光纤非线性光学显微成像
中国科学 G 辑: 物理学 力学 天文学 2007年 第37卷 增刊: 138~145
https://www.wendangku.net/doc/303300919.html,
收稿日期: 2007-05-20; 接受日期: 2007-09-03
Australia Research Council 和国家自然科学基金(批准号: 60410131, 90508003)资助项目
* E-mail:
《中国科学》杂志社
SCIENCE IN CHINA PRESS 光纤非线性光学显微成像
付 玲①②* M. Gu ①②
(① 华中科技大学武汉光电国家实验室(等), 武汉 430074; ② Centre for Micro-Photonics, Faculty of En-gineering and Industrial Sciences, Swinburne University of Technology, Hawthorn, Victoria 3122, Australia)
摘要 在光学显微成像领域, 基于光纤的小型非线性光学显微镜和内窥镜作为
传统显微镜和其他光学成像方法的一种重要补充形式, 近几年来受到人们的关
注. 该文介绍和总结了光纤非线性光学显微成像技术及其在生物医学中的应用.
首先介绍了结合非线性光学显微技术和单模光纤耦合器获得小型非线性光学显
微镜的方法; 特别对基于双包层光子晶体光纤和微电机系统扫描镜的光纤非线性
内窥成像系统进行了分析; 最后通过消化器官的组织成像实验说明了光纤非线性
光学显微镜的重要应用. 研究证明了基于光纤和微电机系统MEMS 扫描镜的非
线性内窥镜的新概念, 并用于生物组织的成像.
关键词 非线性光学显微成像 光纤耦合器 双包层光子晶体光纤 微电机系
统扫描镜 组织成像
显微镜改变了人类认识世界的方法, 是人类历史上最重要的发明之一. 经过300多年的发展, 光学显微成像已成为自然科学研究领域中的重要分支, 为生命和信息等科学领域不断提供新方法和新概念[1]. 特别是上世纪末期出现的非线性光学显微镜具有光学层析能力并能在
厚组织(毫米量级)内实现高空间分辨率(亚微米)成像, 是现代光学显微成像技术的革新, 为人们研究厚组织中的分子和细胞功能提供了有力的工具[2,3]. 非线性光学成像技术主要基于多光
子吸收(multiphoton absorption)[4]、高次谐波(higher harmonic)[5]和相干反斯托克斯拉曼散射(coherent anti-Stokes Raman scattering, CARS)[6]等光学非线性效应, 其中以双光子荧光成像的应用最为广泛. 自非线性光学显微镜诞生以来[4], 科学家们一直致力于将其用于活体(in vivo )成像. 然而, 复杂的光学系统和沉重的光学器件使非线性光学显微成像的研究局限于庞大的显微镜系统, 无法应用到活体的内部器官(internal organs)和整体动物(intact animals)成像.
近年来, 随着新型光纤和微制造技术的迅猛发展, 光纤非线性显微镜和内窥镜(fiber-optic nonlinear optical microscopy/endoscopy)的研究正在扭转这一局面[7]. 光纤非线性显微镜和内窥镜是小型的非线性光学显微成像系统, 由光纤传输激发光或者非线性光信号, 并利用微型扫
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描机制构建光学图像. 光纤的超小尺寸(一般只有数百个微米的直径)与良好的机械和光学性能增加了成像系统的灵活性并减小了系统的尺寸, 使非线性光学成像技术在内部器官和活体动物中的研究成为可能. 自Denk研究小组和Gu研究小组先后研制出基于单模光纤的双光子荧光显微镜之后[8,9], 光纤非线性显微镜和内窥镜的研究在短短6年之内进展迅速[10~19]. 光纤非线性显微镜和内窥镜研究中的关键问题是: (ⅰ) 近红外波段超短脉冲激光的传输和非线性光信号的收集. 光纤的色散和自相位调制等非线性效应会导致脉冲宽度和光谱的展宽, 降低激发效率[20]; 光纤的低数值孔径和小芯径限制了可见光信号的高效收集、系统的信噪比和成像深度. (ⅱ) 扫描机制. 扫描器件应该具有毫米量级的尺寸, 并能实现快速扫描和高图像分辨率来实时监测生物过程. (ⅲ) 系统设计. 系统设计是非线性内窥镜研究的关键, 直接决定了系统的灵活性, 功能和应用范围. 该文研究了基于单模光纤耦合器(single-mode fibre coupler)和双包层光子晶体光纤(double-clad photonic crystal fibre, DCPCF)的非线性光学显微成像系统, 首次实现了基于光纤耦合器的双光子荧光和二次谐波显微成像技术, 并证明了基于DCPCF和微电机系统(microelectromechanical system, MEMS)扫描镜的非线性内窥镜的新概念, 使光纤成像系统的信噪比提高了两阶.
1基于单模光纤耦合器的非线性光学显微镜
Bird和Gu[10,11]首次将单模光纤耦合器引入双光子荧光显微成像, 证明了三端口的单模光纤耦合器能传输近红外波段的超短脉冲激发光并收集荧光. 与基于单模光纤的非线性光学显微镜相比[9], 使用单模光纤耦合器能将非线性显微镜的纵向分辨率提高30%, 且使系统更紧凑并具有自准直的特性. 然而, 二次谐波比双光子荧光更远离单模光纤耦合器的工作波长; 二次谐波源于相干过程, 其偏振各向异性的测量(polarisation anisotropy measurement)要求光纤耦合器能同时传输偏振的激发光和谐波信号[15]. 因此, 我们首先研究了单模光纤耦合器在不同波长的传输特性, 结果如图1(a). 实验中端口3单模光纤耦合器(Newport, F-CPL-S12785)的工作波长为780 nm, 分束比(Splitting ratio)是50:50, 纤芯与包层的直径分别为5和125 μm. 当波长范围在770~870 nm时, 耦合器中端口3~1的耦合效率为20%~41%; 端口2~1在435~532 nm 波长范围内的耦合效率为29%~41%. 当长度为2 m的光纤耦合器传输80~150 mW的激发光至样品端时, 尽管光纤中的群速度色散和自相位调制使脉冲展宽到数皮秒, 系统仍有足够的激发光功率用于非线性成像. 实验结果还表明, 单模光纤耦合器在可见光波段的功能类似于普通光学显微镜中的二向色镜(Dichroic mirror). 当435 nm的激光耦合入端口1, 端口2和端口3的分束比为99.6:0.4, 而且两个端口的输出模式分别表现出单模和多模的特征(图1(b), (c)). 532 nm的激光在单模光纤耦合器中传播时, 测量得到的分束比和输出模式也具有相同特征(图1(d)). 因此, 为了优化在基于单模光纤耦合器的非线性显微镜系统中激发光与非线性信号的传输, 超短脉冲激光通过端口3(激发臂)传递到端口1(样品臂), 后向散射的双光子荧光和二次谐波则由端口1通过端口2(信号臂)被探测器收集(图1). 光纤纤芯能消除焦点以外的杂散光, 在成像系统中具有共聚焦针孔(Pinhole)的功能.
