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胰酶、EDTA的使用及注意事项

胰酶(pancreatin)是一种自猪胰中提取的多种酶的混合物,主要为胰蛋白酶(将蛋白质消化成蛋白胨)、胰淀粉酶(将淀粉消化成糖)与胰脂肪酶(将脂肪消化成甘油和脂肪酸)。其通过在特定位置上降解蛋白,使细胞间结合处蛋白降解,这时细胞由于自身内部细胞骨架的张力作用下成为球形,从而使细胞分开。

不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关,在pH为8.0、温度为37℃时,胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时,应把握好浓度、温度和时间,以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性,所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS,如:D-Hanks液。终止消化时,可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。

胰酶本身就是消化蛋白的,而细胞膜又富含各种膜蛋白,消化过头会对细胞造成损伤的。

细胞之间是通过CAM(细胞粘性分子)相连的,而很多粘性分子只有在有+2价金属离子,如Ca2+,Mg2+,的存在下才能行使这种功能。在胰酶中加EDTA的作用是熬合这些二价离子,使细胞被消化成单细胞形态。

EDTA是乙二胺四乙酸,一种金属螯合剂。一般和胰蛋白酶配合使用。原因在于,钙,镁等金属离子会降低胰酶活力,故在使用胰酶消化液时要配合加入EDTA。它可以螯合这些离子,消除对胰酶的抑制。

ED TA用得非常多,一般浓度在0.02%左右。作用于细胞与间质,对细胞间也有一定作用。注意,它能显著影响pH值,而且在弱碱性条件下才易溶。因此,配制时应调节好酸碱度。它不能被中和。因此,消化下来的细胞要拿PBS洗一遍。

胰酶

这是用得最多的,常用浓度在0.25%。作用时间根据细胞种类、作用温度、作用ph等因素而变化很大,从几分钟到几十分钟不等。

0.25%的胰酶作用于单层贴壁的细胞,在37度条件下,一般消化1-5分钟就足够了。主要作用于细胞间。配制时不能用含钙、镁离子的平衡液,否则影响活性。终止是用血清蛋白,血清含有非特异性胰蛋白酶抑制剂。保存于-20度。

胶原酶。这种方法比较少,一般是用原代培养时,从组织消化下细胞。这种方法作用温和,对细胞损伤较小,价格也较贵,不易保存,使用期限短,中止同样是用血清蛋白。

胰酶使用注意

1.在使用胰酶细胞消化液的过程中要特别注意避免消化液被细菌、支原体污染。

2.胰酶细胞消化液消化细胞时间不宜过长,过长会损伤细胞,导致细胞铺板后生长状况较差。

贴壁细胞的消化

1.吸去培养液,用无菌的PBS、Hanks液或无血清培养液洗涤细胞一次,以去除残余的死细胞/血清。

2.加入少量胰酶细胞消化液,略盖过细胞即可,根据胰酶效率差异可以增加惑减少胰酶用量,室温放置2-5分钟(不同的细胞消化时间有所不同)。

3.显微镜下观察,细胞明显皱缩成圆形,并且肉眼观察培养器皿底部发现细胞的形态发生明显的变化呈白茫状;或者在瓶壁上有部分成点状区域细胞脱落;或者用手拍打克氏瓶正好能够使细胞脱落;或者用枪吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打下来。

4.此时加入含血清的完全细胞培养液停止消化,吹打下细胞,即可直接用于后续实验;如果发现消化不足,则加入胰酶细胞消化液重新消化。钙离子、镁离子和血清蛋白的存在会降低胰酶活力。因此,胰酶溶液常用无Ca2+、Mg2+的D-Hanks’平衡盐溶液配制成0.25%溶液。消化细胞时,加入一些血清或含血清的培养液,或胰蛋白酶抑制剂能终止胰蛋白酶对细胞的消化作用。

如果发现细胞消化时间过长,未及吹打细胞,细胞已经有部分直接从培养器皿底部脱落,直接用胰酶细胞培养液把细胞全部吹打下来。1000-2000rpm离心1分钟,沉淀细胞,尽量去除胰酶细胞消化液后,加入含血清的完全培养液重新悬浮细胞,即可用于后续实验。影响因素

?影响消化速度的因素较多,主要有胰酶溶液的活性(配制条件、冻存或4℃保存时间长短、是否反复冻融、化冻后存放时间及温度等)、消化时的温度(气温、细胞培养瓶及胰酶溶液的温度)以及所加胰酶溶液的多少等。

?加入胰蛋白酶-EDTA溶液,视细胞瓶的大小加入体积为2ml或更多(依培养器皿的大小而定),以使充分浸润。

?一般消化时间约为1至3分钟,肉眼观察瓶底由半透明(细胞单层连接成片)转为透明、点状(出现细小空隙)时,弃去细胞消化液,或看见培养瓶壁呈白茫状即可,并加入适量的完全培养液终止消化,吹打分散;如见大量细胞片状脱落,已消化过头,这样会造成大量细胞从瓶壁上脱下,甚至造成细胞破碎,此时迅速加入完全培养基终止反应。

