大肠杆菌实验

大肠杆菌感受态细胞制备与质粒DNA的转化

一、实验目的

1）掌握用CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。

2）学习和掌握质粒DNA的转化和筛选方法及操作步骤。

二、实验原理

本实验以E.coli DH 5α菌株为受体细胞，并用CaCl2处理，使其处于感受态，然后与pBS质粒共保温实现转化。由于所用pBS质粒带有长那霉素抗性基因。因此可以通过长那霉素抗性来筛选转化子。如果受体细胞没有转入pBS，则在含长那霉素的培养基上不能生长。能在长那霉素培养基上生长的受体细胞肯定已经导入了pBS。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳酶切等进一步鉴定。

三、仪器及试剂

仪器：恒温摇床、CO2细胞培养箱、台式高速冷冻离心机、超净工作台、低温冰箱、恒温水浴锅、制冰机、分光光度计、移液枪、Eppendrof管。

试剂：LB培养基(在950mL水中加入10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10gNaCl、用1mol/L NaOH调制pH=7.2.加入至1L，121℃高压灭菌20min)

长那霉素储存液：100mg/mL

含长那霉素的LB固体培养基：(1L LB液体培养基中加入20g琼脂粉，将配好的LB固体培养基高压灭菌后，冷却至60℃左右，加入长那霉素储存液，使其终浓度为50μg/mL。摇匀后铺板，每皿倒15mL，室温放置过夜至冷凝水挥发干净)

1mol/L CaCl2储存液质粒DNA10ng/Μl

四、实验步骤

1 感受态细胞的制备

1）从LB平板上挑选新活化的E.coli DH 5α单菌株，接种于3~5mL LB液体培养基中，37℃下震荡过夜培养，12h左右，直至对数生长后期。

2）将该菌悬浮液以1:50的比例接种于5mL LB液体培养基中，37℃振荡培养2~3h至OD600为0.5左右。

3）将5mL培养液转入4个1.5mL离心管中，冰上放置10min，然后于4℃下，5000rpm离心5min。

4）弃去上清液，用预冷的1mL 0.1 mol/L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置15~20min后，40℃下5000rpm离心5min。

2 铺平板

将配好灭菌的LB固体培养基加热融化，待冷却至60℃左右后，加入长那霉素储存液，使其终温度为50μg/mL，摇匀后铺板，每皿倒约15mL。室温放置过夜至冷凝水挥发干净。

3 感受态细胞的转化

1）取100μl感受态细胞悬浮液，加入5μLpBS质粒DNA溶液，轻轻摇匀，冰上放置30min。

2）42℃水浴热激70s，热激后迅速置于冰上冷却3~5min。

3）向管中加入400μl LB液体培养基（不含抗生素），混匀后37℃震荡培养1h。使细菌恢复到正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。

4）将上述菌液摇匀，取200μl涂布于含长那霉素的筛选平板上，正面放置0.5h。待菌液完全被吸收后倒置培养皿，37℃培养16~24h，

5）对照实验：

对照组1：以同体积的无菌二次水代替DNA溶液，其他操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。

对照组2：以同体积的无菌二次水代替DNA溶液，取5μl菌液，稀释100万倍，涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。

五、实验数据记录处理

转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，各培养皿中的菌落数如下表所示：

平板序号DNA溶液无菌水抗生素稀释倍数菌落数

1+—+134

2+—+144

3—++10

4—+—1*106145

表 1 各平板数据记录

① 转化子总数=菌落数*稀释倍数*转化反应原液总体积/涂板菌液总体积

1号平板：转化子总数=34*1*505/200=86

2号平板：转化子总数=44*1*505/200=111

② 转化频率（转化子数/每毫DNA）=转化子总数/质粒DNA加入量(mg)

1号平板：转化频率=86/(50*10-6)=1.72*106

2号平板：转化频率=111/(50*10-6)=2.22*106

③ 感受态细胞总数=对照组2的菌落数*稀释倍数*菌液总体积/涂板菌液体积

4号平板：感受态细胞总数=145*106*505/200=3.66*108

④ 感受态细胞转化效率=转化子总数/感受态细胞总数

对1号平板：感受态细胞转化效率=86/(3.66*108)*100%=2.35*10-5%

对2号平板：感受态细胞转化效率=111/(3.66*108)*100%=3.03*10-5%

3号平板上没有菌落生成，说明未转化的细胞在有抗生素的环境中完全不能生存。

六、思考题讨论

1）感受态细胞：细菌收诱导后产生的一种短暂的、易于摄取外源DNA的状态。2）CaCl2法制备感受态细胞的原理：细菌处于0℃的CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基钙磷酸复合物黏附于细胞表面，在经42℃短时间热休克处理，可制备成感受态细胞，促进细胞吸收DNA复合物。

3）制备感受态和转化细胞时注意事项（提高效率方法）：倒平板时应避免培养基温度过高，否则加入的抗生素会失效；OD600值需合适，即细菌应处于对数前期，对数中期；热激时间，热激温度需合适，且热激前加入相当于转化液体积1/10的DMSO可提高效率100倍左右，加入DMSO后不要剧烈振荡；实验过程中需

保证无菌操作、避免引入杂菌；涂板时应小心，防止细胞死亡。

实验1 大肠杆菌的培养与分离

实验1：大肠杆菌的培养和分离 一、教学要求 二、基本内容 培养 无菌技配制培养基的原 的培养基的配制计算→称量→溶化→调pH 实配制培养基的方法→分装→加棉塞→灭菌→倒验平板 室平板划线法培分离、纯化大肠杆菌 养稀释涂布法系列稀释平板涂布 1．培养基的种类和化学成份 培养基的种类有很多划分标准，按物理性质分：固体培养基和液体培养基（加入琼脂多少）。液体培养基用于扩大培养和工业生产，固体培养基用于菌种分离，鉴定，计数（菌落数量）。 培养基的化学成分包括水、无机盐、碳源、氮源、生长因子等。按照微生物的同化作用类型是自养还是异养，碳源不同，自养微生物为无机碳源，如硝化细菌是二氧化碳或碳酸盐，异养微生物为有机碳源，如大肠杆菌是葡萄糖等有机物。 2．常见微生物类群 原核生物（如细菌大肠杆菌――二分裂、革兰氏阴性、异养兼性厌氧性肠道杆菌、蓝藻、支原体、衣原体、放线菌等）、原生生物（草履虫、变形虫等）、真菌（酵母菌――出芽生殖.异养兼性厌氧性微生物、霉菌、食用菌）、病毒等。 细菌是单细胞的原核生物，有细胞壁（肽聚糖）、细胞膜、细胞质，无成型的细胞核，只有一环状DNA分子（拟核）。以分裂（二分裂）的方式繁殖，分裂速度很快。用革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性菌（革兰氏染液染色后，再脱色处理，细菌仍保留染色液的颜色）和革兰氏阴性菌两大类，区别在细胞壁的成分不同。大肠杆菌是革兰氏阴性（细胞壁薄，有荚膜）、兼性厌氧的肠道杆菌。 3．无菌技术 对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌；为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰附近旁进行；避免已灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。 灭菌方法： 。灼烧灭菌法①接种环、接种针、试管口等使用