除了单模光纤耦合器传输特性的研究, 二次谐波光谱的研究也是验证光纤成像系统的关键. 在图1的实验系统中, 我们以AF-50为样品, 用光谱仪(Acton Research Corporation)测量了经过单模光纤耦合器的双光子荧光和二次谐波的光谱. 当激发波长是800 nm时, 通过单模光纤耦合器的辐射谱包含400 nm的二次谐波谱线和430~600 nm的双光子荧光(图2). 二次谐波
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的光谱宽度约为9 nm, 约为激发光带宽的. 当激发光在780~870 nm范围内调谐时, 二次谐波光谱的中心波长则随激发光波长改变, 始终展示出倍频的特性.
图1 基于单模光纤耦合器的双光子荧光和二次谐波成像系统
(a) 单模光纤耦合器在可见光和近红外波段的耦合效率. (b)~(d) 可见光在激发臂和信号臂的输出模式; O1和O2为 0.25 NA
10×显微物镜, O3为0.85 NA 40×显微物镜
双光子荧光和二次谐波显微镜中的光学层析能力源于信号光强度与激发光强度的非线性关系, 纵向分辨率是非线性显微成像系统的重要参数. 通过在纵向位置扫描薄层AF-50, 我们得到了基于单模光纤耦合器的显微镜系统对双光子荧光和二次谐波的响应曲线(图2中的插图). 此结果表明, 在激发波长为800 nm时, 光纤显微镜对二次谐波和双光子荧光成像的纵向分辨率分别为1.8和2.1 μm. 可见二次谐波较短的信号波长使其成像的纵向分辨率比双光子荧光成像的纵向分辨率提高了14%. 当激发光波长由800 nm调谐到860 nm时, 二次谐波成像的纵向分辨率增加到 1.9 μm. 通过三维相干传递函数的理论计算, 我们发现与光纤参数和光学系统参数相关的归一化光纤尺寸对基于单模光纤的二次谐波成像系统的纵向分辨率起决定性的作用, 光纤中二次谐波波长的增加使归一化光纤尺寸增大, 纵向分辨率降低[21].
图2 基于单模光纤耦合器的非线性显微镜的双光子荧光(TPEF)和二次谐波(SHG)光谱与纵向响应曲线
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用偏振的二次谐波信号来反应结构蛋白的形态是二次谐波显微镜的特性之一. 为了证明基于单模光纤耦合器的成像系统具有探测二次谐波偏振各向异性的能力, 我们研究了单模光纤耦合器对偏振光传输和成像的影响. 测量结果表明, 在整个近红外和可见光波段, 单模光纤耦合器中的材料双折射特性使其能传播特定偏振方向的线性偏振光[22]. 因此单模光纤耦合器能传递线性偏振的激发光与高度有序的蛋白纤维(例如鱼鳞, black tetra fish scale)相互作用, 二次谐波经过光纤耦合器后的偏振状态可通过转动探测器前的偏振片并测量收集到的二次谐波强度来确定. 图3(a)和(b)是在探测器前偏振片(Newport, 10GT04)转角正交情况下光纤系统收集到的鱼鳞的二次谐波图像, 激发波长为800 nm, 探测器前的滤光片为400/9 nm. 当偏振片转角改变时, 收集到的二次谐波强度与转角θ 满足cos2θ 的关系(图3(c)). 此结果证明, 基于单模光纤耦合器的显微镜系统能保持二次谐波信号的线性偏振态, 并对结构蛋白成像.
图3 二次谐波偏振各向异性的测量
(a)和(b)偏振方向正交的二次谐波成像, 箭头方向为探测器前偏振片的转角方向. 标尺为20 μm. (c) 二次谐波的强度与
探测器前偏振片转角的cos2θ 关系
2基于双包层光子晶体光纤的非线性光学内窥镜
由于单模光纤能传输高质量的激光束并改善成像系统的层析能力, 因而在光纤成像系统中被普遍采用. 但是单模光纤的低数值孔径(约0.1~0.2)和较小的纤芯尺寸极大地限制了对生物样品中微弱光信号的收集和探测, 使非线性光学显微镜系统的灵敏度较低. 作为光纤领域的革新产物, 光子晶体光纤能通过设计光纤中二维光子晶体的结构实现普通光纤不能具备的功能, 彻底地改变了光纤传输光束的方式. 我们首次改造了有源的DCPCF, 并将其用于光学显微成像来提高系统的灵敏度. 由于MEMS器件具有小尺寸、低功耗、利于建造“芯片显微镜”等优点, 显微内窥成像系统中的扫描机制则由MEMS扫描镜来实现. 基于DCPCF和MEMS 扫描镜的非线性内窥成像系统如图4. 飞秒脉冲光经过光栅对(Newport, 1200 grooves/mm)和一个显微物镜(Melles Griot, 4×/0.12NA)后被耦合到DCPCF. 光纤中出射的光经过MEMS扫描镜后被渐变折射率(Gradient index, GRIN)透镜聚焦到样品上. 非线性光信号则通过MEMS扫描镜后被DCPCF收集到探测器.
