血清胸苷激酶1在中老年人肿瘤免疫监测中的作用

　综合治疗　

血清胸苷激酶1在中老年人肿瘤免疫监测中的作用

张国庆,焦顺昌,魏秀芳

Serum thy m idine kinase1:a p rolifera tion m a rker for neop lasm s imm unologic m onito2 ring of elderly peop le

ZHANG Guo-qing,J I A O Shun-chang,W E I Xiu-fang

D epart m ent of C linical O ncology,the General Hospital of People’s L iberation A r m y,B eijing100853,China.

【Abstract】　O bjecti ve:U sing enzy me i m mune che m ical radiati on assay t o detect the seru m thy m idine kinase1(S

-TK1)in physical exa m inati on peop le and evaluate the value of S-TK1in neop las m i m munol ogic monit oring of

elderly peop le.M ethods:S-TK1fr om72elderly physical exa m inati on peop le was deter m ined with enzy me i m mune

che m ical radiati on assay which was based on anti-TK1mAb.Results:Levels of S-TK1in72elderly physical ex2

a m inati on peop le were(0.450±1.149)pmol/L,the S-TK1level of3individals among them were significantly

higher than that of the others,with the value of7.1,1.8,and7.0pmol/L,res pectively.After further investigati on,

these three peop le were f ound t o be with malignant neop las m.After re moving the data of these three samp les,the av2

erage level of S-TK1in the left69sa mp les was0.239±0.165pmol/L.Conclusi on:S-TK1can be used t o mo2

nit or and p redict elderly peop le’s neop las m i m munol ogic conditi on.

【Key words】seru m thy m idine kinase;enzy me i m mune che m ical radiati on assay;neop las m i m munol ogic monit oring

Modern Oncol ogy2008,16(5):0831-0832

【摘要】　目的:用酶免疫化学发光法检测查体者血清胸苷激酶(S-TK1)的含量,探讨S-TK1在中老年人肿

瘤免疫监测中的作用。方法:利用抗胸苷激酶单克隆抗体(anti-TK1mAb)建立酶免疫化学发光法,分析72

例来我院查体的中老年人S-TK1的水平。结果:72例来我院查体的中老年人S-TK1的珔X=0.450,s=

1.149。其中3名查体者的S-TK1浓度分别为7.1、1.8和7.0pmol/L,明显高于其他查体者。经随访得知,

此3人患有恶性肿瘤。将这3名患者的数据去除,其余69例S-TK1的珔X=0.239,s=0.165。结论:提示S-

TK1可以作为中老年人肿瘤免疫监测预警的指标之一。

【关键词】血清胸苷激酶;酶免疫化学发光法;肿瘤免疫监测

【中图分类号】R730.3 【文献标识码】A 【文章编号】1672-4992-(2008)05-0831-02

胸苷激酶(Thy m idine kinase,简称TK)是嘧啶代谢循环中的关键酶之一,又称补救酶,它能够催化脱氧胸苷(deoxy2 thy m idine,dTdR)转变为脱氧胸苷酸(deoxythy m idylic mono2 phos phate,dT MP)。TK有两种同工酶,分别为细胞质TK (TK1)和线粒体TK(TK2)。其中TK1与细胞分裂密切相关,其在细胞分裂G

1

期含量比较低,到S期后逐渐升高,至G2期达到最高[1]。在正常人的普通细胞中,TK1的含量极低;当细胞更新代谢旺盛时,如胎儿组织及成人的增殖细胞中,TK1将出现较高水平的表达。另外,在一些恶性肿瘤以及某些病毒感染等患者的血清和癌细胞中TK1活性也很高[2]。我们利用抗TK1单克隆抗体(Anti-TK1mAb),建立酶免疫化学发光法检测中老年查体患者血清胸苷激酶(Ser2 u m thy m idine kinase1,S-TK1)的含量,以探讨S-TK1在中老年人肿瘤免疫监测中的临床意义。

1　材料与方法　

【收稿日期】　2007-05-22

【作者单位】　中国人民解放军总医院肿瘤内科,北京　100853

【作者简介】　张国庆(1979-),男,江西吉水人,医师,硕士研究生,主要从事肿瘤免疫研究。1.1　研究对象

2006年9月1日至2006年9月15日72名来自中国人民解放军总医院体检中心查体者。年龄32岁-77岁,既往无恶性肿瘤病史;无先天性或获得性免疫缺陷性疾病;无充血性心力衰竭、心绞痛、心肌梗塞、不能控制的高血压或心律失常等严重的心脏疾患;无活动性肝炎、肝硬化等严重的肝脏疾患;无任意一种肾小球肾炎、肾病综合症、尿毒症等严重的肾脏疾患;无糖尿病、库欣综合症等内分泌疾患。所有研究对象于清晨空腹采集静脉血2m l,分离血清,贮存于-20℃备用。

1.2　主要仪器

C I S-1型化学发光数字成像分析仪,为深圳华瑞同康生物技术有限公司产品。

1.3　方法

TK1的测定酶免疫化学发光法,试剂盒由深圳市华瑞同康生物技术有限公司提供,操作严格按照说明书。TK1含量的计算由TK点印迹图像分析软件完成。

2　结果

前三者白色光点为阳性标准品,其余为研究对象S-TK1的化学发光图像,见图1。

?

1

3

8

?