实验室常用菌株及特性

一、实验室常见菌株简介 Xl1-Blue菌株 基因型：endA1 gyrA96(nalR) thi-1 recA1 relA1 lac glnV44 F?[Tn10 proAB+ lacIq Δ(lacZ)M15] hsdR17(rK- mK+)。 特点：具有卡那抗性、四环素抗性和氯霉素抗性。 用途：分子克隆和质粒提取。 BL21(DE3)菌株 基因型：F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5])。 特点：该菌株用于以T7 RNA聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主。T7噬菌体RNA聚合酶基因的表达受控于λ噬菌体DE3区的lacUV5启动子，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合于非毒性蛋白的表达。 用途：蛋白质表达。 BL21(DE3)ply菌株 基因型：F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3) pLysS(cm R)。 特点：该菌株带有pLysS，具有氯霉素抗性。此质粒还有表达T7溶菌酶的基因，T7溶菌酶能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰IPTG诱导的表达。适合于毒性蛋白和非毒性蛋白的表达。 用途：蛋白质表达 DH5α菌株 基因型：F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG Φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK-, λ– 特点：一种常用于质粒克隆的菌株。其Φ80dlacZΔM15基因的表达产物与pUC 载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α互补，可用于蓝白斑筛选。recA1和endA1的突变有利于克隆DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。 用途：分子克隆、质粒提取和蛋白质表达。 JM109菌株 基因型：endA1 glnV44 thi-1 relA1 gyrA96 recA1 mcrB+ Δ(lac-proAB) e14- [F? traD36 proAB+ lacIq lacZΔM15]hsdR17(rK-mK+)。 特点：部分抗性缺陷，适合重复基因表达, 可用于M13克隆序列测定和蓝白斑 筛选。 用途：分子克隆、质粒提取和蛋白质表达。 DH10B菌株 基因型： F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 endA1 recA1 deoR Δ(ara,leu)7697 araD139 galU galK nupG rpsL λ- The most widely used E. coli strain for BAC cloning is DH10B 。 host for pUC and other α-complementation vectors; pBR322

大肠杆菌实验

大肠杆菌感受态细胞制备与质粒DNA的转化 一、实验目的 1）掌握用CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。 2）学习和掌握质粒DNA的转化和筛选方法及操作步骤。 二、实验原理 本实验以E.coli DH 5α菌株为受体细胞，并用CaCl2处理，使其处于感受态，然后与pBS质粒共保温实现转化。由于所用pBS质粒带有长那霉素抗性基因。因此可以通过长那霉素抗性来筛选转化子。如果受体细胞没有转入pBS，则在含长那霉素的培养基上不能生长。能在长那霉素培养基上生长的受体细胞肯定已经导入了pBS。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳酶切等进一步鉴定。 三、仪器及试剂 仪器：恒温摇床、CO2细胞培养箱、台式高速冷冻离心机、超净工作台、低温冰箱、恒温水浴锅、制冰机、分光光度计、移液枪、Eppendrof管。 试剂：LB培养基(在950mL水中加入10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10gNaCl、用1mol/L NaOH调制pH=7.2.加入至1L，121℃高压灭菌20min) 长那霉素储存液：100mg/mL 含长那霉素的LB固体培养基：(1L LB液体培养基中加入20g琼脂粉，将配好的LB固体培养基高压灭菌后，冷却至60℃左右，加入长那霉素储存液，使其终浓度为50μg/mL。摇匀后铺板，每皿倒15mL，室温放置过夜至冷凝水挥发干净) 1mol/L CaCl2储存液质粒DNA10ng/Μl 四、实验步骤 1 感受态细胞的制备 1）从LB平板上挑选新活化的E.coli DH 5α单菌株，接种于3~5mL LB液体培养基中，37℃下震荡过夜培养，12h左右，直至对数生长后期。

2）将该菌悬浮液以1:50的比例接种于5mL LB液体培养基中，37℃振荡培养2~3h至OD600为0.5左右。 3）将5mL培养液转入4个1.5mL离心管中，冰上放置10min，然后于4℃下，5000rpm离心5min。 4）弃去上清液，用预冷的1mL 0.1 mol/L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置15~20min后，40℃下5000rpm离心5min。 2 铺平板 将配好灭菌的LB固体培养基加热融化，待冷却至60℃左右后，加入长那霉素储存液，使其终温度为50μg/mL，摇匀后铺板，每皿倒约15mL。室温放置过夜至冷凝水挥发干净。 3 感受态细胞的转化 1）取100μl感受态细胞悬浮液，加入5μLpBS质粒DNA溶液，轻轻摇匀，冰上放置30min。 2）42℃水浴热激70s，热激后迅速置于冰上冷却3~5min。 3）向管中加入400μl LB液体培养基（不含抗生素），混匀后37℃震荡培养1h。使细菌恢复到正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。 4）将上述菌液摇匀，取200μl涂布于含长那霉素的筛选平板上，正面放置0.5h。待菌液完全被吸收后倒置培养皿，37℃培养16~24h， 5）对照实验： 对照组1：以同体积的无菌二次水代替DNA溶液，其他操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。 对照组2：以同体积的无菌二次水代替DNA溶液，取5μl菌液，稀释100万倍，涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。 五、实验数据记录处理 转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，各培养皿中的菌落数如下表所示：