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图4 基于DCPCF 和MEMS 扫描镜的非线性光学内窥镜系统
右上角是双包层光子晶体光纤的扫描电子显微镜图像与800 nm 激发光输出模式的叠加, 右下角是能
实现两维扫描的MEMS 扫描镜
非线性光学内窥成像系统中的DCPCF 是由用于光纤激光器的有源DCPCF 演化而来. 我们除去了有源光纤纤芯中的掺杂元素, 其目的是使近红外波段的激发光能在纤芯进行单模传输, 而位于可见光波段的非线性光信号则能被具有高数值孔径的内包层收集[16]. 成像系统中DCPCF(Crystal Fiber A/S)的纤芯和内包层直径分别为20和165 μm(图4). 纤芯被孔间距比(Hole to hole pitch ratio)为0.26的空气小孔包围. DCPCF 的内包层和外包层则被由一圈空气小孔分开, 使内包层拥有高数值孔径(~ 0.6). 需要指出的是, 这种大面积和高数值孔径的光纤只能利用光子晶体的结构实现, 而非普通光纤的制造技术. 通过对DCPCF 光传输特性的研究, 我们发现如果选择与纤芯数值孔径接近的耦合物镜, 改造过后的DCPCF 在410~870 nm 的耦合效率可达到80%~90%(图5). 而使用高数值孔径(0.65)的耦合物镜则会导致光泄露到内包层, 使耦合效率降低20%. 因此, 低数值孔径的耦合物镜能使近红外光耦合到纤芯中的效率为28%, 可见光耦合到内包层的效率为90%, 此数值是单模光纤对可见光耦合效率的两倍.
GRIN 透镜是一种利用特定折射率分布使光线聚焦的小型透镜. 当光纤和GRIN 透镜结合用于非线性光学成像系统, GRIN 透镜的有效数值孔径依赖于光纤和GRIN 透镜之间的距离, 因而
直接影响到光纤成像系统的效果[23]. 例如,
光束的耦合效率与有效数值孔径有关; 成像
的分辨率与有效数值孔径的平方成正比; 双
光子荧光的强度与有效数值孔径的4次方成
正比. 因此, 研究光纤系统的纵向分辨率和
信号水平随光纤和GRIN 透镜距离的变化是
优化系统设计的重要途径. 实验采用了直径
为0.5 mm, 节距(pitch)为0.2, 数值孔径为
0.5的GRIN 透镜(GRINTECH)和AF-50为样
品. 实验结果表明, 当DCPCF 与GRIN 透镜
之间的距离增大时, 双光子荧光成像的纵向
分辨率逐渐得到改善, 而且探测到的荧光强
度逐渐增大(图6(a)).
如果光纤与透镜之间
图5 双包层光子晶体光纤在可见至近红外波段的耦合效率
增刊付玲等: 光纤非线性光学显微成像143
的距离为5 mm, 激发光束充满GRIN透镜的后孔径, 系统能得到最佳的纵向分辨率, 即双光子荧光和二次谐波的纵向分辨率分别为6和5.4 μm (图6(b)). 与基于单模光纤耦合器和GRIN透镜的非线性显微镜系统相比, 由于DCPCF具有高数值孔径和大截面面积, 使用DCPCF取代单模光纤能实现纵向分辨率和非线性光信号的同时最优化, 而使用单模光纤的成像系统在探测到的荧光信号最强时却不具备最高的纵向分辨率[17,23].
图6
(a) 双光子荧光强度和纵向分辨率随GRIN透镜和光纤间距的变化, 荧光强度和纵向分辨率能在间距较大时被同时优化;
(b) 双光子荧光与二次谐波的纵向响应曲线
MEMS扫描镜是成像系统中实现二维光束扫描的器件. 我们使用的MEMS扫描镜是基于电热驱动(Electrothermal actuation)的原理, 在驱动电压少于12 V的情况下其光学扫描角度可达到30°[24]. 镜面的尺寸为0.5 mm, 表面铝膜对800 nm激发光的发射率约为80%(图4). 通过在MEMS扫描镜的快、慢轴应用特殊设计的波形和2.5~7.5 V的电压, 激光束的反射角被改变从而实现二维的线扫描(raster scanning), 其扫描速率为7线/s. 图7(a)是由基于DCPCF、MEMS 扫描镜、和GRIN透镜的显微镜系统获得的荧光微球的双光子荧光图像. 此结果证明了MEMS 扫描镜不仅能传递近红外超短脉冲用于非线性效应的激发, 而且能收集位于可见波段的荧光信号; 飞秒脉冲经过MEMS镜面之后, 脉冲大约展宽了25%, 故可通过镀膜技术来改善这一现象. 更重要的是, 以MEMS扫描镜作为扫描机制的非线性光学成像系统所产生的图像与通过普通扫描台获得的图像高度一致(图7(b)).
图7 基于DCPCF, MEMS扫描镜、GRIN透镜(a)和基于单模光纤耦合器、扫描台、GRIN透镜
(b)的显微镜系统对微球的双光子荧光成像
标尺为10 μm
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DCPCF的独特光学性质使非线性显微镜成像系统的灵敏度得到极大改善. 通过比较由DCPCF和单模光纤耦合器得到的双光子荧光图像(图7(a)和(b)), 我们发现DCPCF的应用使成像系统的信号水平提高了两个量级. 如果使用光栅对补偿脉冲光在DCPCF中经历的群速度色散, 成像系统的信号水平将会在此基础上再提高一个量级. 成像系统灵敏度的改善主要是因为DCPCF比单模光纤具有更高的数值孔径和更大截面面积, 减少了飞秒脉冲在光纤中传输的自相位调制效应, 使飞秒脉冲具有最小的畸变, 而且对GRIN透镜的色差有更强的兼容性.
3基于光纤非线性光学显微镜的组织成像
利用基于DCPCF, MEMS扫描镜和GRIN透镜的非线性光学内窥镜系统(图4), 我们对大鼠的大肠和胃部组织进行了成像, 结果如图8. 为了增加荧光成像的对比度, 大肠和胃部组织从大鼠(Sprague-Dawley)中剥离后, 用浓度为1%的Acridine Orange(Sigma)对其内表面上皮组织染色, 成像实验在大鼠牺牲后两小时之内完成. 大肠组织双光子荧光成像的穿透深度约为100 μm, 图8(a)是双光子荧光成像的截面之一. 光纤显微镜系统能清晰地显示表面上皮细胞和肠道孔穴(intestinal crypts, 箭头)的形态信息. 从大鼠胃部组织获取的双光子荧光图像(图8(b))展示出与大肠截然不同的形态结构, 显微系统的分辨率亦能将胃部的坑穴(gastric pits, 箭头)从上皮细胞中区分出来.
