石油降解细菌的分离提纯及简单应用

石油降解细菌的分离提纯及简单应用

内容简介：

“油田采出水”，也称“油田污水”。油田污水中不仅含有原油，还溶进了地层中各种盐类、悬浮物、有害气体和有机物,BOD5/ COD Cr 值仅有0. 15～0. 3 左右。在原油处理时还掺进了大量高分子化学药剂，形成一种特殊的难降解的有机废水。就此状况及特点，及目前应用于含油废水处理的各种生物处理方法，以及生物处理的原理表明，高效原油降解菌和生物处理构筑物相结合的生物深度处理技术是国内油田污水处理技术发展的趋势。随着生物处理技术的不断发展，越来越多的生物处理方法被应用于油田污水的处理,并获得了良好的处理效果。

关键词：高效降油菌、石油污染土壌、接种、提纯、生物修复

正文：

随着石油工业的发展，含油废弃物的污染范围不断扩大，污染程度也日益严重，对其进行治理有着重要的现实意义。80年代以来，污染土壤的生物修复技术由于具有费用省、操作简单和环境影响小的特点，越来越受到关注, 并得到广泛应用。土壤中广泛分布着可降解石油的微生物种,它们在土壤生物修复中具有重要作用，但是数量上相差很大。土壤中降解石油微生物的数量与污染物的存在有着密切关系。它们能够适应环境,然后进行选择性富集并发生遗传改变，从而导致烃类降解细菌所占比例及编码降解烃类基因的质粒数量增加。有报道指出，降解烃类的微生物一般只占微生物群落总数的不到1 %，而当有石油污染物存在时,降解者的比例增加到10 %。此方法基本实现对不同污染程度、不同类型的污染修复的相应处理手段，研究结果为含油废弃物的土壤异位生物修复技术的实用化提供了试验依据。

优质石油降解细菌的培养筛选方法

菌种的采集：被石油污染的土壤中的细菌

培养基：NH4NO32g ， K2HPO41. 5g， KH2PO43g，MgSO4·70H2O 0. 1g，无水CaCl20. 01g，Na2EDTA·2H2O 0. 01g，原油1g，蒸馏水: 1000mL，pH值7. 2～7. 4.

操作方法（即石油降解菌的富集、分离、纯化）：取一定量的石油污染土样接入装有100mL 培养基的250mL 三角瓶中，于30℃、160 rmin- 1条件下在摇床中培养7d，然后取一定量的上述培养液接入装有100 mL 新鲜培养基的250mL三角瓶中， 30℃、160 r·min- 1条件下摇床中培

养7d;如此共3次。用接种环沾取富集培养液于平板上划线，经过多次划线纯化后，将纯化菌株于试管斜面培养后保存于冰箱。石油降解菌的复筛：称取含油土样50g，溶于经灭菌的培养基100mL 中，配成泥浆，盛于250mL 的三角瓶中，在无菌条件下，将制好的菌悬液接种2mL于三角瓶中，各菌种均做3个平行样，并作加氯化汞杀菌和不加菌2种空白对照。在30℃、160 r·min- 1条件下于摇床中培养。每2d 取1次样，测其石油烃含量,直至其石油烃含量不再有明显变化，筛选出石油烃降解率高的菌种。接种量影响试验的操作方法与菌种复筛的方法相同。不同的是改变接种量和试验土样。样点1、样点2、样点3、样点4的泥浆中石油烃浓度分别为125mg·L - 1、56 mg·L - 1、3245mg·L - 1、209 mg·L – 1。石油降解菌的生物修复：称取含油土样2kg于圆形瓷盆中，将斜面培养的细菌进行活化，与锯末(1∶7,质量比)制成固体培养基，接入石油污染土壤中。土壤含水率基本保持在20%左右,在自然温度下进行修复。

实验的基本结果

1、高效降油菌的筛选：

为了取得高效、彻底的生物修复效果,分离和筛选污染物的高效降解菌种是生物修复的必然要求。试样经过3次富集培养以及分离纯化等步骤得到多个单菌株。在此基础上,采用降解石油试验，复筛出7株对石油具有较高降解能力的菌株。细菌密度可达107 ～109个·mL - 1，株菌可以利用石油为唯一碳源生长。培养7d后的生物除油率为43. 8%～58. 9% ，高于一般石油降解菌对石油类的降解率（ 25. 8% ～32. 8% ）对所筛选的7株菌进行生理生化试验表明，这可能是由于革兰氏阴性菌细胞外层是脂多糖,而脂多糖是由脂类和多糖组成的复合物，可以为细胞提供一个既亲水又亲油的两亲分子层，这一方面使其细胞与油滴表面接触，使石油烃易于进入细胞，另一方面，它能降低水- 油界面张力，使原油变为由细小油滴构成的乳剂，并扩散进入细胞,加速油的降。

2、高效降油菌对石油的降解能力试验中设置了加氯化汞杀菌对照试验和不加菌的空白对照试样。

实验表明，加氯化汞的杀菌试样石油烃降解率为9%的水平，随着降解时间的延长石油烃降解率基本不变，最高为12%。加氯化汞杀菌试样中石油烃减少的主要原因为石油烃挥发和空气氧化的作用。不加菌和氯化汞对照试样2d后的降解率为11% ，降解率随时间的延长逐渐增加，降解8d后37%的石油烃被去除，与氯化汞杀菌试样相比有25%的石油烃是在土壤本身存在的微生物的作用下去除。接种上述提存

后的菌种的试样在2d后即开始表现较强的降解能力，其降解率达到50%左右。与不加菌对照试样相比37%左右的石油烃是被高效菌降解利用，表明分离得到的株菌能很快适应环境发挥高效除油能力。且加菌试样的石油烃降解率曲线变化趋势基本一致，降解率随着降解时间的延长逐渐增加。泥浆为微生物生长提供了良好的环境，降解8d后加菌试样的降解率均达到80%左右，远高于不加菌试样的降解（37%）。