现代肿瘤医学　2008年5月　第16卷第5期

图1　酶免疫化学发光检测结果(the result of the

Enzy me i m mune che m ical radiati on assay

)

图2　S -TK1浓度测定的标准曲线图

(the standard curve of the S -TK1)

表1　72例查体者血清中的S -TK1含量(浓度

单位为pmol/L,A1-A3为标准品)

12

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A 20.06.6 2.20.20.20.47.10.60.30.40.40.7

B 0.40.70.30.2 1.00.20.20.20.40.40.30.2

C 0.20.20.40.30.10.2 1.80.10.20.30.20.3

D 0.20.30.30.20.30.10.10.10.10.10.10.2

E 0.20.27.00.20.10.20.10.10.10.20.10.4

F 0.20.20.20.30.10.20.10.10.10.10

0.1

G

0.20.20.2

S -TK1浓度测定的标准曲线见图2,R =0.9994,说明本

次实验标准品的线性良好。72例查体者血清中S -TK1含量的酶免疫化学发光检测结果见表1。从表1的结果来看,在A 7、C7及E3位置上的三个样品S -TK1的浓度分别为7.1、1.8和7.0pmol/L ,明显高于其他研究对象。3　讨论

在健康组织的细胞外液或血浆中不能检测到TK 的活性。在正常人细胞中,血清总TK 活性(TK1和TK2)含量极低,只是在细胞过度增生的情况下才出现较高的水平。TK 活力增加会引起细胞DNA 合成速度提高,细胞和体液内高

水平的TK 活性表明机体内存在快速增殖的细胞。虽然TK1

和TK2均可以出现在增生和肿瘤细胞中,但TK 病理水平95%以上为TK1活性,故绝大部分情况下提到的TK 活性是指TK1活性。所以,肿瘤中TK1活力水平与肿瘤细胞增殖速度成正比,并与疾病的轻重程度有关[3]。

国内外已有不少针对S -TK1临床意义的研究。张平安等[4]

用增强化学发光法(EC LA )检测消化道肿瘤患者S -TK1后:消化道癌症患者S -TK1水平明显高于正常人(P >0.005);但在消化道癌症患者中,直肠癌、胃癌和结肠癌患者间,以及肿瘤高中分化与低分化癌症患者间S -TK1水平无显著性差异,而肿瘤有转移与无转移患者S -TK1水平有显著性差异。另对直肠癌和结肠癌患者术前、术后的S -TK1动态检测,证明S -TK1与肿瘤的预后密切相关。Zhang j 等[5]对56名膀胱癌患者的S -TK1含量进行了分析,发现膀胱癌患者S -TK1的含量明显高于正常对照组,并且T NM 分期为Ⅲ期者明显高于Ⅰ期,T2者明显高于T1者;但S -TK1的含量与肿瘤的分级程度似乎没有关系。他们还发现术后1周,膀胱癌患者S -TK1含量降低66%,术后1个月左右恢复至正常水平。

本研究的目的是探讨TK1在中老年人肿瘤免疫监测中的作用。从本研究的结果来看,72例来我院查体的中老年人S -TK1的珔X =0.450,s =1.149。在研究中我们发现,在A7、C7及E3位置上的三份样品为阳性,测得的S -TK1的浓度分别为7.1、1.8和7.0pmol/L 。经过进一步的随访得知上述三名查体者均在本次查体中发现患有恶性肿瘤,已在我院行手术治疗,经术后病理检查发现A7患有肺腺鳞癌,C7患有食道鳞癌,E3患有胃腺癌。将这三名患者的数据去除,计算剩余69例中老年查体者S -TK1的珔X =0.239,s =0.165。

因此,本研究初步证实了S -TK1可以作为一种中老年人肿瘤免疫监测预警的指标。下一步的研究可将S -TK1与其他现有的肿瘤免疫指标或肿瘤标记物相比较,以验证S -TK1对于肿瘤预警的敏感性和特异性。

【参考文献】

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m idine kinase 1and 2and deoxycytidine kinase and their activities in extracts fr om human cells and tissues[J ].B i ochem B i ophys Res Commun,1992,88(2):712-718.

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noassay:a potential marker for breast cancer [J ].Cancer Detect Prev ,2001,25(1):8-15.

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及临床意义[J ].中华医学杂志,2001,81(18):1137-1138.

[5]　Zhang J,J ia Q,Zou S,et al .Thy m idine kinase 1:a p r oliferati on

marker for deter m ining p r ognosis and monit oring the surgical out 2come of p ri m ary bladder carcinoma patients [J ].Oncol Rep,2006,15(2):455-461.

?238?MODERN ONC OLOGY,M ay 12008,VO I 116,NO 15

单克隆抗体的制备流程

单克隆抗体的制备流程 （一）动物的选择与免疫 1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb 至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐 剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后 取脾融合 目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：① 将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗 原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞 因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。 （2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。 初次免疫1×107/0.5ml ip ↓2～3周后 第二次免疫1×107/0.5ml ip ↓3周后 加强免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv ↓ 取脾融合 （二）细胞融合

胸苷激酶1项目

胸苷激酶1（TK1）细胞周期分析项目说明 一、 癌症已成为最主要的致死类疾病 近10年来，癌症逐渐取代心血管疾病，成为中国人首要致死类病变，防癌形势严峻（右图）。《2012中国肿瘤登记年报》显示，国人每分钟有6人确诊为肿瘤。以我省（湖南省）为例，截至2010年，肿瘤死亡率为 143.67/10万（略高于全国肿瘤死亡率135.88/10万），每四到五个死亡者中就有一个死于肿瘤，肿瘤类型以肝癌、食道癌、胃癌、肺癌为主。 二、肿瘤发病率逐渐升高带来的高社会成本和经济压力 癌症病人医疗费用在全民医疗费用中占比极高,根据全国政协教科文卫体委员会和中国癌症基金会2006年编写的《癌症的科学与实践》，如果按照每位病人花费2万元来估算，中国每年癌症 病人的医疗费用高达近千亿元，占全国医疗卫生总费用的20％以上，远 图1：2009年全国死亡病因分析 2006年全国医疗费用支出 肿瘤 其他 >20%