生物统计学 实验报告 大肠杆菌

A 题 细胞体内代谢物浓度预测 随着基因组、转录组、蛋白质组等各种“组学”研究计划的蓬勃开展，生命科学进入了“组学”时代。代谢组学作为系统生物学的重要分支，其研究的重点是细胞内代谢物种类与浓度的定性和定量分析以及代谢网络的构建和模拟。 对代谢物的检测及浓度测定主要采用实验方法，包括核磁共振、气相色谱-质谱联用和液相色谱-质谱联用等技术。但由于代谢物种类繁多，且大部分浓度较低（μM 数量级），尤其是胞内代谢物提取难度非常大，精确测定其浓度异常困难，而且实验测定需要消耗大量财力物力和人力，因此通过计算机方法对代谢物浓度预测和分析变得越来越重要。 活细胞的代谢物浓度由什么决定？除了一些特定的代谢和酶的作用以外，有没有那种能全局影响浓度值的性质？ 试根据附件中的数据完成如下问题： 1 根据不同类型的数据，分析代谢物浓度与其物理化学性质之间的关系。 2 筛选合适的物理化学性质，建立预测代谢物浓度的预测模型，并对此模型进行评价; 1.线性插补法处理缺失数据 原理：用该列数据缺失值前一个数据和后一个数据建立线性插值，然后用缺失点在线性插值函数的函数值填充该缺失值，即： 在于消除不同变量的量纲的影响，而且标准化转化不会改变变量的相关系数。 代谢物浓度：取对数 代谢物理化性质：标准差标准化法 )1,1( m j n i S x x x j j ij ij ≤≤≤≤-=' 式中：.)(11,1121∑∑==--= =n i j ij j n i ij j x x n S x n x 3.SAS 软件建立多元线性回归方程 回归模型一般形式： u X b X b X b b Y k k +++++= (22110)

实验1-大肠杆菌的培养与分离

实验1大肠杆菌的培养和分离 、教学要求 、基本内容 1培养基的种类和化学成份 培养基的种类有很多划分标准，按物理性质分：固体培养基和液体培养基（加入琼脂多少）。液体培养基用于扩大培养和工业生产，固体培养基用于菌种分离，鉴定，计数（菌落数量）。 培养基的化学成分包括水、无机盐、碳源、氮源、生长因子等。按照微生物的同化作用类型是自养还是异养，碳源不同，自养微生物为无机碳源，如硝化细菌是二氧化碳或碳酸盐，异养微生物为有机碳源，如大肠杆菌是葡萄糖等有机物。 2 ?常见微生物类群 原核生物（如细菌大肠杆菌一一二分裂、革兰氏阴性、异养兼性厌氧性肠道杆菌、蓝藻、支原体、衣原体、放线菌等）、原生生物（草履虫、变形虫等）、真菌（酵母菌——出芽生殖. 异养兼性厌氧性微生物、霉菌、食用菌）、病毒等。 细菌是单细胞的原核生物，有细胞壁（肽聚糖）、细胞膜、细胞质，无成型的细胞核， 只有一环状DNA分子（拟核）。以分裂（二分裂）的方式繁殖，分裂速度很快。用革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性菌（革兰氏染液染色后，再脱色处理，细菌仍保留染色液的颜色）和革兰氏阴性菌两大类，区别在细胞壁的成分不同。大肠杆菌是革兰氏阴性（细胞壁薄，有 荚膜）、兼性厌氧的肠道杆菌。 3 ?无菌技术 对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌；为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰附近旁进行；避免已灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。 ①接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法。

②玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法，所用器械是干热灭菌箱。 ③培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅。 ④表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯。 4 ?培养基的配制原则 目的要明确：根据培养的微生物种类、培养的目的等确定培养基的类型和配制量。 营养要协调：培养基中各种营养物质的浓度和比例要适宜。 pH要适宜：细菌培养基pH中性或偏碱性，霉菌培养基呈酸性。 5.实验操作步骤 （1）配制培养基：计算T称量T溶化T调pH T分装T加棉塞T火菌T倒平板（形成斜面是为增大接种面积）。 我们一般用LB液体培养基来扩大培养大肠杆菌，培养后可在LB固体培养基上划线分 离。以下为本实验中培养基配置步骤： ①称量：准确称取各成分。蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化钠0.5g，加水50ml。配置LB 固体培养基时还需加1g琼脂。 ②溶化：加热熔化，用蒸馏水定容到50mL。配置LB固体培养基时还需加琼脂，整个 过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。 ③调pH :用1mol/L NaOH溶液调节pH至偏碱性。 ④灭菌：在两个250ml的三角瓶中分别装入50ml LB液体培养基和50ml LB固体培养 基，加上棉塞。将培养皿用牛皮纸包好，放入灭菌锅内，1kg压力灭菌15min。 ⑤倒平板：灭菌后，待固体培养基冷却至60C左右时在酒精灯火焰附近操作进行。其 过程是：①将灭过菌的培养皿放在火焰旁，右手拿装有培养基的三角瓶，左手拔出棉塞；② 右手拿三角瓶，使三角瓶的瓶口迅速通过火焰；③用左手将培养皿打开一条稍大于三角瓶口 的缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖；④待平板冷却凝固后，将平板倒过来放 置。 倒过来放置的目的是防止培养基冷却过程中形成的水滴落到培养基表面。向培养皿中转 移已灭菌的培养基时，也不要把培养基沾在皿壁上。否则，空气中杂菌会在这些粘附培养基 上繁殖，并污染皿内培养基。 （2）接种 微生物接种的最常用方法是平板划线法和稀释涂布法。 平板划线法（方法简单，考试的主要考查点）：通过接种环在琼脂固体培养基表面连 续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面（也是分离纯化的方法）。在第一 次划线后都从上次划线末端开始的目的是获得由单个细菌形成的标准菌落。 稀释涂布平板法（操作复杂，单菌落更易分开）：将菌液进行一系列梯度稀释，并将 不同稀释度菌液分别涂布到琼脂固体培养基上进行培养。当稀释倍数足够高时，即可获得单 个细菌形成的标准菌落。 1 ?划线分离法：用接种环蘸菌液后在含有固体培养基的培养皿平板上划线，在划线过程中菌液逐渐减少，细菌也逐渐减少。划线到最后，可使细菌间的距离加大。在培养10? 20h后，可由一个细菌产生单菌落，菌落不会重叠。如果再将每个菌落分别接种至含有固体培养基的试管斜面上，在斜面上划线，则每个斜面的菌群就是由一个细菌产生的后代。 其操作步骤是：将培养皿底部用拇指和无名指固定成倾斜状态，在火焰旁将培养皿稍微 打开。在此同时，用环状接种针在火焰旁取少许菌悬液，迅速送入培养皿内，在平板培养基 的一边，作第1次平行划线3?5条，转动培养皿约70°角，用烧过冷却的接种针，通过第 1次划线部分作第2次平行划线，然后再用同样方法，通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线。 划线时，接种针应与平板表面成30°角左右。不要使接种针碰到培养皿边缘，也不要将

大肠杆菌生化实验

细菌常用生理生化反应实验结果观察 一结果观察 １葡萄糖发酵实验 直接观察试管, 试管变黄者为葡萄糖发酵阳性菌,不变者为阴性菌. 左边为恶臭假单胞菌，有气泡并变为黄色；右边为大肠杆菌, ２V. P. 反应和甲基红试验: 将培养好的液体培养基分装于两个干净的小试管中,在一管中滴入2-3滴甲基红试剂, 溶液变红的为甲基红阳性菌,不变的为甲基红阴性菌. 在另一管中加入V. P. 试剂,在37℃保温15分钟, 变红者为阳性菌,不变者为阴性菌. VP，图为右边为大肠杆菌，溶液变红，为阳性菌。 ３吲哚实验 在培养好的液体培养基中加入1厘米高的乙醚,振荡,静置分层,加入2-4滴吲哚试剂,在掖面交界出现红色者为吲哚反应阳性菌,不变者为阴性菌.