3、高效降油菌细胞平均降解速率

研究表明，高效降油菌接种量对是对不同土壤除油率影响的主要因素。实验表明接种菌液量越大，石油菌的数量越多。通过增大接种量可以提高土壤中石油菌的数量，同时高的接种量有利于石油烃的降解。除油率随着接种量的增加而增大，表明高的接种量可以增强接种菌与土著微生物的竞争能力，使接种菌迅速适应环境，大量繁殖，发挥高效降解能力。

4、高效降油菌对石油污染土壤的生物修复试验研究

根据国内外大量的研究报道，许多环境因素均对接种高效降油菌的除油效果产生影响。实验中表明，没有投加任何细菌的石油土壤中的石油基本上没有降解，而一般含有降解细菌的石油土壤的降解率是37%，而含有较强的降解率的石油细菌则较高，约85%。即：投加高效菌株可在较短的时间内将土壤中的石油污染物去除。可见保持土壤中较高的降油菌数量是实现生物修复的关键。

5、石油降解菌在环境领域的应用

针对油田含油污水这种难降解处理的工业废水，高效原油降解菌和生物处理构筑物相结合的生物深度处理技术应该是国内油田采出水处理技术发展的趋势。

曝气生物滤池组合工艺法：曝气生物滤池处理污水的原理是反应器内填料上所附生物膜中微生物氧化分解作用，填料及生物膜的吸附阻留作用和沿水流方向形成的食物链分级捕食作用以及生物膜内部微环境和厌氧段的反硝化作用，从而除去水中的油类物质。

MBR —BAF 法（膜生物反应器—曝气生物滤池）：膜生物反应器作为一种新兴高效的污水处理技术已引起了国内外水处理界的高度重视，它实现了超滤膜的高效过滤和高浓度活性污泥生物降解的有机结合，而且不需要二沉池和污泥回流系统,在运行成本、能耗以及处理效果等方面均具有优势。田慧颖等采用MBR —BAF 系统处理辽河油田的采油污水,系统对采油污水中的油、BOD5 、氨氮去除效果很好，去除率均可达到90 %左右，COD 的平均去除率也可达到70 %以上，出

水清澈透明,无异味。

含油泥砂生物法处理：含油泥砂是油田开发过程中产生的重要污染源之一，油泥砂含有大量原油，对周围的大气、水质和土壤会造成严重的污染生物处理法利用微生物将泥砂中的原油污染物降解为CO2和H2O ，实现无害化处理。微生物具有分布广、数量多、代谢类型多样和适应突变能力强的特点，在任何存在污染物的地方都会出现相应的可降解污染物的微生物,利用经过驯化、筛选、诱变或基因重组等获得的高效降解菌种来处理污染物，与物理化学方法相比，具有安全性好，无二次污染，易于管理等优点，因此日益受到国内外环保界的视。

总结

随着我国石油工业的发展，受石油污染土地的面积不断扩大，污染程度也日益严重。这些污染物质毒性大，有的有致癌致突变作用，进入土壤后难以去除，而且会随着径流进入周围的流域和地下水，从而给油田及周围的生态环境带来了严重的环境问题。石油污染的生物修复技术由于生产费用低、不产生二次污染而被视为一项具有广阔前景的高新技术。向石油污染土壤中投加环境适应强、降解效能高的菌种或菌群是提高石油污染土壤生物修复效率的主要手段。但污染土壤的微生物修复是一项涉及污染物特性、微生物生态结构和环境条件的复杂系统工程，分离提存高效的石油降解细菌及它的工程应用必定成为生物及环境界的热点。

主要参考文献：

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唐智新，肖洲强 025322468 (2007) 0420622207

7、不同SBR条件下焦化废水治理效果的研究程建光，陈平，张裴 1005 - 2763

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8、柴油降解细菌的分离及其降解能力初探王刚，于成德，张彭湃，张宁

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9、稠油降解菌的筛选及其对胶质和沥青质生物降解李凤梅，郭书海，牛之欣，

牛明芬，冷延慧，张春桂 056423945 (2006) 0420764204

10、含油泥砂生物法处理室内研究耿雪丽中图分类号: [ TE992. 3 ] :X703

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赵曙辉 1001-7003（2006）05-0027-02

12、石油燃料脱除非水溶性有机硫的微生物菌筛选王素娟钱俊青浙江工业大学生物与环境学院

13、应用生物修复技术处理石油污染土壤魏有权北京科技大学

14、油泥油砂生物综合处理技术研究及应用陈书林，邵涛1000 9752 (2005)

02 0427 04

15、油田污水的生物处理技术陈平，崔红梅，李亚峰 1004 0935 (2007) 03

0178 04

石油降解微生物的研究现状

石油降解微生物的研究现状 陈宇翔生物工程学号：11208523802538 摘要：本文简单介绍了石油降解微生物的概念，并叙述了石油降解微生物的降解机理和影响微生物降解的条件。举例说明了生物降解石油烃的研究现状和对未来研究方向的展望。 Abstract: this paper briefly introduces the concept of microorganism oil, and describes the degradation of microorganism oil mechanism and influencing microbial degradation of conditions. For example the biodegradation petroleum hydrocarbons, the research present situation and prospect of the future study trends. 关键词：石油烃降解微生物石油污染高效性研究现状展望Keywords: petroleum hydrocarbon microorganism oil pollution efficiency research-status prospect 引言： 石油作为重要能源之一已被世界各国广泛使用，随之而来的石油烃污染已经对人类生存的土壤及水体环境造成了严重的危害，微生物降解是一种处理石油烃污染的理想方法。在石油及石油产品的开发利用中，不可避免的会对人类生存环境造成污染，防范、治理石油污染成为环境保护的重要任务之一。目前用于石油污染治理的方法主要有：物理修复法，化学修复法和生物修复法。与传统的物理化学方法比较，生物修复法具有经济花费少、对环境影响小、遗留问题少、最大限度地降低污染物的浓度、修复时间较短、就地修复、操作方便等特点[1]，是国内外科研工作者关注的热点领域，在石油污染的治理中具有广阔的应用前景。 本文从介绍石油降解微生物开始人手，认真分析了石油降解微生物的种类、菌种特征、降解机理，分析了目前用于处理石油污染的微生物的技术特点，现阶段研究现在和具体应用，并对未来的研究方向做出了大胆的设想和展望。