高于其他慢性病的医疗费用。而一般以为，2万元每人的标准完全被低估了。 世界卫生组织指出：三分之一以上甚至约一半以上的癌症都是可以预防的。而癌症预防的成本，远远低于癌症治疗的花费。 同时造成肿瘤发病率和死亡率高及费用高昂的原因有: （1）早期发现难：缺乏经济、灵敏度高的适于早期全身筛查的检测手段：肿瘤标记物增强CT PET-CT 内窥镜免疫组化是否定性否否是配合组化否 灵敏度低，尤其早期高高高高 特异性低低高高高 发现恶变阶段 早期灵敏度 低，中晚期灵 敏度高 肿瘤早期 癌巢早期， 较CT早6 个月 癌前病变期 不典型组 织增生 是否适合全 身筛查 需联合使用是是否否 安全性微创或无创造影剂易产生 过敏，辐射 辐射 微创，但易发 生出血 样本来源 有创 费用低高昂贵低低 （2）中晚期治疗难 原因1：治疗过程中，缺乏准确预后的方法，治疗方案评估信息不足，方案有效性评估不足； 原因2：治疗恢复过程中，缺乏灵敏、准确的复发风险评估方案，无法进行动态、有效的评估。 以上原因使得难以对患者实施具有针对性的个体化治疗方案。往往各

肿瘤免疫学复习题

肿瘤免疫学复习题 一.写出以下名词的英语并解释： 1.适应性免疫adaptive immunity 特异性免疫又称获得性免疫或适应性免疫，这种免疫只针对一种病原。是获得免疫经后天感染(病愈或无症状的感染)或人工预防接种(菌苗、疫苗、类毒素、免疫球蛋白等)而使机体获得抵抗感染能力。一般是在微生物等抗原物质刺激后才形成的(免疫球蛋白、免疫淋巴细胞)，并能与该抗原起特异性反应。 分为三个阶段：1感应阶段是抗原处理、呈递和识别的阶段；2反应阶段是B 细胞、T细胞增殖分化，以及记忆细胞形成的阶段；3效应阶段是效应T细胞、抗体和淋巴因子发挥免疫效应的阶段。 2主要组织相容性复合体major histocompatibility complex (MHC) 指存在于脊椎动物某一染色体上的一组紧密连锁的基因群，其编码的产物(主要组织相容性抗原)与特异性免疫应答的发生密切相关。人类MHC位于第6号染色体，MHC可分为三类基因群。 1. Ⅰ类基因：对于人类而言，包括3个基因位点，即A、B、C。其编码产物为MHCⅠ分子或抗原。 2. Ⅱ类基因：DP、DQ、DR三个亚区，其编码的经典产物为MHC Ⅱ类分子或抗原，尚有与内源性抗原处理有关的LMP、TAP。 3. Ⅲ类基因：编码产物MHC Ⅲ类分子或抗原。 3免疫球蛋白immunoglobulin 简Ig,具有抗体活性的球蛋白。是机体受到病原微生物侵袭或抗原刺激后由浆细胞而产生的特异性抗体，存在于血浆及淋巴液等体液中，能和同一抗原发生特异性免疫反应。免疫球蛋白分为5种，即IgG、IgA、IgM、IgD、IgE等。它们有共同的基本结构,即由2条相同的重肽链和2条相同的轻肽链结合而成;并都有抗体的活性,即作用于抗原,激活补体系统,破坏带抗原的靶细胞。免疫球蛋白的功能：一、V区的功能：体内：中和作用：①中和细菌外毒素②中和病毒；二、C区的功能：1.激活补体：①经典途径：激活能力以IgM最强（高于IgG500倍以上）。IgM>IgG3> IgG1> IgG2。②替代途径：凝聚的IgA，IgG4，IgE。2.与细胞膜上的Fc受体结合：多种组织细胞膜上都有IgG等抗体的Fc 受体，使抗体与不同细胞结合，产生不同的免疫效应。①调理作用：IgG类抗体与相应细菌等颗粒性抗原特异性结合后，通过Fc段与巨噬细胞或中性粒细胞表面相应IgGFc受体结合，所产生的促进吞噬细胞对上述颗粒性抗原吞噬的作用称为抗体的调理作用。②抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用：IgG类抗体与肿瘤或病毒感染细胞表面相应抗原表位特异性结合后，再通过其Fc段与NK细胞、Mφ和中性粒细胞表面相应IgGFc受体结合，增强或触发上述效应细胞对靶细胞杀伤破坏的作用。③介导I型超敏反应：IgE的Fc段可与肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的FcεRI结合，促使其合成和释放生物活性介质，引起I型超敏反应。3.穿过胎盘和粘膜：①通过胎盘：IgG选择性地与FcRn结合，转移到滋养层细胞内，进入胎儿血循环。②穿过粘膜：SIgA可通过呼吸道、

