食品工业992,03:40-42. 1. 2 试剂 0. 1 mg / mL, 1 葡萄糖标准溶液:准确称取10mg 葡萄糖标准品溶于少量蒸馏水中，溶解后转移至容量瓶中，用蒸馏水定容至100 mL. 蒽酮硫酸溶液:准确称取蕙酮50 mg 于100mL 二烧杯中，加入蒸馏水25 mL, ，缓慢加入98% 质量分数）浓硫酸75 mL, ，边加边搅（于冰水浴中完成），直至蕙酮溶解，冷却至室温后使用（临用新配）。 浓盐酸、浓硫酸、NaOH ，以上试剂均为分析纯，实验用水为蒸馏水。 1. 3 方法 1. 3. 1 显色剂（蒽酮硫醇溶液）用量选择。向试管中加入0. 1 mg / mL 葡萄糖标液0. 1 mL, ，并加入蒸馏水至1m L, ，分别加入不同量的显色剂显色测定，以0. 1 mL, 蒸馏水为空 白对照。 1.3.2 显色时间选择。向10 mL 二试管中加入0. 1mg / mL 葡萄糖标液0. 1 mL 二并加入蒸馏水至1mL, ，在冰水浴中缓慢加入9 mL 显色剂摇匀，改变沸水浴时问，冷却至室温后测体系吸光度。 1.3.3 葡萄搪标准曲线的绘制。改变0. 1 mgmL 葡萄糖标准液和蒸馏水的用量，再分别加入9mL 显色剂，进行显色测定。 1.3.4 正交试验确定提取条件。采用正交试验，考查 4 个影响因素（料液比、盐酸浓度、提取时间、水解时问）对实验的影响，因素水平见表 1.

1.3.5 水溶性总搪的提取。取0. 5 g 棉花纤维于150 mL 圆底烧瓶中，加入30 mL, 蒸馏水，在沸水浴中加热60 mLn, 滤出提取液20 mL 于50 mL 烧瓶中，加 5 mol / L 盐酸 5 mL 继续在沸水浴中加热30 mLn ，冷却后，滴加一滴酚酞，用 5 mol / L, 1 的氧氧化钠中和至中性。 1. 3. 6 水溶性总搪的测定。取提取液 1 mL 于10mL 试管中，在冰水浴中缓慢加入9 mL, 蕙酮硫酸溶液摇匀，在沸水浴中加热9 mLn ，冷却后放置30min 测定吸光度。从标准曲线上查得对应的浓度并计算总糖含量。 2 结果与分析 2. 1 吸收曲线 用紫外刊一见分光光度计在500 ~700 nm 波长范围内进行光谱扫描，结果发现在625 nm 处有最大吸收，故本实验采用625 nm 为测定波长。 2. 2 显色剂用量 由图 1 可以看出，当显色剂用量为9 ml 二时吸光度最大，故实验采用显色剂用量为9 m l。