左边为大肠杆菌，出现红色阳性菌；右边为产气杆菌，颜色不变，阴 性菌。 ４硝酸盐还原实验 在点滴板上滴入革里斯试剂A液和B液，如过溶液变红说明有亚硝酸盐，为硝酸盐还原阳性菌，如果不变色需要再倒出部分培养基在另外的小孔中再滴如耳苯胺试剂，如果变蓝，说明此菌为阴性菌；如果不变色，说明此菌为硝酸盐还原强阳性菌． 右下方恶臭假单胞菌，加入革里斯试剂A、B后不变色，再加入二苯 胺试剂后变蓝，为阴性菌；左上方大肠杆菌为红色。 ５柠檬酸盐实验 直接观察斜面，斜面变兰色者为柠檬酸盐利用阳性菌，不变者为阴性菌．

左边产生蓝色，产气杆菌阳性；右边为大肠杆菌，阴性。 ６明胶水解 向培养好的明胶培养基中加入酸性氯化汞或三氯乙酸溶液，并铺满平板，菌落周围出现透明圈的菌为明胶水解阳性菌，没有透明圈的菌为阴性菌． 左边为大肠杆菌，出现透明圈，阳性；右边为枯草杆菌，阴性菌。 7 淀粉水解实验 向培养好的淀粉培养基平板上加入碘液，并铺满平板，菌落周围出现透明圈的菌为淀粉水解阳性菌，没有透明圈的菌为阴性菌．

大肠杆菌微生物培养实验报告及评价标准

实验1 微生物的分离、培养及计数 实验原理 纯化分离：人为提供适宜的菌落生长的条件（包括营养、温度、Ph等）。用平板划线法，通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞菌落。 筛选：转基因大肠杆菌有抗氨苄青霉素基因，所以在含有氨苄青霉素的LB培养基中可以正常繁殖长成菌落。而普通的大肠杆菌没有抗氨苄青霉素基因，咋含有氨苄青霉素的LB培养基中不能繁殖。由此可进行大肠杆菌的筛选。 梯度稀释并计数：通过浓度梯度稀释把液体培养基培养的大肠杆菌稀释到一定浓度，用稀释涂布平板法，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。由此可计数计算大肠杆菌的数量。 实验目的 1.通过制备LB固体培养基，对平板进行划线等，学会使用固体LB 平板。 2.通过用液体培养基，学会对微生物进行扩大培养。 3.通过稀释，学会用计数器对微生物进行计数。

实验材料和药品 待分离的大肠杆菌菌液、高压蒸汽灭菌锅、LB 固体培养基、LB 液体培养基、接种环、玻璃涂布器、培养皿、恒温培养箱、摇床、酒精灯、无菌水、移液枪、EP 管 实验步骤（用简单的流程图表示） 实验数据的记录与分析（如照片、表格等）

稀释倍数104105 大肠杆菌单个菌落个 837799111812数 平均数 浓度×107×107 实验结果与讨论 结果：稀释了105计算出来的结果约为×107ml/cm^3

大肠杆菌的培养

大肠杆菌种子液的制备 牛肉膏蛋白胨培养基的配方： 液体培养基 牛肉膏 3.0g 蛋白胨 10.0g 氯化钠 5.0g 水 1000ml pH 固体培养基在液体培养基的基础上再加入％－％的琼脂1 试管斜面与平板的制备 （1）称量按培养基配方比例依次准确称取蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、琼脂、水放入烧杯中。 （2）熔化在上述烧杯中先加入少于所需要量的水，用玻璃棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，药品完全溶解后， 补充水到所需的总体积。将称量好的％琼脂放入已溶的药 品中，再加热熔化，最后补充所损失的水分。 （3）调PH 在未调PH前，先用精密PH试纸测量培养基的原始PH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH, 边加边搅拌，并随时用PH试纸测基PH直到PH达到。反之 用1mol/L HCl进行调节。 （4）分装将培养基分装入三个试管中和三角烧瓶中。其试管装量不超过管高的1/5，三角烧瓶的量不超过1/2加塞培 养基分装完毕后，在试管口和三角烧瓶口上塞上棉塞。

（5）包扎加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名 称、配制日期。 （6）灭菌将上述培养基以,121℃,15min高压蒸气灭菌。 （7）倒平板，取三个已消毒的培养皿，在无菌操作台上用三角烧瓶中的培养基倒制三个平板培养基，冷却。 （8）搁置斜面将灭菌的试管培养基冷却至50℃左右，将试管口端搁在玻璃棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的 一半为宜。 2 接种大肠杆菌斜面种子 (1) 取实验室储备的大肠杆菌BL21种子，在酒精灯附近， 用接种环在已制备好的斜面上接种上大肠杆菌。 (2) 将接种好的斜面放入37℃的恒温培养箱子中培养24h。 3 制备平板种子 (1) 在无菌条件下，取一支保存的大肠杆菌的斜面，用无菌 生理盐水将菌种冲洗下来，再用无菌生理盐水将其梯度 稀释为1倍，10倍，100倍和1000倍，用移液枪分别吸 取各梯度的溶液涂布平板(每个梯度涂布三个平板，每次 吸取溶液100ul)，然后在37℃培养箱中过夜。 （12）次日，挑取生长状态好，特征明显的单个菌落，接种于新鲜灭菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基中37℃，170r/min 恒温振荡培养18h作种子培养液。

