调控基因gacA在荧光假单胞菌2P24防治土传病害中的作用_闫小雪
植物病理学报
A CT A P HYT OP A T HOL O GICA SIN ICA 34(3):272-279(2004)
调控基因gacA在荧光假单胞菌
2P24防治土传病害中的作用
闫小雪1,2,张力群1*,杨之为2,唐文华1
(1中国农业大学植物病理系,北京100094;2西北农林科技大学植物保护学院,陕西杨凌712100)
摘要:Pseudomonas f luor escens2P24分离自山东小麦全蚀病自然衰退土壤,该菌株能产生抗生素2,4-二乙酰基藤黄酚(2, 4-diacet ylphlor og lucino l,2,4-DA PG)、氢氰酸,嗜铁素和蛋白酶,且抑菌谱广,可防治多种作物土传病害。本研究应用T n5转座突变技术,获得1株产嗜铁素过量,同时不产生2,4-DA PG、HCN、蛋白酶、不能形成生物膜(biofilm)的突变菌株PM3390,其表现型与调控基因g acA的突变体表型相似。通过PCR介导的文库筛选方法,从2P24基因组文库中获得2个含有gacA基因的阳性克隆,进一步亚克隆,得到只含有完整gacA开放阅读框的1.2kb片段,互补实验表明其能恢复突变菌株的多种缺失表型。生测结果表明,g acA-突变菌株与野生型2P24相比,对不同土传病害的生防效果均显著降低。以上结果证实gacA在2P24中具有整体水平的调控功能,并在2P24防治土传病害中起到重要的作用。
关键词:荧光假单胞菌;双因子调控系统;gacA基因;生物防治
The role of regulatory gene gacA in the suppression of soil-borne diseases by Pseudomonas f luorescens2P24 YAN Xiao-x ue1,2,ZHANG Li-qun1*,YANG Zhi-w ei2,T ANG Wen-hua1 (1China A gr icult ur al U niver sity,Beijing100094,China;2No rt h-West Science and T echnolog y U niv ersit y of A g riculture and Fo restr y,Y angling,Shaanxi712100,China)
Abstract:P seudomonas f luor escens2P24,a bio control agent isolated fro m suppressive soil of w heat take-all disease,protects plants against soil-borne diseases.This strain pro duces several antibiotic secondary metabolites,such as2,4-diacety lphloro glucinol(2,4-DA PG),hy drog en cyanide(HCN),sideropho re and proteases.A m utant strain PM3390o btained by T n5mutag enesis show ed pleiotropic changes o n the pr oduction of secondary metabolites including overpr oduction of sider ophor e and no nproduction of2,4-DAPG,HCN and protease.PM3390w as also unable to form biofilm.T hese pheno ty pes w ere comple-mented by a1.2kb DNA frag ment obtained fro m the geno mic DNA library of P.f luorescens2P24.Se-quence analysis revealed a642bp open reading frame(ORF)which w as highly ho molo gous to the re-sponse reg ulator gene gacA.In gr eenho use,the gacA-negative mutant sho w ed decr eased ability to sup-press soil-borne diseases compared w ith that of w ild type2P24.T he results revealed that gacA gene,a glo bal reg ulator in the P.f luorescens2P24,play ed an important role in bioco ntro l of soil-borne plant diseases.
Key words:P seudomonas f luorescens;tw o-co mpo nent regulato ry sy stem;g acA g ene;biocontro l
中图分类号:S476.1 文献标识码:A 文章编号:0412-0914(2004)03-0272-08
假单胞菌(P seudomonas spp.)的一些种类是常见的根际革兰氏阴性细菌。这类细菌中许多是植
收稿日期:2003-11-18;修回日期:2004-01-07
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30100120,30370952)
通讯作者:张力群,副教授,博士,从事植物病害生物防治与细菌分子生物学教学和研究;E-mail:zh anglq@https://www.wendangku.net/doc/2818301882.html,
第一作者:闫小雪(1973-),女,陕西杨凌人,博士研究生,主要从事植物病害生物防治与细菌分子生物学研究。
物有益菌,具有促进植物生长和防治病害的作用,因而被作为植物病害生防菌得到广泛的研究和应用。抗生素的产生一直被认为是假单胞菌重要的生防机理之一。许多菌株能够产生一种或多种抗生素,如2,4-二乙酰基藤黄酚(2,4-diacetylphlo rog lu-cinol,2,4-DAPG)、吩嗪(phenazine)、藤黄绿脓菌素(pyo luteorin)、硝吡咯菌素(pyr rolnitrin)和氢氰酸(HCN)。当前深入研究的几个生防假单胞菌株Q2-87、CHA0、30-84、FPT9601、Pf-5、F113都是高产抗生素的菌株。其中,Q2-87,CHA0和FPT9601产生的抗生素2,4-DAPG,能够有效地防治Gaeu-mannomy ces graminis v ar.tritici引起的小麦全蚀病[1],Thielaviop sis basicola引起的烟草黑根腐病[2]和R alstonia solanacear um引起的番茄细菌性青枯病[3]。菌株30-84、2-79产生的吩嗪类抗生素,在体外可抑制多种植物病原菌的生长,对降低小麦全蚀病严重度起到重要作用[4]。另外,假单胞菌产生的氢氰酸[5]和嗜铁素[6]对防治土传病害也起到一定作用。因为生防菌在适当的时间和适当的定殖位点产生适量的抗生素是构成生防效果的重要基础,所以抗生素的产生和调控成为近年来假单胞菌生防机制研究的热点。
生防荧光假单胞菌2P24分离自山东小麦全蚀病自然衰退土壤,对小麦全蚀病有较好的防治效果。它能产生2,4-DA PG、氢氰酸和一种未定性的嗜铁素[7]。本研究利用转座子T n5对2P24野生菌作突变,筛选与生防因子表现型相关的突变子,进一步通过基因互补和生测试验证实克隆的基因在2P24生防中的作用。
1 材料和方法
1.1 菌株和质粒
本实验使用的菌株和质粒列于表1。大肠杆菌生长培养基LB和生长温度参照文献[8],2P24可分别在LB、M9[8]和KB[9]平板或液体培养基中28℃培养。实验所用抗生素浓度:氨苄青霉素(Ap) 50 g/mL、卡那霉素(Km)50 g/m L、四环素(T et)20 g/mL、氯霉素(Cm)20 g/m L。用于重组质粒筛选的5-溴-4-氯-3-吲哚- -D-半乳糖苷(X-Gal)40 g/mL。1.2 工具酶与试剂
限制性内切酶、连接酶购自TaKaRa公司, T aq DNA聚合酶购自天为时代生物工程公司, PCR产物回收试剂盒购自Omega公司。基因文库构建所用包装蛋白购自Promega公司。2,4-DAPG 标样购自TRC公司。其余化学试剂(分析纯)均为国产。
1.3 DNA操作技术
1.3.1 质粒DNA的酶切,纯化,回收及连接 参照文献[8]的方法进行。重组质粒从大肠杆菌DH5 向荧光假单胞菌2P24的转化在助手质粒的协助下通过三亲杂交实现[10]。
1.3.2 Tn5突变及突变子的筛选和鉴定 通过双亲杂交将连接有mini-T n5的载体pU Tkm1从E. coli S17-1( -p ir)转入2P24,T n5随机插入2P24染色体DNA[11]。即将过夜培养的供体菌悬液与受体菌悬液以1∶1(v∶v)于1.5mL管中混合,收集菌体,无菌水冲洗一次,再次收集菌体悬浮于100 L的无菌水中,将菌液点接于LB平板,30℃培养4h后,收集菌体,稀释后涂于含Km的M9平板, 28℃培养72h,长出的菌落即为T n5突变菌株。嗜铁素的检测、抗生素2,4-DAPG产量的测定(T LC法)以及氢氰酸和蛋白酶的检测方法参考文献[7]。生物膜的形成及定量依据O'T oole和Kolter的方法[12]。
1.3.3 2P24染色体基因组文库的构建 染色体DNA的提取采用CT AB法[13]。经不同酶量的M bo I部分酶切,选取合适的片段与B am HI、Sca I 双酶切的pLAFR-5连接,体外包装,转染E.coli DH5 。
1.3.4 基因组文库的筛选和pBS-33的构建 根据BLAST同源对比,在gacA基因保守区域设计PCR引物:A1:5′-GAAT TCGCTAGGTCTGT C-GGATGC-3′;A2:5′-GAAT TCT ATCGT CACG-CAGCA GCAGGAT G-3′。PCR反应体系为:94℃变性5min;94℃变性40s,63℃复性40s,72℃延伸40s,35次循环;72℃充分延伸10m in。可扩增到一条1.0kb的靶带。采用PCR介导的文库筛选方法[14]对2P24粘粒库进行筛选,获得2个阳性克隆pF20-31和pF30-21。经Eco RI酶切亚克隆得到
273
3期闫小雪,等:调控基因g acA在荧光假单胞菌2P24防治土传病害中的作用
Table1 The details of strains and plasmids in this study
Str ains and plasmids R elev ant cha racter istics So ur ce or r efer ence Strain
P seudomonas f luor escens:
2P24Wild type;2,4-DA P G+;HCN+;Sid+;pr ot eases+;A p R L abor ato ry stock
P M3390gacA-;2,4-D AP G-;HCN-;Sid+++;pro teases-;K m R;Ap R T his paper
P M3390-A PM3390co nt aining plasmid pE-12;2,4-D AP G+;HCN+;Sid++;
pr ot ea ses+;T et R;A p R
T his paper
E scher ichia coli:
D H5 F-recA1endA1hsd R17deoR thi-1sup E44gy r A96relA1
△(lacZY A-arg F)U169 -( 80dlacz△M15)
Sambr oo k,et al.[8]
S17-1( -pir)T hi p r o hsd R r ecA;chr o mosomal RP4;tra+;Sm R/Sp R Simon,et al.[15] Plasmids
pBluescr ipt II SK+Clo ning vecto r;ColE1r eplico n;A p R Str atag ene
pL A RF-5Co smid vecto r;IncP1r eplico n;r lx+;T et R K een,et al.[16]
pRK600 Co lE1oriV;RP4;tra+;R P4or iT;helper plasmid in tr iparental
mating s;Cm R
K essler,et al.[10]
pF20-31,pF30-21Co smid pL A RF-5co ntaining gacA gene;T et R T his paper
pBS-33 pBluescript car r ying3.3kb Eco RI frag ment containing gacA g ene;
Ap R
T his paper
pRK415 Br oad-ho st-r ang cloning vecto r;I ncP1replicon;polylinker o f
pU C19;M ob+;T et R
K een,et al.[16]
pE-12 pR K415carr y ing 1.2kb Eco RI frag ment co nta ining gacA g ene;
T et R
T his paper
pU T km1Deliver y plasmid fo r T n5;R6K r eplicon;Ap R;Km R Her rer o,et al.[11] Pathogens
R hiz octonia solani Causing Cotto n damping-off L abor ato ry stock R alstonia solanacear um Causing T o mato bacter ial w ilt L abor ato ry stock
Note:Sm R,s tr eptomycin res istan t;S p R,s pectinomycin r esis tant;Ap R,ampicillin resis tant;Km R,kanam ycin resis tant;Tet R, tetracycline resis tant;Cm R,chloramph enicol r esis tant.