植物查尔酮合成酶(chalconesynthase)活性比色法定量检

植物查尔酮合成酶（chalcone synthase）活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）主要用途 植物查尔酮合成酶（chalcone synthase）活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A缩合反应系统中释放出巯基辅酶A，使用Ellman试剂后，产生黄色5-巯基-2-硝基苯甲酸产物吸光峰值的变化，即采用比色法来测定植物裂解样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种植物组织，包括种子（seed）、叶片（leaf）、根（root）、胚胎叶（cotyledon）、上胚轴（epicotyl）等查尔酮合成酶的活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。 技术背景 查尔酮合成酶（chalcone synthase；CHS；EC2.3.1.74）是聚酮体合成酶（polyketide synthase；PKS）大家属中的一员，是启动类黄酮（flavonoid）化合物合成通路中第一步关键酶，形成植物系统性获得性抗性（systematic acquired resistance；SAR）的基础。查尔酮合成酶存在于细菌、植物和真菌中。在所有裸子植物（gymnosperm）和被子植物（angiosperm）的各种不同发育阶段中的不同组织中表达。查尔酮合成酶为同源二聚体，分子量为40至4000Kd，由环境压力，包括UV照射、伤口、病原菌袭击等诱导，通过丙二酰辅酶A脱羧基反应（decarboxylation）、与香豆酰辅酶缩合、聚酮体链延展（chain elongation）、中间产物环状化（cyclization）和芳构化（aromatization）产生查尔酮，一种类黄酮化合物前体，作为化学信使，由此生成各种后续继发性代谢化合物，参与抗病原微生物例如异黄酮植物保护素（isoflavonoid phytoalexin）、花青素花色素化、抵御环境压力（UV光保护）、花粉育性（pollen fertility）、抗氧化、共生根系结瘤（symbiotic root nodulation），以及作为抗生素、免疫抑制剂、抗肿瘤和抗真菌的药物作用。还在细菌的囊肿形成和阿米巴细胞分化中产生作用。基于香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A，在敏感性抑制剂木犀草素（Luteolin）存在与否的情况下，受到查尔酮合成酶的作用，缩合产生查尔酮，并释放出巯基辅酶A（CoA-SH），进而与Ellman 试剂5,5-二硫基-双（2-硝基苯甲酸）[5,5,-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反应后，产生黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通过其吸收峰值的变化（412nm波长），来定量分析查尔酮合成酶的活性。查尔酮合成酶反应系统为： 产品内容 清理液（Reagent A）毫升 裂解液（Reagent B）毫升 缓冲液（Reagent C）毫升 反应液（Reagent D）毫升 底物液（Reagent E）毫升 专性液（Reagent F）微升 产品说明书1份 保存方式 保存缓冲液（Reagent C）、反应液（Reagent D）和底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；反应液（Reagent D）和底物液（Reagent E）避免光照；有效保证6月