大肠杆菌

大肠杆菌的培养和分离 ——基础知识和操作过程梳理一、大肠杆菌 细菌是单细胞的原核生物。细菌细胞的结构有细胞壁、细胞膜、细胞质等。细菌无成型的细胞核，细胞壁由肽聚糖组成。由于细菌细胞壁结构不同，细菌可分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两类。革兰氏阳性菌细胞壁厚，无荚膜，多产生外毒素；革兰氏阴性菌细胞壁薄，有荚膜，多产生内毒素。革兰氏阳性菌对青霉素更为敏感。 大肠杆菌是革兰氏阴性、异养兼性厌氧型肠道杆菌。在肠道中一般对人无害，但任何大肠杆菌进入人的泌尿系统，都会对人体产生危害。大肠杆菌在基因工程技术中被广泛的应用，它的质粒是最常用的运载体，它也是基因工程中常用的受体细胞。 二、培养基配置 微生物生命活动过程中需要的化合物有碳源、氮源、生长因子、无机盐和水。有的化合物既是碳源又是氮源、能源。生长因子是微生物生长不可缺少的微量有机物，但不一定需要外界补充，有的微生物可以自身合成。在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。 我们一般用LB液体培养基来扩大培养大肠杆菌，培养后可在LB固体培养基上划线分离。以下为本实验中培养基配置步骤： 1．称量：准确称取各成分。蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化钠0.5g，加水50ml。配置LB固体培养基时还需加1g琼脂。 2．溶化：加热熔化，用蒸馏水定容到50mL。配置LB固体培养基时还需加琼脂，整个过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。 3．调pH：用1mol/L NaOH溶液调节pH至偏碱性。 4．灭菌：在两个250ml的三角瓶中分别装入50ml LB液体培养基和50ml LB固体培养基，加上棉塞。将培养皿用牛皮纸包好，放入灭菌锅内，1kg压力灭菌15min。

实验室常用的细菌作用及其选择

第一篇：JM109，DH5a，BL21这些感受态有何区别 1：DH5a菌株 DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。 基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1 2：BL21(DE3) 菌株 该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT， hsdS（rBB-mB－），gal， dcm（DE3） 3：BL21(DE3) pLysS菌株 该菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT hsdS（rBB-mB－），gal， dcm（DE3，pLysS ，Camr 4：JM109菌株 该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α－互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株 基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac －proAB）/F’[traD36，proAB+，lacIq，lacZΔM15] 5：TOP10菌株 该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。 基因型：F- ，mcrAΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC)，φ80 ，lacZΔM15，△lacⅩ74，recA1 ，araΔ139Δ(ara-leu)7697， galU ，galK ，rps， (Strr) endA1， nupG 6：HB101菌株 该菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验

大肠杆菌实验报告

大肠杆菌紫外线诱变及抗药性菌株筛选 0740063 阿噟兰 1.前言 抗生素能破坏细菌细胞壁的结构，使细菌的繁殖和生长受到抑制。但某些细菌对抗生素表现出抗性，原因是其基因发生了改变，产生能抵抗抗生素的性状。在自然情况下，细菌的基因突变率很低，而且突变是不定向的，因此在自然条件下，想要获得有抗性的细菌是很困难的。当给与适当的物理条件时，其突变率会大大增加。如当用α射线、β射线、γ射线、Χ射线、中子和其他粒子、紫外线、微波等物理因素辐射时，能够促进遗传物质突变。DNA 对紫外线（UV）有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。紫外线引起DNA 结构变化的形式有DNA 链断裂、碱基破坏、胸腺嘧啶二聚体等。因此，紫外线通常作为诱变剂，用于微生物菌种选育。一般细胞分裂越旺盛，诱变剂量越大，突变率高，诱变最有效的波长253~265 nm。选择合适的诱变剂量对于获得较高突变率十分关键，过高或过低的辐射剂量会导致菌株死亡或诱变不充分而降低诱变效果。 在紫外线诱变下，菌株发生不定向的突变，想要得到需要的特向变异必须对诱变后的菌株做筛选。本实验想要得到的是能够抵抗抗生素的菌株，因此可以用抗生素培养基作为筛选培养基对菌种进行筛选。若菌株没有发生定向突变，则该菌株不能在抗性培养基上正常生长，只有发生了定向突变才可能在筛选培养基上正常生长。 紫外线对于菌株有诱变作用外，对菌株还有较强的致死作用，因为紫外线改变了菌株的基因结构导致菌株无法正常生长繁殖。 因此，通过本实验的操作，在合适的照射剂量的设置下，比较不同不同照射剂量下的致死效果和突变率，并初步分析两者的相关性。在分析死亡曲线和诱变率曲线的基础上，能了解诱变育种的机理和方法，为做进一步的诱变实验做准备。 2.材料和方法 实验材料、仪器和试剂 菌种：大肠杆菌 仪器：超净台、离心机、高压灭菌锅、培养箱、磁力搅拌器、培养皿、涂布器、移液管、移液器 试剂：牛肉膏蛋白胨培养基相关试剂、硫酸卡那霉素水溶液（50mg/ml）、生理盐水 实验方法 2.2.1制备培养基 普通培养基——牛肉膏蛋白胨培养基（400ml）： 牛肉膏5g 蛋白胨10g Nacl 5g 琼脂20g 蒸馏水1000ml 按配方配制好培养基后置于灭菌锅中115℃15min，倒平板，4皿*15ml*5组+2皿*15ml=22皿*15ml=330ml 筛选培养基(200ml)：含抗生素50mg/L。（卡那霉素属于氨基糖苷类抗生素，能结合细菌核糖体的30S亚基上的16SrRNA，阻断细菌蛋白质的合成。） 牛肉膏5g 蛋白胨10g Nacl 5g 琼脂20g 蒸馏水1000ml 硫酸卡那霉素水溶液（50mg/ml），按配方先不要加硫酸卡那霉素配制然后115℃15min灭菌，取出培养基后冷却至60℃时将硫酸卡那霉素加入培养基中，充分震荡混匀，倒平板，2皿*15ml*5组+2皿*15ml=12皿*15ml=180ml 2.2.2制备菌悬液（106 ~ 108个/mL） ①固体培养：大肠杆菌划线或涂布接种于固体培养基，37℃培养24-48h。 ②菌悬液：用适量生理盐水刮洗菌落，倒入一个无菌小三角瓶（或试管）中，充分振荡使菌

任务一大肠杆菌病实验室诊断所需培养基的制备实训指导.

任务一大肠杆菌病的实验室诊断所需培养基的制备 实训指导 实训目标熟悉培养基制备的基本程序，会制备常用的培养基，会测定并矫正培养基的pH 。 仪器及材料高压蒸气灭菌器、电热干燥箱、电炉、天平、量筒、烧杯、玻棒、胶头滴管、试管、培养皿、营养琼脂、伊红美兰琼脂、麦康凯琼脂、SS 琼脂、三糖铁琼脂，蒸馏水等 方法与步骤培养基制备的基本程序配料→溶化→测定及矫正pH →过滤→分装→灭菌→冷却→无菌检验→冷藏备用。 一、营养琼脂平板的制备 1. 配料参照营养琼脂瓶上的说明书，跟据所需制备的营养琼脂平板个数，按照15~20mL/平板的量计算出所需营养琼脂和蒸馏水的量，称取营养琼脂粉加入适量蒸馏水中。 2. 溶化在电炉上煮沸，边加热边用玻璃棒搅拌，使营养琼脂粉完全溶解于蒸馏水中。 3. 分装将融化好的培养基分装于玻璃平皿中（15~20mL/个），使培养基覆盖整个平皿底部，平皿内培养基厚度为2~3mm。 4. 灭菌将装有培养基的平皿放到高压锅中，采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌，灭菌条件为121℃灭菌15min。 5. 冷却凝固凝固点大约在40℃。 6. 无菌检验把制备好的培养基倒置于37 ℃恒温培养箱培养18~24h，观察培养基内是否有菌生长。若无菌生长，则为合格培养基。若有菌生长，则培养基不合格。 7. 冷藏备用置4℃冰箱内冷藏保存备用。 此培养基可供一般细菌的分离培养、纯培养，观察菌落特征及保存菌种等，也可作特殊培养基的基础。

