Illumina_HiSeq_2000-BGI
Illumina HiSeq 2000
Illumina Hiseq 2000测序系统是一种高通量测序技术，其测序原理和Illumina Genome Analyzer II 测序系统相似，仍然是采用可逆终止法的边合成边测序技术。
这种测序技术通过将基因组DNA的随机片断附着到光学透明的表面，这些DNA片断通过延长和桥梁扩增，形成了具有数以亿计cluster的Flowcell，每个cluster具有约1000拷贝的相同DNA模板，然后用4种末端被封闭的不同荧光标记的碱基进行边合成边测序。这种新方法确保了高精确度和真实的一个碱基接一个碱基的测序，排除了序列方面的特殊错误，能够测序同聚物和重复序列。
这种技术避免了像传统测序技术那样耗费大量人力、物力进行片段克隆、转化、质粒抽提等繁琐的操作。而且多种样品制备方法使此技术有一系列的广泛应用，包括基因表达、小RNA的发现，蛋白质核酸相互作用等。
HiSeq 2000测序系统是前所未有的高通量测序系统，不仅提高测序通量，降低了成本，而且具有创新的用户体验。预先配置、即插即用的试剂，简单的流动槽上样，简单的触摸屏用户界面，这种人机交互设计特征以及轻松的测序流程，使操作更简单，更方便。
HIseq 2000 cBot
Flowcell Cluster Image
测序实验流程：
?基因组DNA打断；
? DNA 末端修复；
?连接接头；
? DNA片段杂交到 Flowcell上；
? DNA模板延伸，桥式扩增；
? Flowcell制备；
? SBS（synthesis-based-sequenceing）边合成边测序；
? Hiseq上自动化测序；
?图片处理，实时分析，碱基识别；
?图片实时分析；
?变异分析；
?总结报告；
技术特点：
?每个run平均达到200G的数据通量，读长为2 x 100bp；
?每个run可同时运行2张Flow cell, 且每张Flow cell 可进行上下两面扫描；
?采用TDI 线性扫描技术，4个相机同时扫描；
?预先配置、即插即用的试剂，简单的流动槽上样，触摸屏式的用户界面；
?低成本：单次运行即可以～30倍的覆盖度同时对两个人类基因组样品进行测序，或同时绘制
200个基因表达谱。
Illumina Hiseq2000能够对基因组DNA片段大规模高通量并行测序，实验时将基因组或大片段DNA 随机打断成＜700 bp的小片段（主带可为200bp、300bp、500bp 等），加上特定接头做成DNA文库后直接对DNA片段进行单末端（Single-End）或者双末端（Paired-End）测序，不需要克隆到细菌中，可以获得大量的DNA序列信息。
DNA Index文库测序是一种非常经济的测序策略，可实现多个DNA样品的混合测序。实验时通过PCR 将一个由6碱基组成的Index序列标签引入接头序列中，对未知DNA序列和已知的Index标签一并测序，通过不同的样品对应不同的标签序列来达到区分不同样品数据的目的。目前可将2-12个不同的DNA样本混合测序，节约成本，避免了数据多余而造成不必要的浪费。特别适合于小基因组测序、BAC文库测序、长片段PCR产物测序等。
DNA Fragment文库制备的整个过程只需2天，单末端测序长度可达100bp，双末端为200bp。该技术测序通量高，可在全基因组水平上最大限度的、完整的获取基因组及多态性信息。广泛地应用于新基因组测序（De novo sequencing）、基因组重测序（Re-sequencing）、 BAC测序和长片段PCR产物测序等。实验流程：
基因组DNA的随机打断
↓
DNA片段的末端修复
↓
将‘A’碱基加入到DNA片段的3′末端
↓
在DNA片段的末端加上特定接头
↓
PCR扩增连上接头的DNA片段
↓
文库检测
↓
DNA在cBot的成簇扩增
↓
Illumina Hiseq 2000上的测序
↓
生物信息组装/分析
DNA Mate-pair文库测序
基因组DNA Mate-pair文库测序是通过大片段文库构建，从而获得基因组中较大跨度（2-10kb）片段两端的序列。更具体地说：首先将基因组DNA随机打断到特定大小（2-10kb范围可选）；然后经末端修复，生物素标记和环化等实验步骤后，再把环化后的DNA分子打断成400-600bp的片段并通过带有链亲和霉素的磁珠把那些带有生物素标记的片段捕获。这些捕获的片段再经末端修饰和加上特定接头后建成大片段文库，不需要克隆到细菌中，直接在Illumina Hiseq 2000上对这些大片段文库的两端进行测序。