Caspase信号通路

Caspases are a family of cysteine proteases that act in concert in a cascade triggered by apoptosis signaling. The culmination of this cascade is the cleavage of a number of proteins in the cell, followed by cell disassembly, cell death, and, ultimately, the phagocytosis and removal of the cell debris. The Caspase cascade is activated by two distinct routes: one from cell surface and the other from mitochondria (Ref.1). The pathway leading to Caspase activation varies according to the apoptotic stimulus. Initiator Caspases (including 8, 9, 10 and 12) are closely coupled to pro-apototic signals. Pro-apoptotic stimuli include the FasL (Fas Ligand), TNF (Tumor Necrosis Factor), Granzyme-B, GRB (Growth Factor Receptor-Bound Protein), DNA damage, Ca2+ (Calcium) channels and ER (Endoplasmic Reticulum) stress. Once activated, these Caspases cleave and activate downstream effector Caspases (including 3, 6 and 7). Caspase8 cleaves BID (BH3 Interacting Death Domain). tBID (Truncated BID) disrupts the outer mitochondrial membrane to cause release of the pro-apoptotic factors CytoC (Cytochrome-C) which is crucial for activating pro-Caspase9. CytoC that is released from the intermembrane space binds to APAF1 (Apoptotic Protease Activating Factor-1), which recruits Caspase9 and in turn can proteolytically activate Caspase3. SMAC (Second Mitochondria-Derived Activator of Caspase)/DIABLO is also released from the mitochondria along with CytoC during apoptosis, and it functions to promote caspase activation by inhibiting IAP (Inhibitor of Apoptosis) family proteins. ER stress leads to the Ca2+-mediated activation of Caspase12 (Ref.2). Fas and the TNFR (TNF Receptor) activate Caspases8 and 10. Cell death caused by activation of the TNFR or Fas receptors is brought about by the recruitment of the adaptor protein FADD (Fas Associated Death Domain). In the case of the TNFR1, FADD recruitment requires prior binding of TRADD (TNFR-Associated Death Domain Protein). FADD in turn recruits ProCaspase8. The TNFR1 receptor can also mediate activation of Caspase2 via the recruitment of a death-inducing signaling complex. In this case RIP (Receptor-Interacting Protein) acts as an adaptor for the recruitment of RAIDD (RIP-Associated ICH-1/CED-3-homologous protein with a Death Domain), which subsequently binds to ProCaspase2. TNFR also activates Caspase3, 6,7 via TRADD, TRAF2 (TNF Receptor-Associated Factor-2) and RICK (RIP-like Interacting Clarp Kinase). TNF not only induces apoptosis by activating Caspase8 and 10, but can also inhibit apoptosis signaling via NF-KappaB (Nuclear Factor-KappaB), which induces the expression of IAP, an inhibitor of Caspases3, 7 and 9 (Ref.3). GRB (Growth Factor Receptor-Bound Protein), Granzyme B and perforin proteins released by cytotoxic T-Cells induce apoptosis in target cells, forming transmembrane pores, and triggering apoptosis, perhaps through cleavage of Caspases, although Caspase-independent mechanisms of Granzyme-B mediated apoptosis have been suggested (Ref.4). After activation, down stream Caspases cleave cytoskeletal and nuclear proteins (structural, signaling proteins or kinases) like PARP (Poly ADP-Ribose Polymerase), DNA-PK (DNA-Dependent Protein Kinase), Rb (Retino Blastoma Tumor Supressor Protein), PAK1 (p21-Activated Kinase-1), GDID4, Fodrin, Lamin-A, Lamin-B1, Lamin-B2, thus inducing apoptosis. Caspase3 cleaves ICAD (Inhibitor of CAD) to free CAD (Caspase-Activated DNase) to cause DNA fragmentation. The events culminating in Caspase activation and the subsequent disassembly of the cell are the subject of intense study because of their role in many neurodegenerative disorders such as Parkinson's and Alzheimer’s diseases, autoimmune disorders, and tumorigenesis. References: 1. Srinivasula SM,Ahmad M,Fernandes-Alnemri T,Alnemri ES. Autoactivation of procaspase-9 by Apaf-1-mediated oligomerization. Mol Cell. 1998 Jun;1(7):949-57. 2. Pirnia F,Schneider E,Betticher DC,Borner MM. Mitomycin C induces apoptosis and caspase-8 and -9 processing through a caspase-3 and Fas-independent pathway. Cell Death Differ. 2002 Sep;9(9):905-14.

实验8-植物组织中可溶性糖含量的测定(蒽酮比色法)

实验方案 一、实验目的 通过实验，掌握测定萝卜品质的方法 （一）萝卜外部形态的测定 1、实验材料 取鲜样3个∕小区 直尺、蒸馏水、笔、记录本、吸水纸 2、实验方法 ．用自来水将各组萝卜洗净后，再用蒸馏水洗涤，擦干表面水分．每个小区取3个重复，用电子天平称量每株的鲜重，用直尺测量植株的茎长、茎粗、叶长，取平均值作为指标值 实验(二) 植物体内可溶性糖含量的测定（蒽酮法） 一、实验目的 了解蒽酮法测定可溶性糖含量的原理；掌握分光光度计的使用二、实验原理 糖类物质是构成植物体的重要组成成分之一，也是新陈代谢的主要原料和贮存物质。不同载培条件，不同成熟度都可以影响水果、蔬菜中糖类的含量。因此对水果、蔬菜中可溶性糖的测定，可以了解和鉴定水果、蔬菜品质的高低。 蒽酮比色定糖法是一个快速而方便的定糖方法，在强酸性条件下，蒽酮可以与游离的或多糖中存在的己糖、戊糖及己糖醛酸（还原性和非还原性）作用生成蓝绿色的糖醛衍生物，其颜色的深浅与糖的含量在一定范围内成正比。蒽酮也可以和其他一些糖类发生反应，但显现的颜色不同。当存在含有较多色氨酸的蛋白质时，反应不稳定，呈现红色。上述特定的糖类物质，反应较稳定。该法特点：灵敏度高，测定量少，快速方便。 三、材料、仪器及试剂