二、伊红美兰琼脂平板和麦糠凯琼脂平板的制备 参照营养琼脂平板的制备步骤和包装瓶上的说明书制作。 此培养基为鉴别培养基，常用于肠杆菌科细菌的分离培养。 三、SS琼脂平板的制备 此培养基为选择培养基，成分中含有胆盐，制备时无需灭菌处理，其他步骤参照营养琼脂平板的制备方法。 四、三糖铁试管斜面 主要步骤参照营养琼脂平板的制备方法。区别主要有两点，一是按照5mL/支的量将融化好的培养基分装于试管中，倒入的培养基约占试管高度1/3。二是在冷却凝固时将试管摆成斜面放置。 注：本实验所用琼脂为商品化配方琼脂粉，不需要测定矫正pH和过滤。

生物化学实验报告记录：Westernblotting检测大肠杆菌重组蛋白

生物化学实验报告记录：Westernblotting检测大肠杆菌重组蛋白

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实验三 Western blotting检测大肠杆菌重组蛋白 一、实验目的 利用Western Blotting技术，定性（或定量）检测苦荞黄酮醇合酶基因（Flavon ol synthase gene, FtFLS）在大肠杆菌表达宿主菌Escherichia coli BL(DE3)中的诱导表达。 二、实验原理 黄酮醇合酶（FLS，EC 1.14.11.23）属于2-ODD家族，催化黄酮醇合成支路中最后一步氧化反应，也是直接合成黄酮醇的反应。FLS可以使二氢黄酮醇在C3链中C2和C3之间氧化形成双键，从而生成黄酮醇：a Dihydroflavonol + 2-oxoglutarate + O2 a Flavonol + succinate + CO2 + H2O。 本实验采用PCR的方法，在苦荞黄酮醇合酶基因（FtFLS）ORF起始密码子前引入Kpn?酶切位点，去掉终止密码并引入Bam H ?酶切位点。克隆引入酶切位点后的FtFLS到表达载体pET-30b(+)质粒中，其表达产物分别在N-末端和C-末端各含有6 ×His标签。重组质粒（pET-30b(+)-FtFLS）经鉴定后转化表达宿主菌E. coli BL21(DE3)并使用IPTG进行诱导表达。收集诱导0 h、2 h、4 h、6 h和8 h的产物，经SDS-PAGE后用于考马斯亮蓝R-250染色或Western blotting分析。 Western blotting的标准流程如下：蛋白质首先通过SDS-PAGE胺凝胶电泳分离，通过电泳转移到固相支持物上（硝酸纤维素膜、PVDF膜和尼龙膜）；将膜上未反应的位点封闭起来，以抑制抗体的非特异性吸附，固定的蛋白质即可与特异性的多克隆或单克隆抗体相互作用并通过放射、生色或化学发光的方法进行定位。 本实验采用小鼠抗聚组氨酸单克隆抗体（Anti-His tag IgG，一抗）与重组FtF LS蛋白的N-末端和C-末端6 ×His发生抗原-抗体特异反应，再利用辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG（peroxidase-Goat Anti- Mouse IgG，二抗）与一抗发生特异结合，最后使用DAB进行显色。DAB即：二氨基联苯胺（3, 3'-diaminobenzidine），是过氧化物酶（Peroxidase）的生色底物。DAB在过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化和积累，形成浅棕色不溶性产物。该方法常用于检测过氧化物酶的活性，它灵敏度高，特异性好，在免疫组化，原位杂交，Western blotting等膜显色中

鸡大肠杆菌

夏季鸡大肠杆菌的防治 1.临床症状主要表现为采食减少，甚至废绝，精神沉郁呆立，两翅下垂，闭眼缩颈，拉黄白色稀粪，粘在肛门周围。有的甚至出现了瘫痪和一些较轻微的神经症状。 2 剖检变化打开胸腹腔可见气囊壁混浊、增厚，有黄白色干酪样渗出物附着；心包膜增厚，附着有大量渗出物，心包膜和胸腔黏连；肝肿大，表面有淡黄色纤维蛋白膜附着；腹腔内有许多纤维素性渗出物，肠系膜黏连。 3.诊断根据临床症状、剖检变化和实验室检查结果，最后确诊为大肠杆菌病。解剖图片：

大肠杆菌病 疾病概述： 禽大肠杆菌病是由埃希氏大肠杆菌引起的多种病的总称，包括大肠杆菌性肉芽肿、腹膜炎、输卵管炎、脐炎、滑膜炎、气囊炎、眼炎、卵黄性腹膜炎等疾病，对养禽业危害严重。 1、病原 大肠杆菌为革兰氏阴性菌、不形成芽胞，有鞭毛，有的菌株可形成荚膜。在普通培养基中生长良好，菌落不透明、光滑、有光泽，有的菌落带有粘稠性。有的菌株在血液琼脂上表现有溶血性。 与禽类有关的大肠埃希氏菌属最常见的致病性血清型以Ｏ群为主，在母鸡卵黄性腹膜炎中经常可以分离到多种血清型，这些血清型对其它动物致病性不大