一段3.3kb的阳性片段,插入pBluescript KS Eco RI位点,得到重组克隆pBS-33,测序验证。1.4 P.f luorescens2P24野生菌株及其突变菌株
对病原菌的拮抗作用
1.4.1 对病原真菌的拮抗作用 在PDA平板中央接入直径为6mm的病原真菌菌饼,距菌饼边缘
2.5cm处接种待测细菌,25℃培养,待病原真菌长至培养皿边缘时测量抑菌带大小。每处理3个重复。
1.4.2 对病原细菌的拮抗作用 将109cfu/mL 的病原细菌悬液1m L加入冷却至52℃左右的100m L LB培养基中,充分摇匀,倒平板。在距培养皿边缘3cm处接种待测菌,28℃培养48h后检查抑菌圈的有无和大小。每处理3个重复。
1.5 P.f luorescens2P24野生菌株及其突变菌株
温室生测试验
1.5.1 对番茄青枯病的盆栽防病效果 灭菌土培育番茄苗至3～4叶期,将幼苗取出,在108cfu/m L 待测菌液中浸根30m in(加入0.1%羧甲基纤维素),以灭菌水为对照,移至苗钵中,缓苗48h后,每钵灌根接种10mL108cfu/mL的青枯病菌。每处理3个重复,每重复20株苗。接种病原菌9d后调查病情指数,计算防效。病害分级方法参照文献[7]。
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1.5.2 对棉花立枯病的盆栽防病效果 催芽后的棉花种子在108cfu /mL 待测菌液(加入0.1%羧甲基纤维素)中浸种30m in(以灭菌水为对照),播种于接种立枯病菌(菌丝体在麦麸中培养3d,培养物重量/土壤重量=0.03%)的灭菌土中,播种后10d 调查死苗率(烂籽和出苗后死苗均按死苗计算)。每处理3个重复,每重复20株苗。计算防效。
2 结果与分析
2.1 P .f luorescens 2P24突变子的筛选和鉴定
通过双亲杂交,获得大约5000个野生菌株2P24的T n5突变菌株。分别穿刺接种于CAS 嗜铁
素检测平板上,筛选到21株比野生型2P 24产生的黄色晕圈显著增大的突变子。已有文献证实细菌中某种次生代谢物过量表达多是由于其调控基因突变引起的[17]
。因此,初步判断这21个菌株可能是由于Tn 5插入某一调控基因的位点而使代谢失常。进一步对突变子的其它次生代谢产物的产生进行检测(表2),PM 505和PM3390既不产生2,4-DAPG 、
氢氰酸,也不产生蛋白酶。表明Tn 5可能插入到PM 505和PM 3390中的某一调控基因位点,而这一调控基因对2P24产生的次生代谢产物具有整体的调控作用。
2.2 野生gacA 基因的克隆、测序和互补过量产生嗜铁素但不产生2,4-DAPG 、氢氰酸和蛋白酶表现型的PM 3390与已报道的整体性调控因子gacA 突变子相似[3]。用直接PCR 粘粒库筛选技术[14]
,从2P24基因组文库4300个重组子中获得2个阳性克隆pF 20-31和pF 30-21。将这2个
粘粒分别通过三亲杂交转入突变株PM 3390,能恢复PM 3390缺失的表型特征,从而证实pF 20-31和pF30-21中包含可互补缺失功能的完整的基因片段。将pF20-31中的3.3kb 片段插入pBluescr ipt
KS Eco RI 位点,得到重组质粒pBS -33。经测序证实其含有一个与调控基因gacA 具有高度同源性的642bp 开放阅读框(ORF)(图1),编码一段213个氨基酸的蛋白,推测分子量为23.2kDa 。同源性分析表明,该gacA 基因的核苷酸序列与荧光假单胞菌FPT 9601菌株中gacA 基因的同源性达96.1%,氨基酸同源性达99.5%;与F113、Pf-5和CHA0中gacA 基因的氨基酸同源性分别为99.1%、96.2%和88.7%。表明在荧光假单胞菌中,gacA 基因是高度保守的(图2)。将含有gacA 基因的片段进一步亚克隆到1.2kb ,其中仅含有一个完整的gacA ORF,连接到穿梭载体pRK415上,得到pE-12。通过三亲杂交转入突变子PM3390,获得互补菌株PM 3390-A 。分别对菌株
2P24、PM 3390和PM 3390-A 进行次生代谢产物的检测表明,pE -12能够恢复突变菌株PM 3390产生氢氰酸(图3),2,4-DAPG (图4)和蛋白酶的能力。以上结论证实:调控基因gacA 对2P 24产生的次生代谢产物具有整体的调控作用。2.3 gacA 影响生物膜的形成
野生菌株2P 24在1.5mL 的离心管内壁的空气与液体培养基接触面上可形成生物膜,通过结晶紫染色,肉眼可见紫色的环状膜[12]
。对gacA -
突变株PM 3390和互补菌株观察表明:PM 3390丧失了形成生物膜的能力,而互补菌株PM 3390-A 又恢复了这一能力。生物膜产生能力的量化结果也证实
Table 2 Characteristics of 2P24and its Tn5mutants
Secondary met abo lites St rains
2P 24418,1205,1260,1351,2183
5053390917,2560625,785,910,2297,2580,3771,4001,4155,4320
26322913Sider ophor e ++++++++++++++++++HCN
++++---+-+F ung al inhibitio n
+
+
--+
+
+
+
Note:Siderophore:“+”siderophore halo r<3m m,“++”3m m
after 48h in cubation;Fun gal inh ibition:“+”indicated in hibition of the grow th of p athogens,“-”indicated n o inhib ition of the grow th of path og ens.
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3期
闫小雪,等:调控基因g acA 在荧光假单胞菌2P 24防治土传病害中的作用
Fig .1 Nucleotide sequence of the gacA gene of P .f luorescens 2P24
N ote :U nder line :init iatio n co do n and ter mination codon ;ar r ow :the t ranslat ion dir ect ion ;
frame :the deduced r iboso me binding site (R BS);shado w block:r estr ictio n enzyme
sites
Fig .2 Alignment of the predicted amino acid sequence of GacA from
P .f luorescens 2P24with those of other P .f luorescens
N ote :the sequences w ere com par ed by BL A ST ;Number s in par ent heses r epr esent
accessio n numbers fr om G enBank.Identities a re indicated by aster isks.
以上结论(图5)。因此,gacA 基因在荧光假单胞2P24的生物膜形成中也起到重要作用。
2.4 平板拮抗测定和温室生测
2.4.1 通过平板对峙,检测了PM 3390和
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植物病理学报34卷
Fig .3 Detection of HCN produced by gacA
-
mutant and the complemented
strain
Fig .4 TLC assay of 2,4-DAPG produced by
gacA -
mutant and the
complementedstrain
Fig .5 Biofilm formation of 2P24and its deriva -tes in plastic tube
PM 3390-A 的抑菌能力(表3)。以野生2P24为对照,PM 3390丧失了对棉花立枯丝核菌和番茄青枯
菌的抑制能力,而PM 3390-A 恢复了对这2种病原菌的抑制能力,但抑菌圈略小于野生2P 24。Table 3 The inhibition activity of P .f luorescens
2P24and its derivates on PDA against soil -borne pathogens
Pat ho gens Zo ne of no pathog en gr ow th (cm )2P 24PM 3390PM 3390-A R hiz octonia solani 0.840.000.78R alstonia solanacear um
0.71
0.00
0.66
Note :Data are averages of thr ee repeats .