图8 使用基于DCPCF, MEMS扫描镜和GRIN透镜的光纤内窥镜系统对大鼠大肠组织(a)和
大鼠胃部组织(b)的双光子荧光成像
标尺为20 μm
4总结和展望
本文介绍和总结了基于单模光纤耦合器和DCPCF的非线性显微镜系统及其生物医学应用. 单模光纤耦合器能传递近红外波段的激发光和收集可见光波段的双光子荧光和二次谐波, 并在非线性显微镜系统中展示出二向色镜的特性. 基于单模光纤耦合器的成像系统能保持激发光和二次谐波的线性偏振态并用于研究结构蛋白的形态. 通过引入新型的DCPCF, 光纤非线性光学显微镜的灵敏度得到极大改善. MEMS扫描镜和GRIN透镜的结合使基于DCPCF的成像系统更加小型化, 大鼠大肠和胃部的组织成像也证明了非线性光学内窥镜系统的可行性. 在将来的研究中, DCPCF耦合器[25]与内窥镜系统将会实现整个成像系统的全光纤化, 这对光纤非线性光学显微镜的发展有着重要意义. 另外, 此光纤成像技术也可与显微成像领域中新的扫描技术[26,27]结合, 拓展多光子荧光成像的应用. 随着光纤器件和微制造技术的不断发展, 光纤非线性光学显微镜系统将日趋小型化, 为传统的光学显微成像技术提供重要的补充并在生物医学领域发挥作用.
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参考文献
1 Yuste R. Fluorescence microscopy today. Nat Methods, 2005, 2: 902—904[DOI]
2 Zipfel W R, Williams R M, Webb W W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nat Biotech, 2003, 21:
1369—1377[DOI]
3 Helmchen F, Denk W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods, 2005, 2: 932—940[DOI]
4 Denk W, Strickler J H, Webb W W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science, 1990, 248: 73—75[DOI]
5 Campagnola P J, Loew L M. Second harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and
organisms. Nat Biotech, 2003, 21: 1356—1360[DOI]
6 Cheng J X, Xie X S. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: instrumentation, theory, and applications. J Phys
Chem B, 2004, 108: 827—840[DOI]
7 Flusberg B A, Cocker E D, Piyawattanametha W, et al. Fiber-optic fluorescence imaging. Nat Methods, 2005, 2: 941—
950[DOI]
8 Helmchen F, Fee M S, Tank D W, et al. A miniature head-mounted two-photon microscope: high-resolution brain imaging in
freely moving animals. Neuron, 2001, 31: 903—912[DOI]
9 Bird D, Gu M. Resolution improvement in two-photon fluorescence microscopy with a single-mode fiber. Appl Opt, 2002,
41: 1852—1857[DOI]
10 Bird D, Gu M. Compact two-photon fluorescence microscope based on a single-mode fiber coupler. Opt Lett, 2002, 27:
1031—1033[DOI]
11 Bird D, Gu M. Two-photon fluorescence endoscopy with a micro-optic scanning head. Opt Lett, 2003, 28: 1552—
1554[DOI]
12 Jung J C, Schnitzer M J. Multiphoton endoscopy. Opt Lett, 2003, 28: 902—904[DOI]
13 G?bel W, Kerr J N D, Nimmerjahn A, et al. Miniaturized two-photon microscope based on a flexible coherent fiber bundle
and a gradient-index lens objective. Opt Lett, 2004, 29: 2521—2523[DOI]
14 Levene M J, Dombeck D A, Kasischke K A, et al. In vivo multiphoton microscopy of deep brain tissue. J Neurophysiol,
2004, 91: 1908—1912[DOI]
15 Fu L, Gan X, Gu M. Use of a single-mode fiber coupler for second-harmonic-generation microscopy. Opt Lett, 2005, 30:
385—387[DOI]
16 Fu L, Gan X, Gu M. Nonlinear optical microscopy based on double-clad photonic crystal fibers. Opt Express, 2005, 13:
5528—5534[DOI]