微生物菌种的分离和纯化方法

从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。 1、用固体培养基分离和纯化 单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落。当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板，即培养平板的简称，它是指固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基用琼脂或其它凝胶物质固化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由Kock建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。1.1 稀释倒平板法 首先把微生物悬液作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。 1.2 涂布平板法 因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，

微生物石油降解

微生物石油降解综述 Abstract: Oil as a important energy has been one of the countries all over the world widely used, because in the exploitation of oil, storage, transportation, processing and petrochemical products in the process of production, and the sudden discharge of oil leakage accident cause large oil into the environment pollution. Oil pollution harm main performance in the column of \"soil ecosystem tao and the function of the damage, the serious influence the permeability of soil and water permeability, lead to soil harden. Fertility dropped; In the water surface formation oil film, cause the oxygen in the water fell sharply. Cause massive death of aquatic organisms, destroying the aquatic ecological environment and fishery resources; Still can into the underground water system, direct pollution underground water sources, the influence of water and irrigation residents; Some of the oil teratogenic carcinogenic substance but also by biological function of enrichment of the food chain and immediate harm to human health. 摘要：石油作为重要能源之一已被世界各国广泛使用，由于在石油的开采、储存、运输、加工和石化产品生产等过程中的漏油以及突发性泄油事故致使大量的石油进入环境造成污染。石油污染的危害主要表现在列土壤生态系统的结掏和功能的破坏，严重影响土壤的透气性和渗水性，导致土壤板结。肥力下降；在水体表面形成油膜，致使水中溶氧量急剧下降．造成水生生物的大量死亡，破坏水生生态环境和渔业资源；还可进入地下水系，直接污染地下水源，影响居民用水和农田灌溉；石油中的一些致畸致癌物质还可通过食物链的生物富集作用而直接危害人类健康。 随着人们对环境问题的日益关注，石油烃类的微生物降斛研究工作也不断得以深入。近十年米这一领域义有许多研究和相关报道，本文对相关工作进行了综述。 1国内外研究现状 1.1.石油烃类化合物被微生物氧化成为低分子化合物或完全分解为二氧化碳和水的作用。 1.2石油入海后发生一系列物理、化学和生物的变化，其中微生物对石油烃的降解起重要作用。微生物降解烃类是19世纪末发现的。20世纪50年代前，以美国C.E.佐贝尔为代表，对海洋微生物降解石油烃进行了广泛的研究。50年代初气相色谱问世，放射性同位素示踪法的普遍应用，对研究石油烃的微生物降解机制起了积极的作用。60年代以来，由于海上石油污染日趋严重，促使不少沿海国家，如美国、加拿大、日本、英国和苏联等国，积极开展了有关海洋微生物降解石油烃的研究工作。70年代中期，美国学者还用基因工程的技术培育了“超级微生物”，以期能有效地降解石油烃。 中国自1975年起，先后对青岛胶州湾、渤海、厦门港、黄海和东海石油降解微生物的数量、分布、种类组成和影响降解因素等进行了调查研究。 1.1烃类微生物概述 能够降解（氧化）石油烃，或以石油烃为其碳源的微生物称为烃类微生物。

微生物菌种的分离和纯化方法

在从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。 不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特分子生物学的研究及应用中，防止其他微生物的混入。定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”， 、用固体培养基分离和纯化1 有繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、便成称为菌落。一定形态结构的子细胞生长群体，当固体培养基表面众多菌落连成一片时，可以成为菌苔。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，以及许多真菌和单细胞藻鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌、为对该微生物进行分类、所谓平板，类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。即培养平板的简称，它是指固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。固体培养基用琼脂或其它凝这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。胶物质固化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。建立的采用Kock最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100 稀释倒平板法1.1 ），然后分别取不、1:100001:1000首先把微生物悬液作一系列的稀释（如1:10、1:100、50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培同稀释液少许，与已熔化并冷却至如果养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。这个菌落可能就是由一个在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，稀释得当，细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。涂布平板法1.2 且采用稀释因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，因此在微生物倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，再用无菌玻璃涂棒将将一定量的微生物悬液滴加在平板表面，制成无菌平板，冷却凝固后，）。菌液均匀分散至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落（图1供参 考． 涂布平板法1 图平板划线法1.3 最简单的分离微生物的方法是平板划线法，即用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，），微

土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 教学设计

专题2 微生物的培养与应用 课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数教学设计 金堂县竹篙中学谭善财2013-3-16 一．本节课内容的总体目标 二、教学重点与难点 课题重点：对土样的选取和选择培养基的配制课题难点：对分解尿素的细菌的计数 三、课时： 1h 四、本课题内容标准 1、研究培养基对微生物的选择作用，“研究”属于知识性领域的目标动词，应用水平 2、进行微生物的分离，“进行”属于技能性领域目标动词，独立操作水平 3、测定某种微生物的数量，“测定”属于技能性领域目标动词，独立操作水平。 五、本课题研究思路

六、教学思路： 七、教学流程 八、教学过程 教学内容 教师活动 学生活动 设计意图 复习提问 1.微生物最常用的两种接种方法是什么？ 2.什么稀释涂布平板法？其目的是什么？ 学生回忆 为细菌计数原 理、操作做好铺 垫 导入课题 引导学生阅读“课题背景”知识，提出的问题。 学生自主学习 回答问题 创设情景，引入 新课，使学生明 确分解尿素的细 菌的重要性，突出课题的必要性