2.4.2 温室生测试验得到相似结论。由表4可见,野生生防菌株2P 24对棉花立枯病和番茄青枯病的防效分别达50.0%和66.1%,而gacA -突变菌株PM 3390对2种病害几乎完全丧失防治效果。互补菌株处理恢复了野生菌株的部分防效,对棉花立枯病和番茄青枯病的防效分别达38.0%和58.3%。这一结果说明gacA 基因在荧光假单胞2P24防治多种土传病害中有着重要的作用。
3 结论与讨论
双因子调控系统(tw o -component regulatory system )广泛存在于细菌中,这些调控系统帮助生物根据环境信号做出适应性反应。GacS /GacA 是存在于假单胞菌中的一套双因子调控系统。GacS 是信号感应蛋白,它识别胞外信号并通过磷酸基团
的形式激活反应调控蛋白GacA,经磷酸化激活的GacA 蛋白则具有整体水平上调控细胞次生代谢产物的功能。对有益于植物的根围定殖细菌的研究表明(P .f luorescens CHA0、Pf-5、BL915、F113和FPT 9601)GacS /GacA 系统对抗菌次生代谢物合成基因的表达有重要的调控作用[18]。
Table 4 The biocontrol eff ect of P .f luorescens 2P 24and its derivates to diseases
T r eatment T oma to bacter ial wilt
D isease index *Contr o l effect(%)
Cot ton damping -o ff
M o rt ality o f seedling *
(%)Co ntr o l effect(%)
W itho ut any ag ent s 85.9a -96.7a -2P 2429.2b 66.148.3b 50.0P M 339082.4a 4.196.7a 0.0P M 3390-A
34.4b
58.3
60.0b
38.0
Note:
*
Data are averages of thr ee repeats.Data follow ed by differen t letters in the same column mean sig nifican t d ifference at
0.05level.
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3期
闫小雪,等:调控基因g acA 在荧光假单胞菌2P 24防治土传病害中的作用
近年来已有多个gacS和gacA基因被克隆,它们在DNA和氨基酸水平上具有很高的相似性,并且在不同的荧光假单胞菌株中行使相似的功能[3,19]。在这些菌株中,GacS和GacA的突变菌株丧失了产生抗生素的能力,显著降低了对土传病害的生物防治能力。在2P24中,gacA对生防因子2,4-DAPG、氢氰酸、蛋白酶的产生起到正调控作用,从而部分解释了gacA-突变菌株丧失对病原菌抑制作用的原因。而gacA-突变菌株在嗜铁素检测平板上产生过量的嗜铁素,说明在2P24中双因子调控系统对嗜铁素的产生起负调控作用。相同的负调控作用也存在于CHA0中[19]。据报道,细菌产生嗜铁素可以抑制有害细菌和真菌在植物根部的生长[6]。但在本研究中,能产生大量嗜铁素的突变菌株在平板拮抗和温室防效测定中对番茄青枯病和棉花立枯病无防治效果,原因是嗜铁素在铁贫瘠的土壤中通过螯合Fe3+抑制其它微生物生长。而在本研究的实验条件下Fe3+相对丰富,嗜铁素对2P24的生防作用没有影响。
生物膜(bio film)是指微生物形成附着于固体表面的群落。当生存环境中的营养和温度适宜时,大多数细菌都能形成生物膜结构。据研究报道生物膜的形成与细菌在环境中的定殖有关[20],而有效的定殖又是生防菌发挥其生防功能的前提条件。本研究中,野生菌2P24具有形成生物膜的功能, gacA-突变菌株不能形成生物膜,而互补菌株又恢复了这一能力。说明生物膜的形成也需要gacA基因的功能。但GacA是否影响2P24在作物根部的定殖还需进一步的研究。
生防菌2P24对小麦全蚀病和番茄青枯病具有较好的防治效果[7]。本研究利用番茄青枯病和棉花立枯病的生测体系,测定了gacA-突变菌株和互补菌株的防治效果,证明gacA是2P24具有生防能力的重要调控因子。本研究中互补菌株对2种病害的防效均低于野生菌株2P24,究其原因可能是在复杂的土壤环境和非选择抗性条件下,部分菌株中质粒丢失造成gacA总体表达水平低于野生菌株,也可能是因为导入的外源质粒给互补菌带来一定的代谢负担,因而造成互补菌株不能完全恢复野生菌株2P24的生防效果。2P24的gacA-突变菌株处理对2种病害几乎完全丧失生防活性,这与已发表的文献中gacA-突变菌株仍有部分防效不同[3]。这可能和本研究中人工接菌量大,病害发生严重以及野生菌株2P24的特性有关。生防菌的生防效果在多个调控系统的作用下受到多种因子的影响,本文仅对表2中列举的多个可能的调控系统突变子之一进行了遗传学解析,随着对其它突变子的进一步研究,将会对P.f luorescens2P24的生防机制有更深入的了解。
参考文献
[1] Vincent M N,Har r ison L A,Brackin J M,et al.
Genetic analy sis of the antifungal activ ity of a soil-bo rne P seudomonas aur eof aciens str ain[J].A ppl.
Env ir on.M icro biol.,1991,57:2928-2934.
[2] Keel C,Schnider U,M aur hofer M,et al.Suppres-
sion o f ro ot diseases by Ps eudomonas f luor escens
CHA0:impor tance o f the bacterial secondar y
metabolite2,4-diacetylphlo ro glucinol[J].M ol.
Plant-M icr obe Inter act.,1992,5:4-13.
[3] Zhang L Q,Y ang Q,T o sa Y,et al.Inv olvement of
gacA gene in the suppression of toma to ba ct eria l wilt
by Pseudomonas f luorescens FPT9601[J].J.Gen.
Plant Patho l.,2001,67:134-143.
[4] Br isbane P G,Ro vira A D.M echanisms o f inhibitio n
of Gaeumannomy ces gr aminis var.tr itici by fluo res-cent pseudo monads[J].Plant Pat ho l.,1988,37:
104-111.
[5] Vo isar d C,Keel C,Haas D,et al.Cya nide pr oduc-
t ion by Pseudomonas f luor escens helps suppress black
ro ot r ot o f to bacco under gno tobio tic conditions[J].
EM BO J.,1989,8:351-358.
[6] Buysens S,Heung ens K,Po ppe J,et al.Inv olve-
ment of py ochelin and py ov erdin in suppressio n of
py thium-induced damping-o ff of to mato by P seu-
d omonas aer ug inosa7N SK2[J].A ppl.Env ir on.
M icr obio l.,1996,62:865-871.
[7] 魏海雷,王烨,张力群,等.生防菌株2P24与CP F-
10的鉴定及其生防相关性状的初步分析[J].植物
病理学报,2004,34(1):80-85.
[8] Sambr o ok J,Fr it sch E F,M aniatis T.M olecular
Clo ning:a L abor ato ry M anual.2nd ed.[M].Cold
Spr ing Har bo r,NY:Co ld Spr ing Harbo r L abor ator y
Pr ess,1989.
[9] King E O,W ard M K,R aney D E.T w o simple me-
dia fo r the demo nst rat ion of pyo cy anin and fluo res-cein[J].J.L ab.Clin.M ed.,1954,44:301-307.
278植物病理学报34卷
[10]K essler B,Lo r enzo L,T im mis K N.A g eneral sys-
tem to int egr ate lacZ fusions into the chro mosomes
o f G ram-neg ative eubacter ia:reg ulat ion of t he p m
pro mot er o f the T OL plasmid st udied with all con-tr olling elements in mo nocopy[J].M ol.Gen.
G enet.,1992,233:293-301.
[11]Her rer o M,de L or enzo V,T im mis K N.T ranspo-
son vector s co nt aining non-antibiotic r esist ance selec-tion mar kers fo r cloning and st able chr omo so mal in-sert ion of fo reign genes in Gr am-neg ativ e bacter ia
[J].J.Bacter iol.,1990,172(11):6557-6567. [12]O'T o ole G A,K o lter R.Initiatio n o f bio film for ma-
tion in Pseudomonas f luor escens WCS365pr oceeds
v ia multiple,conv er g ent signaling pat hw ay s:a g e-netic analy sis[J].M ol.M icr obio l.,1998,28:449
-461.
[13]A usubel F,Br ent R,K ingsto n R E,et al.Cur rent
pro to co ls in molecular biolog y[M].N ew Y or k,
N Y:W iley and So ns,Inc.,1990.
[14]Hugh G G,A nnet te M G.PCR T echnolog y:Cur-
r ent Innov atio ns[M].Boca R aton:CRC P ress,
1994.
[15]Simon R,Pr iefer U,Puhler A.A bro ad host r ange
mo biliza tio n system for in vivo genetic engineering:
tr anspo son mutag enesis in Gr am-neg ativ e bacter ia
[J].Bio/T echnolog y,1983,1:784-791.[16]K een N T,T amaki S,K obaya shi D,et al.I mpr ov ed
br oad-ho st-r ang e plasmids for DN A cloning in
G r am-nega tiv e bacter ia[J].G ene,1988,70:191-
197.