2、流行病学： 在各种禽类中，以鸡、鸭、鸡和火鸡等较为易感。各种年龄的鸡均可感染，其发病率与死亡率因受各种因素影响而有差异。大肠杆菌在饲料、饮水、鸡的体表、孵化场、孵化器等各处普遍存在，其中种蛋表面、鸡蛋内、孵化过程中的死胚及在蛋中分离率较高。 本病在雏鸡阶段、育成期和成年产蛋鸡均可发生，雏鸡呈急性败血症经过，大鸡则以亚急性或慢性感染为主。若混有其它病原体或应激因素的影响使其感染更为严重。在青年鸡与成年鸡，大肠杆菌病经常与其它病(如传染性支气管炎、新城疫、慢性呼吸道病、传染性鼻炎、输卵管炎或眼球炎)并发。 本病主要通过种蛋、空气中的尘埃、污染的饲料和饮水而传播，一年四季均可发生，多雨、闷热、潮湿季节多发。 3、临床症状：禽大肠杆菌病的潜伏期为数小时至3天，无特征性临床症状，但与禽发病日龄、病程长短、受侵害的组织器官及是否并发其它疾病有很大关系，临床上常见下列类型。 (1)胚胎与幼雏早期死亡 用感染的种蛋进行孵化，使鸡胚在孵化后期出壳之前引起死亡，若感染鸡胚不死，则多数出壳后表现大肚与脐炎，俗称"大肚脐"，病雏精神沉郁，少食或不食，腹部大，脐孔及其周围皮肤发红、水肿，多在1周内死亡或淘汰。有的表现下痢，排出泥土样粪便，1～2天内死亡。 发生脐炎的病理变化可见卵黄没有吸收或吸收不良，卵囊充血、出血，囊内卵黄液粘稠或稀薄，多呈黄绿色，肠道呈卡他性炎症。肝脏肿大，有时可见散在的淡黄色坏死灶，肝包膜略有增厚。 (2)气囊炎 气囊炎常为大肠杆菌与鸡败血霉形体等呼吸道病合并感染而致，一般?表现有明显的呼吸嗓音，咳嗽、呼吸困难并发异常音，食欲明显减少，病鸡逐渐消瘦，死亡率可达20％～30％。有些病鸡若心包炎严重，则常可突然死亡。 病理变化可见胸、腹等气囊壁增厚呈灰黄色，囊腔内有数量不等的纤维性渗出物或干酪样物如同蛋类。 (3)急性败血症 急性败血症在鸡、鸭中最常见，鸡多在3～7周龄的肉鸡中发生，死亡率通常为1％～7％，并发感染时可高达20％。3周龄以下雏鸡多为急性经过，病鸡离群呆立或挤堆，羽毛松乱，肛门附有粪污，排黄白色稀粪，病程1～3天。4周龄以上病鸡，一般病程较长，少数呈最急性经过。病鸡

大肠杆菌培养实验报告

大肠杆菌培养实验报告 篇一：大肠杆菌检测实验报告 国标法测定大肠杆菌样本的细菌总数 实验目的 实验原理：国标法操作的原理 实验器材： 培养箱，10只移液管，1只250ml锥形瓶，5只大试管，试管架，4个平皿，500ml大烧杯1个，电子天平，纱布，脱脂棉，灭菌锅，PH计或PH试纸，100ml量筒，橡皮手套，超净台 实验药品： 磷酸盐缓冲液，蒸馏水，LB培养基，琼脂，5%NaOH，5%HCl 实验步骤： 一： 10只移液管，1只250ml锥形瓶，5只大试管，4个平皿，500ml大烧杯1个，100ml量筒进行洗涤，然后一起放入高压蒸汽灭菌锅中在121摄氏度条件下灭菌20min。灭完菌后烘干，完成后放入超净台中。 用酒精擦拭超净台，紫外消毒30min 二： 1：用电子天平称取成品LB 3.1241g和琼脂1.8756g放入250ml的洁净锥形瓶中。 2：用量筒量取125ml的蒸馏水

加入该锥形瓶中，制成培养基。 3：用棉花堵住该锥形瓶的瓶口，用牛皮纸包住瓶口，用橡皮筋扎牢，再将培养基放入灭菌锅中在121摄氏度之下灭菌20min。 4：灭完菌后放入超净台中备用。 三： 1：取1只无菌250ml锥形瓶，用量筒向其中加入49ml PBS 2：将1ml样品加入到该锥形瓶中，摇匀制成1:50的细菌溶液。 3：取4只试管，编号1—4 4：用无菌移液管分别向4只试管中加入9ml的PBS 5：用1ml无菌移液管从样品中移取1ml菌液加入到1中.震荡试管使菌液均匀。 6：用1ml无菌移液管从1号试管中移取1ml的细菌溶液加入2号试管中，摇匀 7：用另一只1ml无菌移液管从2号试管中移取１ｍｌ细菌溶液，加入3中，摇匀．．．．．．以此类推直至4只试管中均加入了细菌溶液。 9：取4只平皿，编号1—4 10：分别用4只无菌移液管从这4只试管中移取１ｍｌ的菌液置于4只平皿中，加入４５—５０摄氏度温度下的培养基，约１５ｍｍ厚度。缓慢旋转平皿使菌液与培养基混合均匀；待培养基冷凝后倒置。

大肠杆菌

大肠杆菌（学名：Escherichia coli，通常简写：E. coli）)是人和动物肠道中最著名的一种细菌，主要寄生于大肠内，约占肠道菌中的1%。是一种两端钝圆、能运动、无芽孢的革兰氏阴性短杆菌。除某些菌型能引起腹泻外，一般不致病，能合成维生素B和K，对人体有益。 其属名埃希氏菌（Escherichia）来源于其发现者Theodor Escherich。大肠杆菌是肠杆菌科的一员，经常作为细菌的模式生物广泛用于科学研究。 每个人每天平均从粪便中排出1011到1013个大肠杆菌。各种粪便细菌和类似的生活在土壤或植物降解物中的细菌（最常见的是产气肠杆菌，学名Enterobacter aerogenes）一起被归为“大肠菌群”(coliform)。大肠菌群为好氧或兼性厌氧[来源请求]，不形成内孢子，能发酵乳糖产生酸及气体的一群微生物。 在水净化和污水处理领域，因大肠杆菌在粪便中数量极多，故常用为检查水源是否被粪便污染的标志，其测量标准为大肠菌群指数。此外大肠杆菌多数情况下无害，不会从实验室“逃脱”而伤害人类。利用大肠杆菌作为粪便污染的指示物也可能产生误导性的结论，因为其它环境如造纸厂中，大肠杆菌也可大量存在。 然而一般无害的大肠杆菌在以下三种情况下也会导致疾病： 1.当细菌离开肠道进入泌尿道可以导致感染，由于性交会导致细菌进入膀 胱，有时被称作“蜜月膀胱炎”。尿路感染尽管对女性更为普遍，但两性都可能发生。老年中发病男女比例大体相同。因为细菌总是通过尿道进入泌尿系统，厕所的不卫生会升高感染机率，但其它因素也很重要（如女性怀孕，男性前列腺肥大），还有一些原因不明。 2.当细菌由于如溃疡等导致的穿孔进入腹腔，通常会导致致命性的腹膜炎感 染。然而，大肠杆菌对一些抗生素，如链霉素非常敏感，一般情况抗生素能够有效治疗。 3.大肠杆菌的某些株具有毒性（其中一些类似导致痢疾的毒素），可以导致 食物中毒，这通常是因为使用了被污染的肉类（通常是屠宰过程或储藏贩卖过程中的污染所致，加上食物未完全煮熟无法杀死细菌）。疾病的严重程度可以相差很多，尤其对儿童、老人和免疫缺失病人可以是致命的，但通常是温和的。大肠杆菌的内毒素可能对热稳定或不稳定。后者的结构和功能与霍乱毒素相当接近，全毒素包含一个A亚基和五个B亚基。B亚基起黏附作用，使毒素进入肠道细胞，而A亚基断裂出来，使得细胞脱水引起腹泻。