17 Fu L, Jain A, Xie H, et al. Nonlinear optical endoscopy based on a double-clad photonic crystal fiber and a MEMS mirror.
Opt Express, 2006, 14: 1027—1032[DOI]
18 Myaing M T, MacDonald D J, Li X. Fiber-optic scanning two-photon fluorescence endoscope. Opt Lett, 2006, 31: 1076—
1078[DOI]
19 Fu L, Gu M. Fibre-optic nonlinear optical endoscopy. J Microscopy, 2007, 226: 195—206[DOI]
20 Agrawal G P. Nonlinear Fiber Optics. San Diego: Academic. 1989
21 Gu M, Fu L. Three-dimensional image formation in fiber-optical second harmonic generation microscopy. Opt Express,
2006, 14: 1175—1181[DOI]
22 Fu L, Gan X, Bird D, et al. Polarisation characteristics of a 1×2 fiber coupler under femtosecond pulsed and continuous
wave illumination. Opt Laser Technol, 2005, 37: 494—497[DOI]
23 Fu L, Gan X, Gu M. Characterization of the GRIN lens-fiber spacing toward applications in two-photon fluorescence endo-
scopy. Appl Opt, 2005, 44: 7270—7274[DOI]
24 Jain A, Xie H. An electrothermal SCS micromirror for large bi-directional 2D scanning. 13th International conference on
Solid-State Sensor, Actuators and Microsystems. Seoul: IEEE Computer Society Press, 2005. 988—991
25 Fu L, Gu M. A double-clad photonic crystal fiber coupler for compact nonlinear optical microscopy imaging. Opt Lett, 2006,
31: 1471—1473[DOI]
26 Zeng S, Lv X, Zhan C, et al. Simultaneous compensation for spatial and temporal dispersion of acousto-optical deflectors
for two-dimensional scanning with a single prism. Opt Lett, 2006, 31: 1091—1093[DOI]
27 Li D, Zeng S, Lv X, et al. Dispersion characteristics of acousto-optic deflector for scanning Gaussian laser beam of femto-
second pulses. Opt express, 2007, 15: 4726—4734[DOI]
光学显微镜的结构与使用方法
光学显微镜的结构与使用方法 【目的要求】 1、熟悉光学显微镜的主要构造及其性能。 2、掌握低倍镜及高倍镜的使用方法。 3、初步掌握油镜的使用方法。 4、了解光学显微镜的维护方法。 【实验原理】 光学显微镜(light microscope)是生物科学和医学研究领域常用的仪器，它在细胞生物学、组织学、病理学、微生物学及其他有关学科的教学研究工作中有着极为广泛的用途，是研究人体及其他生物机体组织和细胞结构强有力的工具。 光学显微镜简称光镜，是利用光线照明使微小物体形成放大影像的仪器。目前使用的光镜种类繁多，外形和结构差别较大，有些类型的光镜有其特殊的用途，如暗视野显微镜、荧光显微镜、相差显微镜，倒置显微镜等，但其基本的构造和工作原理是相似的。一台普通光镜主要由机械系统和光学系统两部分构成，而光学系统则主要包括光源、反光镜、聚光器、物镜和目镜等部件。 光镜是如何使微小物体放大的呢？物镜和目镜的结构虽然比较复杂，但它们的作用都是相当于一个凸透镜，由于被检标本是放在物镜下方的1～2倍焦距之间的，上方形成一倒立的放大实相，该实相正好位于目镜的下焦点（焦平面）之内，目镜进一步将它放大成一个虚像，通过调焦可使虚像落在眼睛的明视距离处，在视网膜上形成一个直立的实像。显微镜中被放大的倒立虚像与视网膜上直立的实像是相吻合的，该虚像看起来好像在离眼睛25cm处。 分辨力是光镜的主要性能指示。所谓分辨力(resolving power)也称为辨率或分辨本领，是指显微镜或人眼在25cm的明视距离处，能清楚地分辨被检物体细微结构最小间隔的能力，即分辨出标本上相互接近的两点间的最小距离的能力。据测定，人眼的分辨力约为100 μm。显微镜的分辨力由物镜的分辨力决定，物镜的分辨力就是显微镜的分辨力，而目镜与显微镜的分辨力无关。光镜的分辨力（R）（R值越小，分辨率越高）可以下式计算： 这里n为聚光镜与物镜之间介质的折射率（空气为1、油为1.5）； 为标本对物镜镜口张角的半角，sin的最大值为1； 为照明光源的波长（白光约为0.5m）。放大率或放大倍数是光镜性能的另一重要参数，一台显微镜的总放大倍数等于目镜放大倍数与物镜放大倍数的乘积。 一、光学显微镜的基本构造及功能 （一）机械部分 1、镜筒：为安装在光镜最上方或镜臂前方的圆筒状结构，其上端装有目镜，下端与物镜转换器相连。根据镜筒的数目，光镜可分为单筒式或双筒式两类。单筒光镜又分为直立式和倾斜式两种。而双筒式光镜的镜筒均为倾斜的。镜筒直立式光镜的目镜与物镜的中心线互成45度角，在其镜筒中装有能使光线折转45度的棱镜。