浙江中医药大学临床生化与检验选择题

第十一章蛋白质和含氮化合物的生物化学检验▲嘧啶核苷酸补救合成途径的主要酶是： A.氨基甲酰磷酸合成酶 B.嘧啶磷酸核糖转移酶 C.胸苷激酶 D.尿苷激酶 E.胞苷激酶 ★苯丙酮尿症的发生是由于 A.苯丙氨酸羟化酶缺陷 B.酪氨酸脱羧酶缺陷 C.苯丙酮酸氧化酶的缺乏 D.酪氨酸羟化酶的缺陷 E.苯丙氨酸转氨酶缺陷 ★苯丙氨酸检测时每个血斑直径大于多少毫米 A.8 B.7 C.10 D.6 E.9 ★下列哪种蛋白质属于负性急性时相反应蛋白？ A.C3 B.TRF C.Hp D.CRP E.CER ★动物嘌呤代谢的终产物很多，但不包括： A.尿素 B.H2O2 C.NH3 D.尿酸 E.尿囊酸 ★在急性时相反应中，以下哪项蛋白不增高 A.Hp B.ALB C.AAG D.CRP E.Cp ★血浆中Alb增高可见于 A.丢失过多 B.分解增加 C.血液浓缩 D.分布异常 E.合成不足 正确答案： C

★痛风症是因为血中某种物质在关节、软组织处沉积，其成份为 A.黄嘌呤 B.尿酸 C.尿素 D.胆固醇 E.次黄嘌呤 正确答案： B ●导致嘌呤分解增加的疾病有 A.白血病 B.红细胞增多症 C.多发性骨髓瘤 D.以上都是 E.恶性肿瘤化疗 正确答案： D ▲下列属于急性时相反应蛋白的有|C反应蛋白|β2微球蛋白|甲胎蛋白|α1抗胰蛋白酶|α2酸性糖蛋白 A.在急性炎症性疾病如感染、手术、创伤、心肌梗死和肿瘤等情况下，AAT、AAG、Cp、CRP、Hp以及α1-抗糜蛋白酶、血红素结合蛋白、C3、C4、纤维蛋白原等血浆蛋白浓度会显著升高；而血浆PA、Alb与TRF则出现相应的降低。这些血浆蛋白质统称为急性时相反应蛋白。 ★AAT的遗传表型以哪型最多 A.PiMM B.PiMS C.PiSS D.PiZZ E.PiSZ ▲下列哪种蛋白下降，可协助Wilson病的诊断 A.AAG B.ALB C.CRP D.α2-MG E.Cp ★细胞内含量较多的核苷酸是： A.3′-ATP B.3′-dATP C.5′-ATP D.3′-dUTP E.3′-UTP ▲嘧啶核苷酸补救合成途径的主要酶是： A.胞苷激酶 B.嘧啶磷酸核糖转移酶 C.尿苷激酶 D.氨基甲酰磷酸合成酶 E.胸苷激酶

AFP启动子介导胸苷激酶表达载体的构建及其特异性表达.

AFP启动子介导胸苷激酶表达载体的构建及其特异性 表达 【摘要】【目的】构建AFP启动子介导HSV-TK基因表达载体，并对其在肝癌细胞中特异性表达进行分析。【方法】采用PCR法扩增人AFP基因启动子。回收纯化后克隆入pBluescript II KDR-TK相同克隆位点，切取AFP-TK片段，然后通过酶联反应插入到pEGFP-C1中，构建成pEGFP-C1-AFP-TK。对获得的片段进行鉴定、细胞靶向和外源基因表达的鉴定。【结果】序列分析表明，该启动子含300 bp核苷酸，与已报道的序列比较，100%相符。限制性酶切分析，重组质粒pEGFP-C1-AFP-TK已经克隆AFP启动子。RT-PCR及Western blotting 分析pEGFP-C1-AFP-TK转染后的HepG2细胞后，表明TK基因在mRNA水平上能有效的表达，裂解后的HepG2细胞膜蛋白中有相对分子质量约61 ～ 83 ku大小的特异性条带。【结论】人肝细胞癌(HepG2)靶向性质粒pEGFP-C1-AFP-TK 构建成功。 【关键词】 AFP启动子; HepG2细胞; 靶向表达; 单纯疱疹病毒-胸腺嘧 啶激酶1 Abstract：【Objective】 To construct the herpes simplex virus thymidine kinase type 1(HSV-1-TK) expression vector with alpha- fetoprotein (AFP) expression gene as starter， and analyzing its specific expression. 【Method】 The AFP promoter was amplified by means of PCR. It was purified and cloned on the cloning site of pBluescript II KDR-TK. Then the AFP-TK， fragment was obtained and inserted into pEGFP-C1 with T4 DNA ligase. The obtained fragment was identified for its cell targeting and exogenous genes expression. HepG2 genome DNA was extracted as template to amplify the AFP sequence (300 bp). Its PCR product was then conjugated with pMD-18，then amplified and extracted. The pMD-18-AFP was digested， and then the fragment was cloned into pBluescriptII KDR-TK. Then to produce the whole expressing fragment of AFP-TK which was inserted into the pEGFP-C1. Then the construction of pEGFP-C1-AFP-TK finished. The gene product was sent for sequencing evaluation. And the expression of pEGFP-C1-AFP-TK in HepG2 cells and ECV 304 cells was evaluated. And its mRNA expression was also evaluated. 【Result】 The sequence analysis proved that the promoter contained 300 bp nucleic acid which was 100% consistency with literatures. The result of restriction endonuclease analysis demonstrated that the recombined pEGFP-C1-AFP-TK was cloned within the AFP as an AFP promoter. The results of RT-PCR and Western blotting from the HepG2 cells transfected with pEGFP-C1-AFP-TK demonstrated that TK mRNA was expressed effectively. The lysis from the HepG2 cells was a specific band of 61-83 ku. The