DNA Mate-pair文库制备的整个过程需要5天，这种从较大跨度两端所获得的序列对大基因组或者复杂基因组的组装和基因组结构变异发掘具有非常重要的作用，特别适合于新基因组测序(De novo sequencing)项目。
实验流程：
基因组DNA随机打断特定大小片段（2-10kb范围可选）
↓
末端修复
生物素标记
↓
环化
↓
获得来自大片段两端共计400-600 bp的DNA片段
↓
修饰、加接头
↓
PCR扩增连上接头的DNA片段
↓
文库检测
↓
DNA在cBot上的成簇扩增
↓
Illumina Hiseq 2000上的测序
↓
生物信息组装/分析
Small RNA 测序
Small RNA（micro RNAs、siRNAs和 pi RNAs）是生命活动重要的调控因子，在基因表达调控、生物个体发育、代谢及疾病的发生等生理过程中起着重要的作用。Illumina Hiseq 2000能够对细胞或者组织中的全部Small RNA进行深度测序及定量分析等研究。实验时首先将18-30 nt范围的Small RNA从总RNA中分离出来，两端分别加上特定接头后体外反转录做成cDNA再做进一步处理后，利用测序仪对DNA片段进行单向末端直接测序。
从样品制备到测序完成的整个实验过程只需10天，每个样品可得到2.5 Million 以上的Small RNA 序列。通过Illumina Hiseq 2000对Small RNA大规模测序分析，可以从中获得物种全基因组水平的miRNA 图谱，实现包括新miRNA分子的挖掘，其作用靶基因的预测和鉴定、样品间差异表达分析、miRNAs聚类和表达谱分析等科学应用。
实验流程：
从总 RNA中分离 small RNA
↓
5′接头连接和纯化
↓
3′接头连接纯化
↓
RT-PCR扩增
Small RNA文库的纯化
↓
文库的检测
↓
DNA在cBot成簇扩增
↓
Illumina Hiseq 2000上的测序
↓
生物信息学分析
数字化表达谱测序
Illumina Hiseq 2000能够对特定的组织/细胞中的基因表达标签高通量并行测序。实验时将样本总mRNA 反转录成cDNA，酶切处理后将所得到的3′近端的21bp Tag片段文库进行高通量测序，得到大量的Tag序列信息。可以直接对任何物种包括未知基因在内的全基因组表达谱分析，从而对基因、基因表达水平、以及样品间基因表达差异等进行研究。
数字化基因表达谱测序从文库制备到测序的完成只需要6天，每个样本可得到2.5 Million以上的表达标签信息。新一代测序技术的数字化信号检测方式，大大提高了数据的准确度和可重复性。其高灵敏度和高精确性，能成功检测表达差异较弱的基因和低丰度基因，同时还可发现新的转录本、基因组表达调控区域、差异聚腺苷化及反义转录本等。
实验流程：
mRNA的分离和cDNA第一链的合成
↓
cDNA第二链的合成
↓
限制性内切酶NlaIII的酶切
↓
连接GEX NlaIII Adapter 1
↓
限制性内切酶 MmeI 的酶切
↓
连接GEX Adapter 2
↓
Adapter连接cDNA产物和PCR富集
↓
文库的检测
↓
DNA在cBot上的成簇扩增
Illumina Hiseq 2000上的测序
↓
生物信息学分析
转录组测序
实验时，将特定组织或者细胞中的mRNA分离后制备成片段化的cDNA文库，通过Illumina Hiseq 2000对cDNA文库高通量测序，从而获得一个细胞或生物个体的全转录组信息。
利用Illumina Hiseq 2000大规模测定mRNA序列获得转录本信息，该技术具有通量高、覆盖范围广、精度高等特点。其不依赖于基因组参考序列，使所有生物都可以成为研究对象，同时能够在全基因组范围内检测真核细胞中广泛存在的可变剪切现象，为转录本的结构研究、基因转录水平研究、全新转录区域研究等提供重要的研究工具。
实验流程：
Total RNA的DNase I 酶消化
↓
mRNA 分离和随机打断
↓
cDNA第一链和第二链的合成
↓
DNA片段的末端修复
↓
将“A”碱基加入到DNA片段的3′末端
↓
在DNA片段的末端加上特定接头
↓
PCR扩增连上接头的DNA片段
↓
文库的检测
↓
DNA在cBot上的成簇扩增
↓
Illumina Hiseq 2000上的测序
↓
生物信息学分析
DNA甲基化测序
DNA甲基化是研究最为深入的表观遗传学机制，DNA甲基化在维持正常细胞功能、抑制重复序列和寄生
DNA成分对基因组完整性的损害、染色质结构修饰、X染色体失活、胚胎发育、基因组印迹以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一。