研究思路 1、筛选 菌株 1、教师让学生阅读课本P21，讲解：DNA 聚合酶作用，发现过程。引导学生得到启示根据它对生存环 境的要求，到相应的环境中去寻找（即自然界筛 选）。 2、实验室中微生物的筛选原理实验室筛选：人为提 供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、p H 等），同时抑制或阻止其他微生物生长。 3、教师展示各种筛选菌株方法的多媒体图片： 黄石公园热泉 海底火山 大肠杆菌显色培养基 实验室筛选SARS 菌株 4、培养基选择分解尿素的微生物的原理：培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿 1、DNA 聚合酶发现过程，同学们得到什么启示？ 2.学生讨论为什么Taq 细菌能从热泉中筛选出来吗？ 3、学生阅读课本P22侧边栏关于本课题使用的培养基成分相关内容，讨论并回答提供碳源和氮源的分别是什么物质。 4.学生分析讨论，以尿素为唯一 氮源的培养基能否筛选出分解尿素的细菌 3、学生观看教师展示的多媒体图片。 4、学生讨论培养基如何对微生物进行筛选。 引导学生对知识进行迁移学习，培养学生的逻辑迁移思维。 通过观看图片， 使学生由感性认 识过渡到理性认 识。培养学生的学科素养。

石油降解菌的分离

从环境样品中分离筛选石油 降解菌的方案

引言 随着经济技术的迅速发展，石油日渐成为我过的主要能源，且需求量日益增大。研究表明，石油生产和运输环节会对土壤造成严重污染，且污染面积不断扩大。目前，我国石油行业每年产生的含油污泥多大八十万吨。由于石油的粘度大、粘滞性强，会再短时间内形成小范围的高浓度污染，长期的石油污染还会影响土壤的通透性，减少土壤肥力，阻碍植物生长。同时，石油中所含的多环芳香烃具有“三致”效应，一些挥发组分能引起人体麻醉、窒息和化学性肺炎等疾病。因此，石油污染对土壤生态系统的平衡和人体健康都有很大的危害。 目前，针对石油污染治理的方法主要包括：物理方法、化学方法以及生物修复法，但物理方法修复费用较高，耗材较多：化学方法会使用大量化学淋洗剂，很容易造成二次污染。相较而言，微生物修复技术由于生产费用低、不产生二次污染等特点而被视为一项最具有应用前景的修复技术。而且随着分子生物学的发展，无论是DNA文库的建立，还是多态性分析方法的进步，都为污染物的生物修复提供了全新的技术支持。既然生物修复法有诸多优点，那么就应该充分发挥其特性。本文则是着眼于环境样品，分离筛选其中的石油降解菌，以扩大培养进行更大规模的石油降解。 摘要 在长期被石油污染的土壤中，微生物可逐渐改变自身的代谢条件以适应环境。即以石油烃为碳源进行生长、繁殖，同时将石油烃降解。因此在这种土壤中存在着可降解石油烃的微生物，但石油烃降解菌的筛选、分离是生物法处理石油污染的关键。从这个角度考虑，以长期石油污染的土壤中微生物为菌源，从中筛选、分离出高效的石油烃降解菌。要降解哪里的石油就用哪里的土壤培养石油降解菌。目前，国内对极端条件下石油降解微生物研究较少，尤其是对低温、耐盐的石油降解菌，中国北方的大部分湿地，盐碱程度比较高，成年气温较低。无论是来源于海上还是来源于石油化工的污染都比较严重。本文针对大连开发区因石油泄露而被污染的白石湾，就地选取材料进行石油降解菌的筛选以及分离研究。

最新土壤中放线菌的分离与纯化

土壤中放线菌的分离与纯化 实验目的 1掌握放线菌的生长特性，微生物的培养方法。 2掌握微生物实验的基本生物技术，主要包括无菌操作技术，纯种分离技术，纯种培养技术，以及抗生素检测等。 3掌握合成培养基，选择培养基的制备方法。 4学习对微生物实验的中出现问题的分析，解决方法 实验材料 药品：可溶性淀粉、KNO3、NaCl、K2HPO4?3H2O、MgSO4?7H2O、FeSO4?7H2O、琼脂、重铬酸钾 其他：高压蒸汽灭菌锅、扭力天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、试管、牛皮纸、硫酸纸、线绳、无菌培养皿、铁锹、小铲、酒精棉球、镊子、玻璃铅笔。 实验原理 放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中（主要是链霉菌），其数量仅次于细菌。一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。分离放线菌常用稀释倒

平板法。根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基或有机氮培养基。如果培养基成分改变，或土壤预先处理（120℃热处理1h），或加入某种抑制剂（如加数滴10%酚等），都可以使细菌，霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌。再通过稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。 放线菌可以产生抗生素，抑制其他菌种的生长，故可用金黄色葡萄球菌（G+）和大肠杆菌（G-）作指示菌鉴别放线菌。 高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基。这种培养基是采用化学成分完全了解的纯试剂配制而成的培养基，高氏一号培养基：碳源为可溶性淀粉、氮源为KNO3 、NaCl 、K2HPO4?3H2O 、MgSO4?7H2O 作为无机盐，FeSO4?7H2O作为微生物的微量元素，提供铁离子等组成 1.高氏一号合成培养基的制备 K2HPO4 ?3H2O 0.125g，可溶性淀粉5g，硝酸钾0.25, MgSO4? 7H2O0.125g， FeSO4?7H2O 0.025g，氯化钠0.125g，琼脂5g，水250ml。 配制时，先依次加入上述药品（除琼脂外）顺序溶解，加入无菌水至250ml，调节pH＝7.4，再加入琼脂不断搅拌震荡至溶化后，121℃灭菌20分钟。 将6套平皿、12只试管灭菌。