1.材料：植物种子、白菜叶、柑桔 2.仪器：分光光度计；恒温水箱；20ml具塞刻度试管（3支）漏斗；100ml容量瓶；刻度试管；试管架；剪刀；研钵 3.试剂 （1）200μg/ml标准葡萄糖：AR级葡萄糖100mg，蒸馏水溶解，定容至500ml。 （2）蒽酮试剂：1g蒽酮，用乙酸乙酯溶解，定容至50ml，棕色瓶避光处贮藏； （3）浓硫酸 四、实验方法 1.葡萄糖标准曲线的制作 取6支20ml具寒试管，编号，按下表数据配制一系列不同浓度的标准葡萄糖溶液。在每管中均加入0.5ml蒽酮试剂，再缓慢地加入5ml 浓H2SO4，摇匀后，打开试管塞，置沸水浴中煮沸10分钟，取出冷却至室温，在620nm波长下比色，测各管溶液的光密度值（OD），以标 2. 称取1克白菜叶，剪碎，置于研钵中，加入少量蒸馏水，研磨成匀浆，然后转入20ml刻度试管中，用10ml蒸馏水分次洗涤研钵，洗液一并转入刻度试管中。置沸水浴中加盖煮沸10分钟，冷却后过滤，滤液收集于100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀备用。 3.糖含量测定 用移液管吸收1ml提取液于20ml具塞刻度试管中，加1ml水和0.5ml蒽酮试剂。再缓慢加入5ml浓H2SO4（注意：浓硫酸遇水会产生大量的热！），盖上试管塞后，轻轻摇匀，再置沸水浴中10分钟（比色空白用2ml蒸馏水与0.5ml蒽酮试剂混合，并一同于沸水浴保温10分钟）。冷却至室温后，在波长620nm下比色，记录光密度值。查标准曲线上得知对应的葡萄糖含量（μg）。 五、结果计算 样品含糖量（g/100g鲜重）=查表所得糖含量（μg）×稀释倍数×100/样品重（g）×106 六、注意事项

活性硅的测定(钼蓝比色法)

活性硅的测定（钼蓝比色法） 1原理 在PH值为1.1～1.3的溶液中，可溶硅与钼酸铵反应生成硅钼黄，再用氯化亚锡还原生成硅钼蓝，此蓝色的色度与水样中可溶性硅的含量有关。磷酸盐对本方法的干扰可用调整酸度及加草酸或酒石酸的方法加以消除。 当水样中可溶性硅含量小于每升0.5mgSiO2 时，可用硅钼蓝光度法或用正丁醇等有机溶剂萃取浓缩，以提高灵敏度，便于比色。 硅的测定范围：10－500μgSiO2/L和0.5－20mgSiO2/L。 2仪器 具有磨口塞的25ml比色管。 3试剂 3.1 5%(m/V)钼酸铵溶液：用除盐水配制，配制后溶液澄清透明。 3.2 1%氯化亚锡溶液：称取1.19g氯化亚锡(SnCl2 2H2O)于烧杯中，加20ml盐酸溶液(1+1)，加热溶解后，再加80ml纯甘油(丙三醇)，搅匀后将溶液转入塑料瓶中备用。 3.3C(H2SO4)= 5mol/L硫酸溶液：于720ml试剂水中徐徐加入280ml浓硫酸。3.4SiO2储备液的配制 称取0.1000（±0.001）克经700—800℃灼烧过（已研磨细）二氧化硅（优级纯），与（0.7～1.0）克已于270—300℃焙烧过的粉状无水碳酸钠（优级纯）置铂坩埚内混匀，用马弗炉升温至900—950℃，保温20～30min后，把铂坩埚在900—950℃温度下熔融5 min冷却后，将铂坩埚放入硬质烧杯中，用热的超纯水溶解熔融物，放在水浴锅上不断搅拌。待熔融物全部溶解后取出坩埚，以超纯水仔细冲洗坩埚内外壁，待溶液冷却至室温后，移入1L容量瓶中，用超纯水稀