[17]Schw yn B,N eila nds J B.U niv ersal chem ical assay
f or the detection and deter mination of sider ophor es
[J].Anal.Bio chem.,1987,160:47-56.
[18]D uffy B K,D fago G.Contr olling instability in
g acS-gacA reg ulat or y g enes dur ing inoculants pr o-
duct ion of Ps eudomonas f luor es cens bioco nt ro l str ains
[J].A ppl.Env ir on.M icro biol.,2000,66:3142-
3150.
[19]Schmidli-Sacher er P,K eel C,Defag o G.T he g lobal
r eg ulato r G acA of P seudomonas f luor escens CHA0is
r equired for suppr ession o f ro ot disea ses in dico ty le-dons but not in Gr amineae[J].P lant Pat ho l.,
1997,46:80-90.
[20]D eziel E,Comeau Y,Xillemur R.Initiation of
biofilm for mation by Ps eudomonas aeruginosa57RP
co rr elates w it h emer gence o f hyper piliated and hig hly
a dher ent phenot ypic v ariants deficient in sw imming,
sw ar ming and tw itching motilities[J].J.Bacter i-o l.,2001,183:1195-1204.
责任编辑:林春芽
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3期闫小雪,等:调控基因g acA在荧光假单胞菌2P24防治土传病害中的作用
荧光素酶常见问题与解答
1) 什么是双荧光素酶报告基因测试系统（DLR） DLR 测试系统灵敏，方便，在一个系统中用于测量两个单独的荧光素酶报告基因，萤火虫荧光素酶及海洋海肾荧光素酶 (Renilla reniformis) ，DLR测试系统可用于细胞裂解物及无细胞的翻译系统。 2) 有哪些海肾荧光素酶载体 海肾荧光素酶载体pRL用于在转染的哺乳细胞中组成性地表达海肾荧光素酶。这类载体还有T7启动子，可用 T7RNA 聚合物在体外合成海肾荧光素酶，有4个不同的载体： pRL-SV40 载体 pRL-SV40 载体含 SV40 增强子及早期启动子区域，可在多种细胞中组成性地高表达海肾荧光素酶。 pRL-SV40 载体还含有 SV40 的复制起始区，可在表达 SV40 大 T 抗原的细胞中，如 COS-1 ， COS-7 细胞中，瞬时及附加体似地复制。 pRL-CMV 载体 pRL-CMV 载体含有 CMV 极早增强子及启动子，可在多种细胞中组成性地高表达海肾荧光素酶。 pRL-TK 载体 pRL-TK 载体含 HSV 胞嘧啶激酶启动子区域，在多种细胞中组成性地弱表达海肾荧光素酶。pRL-null 载体 pRL-null 载体缺真核启动子及增强子，在海肾荧光素酶基因的上游含有多克隆位点。 3) 用双报告基因有何优点 一般地说，实验报告基因用于测试实验条件下基因的表达，而另一个报告基因作为内对照，以提供实验报告基因测试的归一化。将实验报告基因的活力与内对照报告基因的活力作归一化可消除实验中不同测试间所固有的变化，这些变化减弱实验准确度，其中包括培养细胞的数目及活力的差异，细胞转染及裂解的效率。海肾荧光素酶可用作对照报告基因及实验报告基因。在双荧光素酶报告基因测试中，将萤火虫荧光素酶作为实验报告基因，海肾荧光素酶作为对照报告基因。
荧光素酶报告基因实验自我总结
荧光素酶报告基因实验自我总结 实验原理： 目前由两个主要的应用方向： 第一是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用，转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异顺序结合，这些特异性的序列被称为顺式因子，转录因子的DNA结合域和顺式因子实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验（luciferase Assay）是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。 第二是研究微小RNA(microRNA)对于靶基因的调控，通过生物信息学方法预测microRNA潜在的靶基因以及干预位点序列，并设计合适的microRNA质粒或干预片段，同时构建靶基因的报告基因质粒，二者同时转染细胞，这是确定microRNA是否能影响（上调或下调）靶基因的首选研究方法。 实验流程： 1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic（转录因子与靶基因）或pMIR-REPORT Luciferase质粒（微小RNA与靶基因）2）将要检测的转录因子表达质粒（或microRNA质粒）与报告基因质粒共转染293细胞或目的细胞。如果此转录因子（或microRNA）能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。 3）加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光素，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。 实验目的：研究转录因子和MicRNA对于靶基因调控的首先方法 实验步骤： （1）用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点。 （2）设计引物用PCR法从基因组DNA中克隆所需的靶启动子片段，将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒中。 （3）筛选阳性克隆，测序，扩增克隆并提纯质粒备用。 （4）扩增转录因子质粒（或microRNA质粒），提纯备用，同时准备相应的空载质粒对照。（5）培养293细胞（或其它目的细胞），并接种于12孔板中，生长24小时（80%汇合度）。（6）将报告基因质粒与转录因子表达质粒共转染细胞。 （7）用适当的方法提取蛋白并用于荧光素酶检测。 （8）加入酶作用底物，于荧光计数仪上测定荧光素酶的活性。 （9）计算相对荧光强度，并与空载对照比较，判断影响因子是否有效的作用于靶基因。
双荧光素酶测试系统及海肾类对照报告基因载体
双荧光素酶测试系统及海肾类对照报告基因载体 1.什么是双荧光素酶报告基因测试系统（DLR）？ DLR测试系统灵敏，方便，在一个系统中用于测量两个单独的荧光素酶报告基因，萤火虫荧光素酶及海洋海肾荧光素酶(Renilla reniformis)，DLR测试系统可用于细胞裂解物及无细胞的翻译系统。 2.有哪些海肾荧光素酶载体？ 海肾荧光素酶载体pRL用于在转染的哺乳细胞中组成性地表达海肾荧光素酶。这类载体还有T7启动子，可用T7RNA聚合物在体外合成海肾荧光素酶，有4个不同的载体： A pRL-SV40载体??? pRL-SV40载体含SV40增强子及早期启动子区域，可在多种细胞中组成性地高表达海肾荧光素酶。pRL-SV40载体还含有SV40的复制起始区，可在表达SV40大T抗原的细胞中，如COS-1，COS-7细胞中，瞬时及附加体似地复制。 B pRL-CMV载体pRL-CMV载体含有CMV极早增强子及启动子，可在多种细胞中组成性地高表达海肾荧光素酶。 a pRL-TK载体 pRL-TK载体含HSV胞嘧啶激酶启动子区域，在多种细胞中组成性地弱表达海肾荧光素酶。 b pRL-null载体 pRL-null载体缺真核启动子及增强子，在海肾荧光素酶基因的上游含有多克隆位点。 3.用双报告基因有何优点？ 一般地说，实验报告基因用于测试实验条件下基因的表达，而另一个报告基因作为内对照，以提供实验报告基因测试的归一化。将实验报告基因的活力与内对照报告基因的活力作归一化可消除实验中不同测试间所固有的变化，这些变化减弱实验准确度，其中包括培养细胞的数目及活力的差异，细胞转染及裂解的效率。海肾荧光素酶可用作对照报告基因及实验报告基因。在双荧光素酶报告基因测试中，将萤火虫荧光素酶作为实验报告基因，海肾荧光素酶作为对照报告基因。 4.相比用CAT或β-半乳糖苷酶对表达数据作归一化，双荧光素酶报告基因测试系统有何优点？
荧光素酶报告基因检测