石油降解希瓦氏菌

第21卷第2期极地研究Vol.21,No.2 2009年6月CH I N ESE JOURNAL OF P OLAR RESE ARCH June2009 研究论文 影响南极海洋石油烃低温降解菌希瓦氏菌NJ49生长和降解率的环境因素研究 刘芳明1,2　缪锦来1,2　臧家业1　董春霞3　王以斌1,2 (1国家海洋局第一海洋研究所,青岛266061;2海洋生物活性物质国家海洋局重点实验室,青岛266061; 3颐中(青岛)实业有限公司,青岛266021) 提要　以柴油为唯一碳源和能源,从南极海水海冰微生物资源库中筛选到一株石油烃低温降解菌希瓦氏菌NJ49,并对影响其生长和降解率的环境因素(pH、温度、盐度、营养盐和表面活性剂)进行了初步研究。结果表明:希瓦氏菌可作为低温海域石油烃污染生物修复的菌源,其生长和降解的最适条件为:初始pH7.5,温度15℃,盐度6%,摇瓶装量80m l,最佳氮源硝酸铵,最佳磷源为磷酸二氢钾和磷酸氢二钾的混合物,添加表面活性剂可促进希瓦氏菌NJ49的生长和生物降解率。 关键词　南极海洋　低温降解菌　柴油　生物降解　环境因素 0　引言 随着海上石油开采、运输和各类交通活动的日益频繁,海洋中石油烃污染物逐渐增多,而大规模溢油事件也时有发生,给海洋生态及近岸环境造成严重危害,由于自然微生物的生物修复是清除海洋石油烃污染的一种重要机制[1],因此备受关注。国内研究者对海洋中温降解菌的生物降解曾进行了广泛研究[2—4],但对低温环境中石油烃降解研究较少。 南极低温微生物资源丰富,从中获取低温降解菌成为新的研究热点,国外学者已从南极海洋中分离筛选得到不同种属的降解细菌,如Ha lo m onas[5]、R hodococcus[6]和Sphin2 go m onas[7],有的降解菌可以在4℃条件下降解烷烃[8],甚至在更低的温度条件下降解多环芳烃[9],为低温环境石油烃污染修复提供了新的思路。 柴油是一种复杂的蒸馏混合物,内含碳原子数为C9—C20范围的石油烃,因此是研 [收稿日期]　2008年11月收到来稿,2009年2月收到修改稿。 [基金项目]　国家自然科学基金项目(40876107)资助。 [作者简介]　刘芳明,男,1978年出生。实习研究员,主要从事海洋环境污染、监测与修复研究。

食品中腐败菌的分离纯化及生物学性状观察

微生物学大实验 食品中腐败菌的分离纯化及生物学性状观察 （标题小四黑体，正文小四宋体，段前、段后0，行距20磅） 专业 班级 姓名 同组人 日期

0 前言 食品腐败变质是指食品受到各种内外因素（例如温度，气体等）的影响，造成其原有物理性质或化学性质发生变化，降低或失去其营养价值和商品价值的过程。食品腐败变质的过程实质上是食品中碳水化合物、蛋白质、脂肪在污染微生物的作用下分界变化、产生有害物质的过程。 本次实验以略微腐烂的苹果、栗子、香蕉，饮料为材料，运用三区划线、倾注、点植、涂布等方法从中分离出腐败菌，观察和分析其菌种及菌落形态。 1 试验材料和仪器设备 1．1试验材料 食材：土豆、苹果、栗子、香蕉、饮料。 试剂：营养琼脂粉、麦芽粉、琼脂粉、葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、磷酸氢二钠、溴麝香草酚兰溶液、草酸结晶紫、碘液、95%酒精、沙黄、生理盐水、%吕氏碱性美蓝染液、自来水等。 1．2仪器设备 试验仪器：显微镜、蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、试管、酒精灯、接种针（环）、针、培养皿、盖玻片、载玻片、三角玻璃涂布棒等。 2 试验方法 培养基的制备 2.1.1营养琼脂培养基 称取4.5克营养琼脂粉，加入100ml水加热溶解，分装，在121℃下蒸汽灭菌。20min后取出导入无菌平皿中冷却凝固。 2.1.2土豆培养基 将去皮土豆200g切成2cm左右小块加入1000ml水煮沸10min，过滤补充水份，加入20g琼脂粉，20g葡萄糖，加热溶化，分装，121℃下蒸汽灭菌20min。 2.1.3麦芽汁培养基 称取5g麦芽粉加入100ml和2g琼脂，在115℃下蒸汽灭菌20min。 2.1.4糖发酵培养基的制备 2.1.4.1葡萄糖发酵管 取0.25g葡萄糖加入100ml的已配置好的糖溶液混合均匀即可. 2.1.4.2葡萄糖发酵管 取0.25g乳糖加入100ml已配置好的糖溶液混合均匀即可.

石油烃类的微生物降解研究

石油烃类的微生物降解研究 石油作为重要能源之一已被世界各国广泛使用，随之而来的石油烃污染已经对人类生存的土壤及水体环境造成了严重的危害，微生物降解是一种处理石油烃污染的理想方法。综述了降解菌种类和不同烃类的微生物代谢途径，分析了包括温度、营养物、氧和pH值等环境因素对石油烃降解的影响，为进一步的研究应用提供参考依据。 随着工业和经济的发展，人类对能源的需求日渐增多，促进了石油工业的飞速发展；在石油生产、贮运、炼制加工及使用过程中，不可避免地会有石油烃类的溢出和排放，造成土壤及水体的石油污染。据统计全球每年倾注到海洋的石油总量在200~1000万t之间。辽宁省环境中心监测站的化验结果显示，在辽河油田的重度污染区内，土壤中的含油量已达到10 000 mg／kg以上，是临界值(200 mg／kg)的50多倍，严重影响了油田附近的生态环境。 石油烃类物质引起的环境污染越来越引起人们的关注。利用物理、化学方法处理石油烃可以得到较受到了限制翻。生物处理方法是近年来发展起来的，具有处理效果好、费用低、对环境影响小、无二次污染及应用范围广等优点，是迄今为止处理石油烃污染比较好的一种方法。 1.降解石油烃类的微生物种类 国外在20世纪40年代就开展了细菌降解石油烃的研究，我国这方面的研究始于20世纪70年代末期。研究表明，在土壤和水体环境中存在着大量能够降解石油烃的微生物，主要是细菌和真菌；细菌在海洋生态系统的石油烃类降解中占主导地位，而真菌则是淡水和陆地生态系统中更为重要的修复因子。石油烃降解菌和藻类见表1。