* 血清终止的原理

其一解释其实是竞争抑制,就是用过量的牛血清中含有的蛋白来和胰酶结合,不给胰酶消化细胞蛋白的机会。

其二解释就是终止是用血清蛋白,血清含有非特异性胰蛋白酶抑制剂。

* 为什么用胰蛋白酶消化

胰酶、EDTA的使用及注意事项

谷氨酰胺

合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺,其作用非常重要,细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质,谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量(3/10000g)的谷

氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定,4℃下放置1周可分解50%,故应单独配制,置于-20℃冰箱中保存,用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2周以上时,应重新加入原来的谷氨酰胺。

一般培养液中谷氨酰胺的含量为1~4mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液贮存,用时加入培养液。配制方法为,谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液,充分搅拌溶解后,过滤除菌,分装小瓶,-20℃保存,使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。

胰酶、EDTA的使用及注意事项

胰酶、EDTA的使用及注意事项

上面是用5个MOI的PRRSV感染Marc-145,72小时后得到的细胞病变图片。上图是CPE,下图是正常细胞对照。

EDTA

EDTA 是一种重要的络合剂。EDTA用途很广,可用作彩色感光材料冲洗加工的漂白定影液,染色助剂,纤维处理助剂,化妆品添加剂,血液抗凝剂,洗涤剂,稳定剂,合成橡胶聚合引发剂,EDTA是螯合剂的代表性物质。能和碱金属、稀土元素和过渡金属等形成稳定的水溶性配合物。

1基本信息

【名称】:

中文名称:乙二胺四乙酸。

胰酶、EDTA的使用及注意事项

胰酶、EDTA的使用及注意事项

化学名称:Ethylene Diamine Tetraacetic Acid。

化学简称:EDTA

中文别名:四乙酸二氨基乙烷(二氨基乙烷四乙酸),托立龙。

俗名:依地酸(特别是它的钙盐络合物,医学上称为依地酸钠钙)。

英文名称:Ethylenediaminetetraacetic acid

英文别名:(Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid,Edathamil

【线性分子式】:(HO2CCH2)2NCH2CH2N(CH2CO2H)2

【分子式】:C10H16N2O8

【分子量】:292.248(注:EDTA二钠为372.2)。

【密度】: 1.566 g/cm3

【熔点】:250℃

【贮藏】:密封保存。常温即可。

2理化性能

白色无臭无味、无色结晶性粉末,熔点240℃(分解)。不溶于冷水、乙醇及一般有机溶剂,微溶于热水,溶于氢氧化钠,碳酸钠及氨的溶液中,能溶于160份100℃沸水。其碱金属盐能溶于水,钠盐在水中的溶解度见下表(g/L)。一般用乙二胺四乙酸的钠盐代替EDTA。

胰酶、EDTA的使用及注意事项

3用途

本品为钙离子络合剂,洗涤剂,血液抗凝剂。生化研究中用作钙螯合剂,消除微量重金属导致的酶催化反应中的抑制作用。

EDTA是化学中一种良好的配合剂,它有六个配位原子,形成的配合物叫做螯合物,EDTA在配位滴定中经常用到,一般是测定金属离子的含量,在生物应用中,用于排除大部分过度金属元素离子(如铁(III),镍(II),锰(II))的干扰。在蛋白质工程及试验中可在不影响蛋白质功能的情况下去除干扰离子。

EDTA用途很广,可用作彩色感光材料冲洗加工的漂白定影液,染色助剂,纤维处理助剂,化妆品添加剂,血液抗凝剂,洗涤剂,稳定剂,合成橡胶聚合引发剂,EDTA是螯合剂的代表性物质。能和碱金属、稀土元素和过渡金属等形成稳定的水溶性络合物。除钠盐外,还有铵盐及铁、镁、钙、铜、锰、锌、钴、铝等各种盐。主要用途:乙二胺四乙酸主要用作络合剂,广泛用于水处理剂、洗涤用添加剂、照明化学品、造纸化学品、油田化学品、锅炉清洗剂及分析试剂。

1、高分子化学工业:用作丁苯胶乳聚合活化剂、腈纶生产装置的聚合反应终止剂;

2、日用化学工业:用作多种洗涤剂、护肤品、烫发护发剂的添加剂;

3、造纸业:用作纤维蒸煮时的处理剂、提高纸张白度,减少蒸锅中的结垢;

4、医药工业:与甲酰胺环合可制得乙亚胺,是一种主要用于治疗银屑病的药物,还作

为某些疫苗的稳定剂及血液抗凝剂;

5、纺织印染业:提高染料上色率和印染纺织品的色调和白度;

6、在食品行业:可在罐头加工等食品行业中作螯合剂,驱除金属离子的干扰。

7、在分子生物学实验中:是二价金属螯合剂,抑制核酸酶;降低细胞膜的稳定性。此外,EDTA也可用来使有害放射性金属从人体中迅速排泄起到解毒作用。