肿瘤免疫与免疫学检验

肿瘤免疫与免疫学检验 第一节肿瘤抗原 一、根据肿瘤抗原的特异性分类 （一）肿瘤特异性抗原（ TSA） TSA是肿瘤细胞所特有的新抗原，它只表达于肿瘤细胞，而不存在于正常组织细胞。TSA可存在于不同个体的同一组织学类型的肿瘤中，如黑色素瘤相关排斥抗原（MARA）。 （二）肿瘤相关性抗原（TAA） TAA是指非肿瘤细胞所特有的，正常组织或细胞也可表达的抗原物质，但此类抗原在癌变细胞的表达水平远远超过正常细胞。 二、根据肿瘤抗原产生机制分类 （一）理化因素诱发的肿瘤抗原 机体受到化学致癌剂（如甲基胆蒽、氨基偶氮染料、二乙基亚硝胺等）或物理因素（如紫外线、X射线等）作用，可使某些基因产生突变，诱发肿瘤发生。此类肿瘤抗原的特点是特异性强，但免疫原性弱。 （二）病毒诱发的肿瘤抗原 人类某些肿瘤的发生与病毒感染有密切关系。能够诱发肿瘤的病毒，主要是DNA病毒和RNA病毒，尤其是反转录病毒。 （三）自发性肿瘤抗原 自发性肿瘤表达的抗原大部分可能为突变基因的产物。 （四）正常细胞成分的异常表达 1.分化抗原 2.过度表达的抗原 3.胚胎抗原 4.细胞突变产生的独特型抗原 第二节机体抗肿瘤的免疫学效应机制 机体的抗肿瘤免疫学效应机制十分复杂，涉及多种免疫成分，包括先天性免疫（非肿瘤特异性免疫）和获得性免疫（肿瘤特异性免疫），二者共同参与机体免疫监视和抗肿瘤效应。 一、抗肿瘤的细胞免疫机制 细胞免疫机制在机体抗肿瘤效应中发挥着最主要的作用，参与抗肿瘤免疫的细胞包括T细胞、NK细胞、巨噬细胞和树突状细胞等。 （一）T细胞 （二）NK细胞 （三）巨噬细胞 （四）树突状细胞 二、抗肿瘤的体液免疫机制 免疫系统针对肿瘤抗原发生体液免疫应答，产生特异性抗肿瘤抗原的抗体，并发挥抗肿瘤作用。 1.补体的溶细胞效应。 第1页

胸苷激酶1(thymidine kinase 1,简称TK1)

细胞质胸苷激酶也称为胸苷激酶1（thymidine kinase 1，简称TK1），它和线粒体胸苷激酶（thymidine kinase2，简称TK2）为同工酶，是胸苷激酶在细胞内存在的两种形式。胸苷激酶1（TK1）与细胞增殖有密切关系。 胸苷激酶1（TK1）是DNA合成中的关键酶之一，它催化胸苷（Tdr）磷酸化为胸苷一磷酸（TMP），进而形成的胸苷三磷酸（TTP——DNA合成中的4中必须脱氧核苷酸之一），从而参与DNA合成（如图1）。 TK1在细胞增殖DNA合成中的作用 （图1：TK1在细胞增殖DNA合成中的作用机理图） TK1水平的升高和DNA的合成成正相关，在细胞周期中，TK1在G1期晚期开始升高，S期达到最高，至G2期开始下降，由于TK1与细胞周期S 期的特殊相关性，又被称为“S期关键酶”，与细胞增殖相关。 研究表明，对于异常增殖类病变（如：恶性组织病变，肿瘤等），由于病变细胞缺失了凋亡调控，DNA合成剧增会导致TK1水平的异常升高，即存在恶性增殖病变患者血清内TK1酶含量会比正常人有2-200倍的升高（图2）。目前，胸苷激酶1检测被广泛应用于体检及临床中的恶性增殖病变筛查和治疗后的跟踪监测。 TK1水平在正常与异常增殖中的变化 （图2：TK1在正常增殖与异常增殖患者血清中的差异） 编辑本段研究历史 1950s 胸苷激酶1被发现； 1980s 胸苷激酶1在世界范围内掀起研究热潮，美国、欧洲、日本均开始胸苷激酶1的相关研究；

1986 极富盛名的诺贝尔奖评审委员会所在的瑞典Karolinska医学院在Bernhard Tribukait教授（瑞典Karolinska大学终身教授，流式细胞技术发明者）的倡导下，成立了胸苷激酶1研究组，开始TK1的基础及应用研究； 1990s 胸苷激酶1活性检测方法及试剂盒问世，但是终由于操作方法的繁琐和对实体肿瘤灵敏度偏低等问题，在掀起一段热潮后终归沉寂； 1996 血清胸苷激酶1浓度免疫化学发光检测方法问世，解决了之前的实体瘤灵敏度偏低问题，同时免疫化学发光法更易操作，无放射污染； 2006- 血清胸苷激酶1检测再次掀起了医学临床研究热潮。 编辑本段应用价值 近年来，随着对肿瘤认识的加深，肿瘤是一种“慢性增殖类”病变的概念已为越来越多的人所接受。即，肿瘤的发生始于细胞癌变和组织的恶性增殖病变，但是从细胞开始发生癌变到原位癌的出现，是一个漫长的过程，往往需要8-15年，但原位癌一旦形成到由于肿瘤致死，只需要1-2年时间。所以，进入21世纪以来，WHO（世界卫生组织）就提出要将肿瘤的预防提前到原位癌尚未形成的“癌前病变”（已有一定程度的组织增生，但未成癌。WHO规定有20%几率进程为肿瘤的增殖类病变称为“癌前病变”）时期，以达到早发现、早诊断、早治愈的效果。 但是目前常用的肿瘤检测手段：肿瘤标志物、影像学对于早期肿瘤几乎无能为力，大部分肿瘤标志物对于早期肿瘤的灵敏度低于30%，影像学目前能够最早检测到癌巢直径为0.5cm，也以成癌。是否能有一种与恶性增殖密切相关的标志物能够及时提示体内出现增殖异常，及早提起关注已成为广大诉求。 胸苷激酶1（TK1）基于与细胞增殖的密切关系，能够及时提示体内癌前病变是否已出现恶性进展，再根据其他阳性体征，有针对性的进行干预，能够达到阻止肿瘤真正发生，预防肿瘤的效果。 编辑本段应用案例 体检应用 评估各类增殖类疾病恶变风险：处于过度增殖的增殖类疾病是肿瘤形成的第一步。基于TK1与细胞增殖的密切关系，能够灵敏地检查出TK1浓度的变化，从而发现恶性增殖风险，为肿瘤的预防提供增殖信息，适用于健康人群的肿瘤预防检测。 临床应用