荧光素酶报告基因检测 ●原则 荧光素酶检测系统，可用裂解液来温和而快速地提取真核细胞中的荧光素酶，用其底物来检测荧光素酶活性。检测步骤如下： 1)加裂解缓冲液裂解转染的细胞。 2)将上述裂解物转移入微孔板或者试管中（根据检测的需要选择所用器材类型）。 3)加入含有所有酶反应成分（必须包括底物荧光素），使化学发光反应开始。 4)用荧光仪或者液闪计数仪检测所发射的荧光。 ●特点 ◆敏感度和检测范围：5 fg荧光素酶 ◆发射光的线性范围：10 fg—10 ng ◆确切的检测限依检测仪器而定。 ◆特异性：本文介绍的荧光素酶报告基因系统的操作步骤，通常用来检测转染了萤火虫荧光素酶 基因的真核细胞中荧光素酶表达的活性。不适用于对细菌荧光素酶进行检测。 ●器材和试剂 ◆器材 在微孔板或试管中，用自动或手动荧光仪、液闪计数仪或者摄影胶片都可以检测到荧光素酶活性，而且高度敏感。当用微孔板时可以是白色，也可为黑色。 ◆试剂 1)荧光素酶检测试剂：荧光素酶检测试剂包括荧光素、ATP、CoA、以及一些添加剂，这些 试剂可以启动酶反应。这种荧光酶检测试剂的混合物可稳定保存在在-60℃以下12个月，- 15℃~- 25℃一个月，2℃~8℃只能保存一周。避免反复冻融。应避光保存，因为荧光素在 光照下会发生氧化。 2)裂解缓冲液：下面将加以介绍。 ●基本操作步骤 下面的操作步骤适用于培养的真核细胞。提取物必须立刻检测，否则必须在-15～-25℃储存大约一个月。不要反复冻融以避免酶活性的降低。 1)将荧光素酶报告基因与β-gal对细胞进行共转染，按实验计划进行处理。 2)彻底吸去培养皿（60mm）中的细胞培养液，用冰预冷的磷酸盐缓冲液（PBS，无钙和镁离子） 小心冲洗细胞3次，彻底去除剩余的PBS。10×PBS缓冲液：NaCl 100g，KCl 2.5g，Na2HPO4 14.4g，KH2PO42.5g，用三蒸水定容至1000 ml。 3)加入最小体积的Triton/甘氨酰甘氨酸裂解缓冲液盖过细胞，例如60 mm的培养皿用360 μl裂 解液，35毫米的培养板用150 μl裂解液。用橡皮刮将细胞刮离培养皿。将裂解物转移到微量离 心管中。Triton/甘氨酰甘氨酸裂解缓冲液：1%（v/v）Triton X-100，25mmol/L甘氨酰甘氨酸（p H7.8），15mmol/L MgSO4，4mmol/L EGTA，1mmol/L DTT（临用前加入） 4)在漩涡混合器上轻轻振荡细胞裂解液，以最大速度4℃离心以去除细胞碎片。将上清转移到另 一个微量离心管中，置于冰上以备分析。 5)在开始化学发光反应之前，将100 μl的细胞提取物转移到荧光仪或者液闪计数仪所用的检测 器皿中（我们建议用96孔板）。加入360 μl荧光素酶分析缓冲液。荧光素酶分析缓冲液：25m
荧光素酶报告实验
荧光素酶报告实验 1 扩增目的片段 扩增包含靶基因与miRNA互补位点的3’UTR序列以及mutant序列，上下游引物5’端各含有不同的酶切位点和保护碱基（如Pme I，Spe I）；电泳检测目的条带，看大小是否正确，然后用试剂盒纯化PCR产物备用。主要采用了2 种方法进行序列突变及扩增，如下图所示：第一种方法： 第二种方法： 1.2 取1-2 μg纯化的目的片段或pMIR-REPORT载体，按酶切反应体系配制混合液进行酶切（加0.01% BSA），酶切3h后，80℃灭活5 min，冰上降温。酶切产物进行胶回收。
酶切体系连接体系Component V olume (μl) Component V olume (μl) H2O 16-x H2O 8-m-n Vector or DNA x Vector m NEB Buffer I或IV 2 DNA n Spe I 1 10×T4 Ligase Buffer 1 Pme I 1 T4 DNA Ligase 1 Total voloume 20 Total voloume 10 1.3 配制连接反应混合液（DNA和Plasmid的molar ratio为3:1到6:1），16℃连接过夜或室温连接10 min。连接完毕后，将连接产物转化入感受态大肠杆菌（热激法）。Amp（100 μg/ml）抗性培养板筛选阳性克隆，菌落PCR鉴定目的片段，送3个样本测序，提取质粒酶切鉴定等。并扩繁阳性克隆。重组Luc-3’UTR 质粒主要元件和组成如下图所示（重组Luc-3’UTR-Mut 原理相同）： pLuc-MET 3'UTR 荧光素酶报告基因载体的构建 4.接种对数生长期的HEK293细胞（10% FBS+90% DMEM培养）于96孔板，3×103个/孔，每个实验组设置6个复孔，37℃，5% CO2培养箱中培养24h； 5.根据Lipofectamine 2000转染试剂说明书，配制转染液，转染HEK293细胞； A 液B液 pLuc-3’UTR 0.1 μg Lipofectamine 2000 0.5 μl pRL-SV40 0.05 μg OPTI-MEM 25 μl Mimic/NC 100 nM终浓度 OPTI-MEM 25 μl 6 转染48 h后，吸除96孔板中的培养液，用ddH2O稀释Passive Lysis Buffer至1×浓度，在96孔板中加入1×Passive Lysis Buffer，20 μl/孔，用移液枪反复吸打裂解细胞； 7 在白色不透明的96孔板中加入100 μl/孔的Luciferase Assay Substrate； 8 从每孔裂解好的细胞悬液中吸出11.5 μl加入Luciferase Assay Substrate中混匀； 9 在酶标仪500 ms条件下检测，并记录数据； 10 用Stop & Glo? Buffer稀释Stop & Glo? Substrate至1×使用浓度； 11 在第7步完成后，加入Stop & Glo? Substrate 100 μl/孔，混匀； 12 在酶标仪500 ms条件下检测，并记录数据，两次测得数据的比值代表各孔样本的相对荧光强度。
荧光素酶及其报告基因的应用和检测
荧光素酶及其报告基因的应用和检测 一生物发光 生物发光（bioluminescence）是指生物体发光或生物体提取物在实验室中发光的现象。它不依赖于有机体对光的吸收，而是一种特殊类型的化学发光，化学能转变为光能的效率几乎为100%。也是氧化发光的一种。生物发光的一般机制是：由细胞合成的化学物质，在一种特殊酶的作用下，使化学能转化为光能。 与荧光的区别在于 荧光：荧光检测需要激发光源，发射光的能量来源于激发光，荧光反应为瞬时反应。 发光：生物发光、化学发光，发光反应无需激发光源，发射光的能量来源于化学反应，发光有一定的持续时间。 二荧光素酶 荧光素酶（Luciferase）是生物体内催化荧光素(luciferin)或脂肪醛(firefly aldehyde)氧化发光的一类酶的总称,来自于自然界能够发光的生物。 自然界存在的荧光素酶来自萤火虫、发光细菌、发光海星、发光节虫、发光鱼、发光甲虫等。细菌荧光素酶对热敏感,因此在哺乳细胞的应用中受到限制。目前,以北美萤火虫虫(Photinus pyralis)来源的荧光素酶基因应用的最为广泛,该基因可编码550个氨基酸的荧光素酶蛋白，是一个61kDa的单体酶，无需表达后修饰，直接具有完全酶活。 发光机制 生物荧光实质是一种化学荧光。萤火虫荧光素酶在Mg2+、ATP、O2的参与下,催化D2荧光素(D2luciferin) 氧化脱羧,产生激活态的氧化荧光素,并放出光子,产生550～ 580 nm 的荧光,其化学反应式如下。 这种无需激发光就可发出偏红色的生物荧光,其组织穿透能力明显强于绿色荧光蛋白( GFP) 。荧光素酶是靠酶和底物的相互反应发光,特异性很强,灵敏度高,由于没有激发光的非特异性干扰, 信噪比也比较高。 三荧光素酶报告基因 报告基因（report gene）是一种易于检测蛋白质或酶等表达产物的基因，可通过报告基因产物的表达来“报告”目的基因的表达调控。通常把报告基因的编码序列和基因表达调节序列融合形成嵌合基因,或与其他目的基因融合,在调控序列控制下进行表达,
双荧光素酶报告基因分析promega
双荧光素酶报告基因分析 1. 介绍 荧光素酶报告基因表达的转录调控常被用来研究培养细胞的生物学特性。荧光素酶是理想的报告基因，因为哺乳动物细胞中不含内源性荧光素酶，一旦转录完成立刻就生成功能性的荧光素酶。 Dual-Luciferase?双荧光素酶报告基因检测系统中含有在同一细胞中同时表达的两种荧光素酶。通常，报告基因实验中往往会受到各种实验条件的影响，共转染的“对照”报告基因会作为内对照，为试验提供一基准线。实验报告基因经过内参照的处理可以减小细胞活性和转染效率对实验的影响，因此双报告系统减少了外部干扰，使得实验数据更可信。实验中报告基因和对照基因的酶没有种源同源性，萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶对应不同的反应底物，反应中没有任何的交叉干扰。
萤火虫荧光素酶底物和海肾荧光素酶底物分别与检测试剂反应可以使灵敏度最大化。由于超强的光信号和超高的信噪比，本系统被广泛用于制药和生物技术产业中。双荧光素酶报告基因检测系统适配于各种培养哺乳细胞的培养基，如1640，MEM，DMEM，F12等。这些试剂与被动裂解液所附带的试剂盒，可以从Promega试剂盒中分开，单独使用。 具有超高灵敏度和超宽线性范围的Veritas?微孔板发光检测仪特别适合DLR 报告基因检测系统，Veritas?软件中预装了DLR 的检测程序使得安装更为方便，内置自动加样器使得应用更为简单。 Veritas?微孔板发光检测仪使用荧光素酶检测试剂II (LAR II)最低可以检测到1X10-19 mol 荧光素酶分子，使用Stop & Glo?试剂可以检测到1X10-18 mol 海肾荧光素酶分子，检测线性范围分别为8 和6 个数量级。所有的检测均采用纯化的重组萤火虫荧光素酶 (E1701)和纯化的重组海肾荧光素酶。