光学显微镜的原理及构造
光学显微镜的原理及构造显微镜是人类认识物质微观世界的重要工具，是现代科学研究工作不可缺少的仪器之一。显微镜自1666年问世以来已有300多年的历史了，其间随着科学技术不断发展，显微镜的品种不断增加，结构和性能逐步得到完善和提高。 根据不同的使用用途，光学显微镜可分为普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜、倒置显微镜、体视显微镜、偏光显微镜等10多种。目前，世界上许多国家都可以生产光学显微镜，牌名、种类繁杂，其中德国、日本等国制造的显微镜品质、数量占优势，但价格昂贵。 对于现代的光学显微镜，包括各种简单的常规检验用显微镜、万能研究以及万能照相显微镜等，首先要认识其构造及各部件的功能，同时要掌握正确的调试、使用和保养方法，才能在实际应用中面对各种要求时以不同的显微镜检方法，充分发挥显微镜应有的功能，提高常规检验工作效率. 光学显微镜的原理和构造 随着科学技术的发展，显微镜检方法由最传统的明视野、暗视野发展出了相差法、偏光方法；荧光方法也由透射光激发进展为落射光激发，使荧光效率大为提高；微分干涉相衬方法基于偏光方法，而巧妙地利用了微分干涉棱镜，使之能应用于医学与生物学的样品，又能应用于金相样品的分析与检验。 下面以德国ZEISS公司生产的Axioplan万能研究用显微镜，简单介绍万能显微镜的基本组成部件。 1. 显微镜主机体（stand） 显微镜的主机体设计成金字塔形，而底座的截面呈T字形，使显微镜的整体相当稳固。显微镜的光学部件和机构调节部件、光源的灯室、显微照相装置、电源变压稳压器等，都可安装在主机体上或主机体内。 2. 显微镜的底座（base） 底座和主机体通常组成一个稳固的整体。底座内通常装有透射光照明光路系统（聚光、集光和反光）部件，光源的滤光片组，粗/微调焦机构，光源的视场光阑也安装在底座上。 3. 透射光光源（tranilluminator） 透射光光源由灯室（lamp housing）、灯座（lamp socket）、卤素灯（halogen lamp）、集光与聚光系统（lamp collector and lamp condenser）及其调整装置组成。 4. 透射光光源与反射光光源的转换开关（toggle switch） 这是新一代AXIO系列显微镜特有的装置，透射光和反射光可通用。当具有透/反两用的配置时，利用这一转换开关能方便而又迅速的使透射光 和反射光互相转换。在纯透射光的配置中，这一开关就改为电源开关。
练习使用光学显微镜
练习使用光学显微镜 蔡清柑 1、教学目标 ①知识目标：正确说明显微镜的结构与功能 ②能力目标：能独立、规范地使用显微镜，能观察到清晰的物像；在认识、使用显微镜的过程中发现问题，并尝试解决问题； ③情感目标：认同显微镜的规范操作方法，养成爱护显微镜的习惯，初步形成实事求是的科学态度。 2、教学重点、难点的分析： ①教学重点显微镜的使用方法。 ②教学难点规范使用显微镜，并观察到物象。 3、课前准备 教师：准备显微镜，并逐个检查（准备两个不同倍数的目镜）；两种标本（写有“上”字的玻片；永久装片），纱布，显微镜的使用课件；课前每班培训几名学生，以便课上帮助教师辅导其他学生。 4、教学程序 4.1导入新课复习显微镜的结构名称及其用途。（让学生指着显微镜说出结构名称及其用途）（展示图片：细胞图）让学生了解细胞非常小（提示图中物象之所以看的很清楚是被放大了百倍以上）而且形状各异。应该要会使用显微镜。 4.2新课过程 1、认识材料和用具引导学生观察实验桌上显微镜、玻片标本、擦镜纸、纱布等。
2、取镜和安放右手握，左手托；略偏左，安目镜。指导学生看书35页及课件展示：取镜和安放。强调安放目镜时，手指不要触摸镜头，对学生进行爱护显微镜的教育。 3、显微镜的构造学生四人一组，看书对照实物回顾显微镜各部分名称。 4、显微镜的使用教师对学生的回答进行鼓励，引出显微镜的使用。介绍两种观察标本： （1）写有“上”字的玻片；（2）永久装片 5、对光要求学生先看书，然后指导学生动手观察。按照先看到一个白亮的视野→放入标本→-看到清晰像的顺序。 （1）低倍物镜对准通光孔。（2）左眼看，右眼睁。（注：两眼都睁开）（3）转动反光镜，看到明亮视野。（注：双手转动反光镜） 6、观察学生边看书或课件展示自学边操作显微镜进行观察。 （1）标本放在载物台上，压住，正对通光孔。 （2）镜筒先下降，直到接近标本。 （3）左眼注视目镜，使镜筒缓缓上升，直到看清物像。 7、强调 ⑴用低倍物镜（4×，即最短的物镜）对准通光孔。 ⑵转动转换器的手法要正确，对学生进行爱护显微镜的教育。 ⑶镜筒先下降后上升，镜筒下降时，眼睛一定要看着物镜，以免压碎标本。 ⑷左眼看目镜，右眼睁开是为了画图。引导学生继续观察。 8、讨论并回答问题： ⑴视野中“上”字是否倒置，其物像比实际大小放大了多少倍？ ⑵若视野中“上”字位于左上方，怎样操作才能将其移至视野中央？ ⑶物像放大倍数越大，视野会越暗还是越亮？ ⑷物像放大倍数越大，视野中看到的细胞数目越多还是越少？
显微成像系统资料
品名型号数量供货单价备注 奥林巴斯生物成像系统显微镜CX31 1套30000元见配置清单奥林巴斯生物显微镜CX23 1套25000元见配置清单备注：以上为人民币含税报价单，含运费和包装培训费，壹年保修期。 生物显微镜CX31技术规格： 用途：可观察普通染色的切片观察。 1．工作条件 1.1 适于在气温为摄氏-40℃～＋50℃的环境条件下运输和贮存，在电源220V （ 10%）/50Hz、气温摄氏-5℃～40℃和相对湿度85%的环境条件下运行。 1.2 配置符合中国有关标准要求的插头，或提供适当的转换插座。 2．主要技术指标 2.1 生物显微镜 *2.1.1 光学系统：无限远光学矫正系统，齐焦距离必须为国际标准45mm。 2.1.2 放大倍率：40-1000倍 *2.1.3 载物台：钢丝传动，无齿条结构，尺寸为188mm × 134mm，活动范围为 X轴向76mm × Y轴向50mm，双片标本夹 2.1.4 调焦机构：载物台垂直运动由滚柱（齿条—小齿轮）机构导向，采用粗 微同轴旋钮，粗调行程每一圈为36.8mm，总行程量为25mm，微调行程为每圈 0.2mm，具备粗调限位挡块和张力调整环 2.1.5 聚光镜：带有孔径光阑的阿贝聚光镜，N.A. 1.25，带有蓝色滤色片 *2.1.6 照明系统：内置6V30W卤素灯，内置透射光柯勒照明 *2.1.7 三目观察筒：视场数≥20，瞳距调节范围为48-75mm，铰链式 2.1.8 目镜：10X，带眼罩，视场数≥20带目镜测微尺 *2.1.9 物镜：平场消色差物镜4X（N.A.≥0.1）、10X（N.A.≥0.25）、40X（N.A.≥0.65）、 100X（N.A.≥1.25）