大量研究表明，当菌群处于石油污染环境中时，利用烃类化合物的微生 物数量急剧增长，尤其是含降解质粒的微生物。Atlas报道在正常环境下降解菌一般只占微生物群落的1％，而当环境受到石油污染时，降解菌比例可提高到10％。含质粒细菌在石油烃污染环境中出现的频率和数量LL-t~污染环境高，说明质粒在石油烃的降解中可能起着重要作用。降解质粒的存在为降解工程 菌的构建提供了可能。 2.石油烃类的微生物代谢途径 2.1 直链烷烃 通常认为饱和烃在微生物作用下，直链烷烃首先被氧化成醇，醇在脱氢 酶的作用下被氧化为相应的醛，然后通过醛脱氢酶的作用氧化成脂肪酸；氧 化途径有单末端氧化、双末端氧化和次末端氧化[7]。在转化为相应的脂肪酸后，一种转化形式为直接经历随后的／3一氧化序列，即形成羧基并脱落2个 碳原子；另一种转化形式为脂肪酸先经历60一羟基化形成∞一羟基脂肪酸， 然后在非专一羟基酶的参与下被氧化为二羧基酸，最后再经历一氧化序列

细菌 、放线菌 、酵母菌及霉菌的分离与纯化

土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化 一、实验目的 1. 学习、掌握从土壤稀释分离、划线分离各类微生物的技术。 2. 学习从样品中分离、纯化出所需菌株。 3. 学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物的培养条件和培养时间。 4. 学习平板菌落计数法。 二、实验原理 将待分离的样品进行一定的稀释，使微生物的细胞（或孢子）尽量呈分散状态，选用有针对性的培养基，在不同温度、通风等条件下培养，让其长成一个纯种单个菌落。 要想获得某种微生物的纯培养，还需提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。微生物四大类菌的分离培养基、培养温度、培养时间见表2-1所示。 表2-1 微生物四大类菌的分离和培养要求 样品来源分离对象分离方法稀释度培养基名称培养温度 /℃培养时间/d 土样细菌稀释分离10-5，10-6， 10-7 牛肉膏蛋白胨30～37 1～2 土样放线菌稀释分离10-3，10-4， 10-5 高氏1号28 5～7 土样霉菌稀释分离10-2，10-3， 10-4 马丁氏琼脂28～30 3～5 面肥或土样酵母菌稀释分离10-4，10-5， 10-6 马铃薯葡萄糖28～30 2～3 细菌分离平 板 细菌单菌落划线分离10-2 牛肉膏蛋白胨30～37 1～2 三、实验材料 1. 菌源土样 2. 培养基牛肉膏蛋白胨培养基，马丁氏培养基，高氏合成1号培养基，马铃薯葡萄糖培养基(制平板和斜面)，见附录Ⅲ。 3. 无菌水 250 mL锥形瓶，每瓶装99 mL无菌水(或95mL为分离霉菌用)，内装10粒玻璃珠。 4.5 mL无菌水试管(每人5～7支)。 4. 其他物品无菌培养皿，无菌移液管，无菌玻璃涂棒(刮刀)，称量纸，药勺，橡皮头，10%酚溶液。 （一）系列稀释平板法 1. 取土样 选定取样点，按对角交叉（五点法）取样。先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。盛土的容器应是无菌的。将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等杂物，装入已灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。同时取10～15g，称重后经105℃烘干8h，置干燥器中冷却后再次称重，计算含水量。土样采集后应及时分离，凡不能立即分离的样品，应保存在低温、干燥条件下，尽量减少其中菌种的变化。 2. 制备土壤稀释液 称土样1g于盛有99mL无菌水的三角瓶中，充分振荡，此即为10-2浓度的菌悬液。用无菌移液管吸取悬液0.5mL于4.5mL无菌水试管中，用移液管吹吸三次，摇匀，此即为10-3浓度。同样方法，依次稀释到10-7。稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下进行。

高效石油降解菌的筛选

海洋中高效石油降解菌的筛选 楼浩 04016158

摘要 本研究利用原油为唯一碳源，采用富集培养分离的方法从象山港的表层海水和底泥混合物中筛选到两株石油降解菌株F3和F4。通过检测，两种菌株在油浓度为2000mg·L-1、温度为28℃的条件下培养七天后，降解率分别达到了48.1%和51.3%，与目前已筛选出的海洋石油降解菌相比较，F3、F4均属于降解率较高的菌株。本研究还对营养盐、原油浓度等影响F3、F4菌株生长和降解率的相关因素进行了初步探讨。结果表明：①氮、磷营养盐在较大程度上限制了F3、F4菌株对原油的降解率，是主要的限制因子。在氮磷浓度≥1.0m g·L-1时，F3菌株才能达到最大的降解效率48.1%，在氮磷浓度≥1.5m g·L-1时，F4菌株才能达到最大的降解效率57.3%。②F4菌株的降解率随原油浓度的降低而增加。在原油浓度为400mg·L-1时，F3、F4菌株的降解率分别达到57.6%和61.5%，而在油浓度为4000 mg·L-1时，F3、F4菌株的降解率仅为27.5%、11.2%，相比之下F3菌株对原油浓度的耐受能力更强。 关键词：石油降解菌；筛选；原油降解率；氮磷营养盐；原油浓度