重亚硫酸盐（Bisulfite）处理结合测序分析是研究甲基化最常用也是最准确的方法。基于重亚硫酸盐高效处理结合新一代高通量测序技术Illumina Hiseq 2000使得基因组整体水平高精度的甲基化检测成为现实。该技术主要流程：先将基因组DNA或大片段DNA随机打断，加上特定接头后用重亚硫酸盐高效处理，对处理好的DNA文库在基因组水平上进行大规模测序，然后进行全基因组范围内高精度的甲基化状况分析。
文库制备的整个过程需要3天，CT转换率达到98%以上。该技术可在全基因组水平上最大限度的、完整的获取甲基化状态信息和与基因表达调控的多重关系，可高效精确完成全基因组甲基化测序及高分辨DNA 甲基化谱式绘制，并可对发现的靶点区进行甲基化特异性PCR验证。
实验流程：
基因组DNA随机打断
↓
DNA片段的末端修复
↓
将‘A’碱基加入到 DNA片段的3’末端
↓
DNA片段末端加上特别处理的甲基化接头
↓
重亚硫酸盐处理
↓
去盐处理
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PCR扩增连上接头的DNA片段
↓
文库检测
↓
DNA 在cBot上的成簇扩增
↓
Illumina Hiseq 2000上的测序
↓
生物信息学分析
ChIP-seq
染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是研究蛋白质与DNA之间相互作用的强有力工具，在研究同染色质相关蛋白质，如组蛋白和它的异构体、特定DNA结构域上转录因子等许多相关
领域中被广泛应用。
Illumina Hiseq 2000能够对染色质免疫共沉淀获得的微量DNA片断进行大规模测序，通过免疫共沉淀得到目的DNA（> 10ng, 200bp左右），将获得的DNA片段加上接头后进行PCR扩增，得到 ChIP- Seq 文库后直接进行大规模测序。ChIP-Seq是继ChIP-ChIP后，蛋白/核酸相互作用研究的又一技术突破。实现了全基因组范围内更精确、更敏感、更经济的定位目蛋白所有的结合位点。
利用新一代测序技术的ChIP-Seq技术，可获得数百万条序列标签，并能把所关注的蛋白的DNA结合位点精确定位到基因组上。样品制备的整个过程需要3天，可以获得全基因组范围内组蛋白各种修饰的高分辨率分布图。其高质量、高通量、低成本的数据产出，为蛋白质DNA之间相互作用特别是表观基因组学方面的研究奠定了重要的技术基础。
实验流程：
染色质免疫共沉淀
↓
目的DNA片段
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DNA片段的末端修复
↓
将‘A’碱基加入到 DNA片段的3‘末端
↓
DNA片段末端加上接头
↓
PCR扩增加上接头的DNA片段
↓
文库检测
↓
DNA在cBot成簇扩增
↓
Illumina Hiseq 2000上的测序
↓
生物信息学分析
Meta-Genomics DNA测序
宏基因组学（也称元基因组学、环境基因组学、生态基因组学）是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以测序分析和功能基因筛选为研究手段，研究微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间关系的新方法。
Meta-Genomics DNA测序是基于新一代测序仪Illumina Hiseq 2000对特定环境微生物种群全基因组DNA研究技术。该方法的特点是在提取微生物种群的DNA后，制备DNA文库进行高通量的测序，可以从整体上对样品群落进行分析，不受微生物是否能培养的限制，而且研究对象从单一基因组到一个基因组集合，也摆脱了对于传统基因组研究的物种限制，开辟了微生物群体基因组学研究的新路径。
实验流程：
Meta基因组的提取
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DNA随机打断
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DNA片段末端修复
↓
将‘A’碱基加入到DNA片段的3′末端
↓
在DNA片段的末端加上接头
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纯化连接产物
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PCR扩增连上接头的DNA片段
↓
文库的检测
↓
DNA在cBot的成簇扩增
↓
Illumina Hiseq 2000上的测序
↓
生物信息组装/分析