显微镜的组成与结构(大全)
利用光学原理把人眼所不能分辨的微小物体放大成像，以供人们提取微细结构信息的光学仪器。 简史 早在公元前1世纪，人们就已发现通过球形透明物体去观察微小物体时可以使其放大成像。后来逐渐对球形玻璃表面能使物体放大成像的规律有了认识。1590年，荷兰和意大利的眼镜制造者已经造出类似显微镜的放大仪器。1610年前后，意大利的伽利略和德国的J.开普勒在研究望远镜的同时，改变物镜和目镜之间的距离，得出合理的显微镜光路结构，当时的光学工匠遂纷纷从事显微镜的制造、推广和改进。17世纪中叶，英国的R.胡克和荷兰的 A.van列文胡克都对显微镜的发展作出了卓越的贡献。1665年前后，胡克在显微镜中加入粗动和微动调焦机构、照明系统和承载标本片的工作台。这些部件经过不断改进，成为现代显微镜的基本组成部分。1673～1677年期间，列文胡克制成单组元放大镜式的高倍显微镜,其中9台保存至今。胡克和列文胡克利用自制的显微镜在动、植物机体微观结构的研究方面取得了杰出的成就。19世纪，高质量消色差浸液物镜的出现使显微镜观察微细结构的能力大为提高。1827 年G.B.阿米奇第一个采用浸液物镜。19世纪70年代，德国人E.阿贝奠定了显微镜成像的古典理论基础。这些都促进了显微镜制造和显微观察技术的迅速发展，并为19世纪后半叶包括R.科赫、L.巴斯德等在内的生物学家和医学家发现细菌和微生物提供了有力的工具。 在显微镜本身结构发展的同时，显微观察技术也在不断创新：1850年出现了偏光显微术，1893年出现了干涉显微术，1935年荷兰物理学家F.泽尔尼克创造了相衬显微术，他为此在1953年被授予诺贝尔物理学奖金。 古典的光学显微镜只是光学元件和精密机械元件的组合，它以人眼作为接收器来观察放大的像。后来在显微镜中加入了摄影装置，以感光胶片作为可以记录和存储的接收器。现代又普遍采用光电元件、电视摄象管和电荷耦合器等作为显微镜的接收器，配以微型电子计算机后构成完整的图象信息采集和处理系统。 工作原理表面为曲面的玻璃或其他透明材料制成的光学透镜可以使物体放大成像。光学显微镜就是利用这一原理把微小物体放大到人眼足以观察的尺寸。近代的光学显微镜通常采用两级放大，分别由物镜和目镜完成。被观察物体AB位于物镜的前方,被物镜作第一级放大后成一倒立的实象A1B1。然后此实像再被目镜作第二级放大，成一虚象A2B2,人眼看到的就是虚像，显微镜的总放大倍率为：显微镜总放大倍率＝物镜放大倍率×目镜放大倍率 放大倍率是指直线尺寸的放大比而不是面积比。在用人眼直接观察的显微镜中,可以在实像面A1B1处放置一块薄型平板玻璃片，其上刻有某种图案的线条，例如十字线。当实像A1B1和这些刻线叠合在一起时,利用这些刻线就能对物体进行瞄准定位或尺寸测量。这种放置在实像面处的薄型平板玻璃片通称分划板。在新型的以光电元件作为接收器的光学显微镜中，电视摄象管的靶面或其他光电元件的接收面就设置在实像面上。 组成
高中生物实验：普通光学显微镜的使用方法
高中生物实验：普通光学显微镜的使用方法 普通光学显微镜的构造主要分为三部分：机械部分、照明部分和光学部分。 机械部分 镜座：是显微镜的底座，用以支持整个镜体。 镜柱：是镜座上面直立的部分，用以连接镜座和镜臂。 镜臂：一端连于镜柱，一端连于镜筒，是取放显微镜时手握部位。 镜筒：连在镜臂的前上方，镜筒上端装有目镜，下端装有物镜转换器。 物镜转换器(旋转器)：接于棱镜壳的下方，可自由转动，盘上有3-4个圆孔，是安装物镜部位，转动转换器，可以调换不同倍数的物镜，当听到碰叩声时，方可进行观察，此时物镜光轴恰好对准通光孔中心，光路接通。 镜台(载物台)：在镜筒下方，形状有方、圆两种，用以放置玻片标本，中央有一通光孔，我们所用的显微镜其镜台上装有玻片标本推进器(推片器)，推进器左侧有弹簧夹，用以夹持玻片标本，镜台下有推进器调节轮，可使玻片标本作左右、前后方向的移动。 调节器：是装在镜柱上的大小两种螺旋，调节时使镜台作上下方向的移动。 粗调节器(粗螺旋)：大螺旋称粗调节器，移动时可使镜台作快
速和较大辐度的升降，所以能迅速调节物镜和标本之间的距离使物象呈现于视野中，通常在使用低倍镜时，先用粗调节器迅速找到物象。 照明部分 装在镜台下方，包括反光镜，集光器。 反光镜：装在镜座上面，可向任意方向转动，它有平、凹两面，其作用是将光源光线反射到聚光器上，再经通光孔照明标本，凹面镜聚光作用强，适于光线较弱的时候使用，平面镜聚光作用弱，适于光线较强时使用。 集光器(聚光器)位于镜台下方的集光器架上，由聚光镜和光圈组成，其作用是把光线集中到所要观察的标本上。 聚光镜：由一片或数片透镜组成，起汇聚光线的作用，加强对标本的照明，并使光线射入物镜内，镜柱旁有一调节螺旋，转动它可升降聚光器，以调节视野中光亮度的强弱。 光学部分 目镜：装在镜筒的上端，通常备有2-3个，上面刻有5*、10*或15*符号以表示其放大倍数，一般装的是10*的目镜。 物镜：装在镜筒下端的旋转器上，一般有3-4个物镜，其中最短的刻有“10*”符号的为低倍镜，较长的刻有“40*”符号的为高倍镜，最长的刻有“100*”符号的为油镜，此外，在高倍镜和油镜上还常加有一圈不同颜色的线，以示区别。 在物镜上，还有镜口率(N.A.)的标志，它反应该镜头分辨力的大小，其数字越大，表示分辨率越高，各物镜的镜口率如下表：
显微镜种类及使用方法