ABSTRACT The use of oil as the sole carbon source, using enrichment culture method from the surface water and sediment which in the Xiangshan Port isolated two strains of oil degradation, Named as F3 and F4. To detect these two strains in the oil concentration was 2000mg/L, the temperature is 28℃ training seven days ,The degradation rate respectively reached 48.1% and 51.3%, compared with that which has been selected marine oil degrading bacteria, F3, F4 belong to the higher efficiency degradation of crude oil strain. The issue also conducted a preliminary test about nutrients, oil concentration and so on which Impact F3, F4 strain growth and the degradation efficiency. The results showed that: ①nitrogen and phosphorus nutrient limitation to a greater extent on the F3, F4 strains degradation efficiency , is the main limiting factor. In the concentration of nitrogen and phosphorus ≥ 1.0mg/L, F3 strain to achieve normal degradation efficiency 48.1%, the concentr ation of nitrogen and phosphorus in ≥ 1.5 mg/L, F4 strains to reach the degradation efficiency is 57.3%. ② the degradation of the F4 strain increasing when the concentration of oil reduced. in the concentration of 400 mg/L, The degradation rate of F3, F4 strains respectively reached 57.6% and 61.5%, the concentration of oil in the 4000mg/L, The degradation rate F3, F4 strains of was only 27.5%, 11.2%, but compared with F4, F3 strains better adapted to the higher concentration of oil. Key Words: Petroleum Degrading strains; Screening;Degradation of oil;nutrients of nitrogen and phosphorus; Oil concentration

石油烃降解菌的研究【文献综述】

文献综述 食品科学与工程 石油烃降解菌的研究 [摘要]石油烃降解菌，是一种能在油水表面上生长而降解石油的微生物，因土壤和近海中含有丰富的N、P等营养原料，所以在近海和土壤中的石油烃降解菌的密集度较高，然而，由于远海中会缺乏N、P等营养物质，所以石油降解菌的繁殖受到一定的制约。当海水一旦受到石油的污染后，降解菌就不能很快消除污染物，所以培养适应能力和降解率高的石油降解菌是解决石油污染的主要方法。 [关键词]石油污染；石油烃降解菌；石油烃（TPH），微生物 作为现代工业的关键燃料和原料，石油及其加工品广泛应用在生产和生活的各个领域，包括工业、军事、交通等各行业，但是随着石油工业的快速发展,石油同时也成为海洋环境的主要污染物.据初步统计,由于各种原因,全世界每年有约1.0×107t的石油进入海洋环境中,我国每年排入海洋的石油达1.15×105t[1]。 由于工艺水平的限制和处理技术的落后，大量含石油类的废水、废渣不可避免的被排入到生态环境中，严重了影响整个生态系统，尤其是土壤和海洋系统。虽然石油在人类社会发展提供有力的能源来源，但伴随带来的环境污染问题也日益加剧。土壤，是人类赖以生存的重要自然资源之一，要对受石油污染土壤进行完整的治理，并使它在短时间内达到可耕作的标准水平，对于保护生态环境、实现农业和工业的可持续发展具有非常重要的意义。在污染土壤的各种治理的方法中，微生物修复法对环境破坏性小而且消费低而受到人们的重视，近年来的发展尤为迅速，在一定程度上为污染土壤的修复带来技术上的更新，也为解决石油污染问题带来新的希冀。但是，从污染性质来看，即使油井关闭后，其对环境的影响仍会持续相当长的时间[2]。这些都引起了社会各界的普遍关注,近年来，从中央到地方各大主要媒体对这一问题均作了大量专题报道[3]。 一、土壤石油污染的来源 石油污染,一般指原油的初级加工产品(包括汽油、柴油等)以及各类石油的分解产物所造成的污染。在石油的开采、加工和使用的过程中，造成的石油溢出和泄漏，对环境（空气、土壤、海洋等）产生极大的负面影响。而土壤是作为物质流动和能量循环的重要环境，常常是污染物迁移、停留和积累的最终承受者。 石油污染物主要是通过五种方式进入到土壤中：⑴原油的泄漏和溢油意外引起的落地原油污染；⑵含油的矿渣、污泥和废物的堆放，导致石油向土壤渗透并向四周扩散；⑶使用含油污水灌溉农田；⑷汽车尾气的排放所产生的气态石油类污染物渗入到土壤中；⑸药剂污染，即作为各种杀虫剂、防腐剂的溶剂和乳化剂等的石油类物质随药剂使用而进入到土壤中。在这些因素中，前三个因素是引起土壤石油污染最主要的原因，造成污染的面积

【开题报告】石油烃降解菌的筛选

开题报告 食品科学与工程 石油烃降解菌的筛选 一、综述本课题国内外研究动态，说明选题的依据和意义 目前，常有有关石油及其产品的微生物降解方面的研究报道，但对这些研究大多数以分离鉴定微生物种类为主，对混合菌株性能评价以及它们对高含油量的油泥降解研究很少。 作为现代社会的最主要动力燃料与化工原料，石油及其产品广泛应用于生产和生活的各个方面，包括工业、农业、军事、交通运输等各个行业，因此人们将石油称作“黑色的金子”。但是随着石油工业的发展，由于工艺水平和处理技术的限制，在许多环境特别是海洋环境中，石油污染已经成为一个普遍而严重的问题，石油的主要成分是烃类，在一个典型的石油样品中，含有的烃类可达200~300种之多，石油进入海洋后，石油中的一些成分可直接挥发而进入空气；一小部分海洋表面的石油受到紫外线作用可发生光化学分解，但速度极慢；而绝大部分石油要通过微生物的降解作用才得到净化。石油烃降解菌是一类能在油水界面上生长繁殖而降解石油的微生物，在近海、海湾等处，因海水中含有丰富的N、P等营养物质，石油降解菌的数量较多，然而，由于外洋海水中N、P等营养组织的缺乏，石油降解菌的繁殖受到制约，一旦污染，不容易很快消除，所以培养石油降解菌成为治理海上石油污染的主要方式。 而且在污染土壤的各种治理方法中，微生物修复由于具有费用低、处理效果好并且对环境破坏性小等诸多优点而受到人们的重视。所以筛选和培养石油烃降解菌对减轻石油污染是一个非常有意义的事情。 二、研究的基本内容，拟解决的主要问题： 1、降解石油烃的菌类哪些比较常见 2、石油烃降解菌降解石油的情况是怎样，会不会对环境产生二次污染 3、石油烃降解菌降解石油的能力会受环境的哪些因素影响 三、研究步骤、方法及措施： 1.用牛肉膏蛋白胨培养基进行菌种分离纯化与斜面保藏。