荧光素酶报告系统
亦称发光酶。是催化生物发光的酶系的总称。它是光物质的冷水抽提物在氧中发光时，底物虫荧光素被消耗以后残余的对热不稳定的高分子成分。现在对萤虫相海萤以及发光细菌的虫荧光素酶结晶物的研究得最多。它们属于加氧酶（oxygenase），不含金属和辅酶。对于发光，有的酶必须以ATP等作为辅助 因子，有的则不需要。其发光机制等已了解到可因种的不同而有很大的差异，虫萤光素酶具有高度的特异性，一般仅作用于来自近缘种的虫荧光素。当然，萤虫、海萤的酶是不能互相代替引起发光的。海萤的虫荧光素酶在干燥状态下相当稳定，可以保存 双荧光素酶报告基因测试∶结合萤火虫和海洋腔肠荧光素酶先进的共报告基因测试技术 在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时,通常采用第二个报告基因来减少实验的 变化因素。但传统的共报告基因(比如CAT,β-Gal,GUS)不够便利,因为各自的测 试化学,处理要求,检测特点存在差异。Promega提供一种先进的双报告基因技术,结合了萤火虫荧光素酶测试和海洋腔肠荧光素酶测试。双荧光素酶报告基因测试系统,结合pRL载体系统,表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素酶,在单管中进行 双荧光素酶报告基因测试,快速,灵敏,简便。系统还提供PLB裂解液,用来裂解在多孔板中培养的哺乳细胞,不需操作单个样品。对于正在使用萤火虫荧光素酶报 告基因载体的研究人员。双荧光素酶报告基因测试系统将使他们立即体会到该系统的便利。 介绍 双报告基因用于实验系统中作相关的或成比例的检测, 通常一个报告基因 作为内对照, 使另一个报告基因的检测均一化。检测基因表达时双报告基因通常用来瞬时转染培养细胞，带有实验报告基因的载体共转染带有不同的报告基因作为对照的第二个载体。通常实验报告基因偶联到调控的启动子, 研究调控基因的结构和生理基础。报告基因表达活力的相对改变与偶联调控启动子转录活力的改变相关，偶联到组成型启动子的第二个报告基因，提供转录活力的内对照, 使测试不被实验条件变化所干扰。 通过这种方法, 可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性, 比如, 培养细 胞的数目和活力的差别, 细胞转染和裂解的效率。 使用萤火虫荧光素酶,结合氯霉素乙酰转移酶(CAT), β-半乳糖苷酶(β-Gal), 或葡萄醛酸糖苷酶(GUS)的双报告基因,近几年已普遍使用。但这些双报告基因 组合削弱了荧光素酶操作的优势, 比如荧光素酶测试和定量可在几秒钟内进行, 但CAT, β-Gal和GUS测试法, 则在定量前需要长时间的保温。另外,这些报告 基因受限于它们的灵敏度和线性应答范围, 必须注意不要超过这些范围, 内源性
双荧光素酶测试系统及海肾类对照报告基因载体
双荧光素酶测试系统及海肾类对照报告基因载 体 Company Document number：WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998
双荧光素酶测试系统及海肾类对照报告基因载体 1.什么是双荧光素酶报告基因测试系统（DLR）？ DLR测试系统灵敏，方便，在一个系统中用于测量两个单独的荧光素酶报告基因，萤火虫荧光素酶及海洋海肾荧光素酶(Renilla reniformis)，DLR测试系统可用于细胞裂解物及无细胞的翻译系统。 2.有哪些海肾荧光素酶载体？ 海肾荧光素酶载体pRL用于在转染的哺乳细胞中组成性地表达海肾荧光素酶。这类载体还有T7启动子，可用T7RNA聚合物在体外合成海肾荧光素酶，有4个不同的载体： A pRL-SV40载体pRL-SV40载体含SV40增强子及早期启动子区域，可在多种细胞中组成性地高表达海肾荧光素酶。pRL-SV40载体还含有SV40的复制起始区，可在表达SV40大T抗原的细胞中，如COS-1，COS-7细胞中，瞬时及附加体似地复制。 B pRL-CMV载体pRL-CMV载体含有CMV极早增强子及启动子，可在多种细胞中组成性地高表达海肾荧光素酶。 a pRL-TK载体 pRL-TK载体含HSV胞嘧啶激酶启动子区域，在多种细胞中组成性地弱表达海肾荧光素酶。 b pRL-null载体 pRL-null载体缺真核启动子及增强子，在海肾荧光素酶基因的上游含有多克隆位点。 3.用双报告基因有何优点？ 一般地说，实验报告基因用于测试实验条件下基因的表达，而另一个报告基因作为内对照，以提供实验报告基因测试的归一化。将实验报告基因的活力与内对照报告基因的活力作归一化可消除实验中不同测试间所固有的变化，这些变化减弱实验准确度，其中包括培养细胞的数目及活力的差异，细胞转染及裂解的效率。海肾荧光素酶可用作对照报告基因及实验报告基因。在双荧光素酶报告基因测试中，将萤火虫荧光素酶作为实验报告基因，海肾荧光素酶作为对照报告基因。 4.相比用CAT或β-半乳糖苷酶对表达数据作归一化，双荧光素酶报告基因测试系统有何优点
双荧光素酶报告基因检测试剂盒使用说明
双荧光素酶报告基因检测试剂盒使用说明 产品说明： 报告基因检测，是真核基因表达调控研究的常用方法。由于检测光量子的方法非常敏感，采用生物发光(bioluminescent)法，是报告基因检测最常用的有效手段。荧光素酶(luciferase)催化底物荧光素的转化，发射出光子。萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase)和海肾荧光素酶(Ranilla luciferase)催化的发光反应，具有相似的光学特征和很好的浓度线性范围(7~8个数量级的线性范围)，酶的检测灵敏度达10-18mol到10-20mol，但两者催化的化学反应底物和最适反应条件完全不同。这两种荧光素酶配合形成了十分有效的双荧光素酶报告基因系统，其中Ranilla luciferase通常作为内参照。 本试剂盒提供了一体化形式的双荧光素酶检测系统。采用通用裂解缓冲液，适合于两种荧光素酶活性的保持，且与其他类型的报告基因检测和蛋白含量检测兼容；优化的两种酶反应体系，使每种发光反应持续数十分钟，以便于手工操作多个样品；并保证Firefly luciferase发光及时淬灭，不影响后续Ranilla luciferase的测定；优化的反应体系还使两种荧光素酶活性比值趋于合理的敏感范围，更有利于后续数据的比较。 产品内容： 名称数量保存条件5x Universal Lysis Buffer(通用裂解液)25ml-20℃ Fassay Buffer I(虫酶缓冲液)10ml-20℃ Fassay Substrate I(虫酶底物)0.5ml-20℃ Rassay Buffer II(海酶缓冲液)10ml-20℃ Rassay Substrate II(海酶底物)0.2ml-20℃可作100次双荧光素酶检测。低温运输，-20℃或-80℃避光保存。有效期6个月。
双萤光素酶报告基因的应用-常见载体及案例简介
双萤光素酶报告基因的应用，常见载体及案例简介双萤光素酶报告基因检测（Dual-Luciferase Reporter Assay）通常以萤火虫萤光素酶(Firefly luciferase)为报告基因，以海肾萤光素酶(Renilla luciferase)为内参基因。所构成的报告系统具有灵敏度高、动态范围广、应用灵活等优势，广泛用于基因调控、非编码RNA靶向互作等研究领域。 Firefly luciferase（简称F-Luc）以萤光素(luciferin)为底物，在Mg2+、ATP和氧分子存在条件下，催化luciferin氧化成oxyluciferin，在此过程中发出最强波长在560nm 左右的生物萤光(bioluminescence)。F-Luc表达框的上游启动子区域插不同功能序列，可以通过转录起始条件造成其报告萤光的变化。在F-Luc的3’UTR区域插入待验证的靶序列，通过其翻译抑制或mRNA稳定性降低，可以反映是否存在靶向互作。 Renilla luciferase（简称R-Luc）以腔肠素（coelenterazine）为底物，在氧分子存在的条件下催化coelenterazine氧化生成coelenteramide，此过程中发出最强波长在465nm 左右的生物萤光。R-Luc通常由固定组成型启动子驱动，在报告系统中作为校正input误差的内参信号。 生物萤光产生反应式 一、应用方向 1. 验证microRNA同mRNA靶向互作。将待测mRNA的3’UTR序列插入报告基因载体，再共转入该microRNA，如果萤光素酶活性下降，则提示为其靶序列。 2. 验证microRNA同lncRNA靶向互作。将候选的lncRNA序列插入报告基因载体中F-Luc的3’UTR区域，检测萤光素活性。 3. 启动子结构分析。将启动子区域序列（通常2k左右）进行分段截短，或对特定位点进行突变，再分别构建入luciferase报告载体，检测其启动子活性。 4. 启动子SNP分析。一些基因的启动子区域存在单核苷酸多态性，可运用萤光素酶报告系统分析其相对活性。
双荧光素酶报告基因检测系统-promega
