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荧光定量PCR应用中的问题及优化方案

实时定量PCR应用中的问题及优化方案

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction , PCR)自诞生之日起就决定了它不仅是一种高敏感、高特异的检测核酸分子的定性方法,而且也是一个能对核酸分子进行精确定量的有力工具[1]。随着分子生物学技术研究的不断进展,定量PCR技术取得了突飞猛进的发展,不仅建立了一系列的方法,而且也诞生了许多与这些方法相匹配的新型热循环仪和实验材料。实时定量PCR(real-time quantitative PCR)技术便是一种具有革命性意义的定量PCR技术,所谓实时定量PCR是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量,并据此推断目的基因的初始量[2]。目前它作为一个极有效的实验方法,已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域,仅2000-2001年,收录在Medline上的以real-time PCR为关键词的文章就达一千多篇。实时PCR技术较之与以前的以终点法进行定量的PCR技术具有无与伦比的优势。首先,它不仅操作简便、快速高效,而且具有很高的敏感性和特异性。其次,由于是在封闭的体系中完成扩增并进行实时测定,大大降低了污染的可能性并且无须在扩增后进行操作。另外,它还可以通过不同的引物设计在同一反应体系中同时对多个靶基因分子进行扩增,即多重扩增[3,4,5]。本文将对实时定量PCR目前的应用状况、仪器应用、新材料进展以及实验条件的优化作一综述。

实时定量PCR的应用现状

实时定量PCR技术自1996年诞生以来,由于它显著的优越性,不仅广泛的应用于分子生物学的各个研究领域,而且也开始作为一种诊断手段应用于临床。其应用涉及到的范围包括DNA、mRNA和病毒荷载量的定量,核酸多态性分析,基因突变分析等多个领域[3]。

Giulietti 等人[6]对用实时定量PCR测定细胞因子基因的表达作了详细的描述。细胞因子是一种调节蛋白,它对免疫反应、炎症反应具有重要的调节作用,其量的改变常常与一些疾病,如炎症反应、自身免疫性疾病、移植排斥有密切的关系。由于所得到组织样本常常因为太小而不能满足在蛋白质水平的检测,另外,通常用的蛋白质检测方法(如ELISA)的灵敏度也难以完成对极微量的蛋白产物的检测,所以应用PCR定量进行基因诊断就显得十分有意义。

众所周知,cDNA微排列和差异表达PCR技术是对基因表达变化分析的两种关键技术,但是这两种技术只能对基因表达变化进行定性分析,而不能进行定量分析。Rajeevan 等人[7]利用实时定量PCR技术却成功地将基因表达的变化进行了量化,不仅有效地证明了上述两种方法的有效性,而且提供了一种具有高通量的对基因表达变化进行检测的新技术。

实时定量PCR技术的出现不仅增强了有关对基因量变化的研究方法,而且也增强了对基因质所发生变化方面的研究。例如Laird和他的同事们[8]建立了一种被称作Methylight 的实时定量PCR方法,它能通过特异的引物和/或Taqman探针检测基因CpG岛的胞嘧啶