释至刻度,混匀后移入塑料瓶中储存。此液应完全透明，如有浑浊须重新配制。 3.5 SiO2工作液的配制 3.5.11ug/ml的SiO2工作溶液： 吸取100ug/ml的SiO2储备液1.0ml，于100ml的容量瓶中.用高纯水稀释至刻度。 注：SiO2工作溶液应在使用时配制，且储存时间不宜过长。 3.5.20.02mg/ml的SiO2工作溶液： 吸取10ml的SiO2储备液，于50ml的容量瓶中,用高纯水稀释至刻度。 3.6正丁醇（或异戊醇) 4分析步骤 4.1活性硅含量大于每升0.5mgSiO2时，测定方法如下： 4.1.1于一组比色管中分别注入二氧化硅工作液(1ml含0.02mgSiO2)0.25、0.5、1.0、1. 5......ml，用无硅水稀释到10ml。 4.1.2在另一支比色管中注入适量水样并用无硅水补足到10ml。 4.1.3往上述比色管中各加0.2ml 5mol/L硫酸溶液，摇匀。 4.1.4用滴定管分别加入1ml钼酸铵溶液，摇匀。 4.1.5静置5min后，用滴定管分别加入5ml 5mol/L硫酸溶液，摇匀，静置1min。 4.1.6再分别加入2滴氯化亚锡溶液，摇匀。 4.1.7静置5min后进行比色。

caspase资料

caspase家族蛋白酶的组成 已命名的caspase家族成员均已克隆成功，它们不但在氨基酸序列上具有同源性，而且在空间结构上也很相似。目前已经获得了caspase-1(ICE)和caspase-3(CPP32)的X线结晶图像，结果显示它们具有相似的空间结构，在P20的C端和P10的N端有200多个氨基酸残基的序列尤为保守，在空间结构上组成相似的β折叠中心和相邻的α螺旋，保守的、对蛋白酶活性有特殊意义的氨基酸残基均位于这一段，并形成特定的结构。不同源的序列主要存在于P20的N端和P20与P10交界处，这两个部位的氨基酸残基在蛋白酶活化过程中一般被全部或部分切除。 所有的成员都保守性地包含有与底物P1Asp作用的氨基酸残基，如在ICE中，它们是催化中心的Cys285，与酶/抑制剂复合物的巯基半缩醛以氢键结合的His237，以及可以稳定反应中间物氧阴离子的Gly238。另外，Arg179、Arg341、Gln383和Ser347形成容纳P1Asp的“口袋”，Ser339靠近Cys285的巯基，以氢键结合P1位的酰

胺。与P2~P4作用的氨基酸残基则变异比较大，这可能是各个成员识别不同底物的特异性之所在。在活性Cys周围的氨基酸序列也很保守，一般都有Gln-Ala-Cys-Arg-Gly(QACRG)五肽序列，在caspase-8、caspase-10中为QACQG，在caspase-9中是QACGG，这三个成员都有一个氨基酸残基的变异，但这种变异不影响蛋白酶的剪切活性和特异性。 未活化的caspase家族蛋白酶是以酶原形式存在的，酶原的氨基端有一段被称为“原结构域”(pro-domain)的序列。酶原活化时不但要将原结构域切除，并且要将剩余部分剪切成一大一小两个亚基，分别称为P20和P10，活性酶就是由这两种亚基以(P20/P10)2的形式组成的。这种活化反应也是Asp特异的，剪切发生在酶原中保守序列的Asp与其后的氨基酸残基之间，一般是先切下羧基端的小亚基，然后再从大亚基的氨基端切去原结构域。这种剪切可以是酶原及中间活性酶自我催化，也可以是其它ICE家族蛋白酶的作用，还有其它酶类如颗粒酶B参与。二caspase家族蛋白酶的结构与功能 按照结构同源性的大小，可以将caspase蛋白酶分为三个组，分别以caspase-1、caspase-2和caspase-3为代表。其中最重要的是caspase-1、caspase-3 和caspase-8。