微生物菌种的分离和纯化方法

微生物菌种的分离和纯 化方法 https://www.wendangku.net/doc/3347001.html,work Information Technology Company.2020YEAR

从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。 1、用固体培养基分离和纯化 单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落。当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板，即培养平板的简称，它是指固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基用琼脂或其它凝胶物质固化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由Kock建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。 1.1 稀释倒平板法 首先把微生物悬液作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。 1.2 涂布平板法

土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(教案)

课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 ★课题目标 （一）知识与技能 利用选择培养基分离细菌，运用相关技术解决生产生活中有关微生物的计数 （二）过程与方法 分析研究思路的形成过程，找出共性和差异性 （三）情感、态度与价值观 形成无菌不在的概念，养成讲究卫生的习惯 ★课题重点 对土样的选取和选择培养基的配制 ★课题难点 对分解尿素的细菌的计数 ★教学方法 启发式教学 ★教学工具 多媒体课件 ★教学过程 （一）引入新课 上节课我们学习了培养基的配置以及接种技术。下面我们来学习如何进行细菌的分离，获得所需要的目的微生物。 （二）进行新课 1．基础知识 1．1 尿素是一种重要的氮肥，农作物不能（能，不能）直接吸收利用，而是首先通过土壤中的细菌将尿素分解为氨和CO2 ，这是因为细菌能合成脲酶。 1．2 科学家能从热泉中把耐热细菌筛选出来是因为热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物，这样也适用于实验室中微生物的筛选，原理是人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、PH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。 点评：生物适应一定环境，环境对生物具有选择作用。所以通过配制选择培养基、控制培养条件等选择目的微生物。 〖思考1〗在该培养基配方中，为微生物的生长提供碳源的是葡萄糖，提供氮源的的是尿素，琼脂的作用是凝固剂。 〖思考2〗该培养基对微生物具有（具有，不具有）选择作用。如果具有，其选择机制是只有能够以尿素作为氮源的微生物才能在该培养基上生长。

1．3在统计菌落数目时，常用来统计样品中活菌数目的方法是稀释涂布平板法。除此之外，显微镜直接计数也是测定微生物数量的常用方法。 【补充】显微镜直接计数是测定微生物的方法。 公式：观察到的红细胞平均数∶观察到的细菌平均数＝红细胞含量∶细菌含量 1．4 采用稀释涂布平板法统计菌落数目时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300 的平板进行计数。 〖思考3〗从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数的计算方法是（平均菌落数÷涂布的稀释液体积）×稀释倍数。 〖思考4〗利用稀释涂布平板法成功统计菌落数目的关键是恰当的稀释度。 〖思考5〗第二位同学的结果接近真实值。你认为这两位同学的实验需要改进的操作是第一位同学需设置重复实验组；第二位同学统计的三个菌落数相差太大，说明操作有误，需重新实验。 1．5统计的菌落数比活菌的实际数目低。这是因为当两个或多个细胞在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数来表示。 1．6设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。 1．7对照实验是指除了被测试的条件外，其他条件都相同的实验。满足该条件的称为对照组，未满足该条件的称为实验组。 〖思考6〗请设计本实验的对照实验组： 方案1：其他同学用A同学的土样进行实验。 方案2：A同学以不接种的培养基作为空白对照。 2．实验设计 2．1 实验设计的内容包括实验方案、材料用具、实施步骤和时间安排等。 2．2 根据图示2－7填写以下实验流程： 2．3 土壤微生物主要分布在距地表3～8cm的近中性土壤中，约70％～80％为细菌。2．4 分离不同的微生物采用不同的稀释度，其原因是不同微生物在土壤中含量不同，其目的是保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板。细菌稀释度为104、105、106，放线菌稀释度为103、104、105，真菌稀释度为102、103、104。 2．5 培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌一般在30～37℃培养1～2d，放线菌一般在25～28℃培养5～7d，霉菌一般在25～28℃的温度下培养3～4d。 2．6 在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结

高二生物土壤中分解尿素的细菌的分离与计数知识点梳理

高二生物土壤中分解尿素的细菌的分离与 计数知识点梳理 1.培养基一般都含有、、、四类营养物质，另外还需要满足微生物生长对、以及的要求。 2.培养基的分类：按照物理性质可以分为、、;按照化学性质分为和;按照用途分为和。 3.尿素可以为农作物提供肥，但是只有被分解成之后，才能被植物吸收利用。 4.以土壤中能分解尿素的细菌为研究对象，要达到的两个主要目的是： ⑴; ⑵。 (一)筛选菌株 1.原理: 人为提供有利于生长的条件(包括等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。 2.方法：选择培养基 (1)定义：在微生物学中，将允许的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。 (2)配制的的依据：

①在培养基中加入某种化学物质可以做到这一点，加入可以分离出酵母菌和霉菌。加入高浓度的食盐可得到。这里的加入是在培养的培养成分的基础上加入的。 ②培养基中的营养成分的改变也可达到分离微生物 的目的。如培养基中缺乏源时，可以分离固氮微生物。 ③当培养基的某种营养成分为特定化学成分时，也具有分离效果。 ④改变微生物的培养条件，也可以达到分离微生物的目的，如将培养基放在环境中培养只能得到耐高温的微生物。 (二)统计菌落数目 (1)测定微生物数量的常用方法有和。 (2)稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的原理 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活细菌。为了保证结果准确，一般设置个平板，选择菌落数在的平板进行计数，并取。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。 (三)实验设计 实验设计包括，所需、、用具和药品，具体的以及时间安排等的综合考虑和安排。