细胞培养与病毒培养实验步骤

实验二传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养 一、实验目的 了解倒置显微镜的构造与使用，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特征，掌握细胞的传代培养方法、病毒接种方法及收毒方法。 二、常用细胞的种类 BHK-21：仓鼠肾传代细胞 PK-15：猪肾传代细胞 IBRS-2：猪肾传代细胞 Hela：人的子宫瘤细胞 Vero：非洲绿猴肾细胞 Marc-145：来源于Vero细胞 TK-143：人的胸苷激酶阴性细胞 Sf9：昆虫细胞 三、材料 1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头 2、BHK-21（baby hamster kidney）细胞 3、0.25%胰酶 4、生长液：含10%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM 维持液：含2-5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM

5、伪狂犬病病毒液（PRV） 四、传代细胞培养的条件要求 1）细胞密度：2-3×105个/ml 2）pH范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8 3）培养温度 哺乳动物细胞一般为37℃ 昆虫细胞28-30℃ 五、常用细胞分散剂与作用原理 1、胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解， 导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。 2、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）：与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。 3、灰色链丝菌酶：由灰色链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽 酶的混合物。 六、营养液 1、人工综合营养液 氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。 2、血清 1）血清的种类 胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。 2）血清的处理

体检发现的218例肿瘤病人细胞质胸苷激酶1在临床应用中的分析与研究

云南医药２０１２年第３３卷第６期 ·论著· 体检发现的２１８例肿瘤病人细胞质胸苷激酶１在临床应用中的分析与研究 王朝敏1，徐道亮2，李斌3 （江苏省苏北人民医院１．肿瘤科，２．内科，３．核医学科 江苏扬州２２５００１） 摘要：目的探讨肿瘤患者血清细胞质胸苷激酶（ＴＫ１）在临床应用上的意义。方法利用免疫印迹增强化学发光法， 检测２１８例肿瘤患者血清和４０例健康体检者血清的ＴＫ１水平。结果肿瘤病人ＴＫ１阳性率为４５．２９％，健康体检者血清 ＴＫ１阳性率为５％。鳞癌ＴＫ１阳性率为２６．０９％，腺癌ＴＫ１阳性率为５４．２９％。其中乳腺肿瘤、消化道肿瘤、其它肿瘤ＴＫ１阳性率较高，分别达５５．５７％、６２．５１％、５３．８６％。肺部肿瘤及宫颈肿瘤的ＴＫ１阳性率较低，分别为１２．５１％、１４．３％。结论血 清ＴＫ１检测在腺癌的辅助诊断上是一个有价值的标志物。 关键词：细胞质胸苷激酶１；肿瘤标志物；免疫印迹增强化学发光法中图分类号：Ｒ７３０．４５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００６－４１４１（２０１２）０６－０５１６－０３ Ｃｌｉｎｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｃｙｔｏｓｏｌｉｃｔｈｙｍｉｄｉｎｅｋｉｎａｓｅ１ｉｎ２１８ｃａｓｅｓｗｉｔｈｔｕｍｏｒ．ＷＡＮＧＺｈａｏ－ｍｉｎ，ＸＵＤａｏ－ｌｉａｎｇ，ＬＩＢｉｎ．（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＴｕｍｏｒ，ＳｕｂｅｉＰｅｏｐｌｅ＇ｓＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｊｉａｎｇｓｕ２２５００１，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｃｌｉｎｉｃａｌｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｏｆｃｙｔｏｓｏｌｉｃｔｈｙｍｉｄｉｎｅｋｉｎａｓｅ（ＴＫ１）ｉｎｔｕｍｏｒｐａ－ｔｉｅｎｔｓ．ＭｅｔｈｏｄｓＵｓｉｎｇｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇｅｎｈａｎｃｅｄｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｔｏｄｅｔｅｃｔｓｅｒｕｍＴＫ１ｌｅｖｅｌｓｉｎ２１８ｃａｎｃｅｒｐａ－ｔｉｅｎｔｓａｎｄ４０ｈｅａｌｔｈｙｃａｓｅｓ．ＲｅｓｕｌｔｓＴｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｅｏｆＴＫ１ｉｎｔｕｍｏｒｐａｔｉｅｎｔｓｗａｓ４５．２９％，ａｎｄｉｎｈｅａｌｔｈｙｓｕｂｊｅｃｔｓｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｅｗａｓ５％．Ｉｎｓｑｕａｍｏｕｓｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａ，ｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｅｗａｓ２６．０９％ａｎｄｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｅｗａｓ５４．２９％ｉｎａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｉｎｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ，ｄｉｇｅｓｔｉｖｅｔｒａｃｔｔｕｍｏｒａｎｄｏｔｈｅｒｔｕｍｏｒｓｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｅｓｗｅｒｅｈｉｇｈｅｒ，ｏｆ５５．５７％，６２．５１％ａｎｄ５３．８６％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｉｎｌｕｎｇｃａｎｃｅｒａｎｄｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒ，ＴＫ１ｐｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｅｓｗｅｒｅｌｏｗ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｏｆ１２．５１％ａｎｄ１４．３％．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＴｈｅＴＫ１ｉｎｓｅｒｕｍａｉｄｓｄｉａｇｎｏｓｉｓｆｏｒａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａａｎｄｉｓａｖａｌｕａｂｌｅｍａｒｋｅｒｆｏｒｔｕｍｏｒ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｔｈｙｍｉｄｉｎｅｋｉｎａｓｅ１；Ｔｕｍｏｒｍａｒｋｅｒ；Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇｅｎｈａｎｃｅｄｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｍｅｔｈｏｄ 胸腺嘧啶核苷激酶（ＴＫ）是胸腺嘧啶核苷合成ＤＮＡ的关键酶之一。ＴＫ以两种同工酶的形式出现：细胞质胸苷激酶（ＴＫ１）和线粒体胸苷激酶（ＴＫ２）。ＴＫ１是评估增殖细胞的增殖度的重要标志。ＴＫ１和ＤＮＡ合成呈正相关。故ＴＫ１的升高与肿瘤细胞生长状态密切相关。本文对２１８例各类恶性肿瘤病人的ＴＫ１水平进行检测和分析，旨在研究ＴＫ１与恶性肿瘤的关系及其在临床应用上的意义。 材料与方法 一、研究对象：２０１０年６月～２０１１年１２月期间，本院经病理学确诊的恶性肿瘤患者２１８例，男性１２０例，女性９２例，年龄３２～７６岁（女性 ４５±１１岁，男性５２±９岁）。其中乳腺肿瘤３６例，肺部肿瘤３２例，消化道肿瘤６４例，宫颈肿瘤２８例，其它肿瘤５２例。所有病例中腺癌７０例，鳞癌４６例，其它肿瘤９６例。收集同期健康体检者４０例作为对照组，男性２２例，女性１８例，年龄３５～７３岁（４７．５±８．５岁）。 二、材料及仪器：硝酸纤维素薄膜，ａｎｔｉ－ＴＫ１Ａｂ，ＴＫ标准品（２．２、６．６、２０ｐｍｏｌ／Ｌ），ＥＣＬ试剂，生物素化二抗，辣根过氧化物酶标记亲和素，封闭剂，抗体稀释液，抗体洗涤液（以上组成ＴＫ１诊断试剂盒）。ＣＩＳ－Ⅰ型化学发光数字成像分析仪。试剂及仪器均由深圳华润同康生物技术有限公司提供。 三、方法和步骤：⑴所有研究对象均采集静 收稿日期：２０１２－０８－１２作者简介：王朝敏（１９６３～）女，副主任医师，从事肿瘤综合治疗２０余年。通信作者：徐道亮。ｙｚｘｄｌ＠１２６．ｃｏｍ ５１６··