大肠杆菌实验总结

分离

划线分离：方法简单，但单菌落较难分开。 涂布分离：单菌落更易分开，但操作复杂。 （一）制备LB培养基（通用的细菌培养基） 1、配方：蛋白胨10.0克，牛肉膏5.0g，氯化钠10.0克，水1000ml （配固体培养基再加琼脂20克） 2、流程 计算称量溶解调pH分装加塞，包扎灭菌倒平板

培养基配制(特) 培养基应现配现用，每次配置350ml，一次性使用完毕。 1、按下表称取物资配置LB培养基到500ml锥形瓶中： 2、用双层铝箔和棉绳对锥形瓶进行封口，摇晃锥形瓶以使各物质迅速、均匀、完全、 溶解。待灭菌。 ①分装：注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，因此在将培养基转移到三角瓶或试管中时必须用___三角漏斗 _。 ②加塞：试管用塑料盖或__棉花塞___；三角瓶口用_封口膜__或_6层纱布封口,再用__牛皮纸__或报纸封口。 ③包扎：用_牛皮纸__或报纸 ④灭菌：高压蒸气灭菌法 1）加水：向外层锅内加入适量的水，加水的要求是不触及内胆 _. 2）装锅：物品放置的要求__整齐、稳定、留出空隙：加盖：将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的_排气槽__内。再以__两两对称方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺 栓松紧一致，勿使漏气。3）加热排气：打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀。4）保温保压：当锅内压力升到1_kg/cm2时，控制热源，维持压力至15 _min。5）出锅：切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力降至_0_时，打开_排气阀__，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。否则会因锅内压力较高，打开气阀后造成的压力差可能使容器内的培养基喷溅造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至使容器爆炸。

微生物实验室常用的标准菌种管理及、保存SICOLAB整理

微生物实验室常用的标准菌种管理及、保存SICOLAB整理 在微生物实验室中，常需保存-些实验中常用的标准菌种及菌株，如金黄色葡萄球菌，致病性大肠杆菌，几种常见的沙门氏菌，痢疾杆菌等，以供学生进行细菌涂片染色检查、细菌接种培养、制备凝集抗原、免疫动物制备诊断血清及测定诊断血清效价等。在做抗菌药物敏感试验时，也需常备-套对各种抗菌药物“敏感”的对照菌株，使学生学会判断细菌对药物的敏感性。对这些菌种的妥善保管和保存，是良好的实验室管理和实验质量的重要保证。 一、保管 由于实验室中保存的菌种大多对人体具有致病性，经多次移种又易被污染和发生变异，做好安全及质量管理至关重要，主要应做到以下几点。 1.1专人负责菌种保管应指定专人负责，存放于加锁的冰箱中。保管人应具备高度的责任心，明确职责，严格执行有关的规章制度，以确保菌种安全。 1.2详细登记实验室应备有-本详细登记本，对各种菌种进行详细登记，内容包括菌种的名称，编号，数量，分离日期，鉴定者，细菌的形态染色，培养生化特性，抗原结构，动物致病力等，并注明使用、移种及销毁的情况和原因。 1.3定期移种对菌种的保管不仅要求菌种不死，还要力求其生物学性状等不发生变异。各种菌种应按规定时间定期移种。细菌在人工培养基上经数代培养后，其形态、菌落、毒力等均易发生变异，因此，在每移种3次后应做-次全面鉴定，检测菌种有无污染和变异，如发现污染和变异时，应及时处理。 二、保存 保存菌种应根据细菌的培养特性、抵抗力等选择适合的培养基，微生物实验室常用菌种的-般保存方法有以下几种： 2.1科面保存法 2.1.1普通肉汤琼脂斜面：肠道杆菌、葡萄球菌等营养要求不高的细菌可接种于普通琼脂斜面上，斜面底部应加少许无糖肉膏液，以防干涸(但变形杆菌“OX”及伤寒杆菌“O’’菌株宜接种于斜面底部无肉汤的干燥的琼脂斜面，以防变异)，用橡皮塞塞紧，置37℃培养18-24h 后，放于4℃冰箱中，可保存1个月，每经1个月需接种传代1次。 2.1 .2血液琼脂斜面：链球菌及肺炎球菌的营养要求较高，在普通培养基上生长不良或不生长，应接种于血液琼脂斜面上，37℃培养生长后，放4℃冰箱保存，链球菌需半个月-1个月接种1次;肺炎球菌因能产生自溶酶而导致自溶现象，需4d移种1次。肺炎球菌在人工培养基上经数代培养后，其形态、菌落、毒力均易发生变异，在人工培养基上肺炎球菌很快失去荚膜，经多代培养后其光滑型菌落可变为粗糙型，毒力也大为降低。 2.1.3鸡蛋斜面：成分为新鲜全蛋、1%葡萄糖肉汤及甘油。少数沙门氏菌当新从病人检材中分离出来时，常具有Vi抗原，具有Vi抗原的细菌，有抵抗吞噬的作用，并保护细菌不被相应抗体在补体参与下所溶解，故毒力较强。含有Vi抗原的沙门氏菌等，可接种于鸡蛋斜面上，37℃培养18-24h，加无菌液体石蜡至斜面浸没，再超出约1cm，置4℃冰箱，可保存3-6个月，Vi抗原经长期人工培养，也易消失。 2.1.4吕氏血清斜面：白喉杆菌可保存在该培养基上，其成分为l%葡萄糖肉汤(pH7 .4)1份，牛血清或兔血清(无菌)3份。白喉杆菌在此培养基上生长迅速、旺盛，菌体形态典型，如在培养基中再加人5%-10%的中性甘油，则培养出的白喉杆菌的异染颗粒更为明显，但24h后即衰老成为多形态，很少有异染颗粒，菌体粗大3-4倍，置4℃冰箱可保存2周-1个月。2.2半固体穿刺保存法 2.2.1普通半固体：大肠杆菌、葡萄球菌、绿脓杆菌等可穿刺接种于普通半固体培养基内，37℃培养18-24h后，加1层无菌的液体石蜡，厚度约为1cm，置4℃冰箱可保存3-6个月。传代移种时，将半固体菌种管倾斜，使液体石蜡流至-边，再取菌移种于新的培养基。将沾