Dual-Luciferase? Reporter Assay 试剂准备 Luciferase Assay Buffer II 10ml Luciferase Assay Substrate 1vial Stop & Glo? Buffer 10ml Stop & Glo? Substrate, 50X 200ul Passive Lysis Buffer (PLB), 5X 30ml 1.1X PLB: 加1体积的5X Passive Lysis Buffer (PLB)到4体积的dH20中，40C 保存（一个月）。 https://www.wendangku.net/doc/2818301882.html,R II：将Luciferase Assay Substrate重悬于10ml Luciferase Assay Buffer II 中（-200C保存1个月，-700C保存1年）。 3.1X Stop & Glo 试剂：1体积50X Stop & Glo? Substrate加入49体积的 Stop & Glo? Buffer中（-200C保存15天）。（每次试验需要100ul） 细胞处理 1. 吸除细胞培养液 2. 1X PBS轻柔的冲洗细胞 3. 加入1X PLB（推荐用量） 4.细胞溶解 室温条件下，轻摇细胞15min，
瞬时转染和报告基因实验 采用脂质体介导技术转染。重组质粒分别为p-629/+100，p-401/+100，p-238/+100，p-80/+100，p-25/+100。pGL3- basic为阴性对照;同时以转染phRL-tk(海肾荧光素酶)作内对照。具体转染方法参照转染(Polifectamine Reaent)说明书进行。 1. 将质粒DNA(3.2μg)与phRL-tk (0.8μg)按1:4混合后为A液，混匀30s， PolyFect(QIAGEN)与无血清无抗生素的DMEM按1:50混匀后为B液，混匀30s; 2. A+B混匀(B加入A)15s，室温下孵育5-10 min; 3. 吸出六孔板中的培养液，用无血清无抗生素的DMEM洗3遍，然后加入AB 混合液，每孔0.8mL; 4. 6h后，加入2mL完全DMEM; 5. 24h后，倒出旧培养液，换为完全DMEM; 6. 100μg H2O2或B(a)P处理lh或24h;（200 μM MMS，24h-溶解于Me2SO, Sigma)； （H2O2不引起OGG1升高）
荧光素酶报告基因的检测
一、荧光素酶报告基因的检测原理 荧光素酶（Luciferase）是生物体内催化荧光素(luciferin)或脂肪醛(firefly aldehyde)氧化发光的一类酶的总称，来自于自然界能够发光的生物。 自然界存在的荧光素酶来自萤火虫、发光细菌、发光海星、发光节虫、发光鱼、发光甲虫等。细菌荧光素酶对热敏感，因此在哺乳细胞的应用中受到限制。目前，以北美萤火虫虫(Photinus pyralis)来源的荧光素酶基因应用的最为广泛，该基因可编码550个氨基酸的荧光素酶蛋白，是一个61kDa的单体酶，无需表达后修饰，直接具有完全酶活。 发光机制 生物荧光实质是一种化学荧光。萤火虫荧光素酶在Mg2+、ATP、O2的参与下，催化D2荧光素(D2luciferin) 氧化脱羧，产生激活态的氧化荧光素，并放出光子，产生550～580 nm 的荧光，其化学反应式如下。
这种无需激发光就可发出偏红色的生物荧光，其组织穿透能力明显强于绿色荧光蛋白(GFP)。荧光素酶是靠酶和底物的相互反应发光，特异性很强，灵敏度高，由于没有激发光的非特异性干扰，信噪比也比较高。 二、荧光素酶报告基因的检测流程 1、重组质粒制备: 制备含有待检测基因-Luc/Rluc的重组质粒； 2、细胞系选择: 根据实验需要选择细胞株，通常选择转染效率较高的293T细胞或原代细胞等； 3、共转染: 将带有Luc/Rluc标记的报告基因和目的基因进行共转染，设置不同的检测时间点，一般为24h/48h； 4、外界干预: 转染后，可进行物理/化学/病毒等的相应刺激； 5、细胞处理: 采用进口/国产双荧光素酶检测试剂盒依照protocol操作； 6、荧光检测: 使用GENios Pro 酶标仪或具有类似检测功能的设备进行荧光强度检测。 三、荧光素酶报告基因的优点 1、优越的灵敏度，比Westernbloting灵敏度高1000倍以上； 2、内源性低，哺乳动物无内源性表达； 3、荧光素酶检测不受细胞内其他物质影响； 4、发光检测，检测方便；
双荧光报告系统
报告基因 Promega中文通讯第2期 2002 荧光素酶 双荧光素酶报告基因测试∶ 结合萤火虫和海洋腔肠荧光素酶先进的共报告基因测试技术 在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时 ,通常采用第二个报告基因来减少实验的变化因素。但传统的共报告基因(比如CAT,β-Gal,GUS)不够便利,因为各自的测试化学,处理要求,检测特点存在差异。Promega提供一种先进的双报告基因技术,结合了萤火虫荧光素酶测试和海洋腔肠荧光素酶测试。双荧光素酶报告基因测试系统,结合pRL载体系统,表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素酶,在单管中进行双荧光素酶报告基因测试,快速,灵敏,简便。系统还提供PLB裂解液,用来裂解在多孔板中培养的哺乳细胞,不需操作单个样品。对于正在使用萤火虫荧光素酶报告基因载体的研究人员。双荧光素酶报告基因测试系统将使他们立即体会到该系统的便利。 介绍 双报告基因用于实验系统中作相关的或成比例的检测, 通常一个报告基因作为内对照, 使另一个报告基因的检测均一化。检测基因表达时双报告基因通常用来瞬时转染培养细胞，带有实验报告基因的载体共转染带有不同的报告基因作为对照的第二个载体。通常实验报告基因偶联到调控的启动子, 研究调控基因的结构和生理基础。报告基因表达活力的相对改变与偶联调控启动子转录活力的改变相关，偶联到组成型启动子的第二个报告基因，提供转录活力的内对照, 使测试不被实验条件变化所干扰。 通过这种方法, 可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性, 比如, 培养细胞的数目和活力的差别, 细胞转染和裂解的效率。 使用萤火虫荧光素酶,结合氯霉素乙酰转移酶(CAT), β-半乳糖苷酶(β-Gal), 或葡萄醛酸糖苷酶(GUS)的双报告基因,近几年已普遍使用。但这些双报告基因组合削弱了荧光素酶操作的优势 , 比如荧光素酶测试和定量可在几秒钟内进行, 但CAT, β-Gal和GUS测试法, 则在定量前需要长时间的保温。另外,这些报告基因受限于它们的灵敏度和线性应答范围, 必须注意不要超过这些范围, 内源性细胞活力也会干扰这类报告基因的使用。许多类型的细胞有内源β-Gal 或GUS表达, 不利于准确定量报告基因表达, 胞内去乙酰酶活力干扰CAT活力测试。尽管在高温
双荧光素酶报告系统
双荧光素酶报告系统 双荧光素酶报告基因测试∶ 结合萤火虫和海洋腔肠荧光素酶先进的共报告基因测试技术 在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时 ,通常采用第二个报告基因来减少实验的变化因素。但传统的共报告基因(比如CAT,β-Gal,GUS)不够便利,因为各自的测试化学,处理要求,检测特点存在差异。Promega提供一种先进的双报告基因技术,结合了萤火虫荧光素酶测试和海洋腔肠荧光素酶测试。双荧光素酶报告基因测试系统,结合pRL载体系统,表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素酶,在单管中进行双荧光素酶报告基因测试,快速,灵敏,简便。系统还提供PLB 裂解液,用来裂解在多孔板中培养的哺乳细胞,不需操作单个样品。对于正在使用萤火虫荧光素酶报告基因载体的研究人员。双荧光素酶报告基因测试系统将使他们立即体会到该系统的便利。 介绍 双报告基因用于实验系统中作相关的或成比例的检测, 通常一个报告基因作为内对照, 使另一个报告基因的检测均一化。检测基因表达时双报告基因通常用来瞬时转染培养细胞，带有实验报告基因的载体共转染带有不同的报告基因作为对照的第二个载体。通常实验报告基因偶联到调控的启动子, 研究调控基因的结构和生理基础。报告基因表达活力的相对改变与偶联调控启动子转录活力的改变相关，偶联到组成型启动子的第二个报告基因，提供转录活力的内对照, 使测试不被实验条件变化所干扰。 通过这种方法, 可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性, 比如, 培养细胞的数目和活力的差别, 细胞转染和裂解的效率。 使用萤火虫荧光素酶,结合氯霉素乙酰转移酶(CAT), β-半乳糖苷酶(β-Gal), 或葡萄 醛酸糖苷酶(GUS)的双报告基因,近几年已普遍使用。但这些双报告基因组合削弱了荧光素酶操作的优势 , 比如荧光素酶测试和定量可在几秒钟内进行, 但CAT, β-Gal和GUS测试法, 则在定量前需要长时间的保温。另外,这些报告基因受限于它们的灵敏度和线性应答范围, 必须注意不要超过这些范围, 内源性细胞活力也会干扰这类报告基因的使用。许多类型的细胞有内源β-Gal或GUS表达, 不利于准确定量报告基因表达, 胞内去乙酰酶活力干扰CAT活力测试。