中国慢性淋巴细胞白血病小淋巴细胞淋巴瘤的诊断与治疗指南(完整版)

中国慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤的诊断与治疗 指南（完整版） 近年，慢性淋巴细胞白血病（CLL）/小淋巴细胞淋巴瘤（SLL）的基础与临床研究，特别是新药治疗方面取得了巨大进展。为提高我国对CLL/SLL 诊断、鉴别诊断及规范化治疗水平，中国抗癌协会血液肿瘤专业委员会、中华医学会血液学分会和中国慢性淋巴细胞白血病工作组组织相关专家对2015年版CLL/SLL的诊断与治疗指南[1]进行了更新修订，制订本版指南。 一、定义 CLL/SLL是主要发生在中老年人群的一种具有特定免疫表型特征的成熟B淋巴细胞克隆增殖性肿瘤，以淋巴细胞在外周血、骨髓、脾脏和淋巴结聚集为特征。 二、诊断、分期、预后及鉴别诊断 1．诊断： 达到以下3项标准可以诊断：①外周血单克隆B淋巴细胞计数≥5×109/L。②外周血涂片特征性的表现为小的、形态成熟的淋巴细胞显著增多，其细胞质少、核致密、核仁不明显、染色质部分聚集，并易见涂抹细胞；外周血淋巴细胞中不典型淋巴细胞及幼稚淋巴细胞<55%。③典型的流式细胞术免疫表型：CD19+、CD5+、CD23+、CD200+、CD10-、FMC7-、CD43+；表面免疫球蛋白（sIg）、CD20及CD79b弱表达（dim）。流式细胞术确认B细胞的克隆性，即B细胞表面限制性表达κ或λ轻链（κ∶

λ>3∶1或<0.3∶1）或>25%的B细胞sIg不表达。与2008版不同，在2016版WHO有关造血与淋巴组织肿瘤分类中提出外周血单克隆B淋巴细胞计数<5×109/L，如无髓外病变，即使出现血细胞少或疾病相关症状，也不能诊断CLL[2,3,4]。但2018年更新的国际CLL工作组标准仍将此种情况诊断为CLL[5]。国内绝大多数专家也认为这种情况在排除其他原因导致的血细胞减少后，其临床意义及治疗同CLL，因此应诊断为CLL。 SLL：与CLL是同一种疾病的不同表现。淋巴组织具有CLL的细胞形态与免疫表型特征。确诊必须依赖病理组织学及免疫组化检查。临床特征：①淋巴结和（或）脾、肝肿大；②无血细胞减少；③外周血单克隆B淋巴细胞<5×109/L。CLL与SLL的主要区别在于前者主要累及外周血和骨髓，而后者则主要累及淋巴结和骨髓。Lugano Ⅰ期SLL可局部放疗，其他SLL的治疗指征和治疗选择同CLL，以下均称为CLL。 单克隆B淋巴细胞增多症（MBL）：MBL是指健康个体外周血存在低水平的单克隆B淋巴细胞[4]。诊断标准：①B细胞克隆性异常；②单克隆B淋巴细胞<5×109/L；③无肝、脾、淋巴结肿大（淋巴结长径<1.5 cm）； ④无贫血及血小板减少；⑤无慢性淋巴增殖性疾病（CLPD）的其他临床症状。根据免疫表型分为三型：CLL表型、不典型CLL表型和非CLL表型。对于后二者需全面检查，如影像学、骨髓活检等，以排除白血病期非霍奇金淋巴瘤。对于CLL表型MBL，需根据外周血克隆性B淋巴细胞计数分为"低计数"MBL（克隆性B淋巴细胞<0.5×109/L）和"高计数"MBL（克隆性B淋巴细胞≥0.5×109/L），"低计数"MBL无需常规临床随访，而"

伪狂犬病毒标记神经环路的研究进展

伪狂犬病毒标记神经环路的研究进展 罗振 潘建青 边晔 王立平 摘 要 伪狂犬病毒(PRV)作为一种亲神经性的病毒，它以其自我复制、跨突触、特异性传递的三大优势在揭示神经系统中功能性神经元之间的连接发挥着重大的作用。经基因重组后的伪狂犬病毒不但继承了原有病毒的优势，同时还延伸出其它特异性的功能。本文即对目前应用伪狂犬病毒标记神经环路的一些技术和应用进行综述。 关键词 伪狂犬病毒；神经环路 1 神经环路标记概述 在上世纪九十年代以前，在揭示神经环路中神经元之间的连接主要是通过注射一种染料或蛋白来标记神经元。这种方法需要很多的动物，才能明确最简单的环路，同时大量与实验无关的神经环路被标记，此外这种方法不可能注射特异性的示踪剂到神经元。病毒示踪的价值在于它能够在同种生物体内标记完整的神经环路。由于病毒能够在神经细胞中自我复制，不像化学物质或蛋白很容易被扩散同时能够通过突触的极少。近年来用重组病毒在生物体内表达荧光蛋白的方法使得神经环路的标记更加简单化和直观化，并且能够在活体长期存在。 2 伪狂犬病毒标记神经环路 野生型的伪狂犬病毒由于毒性太强，对神经元的破坏性极强，很容易导致实验动物的死亡[1,2,3]，因此使用效果不是很好。目前使用的伪狂犬病毒毒株都是减毒后的病毒，它的优点在于病毒能够在体内长期，使实验动物并无明显病症，从而可以标记完整的神经环路。目前成功的应用于跨突触感染的伪狂犬病毒毒株有PRV-Bartha[4]。伪狂犬病毒感染神经元的传递方式是由突触后到突触前的逆行感染方式。荧光蛋白作为一种新型的标记物，在各个领域已得到广泛的应用。利用基因重组技术，将表达荧光蛋白的基因插入到伪狂犬病毒的非必须基因中，从而使得被感染的细胞内表达有荧光蛋白，被感染的组织可以在共聚焦显微镜下直接观察，从而省去很多实验的下游步骤。 3 条件复制型重组伪狂犬病毒 通过直接的大脑内注射伪狂犬病毒能够揭示中央神经系统环路，这种立体定位的注射能够提供一种精确的轴突终端的剂量依赖性感染，伪狂犬病毒粒子较大，直径约200nm，很容易吸附到细胞外基质上的蛋白，因此病毒粒子不会从注射位点扩散。精确的描绘中央神经系统环路需要很好的控制感染，为了达到这个目的DeFalco和他的同事构建了一个PRV-Bartha的衍生毒株，这种毒株不能自主表达胸苷激酶(TK)基因，而TK基因的表达受阻会导致病毒不能自主复制，当被感染的细胞能够表达Cre重组酶时，这种病毒的TK基因表达抑制被解除，能够表达TK基因同时绿色荧光蛋白[5,6]，此时病毒能够复制并且传递到所有突触连接的神经元细胞。 4 伪狂犬病毒在标记视网膜环路的应用 当PRV-Bartha被注射到眼球玻璃体，病毒最后被传递到另外一只眼的视网膜神经胶质细胞上，在这个模式中，PRV通过眼窝肌肉和睫状肌副交感神经和交感神经分布传递到中央神经系统，通过交感神经逆行感染导致视交叉上核的感染，并且从这里传递到对侧眼球的视网膜神经节细胞[7]。最近的研究中，Viney和他的同事利用这种模式，研究一种内在的光敏感的视网膜神经节细胞的局部环路，发现PRV对少数光敏感的视网膜神经节细胞的标记是专有的[8]。 5 伪狂犬病毒示踪的新应用 PRV能够量化动态的神经元连接，在大脑发育过程中，通过测量PRV侵入大脑皮层的程度，神经元之间的连接能够被观察。通过比较出生后1~8天的小狗幼仔被间歇障碍隔离或与母亲的间歇分离来观察这种处理对后代的CNS发育过程中的影响，小狗幼仔胃腹侧被注射PRV-Bartha，感染后63~66小时病毒传递到脑干和脑皮层时被并分析。处理组的纹状体、中心

生物工程中单克隆抗体的制备流程

单克隆抗体的制备流程 按工程：陈亚军 [ 摘要]：动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，具有不同基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞（浆细胞）和记忆B细胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体 [关键词]：单克隆抗体、流程图 （一）动物的选择与免疫 1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb 至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐 剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后 取脾融合 目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：① 将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗 原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞 因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。 （2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。