尽管在高温下预处理细胞裂解液(1,2), 会降低内源性β-Gal和CAT测试的干扰，但这些处理也会快速失活荧光素酶。因此,在此类双报告基因检测中, 必须以不同的步骤分别处理共转染的细胞裂解液。 理想的双报告基因方法应该使用户能够以萤火虫荧光素酶所具有的速度,灵敏和线性范 围对同一样品中的两个报告基因同时测定。这在传统的报告基因, 如CAT, β-Gal和GUS是不可能的, 由于它们测试化学,处理要求所固有的局限。相反 , 结合萤火虫 ( Photinus pyralis ) 和海洋腔肠 ( Renilla reniformis ) 双荧光素酶， Promega 的双荧光素酶报告基因测试 (DLR) 系统可满足这些要求，在单管中完成这些测试。 双荧光素酶报告基因测试化学 荧火虫和海洋腔肠荧光素酶都具有生物发光报告基因的卓越的测试特点 , 但它们在进化 上的起源不同 , 因此 , 具有不同的酶学结构和底物要求。这些差别用来发展了 DLR 测试化学 , 选择性地区别这两种发光报告基因的活力。萤火虫荧光素酶是一个 61kDa 单亚基蛋白质 , 酶活力不需翻译后修饰 (3,4), 在翻译后即可作为遗传报告基因。在 ATP,Mg 2+ 和 O 2 存在下，通过甲虫荧光素的氧化反应发光 ( 图 1) 。在常规反应条件下 , 荧光素的氧化发生时 , 以荧光素 -AMP 作为中间体 , 转换非常缓慢。结果 , 在底物和酶混合后 , 测试化学产生"闪烁"的光 , 并迅速衰减。专利化的测试试剂 , 定量萤火虫荧光素酶活力 , 掺入了
双荧光素酶报告基因分析
双荧光素酶报告基因分析 转载请注明来自丁香园 发布日期：2010-04-08 10:59 文章来源：北京原平皓生物技术有限公司 关键词：双荧光素酶基因表达报告基因检测 1. 介绍 荧光素酶报告基因表达的转录调控常被用来研究培养细胞的生物学特性。荧光素酶是理想的报告基因，因为哺乳动物细胞中不含内源性荧光素酶，一旦转录完成立刻就生成功能性的荧光素酶。 Dual-Luciferase?双荧光素酶报告基因检测系统中含有在同一细胞中同时表达的两种荧光素酶。通常，报告基因实验中往往会受到各种实验条件的影响，共转染的“对照”报告基因会作为内对照，为试验提供一基准线。实验报告基因经过内参照的处理可以减小细胞活性和转染效率对实验的影响，因此双报告系统减少了外部干扰，使得实验数据更可信。实验中报告基因和对照基因的酶没有种源同源性，萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶对应不同的反应底物，反应中没有任何的交叉干扰。 萤火虫荧光素酶底物和海肾荧光素酶底物分别与检测试剂反应可以使灵敏度最大化。由于超强的光信号和超高的信噪比，本系统被广泛用于制药和生物技术产业中。双荧光素酶报告基因检测系统适配于各种培养哺乳细胞的培养基，如1640，MEM，DM EM，F12等。这些试剂与被动裂解液所附带的试剂盒，可以从Promega试剂盒中分开，单独使用。 具有超高灵敏度和超宽线性范围的Veritas?微孔板发光检测仪特别适合DLR 报告基因检测系统，Veritas?软件中预装了DLR 的检测程序使得安装更为方便，内置自动加样器使得应用更为简单。
Veritas?微孔板发光检测仪使用荧光素酶检测试剂II (LAR II)最低可以检测到1 X10-19 mol 荧光素酶分子，使用Stop & Glo?试剂可以检测到1X10-18 mol 海肾荧光素酶分子，检测线性范围分别为8 和6 个数量级。所有的检测均采用纯化的重组萤火虫荧光素酶(E1701)和纯化的重组海肾荧光素酶。 图1－3 使用Promega 公司Dual-Luciferase?双荧光素酶报告基因检测系统，萤火
双荧光素酶报告基因
启动子活性分析（双荧光素酶报告基因实验） 一、实验目的：分析启动子活性 二、实验原理：荧光素酶报告基因的活性用Dual-Luciferase?Reporter Assay System（Promega）试剂盒来检测。利用单通道多标记荧光检测仪测定荧 光素酶活性。在双荧光素酶系统中，除了用于检测启动子活性的萤火虫 荧光素酶外，另外一种组成型表达的Renilla荧光素酶质粒PRL-TK也被 同时转染入细胞内作为内参。 三、实验材料：Dual-Luciferase?Reporter Assay System（Promega）试剂盒， PBS，细胞裂解液，96孔， 四、实验设备：单通道多标记荧光检测仪 五、实验方法及步骤： 1）启动子萤光素酶报告载体与共转染质粒按照质量等比例、总量0.8μg的原则转染细胞，36h后收获细胞； 2）96孔板吸弃细胞培养基，PBS冲洗细胞一次，加入1×PLB细胞裂解液20μl，置于室温震荡裂解20min； 3）轻轻吹打细胞，取10μl细胞裂解液加入50μl Luciferase Assay Reagent，轻轻震荡混匀，立刻置于单通道多标记荧光检测仪中测定Firefly Luciferase活性； 4）读数后立即加入50μl Stop & Glo?Reagent轻轻震荡混匀，读取Renilla Luciferase活性； 5）所得的结果为各个实验样品的Firefly Luciferase活性与Renilla荧光素酶活性的比值。每个实验组重复3-4孔，整个实验独立重复3次。实验结 果均为3次独立的实验结果的平均值。所有的结果均以平均值±标准差 (mean±S.D.)表示。 六、注意事项 1.做好对照。 2.多做几个复孔，求平均值。 七、补充知识点 双荧光素酶报告基因实验
各种荧光素酶报告基因检测试剂盒解析
各种光素酶报告基因检测试剂盒解析 荧光素酶(Luciferase)是自然界中能够催化荧光素产生生物发光的酶的统称，其中最有代表性的是来自萤火虫体内(Fire?y)和海肾(Renilla)体内的两类萤光素酶，分别命名为F-Luciferase和R-Luciferase，同时近年来研究得较多的来源于高斯氏菌的高斯荧光素酶（Gauss luciferase）。 荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)，可通过荧光测定仪设备测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光，常应用于启动子转录活性调控及miRNA靶基因验证等方向研究。 萤火虫萤光素酶 最通用和最常见的报告基因是北美萤火虫photinus pyralis的荧光素酶，该蛋白质不需要翻译后修饰即可获得酶活性。高浓度（体内）甚至没有毒性，可用于原核和真核细胞。 Amplite?萤光素酶报告基因检测试剂盒 图1.在带有NOVOstar读板器（BMG Labtech）的白色96孔板中，使用Amplite?萤光素酶报告基因基因检测试剂盒（12518）检测萤光素酶剂量反应。该试剂盒可在20min-5h的孵育时间内检测到低至0.1pg /孔的萤光素酶，而不会丢失信号强度。半衰期超过4小时。 Amplite?萤光素酶报告基因检测试剂盒（12518）使用无DTT专利配方来定量活细胞和细胞提取物中的萤光素酶活性。该测定基于萤火虫荧光素酶，萤火虫荧光素酶是一种单体的61 kD 酶，可催化荧光素的两步氧化，在560 nm处产生光。
Amplite?萤光素酶报告基因检测试剂盒特点： 具有优化的“混合读取”测定规程，可与HTS液体处理仪器兼容 具有高灵敏度，可用于需要低检测限的测定 具有用于研究基因调控和功能的快速，简单且均一的生物发光测定法 与标准细胞生长培养基的使用兼容 高斯荧光素酶 近年来，其他荧光素酶（例如高斯荧光素酶）的使用有所增加，因为这些报告基因较小，并且不需要ATP的存在。高斯荧光素酶是一种20 kD的蛋白质，可通过氧气催化腔肠素氧化，产生光。来自于海洋足类高斯氏菌的生物发光酶在表达后可有效地从哺乳动物细胞中分泌出来。 Amplite?高斯荧光素酶报告基因检测试剂盒使用专有的发光配方来定量细胞培养基中的荧光素酶活性。当该试剂与高斯荧光素酶相互作用时，产生发光产物，该发光产物提供强发光。 Amplite高斯荧光素酶报告基因测定试剂盒特点： 提供了与HTS液体处理仪器兼容的所有基本组件 它们具有高灵敏度，可以以方便的96孔和384孔微量滴定板形式进行 半衰期为一小时的“辉光型”信号在大量检测板之间提供一致的信号 与标准细胞生长培养基兼容 海肾荧光素酶 海肾萤光素酶是一种从海桑（Renilla reniformis）分离的36 kDa蛋白。与萤火虫荧光素酶相比，海肾荧光素酶的底物和辅因子要求不同。海肾荧光素酶在氧气存在下使用腔肠素，产生480 nm的蓝光。与萤火虫萤光素酶类似，海肾萤光素酶因其底物要求和光输出方面的差异而可用于双重报告检测。 Amplite?海肾荧光素酶报告基因测定 Amplite?Renilla萤光素酶报告基因检测试剂盒提供了一种快速，灵敏的方法，可以使用专有的发光配方在基于细胞的检测中检海肾萤光素酶的活性，与海肾萤光素酶相互作用后，该试剂产生具有强光的产物。 Amplite?海肾荧光素酶报告基因检测试剂盒特点： 该测定法与标准细胞生长培养基兼容 该试剂盒可以测量野生型和合成hRluc基因的原始表达或基因表达 每个试剂盒均包含可以方便96孔和384孔板检测所必不可少的组分 各类萤光素酶底物，辅因子和物理特性：
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