显微镜的种类及其使用方法 一、光学显微镜 光学显微镜是一种精密的光学仪器。当前使用的显微镜由一套透镜配合，因而可选择不同的放大倍数对物体的细微结构进行放大观察。普通光学显微镜通常能将物体放大1500～2000 倍(最大的分辨力为0.2μm)。 （一）光学显微镜的基本结构（附图1） 1．光学部分包括目镜、物镜、聚光器和光源等。 （1）目镜通常由两组透镜组成，上端的一组又称为“接目镜”，下端的则称为“场镜”。两者之间或在场镜的下方装有视场光阑（金属环状装置），经物镜放大后的中间像就落在视场光阑平面上，所以其上可加置目镜测微尺。在目镜上方刻有放大倍数，如10×、20×等。按照视场的大小，目镜可分为普通目镜和广角目镜。有些显微镜的目镜上还附有视度调节机构，操作者可以对左右眼分别进行视度调整。另有照相目镜(NFK)可用于拍摄。 （2）物镜由数组透镜组成，安装于转换器上，又称接物镜。通常每台显微镜配备一套不同倍数的物镜，包括：①低倍物镜：指1×～6×； ②中倍物镜：指6×～25×；
③高倍物镜：指25×～63×；④油浸物镜：指90×～100×。 其中油浸物镜使用时需在物镜的下表面和盖玻片的上表面之间填充折射率为 1.5 左右的液体（如香柏油等），它能显著地提高显微观察的分辨率。其他物镜则直接使用。观察过程中物镜的选择一般遵循由低到高的顺序，因为低倍镜的视野大，便于查找待检的具体部位。显微镜的放大倍数，可粗略视为目镜放大倍数与物镜放大倍数的乘积。 （3）聚光器由聚光透镜和虹彩光圈组成，位于在载物台下方。聚光透镜的功能是将光线聚焦于视场范围内；透镜组下方的虹彩光圈可开大缩小，以控制聚光器的通光范围，调节光的强度，影响成像的分辨力和反差。使用时应根据观察目的，配合光源强度加以调节，得到最佳成像效果。 （4）光源较早的普通光学显微镜借助镜座上的反光镜，将自然光或灯光反射到聚光器透镜的中央作为镜检光源。反光镜是由一平面和另一凹面的镜子组成。不用聚光器或光线较强时用凹面镜，凹面镜能起会聚光线的作用；用聚光器或光较弱时，一般都用平面镜。新近出产的显微镜一般直接在镜座上安装光源，并有电流调节螺旋，用于调节光照强度。光源类型有卤素灯、钨丝灯、汞灯、荧光灯、金属卤化物灯等。 显微镜的光源照明方法分为两种：透射型与反射(落射)型。前者是指光源由下而上通过透明的镜检对象；反射型显微镜则是以物镜上方打光到(落射照明)不透明的物体上。 2. 机械部分包括镜座、镜柱、镜壁、镜筒、物镜转换器、载物台和准焦螺旋等。 （1）镜座基座部分，用于支持整台显微镜的平稳。 （2）镜柱镜座与镜臂之间的直立短柱，起连接和支持的作用。 （3）镜臂显微镜后方的弓形部分，是移动显微镜时握持的部位。有的显微镜在镜臂与镜柱之间有一活动的倾斜关节，可调节镜筒向后倾斜的角度，便于观察。 （4）镜筒安装在镜臂先端的圆筒状结构，上连目镜，下连接物镜转换器。显微镜的国际标准筒长为160 mm，此数字标在物镜的外壳上。 （5）物镜转换器镜筒下端的可自由旋转的圆盘，用于安装物镜。观察时通过转动转换器来调换不同倍数的物镜。 （6）载物台镜筒下方的平台，中央有一圆形的通光孔。用于放置载玻片。载物台上装有固定标本的弹簧夹，一侧有推进器，可移动标本的位置。有些推动器上还附有刻度，可直接计算标本移动的距离以及确定标本的位置。 （7）准焦螺旋装在镜臂或镜柱上的大小两种螺旋，转动时可使镜筒或载物台上下移动，从而调节成像系统的焦距。大的称为粗准焦螺旋，每转动一圈，镜筒升降10mm；小的为细准焦螺旋，转动一圈可使镜筒仅升降0.1mm。一般在低倍镜下观察物体时，以粗准焦螺旋迅速调节物像，使之位于视野中。在此基础上，或在使用高倍镜时，用细准焦螺旋微调。必须注
光学显微镜的使用步骤和维护保养
光学显微镜的使用步骤和维护保养 一、操作步骤和注意事项 （一）正置显微镜 1、安放右手握住镜臂，左手托住镜座，使镜体保持直立。桌面要清洁、平稳，要选择临窗或光线充足的地方。单筒的一般放在左侧，距离桌边3～4厘米处。 2、清洁检查显微镜是否有毛病，是否清洁，镜身机械部分可用干净软布擦拭。透镜要用擦镜纸擦拭，如有胶或粘污，可用少量二甲苯清洁之。 3、对光镜筒升至距载物台1～2厘米处，低倍镜对准通光孔。调节光圈和反光镜，光线强时用平面镜，光线弱时用凹面镜，反光镜要用双手转动。若使用的为带有光源的显微镜，可省去次步骤，但需要调节光亮度的旋钮。 4、安装标本将玻片放在载物台上，注意有盖玻片的一面一定朝上。用弹簧夹将玻片固定，转动平台移动器的旋钮，使要观察的材料对准通光孔中央。 5、调焦调焦时，先旋转粗调焦旋钮慢慢降低镜筒，并从侧面仔细观察，直到物镜贴近玻片标本，然后左眼自目镜观察，左手旋转粗调焦旋钮抬升镜筒，直到看清标本物像时停止，再用细调焦旋钮回调清晰。操作注意：不应在高倍镜下直接调焦；镜筒下降时，应从侧面观察镜筒和标本间的间距；要了解物距的临界值。若使用双筒显微镜，如观察者双眼视度有差异，可靠视度调节圈调节。另外双筒可相对平移以适应操作者两眼间距。 6、观察若使用单筒显微镜，两眼自然张开，左眼观察标本，右眼观察记录及绘图，同时左手调节焦距，使物象清晰并移动标本视野。右手记录、绘图。镜检时应将标本按一定方向移动视野，直至整个标本观察完毕，以便不漏检，不重复。光强的调节：一般情况下，染色标本光线宜强，无色或未染色标本光线宜弱；低倍镜观察光线宜弱，高倍镜观察光线宜强。除调节反光镜或光源灯以外，虹彩光圈的调节也十分重要。 （1）低倍镜观察观察任何标本时，都必须先使用低倍镜，因为其视野大，易发现目标和确定要观察的部位。 （2）高倍镜观察从低倍镜转至高倍时，只需略微调动细调焦旋钮，即可使物像清晰。使用高倍镜时切勿使用粗调焦旋钮，否则易压碎盖玻片并损伤镜头。转动物镜转换器时，不可用手指直接推转物镜，这样容易使物镜的光轴发生偏斜，转换器螺纹受力不均匀而破坏，最后导致转换器就会报废。（3）油镜的观察先用低倍镜及高倍镜将被检物体移至视野中央后，再换油镜观察。油镜观察前，应将显微镜亮度调整至最亮，光圈完全打开。使用油镜时，先在盖玻片上滴加一滴香柏油（镜油），然后降低镜筒并从侧面仔细观察，直到油镜浸入香柏油并贴近玻片标本，然后用目镜观察，并用细调焦旋钮抬升镜筒，直到看清标本的焦段时停止并调节清晰。香柏油滴加要适量。油镜使用完毕后一定要用擦镜纸沾取二甲苯擦去香柏油，并再用干的擦镜纸擦去多余二甲苯。 7、结束操作观察完毕，移去样品，扭转转换器，使镜头V字型偏于两旁，反光镜要竖立，降下镜筒，擦抹干净，并套上镜套。若使用的是带有光源的显微镜，需要调节亮度旋钮将光亮度调至最暗，再关闭电源按钮，以防止下次开机时瞬间过强电流烧坏光源灯。 （二）倒置显微镜倒置显微镜与正置显微镜的主要区别在于物镜位于载物台下方，这样有利于观察时在上方对样品进行一些实时操作。 倒置显微镜操作过程基本与双筒的正置显微镜相似，需注意以下几点：观察时可调节铰链式双目目镜至舒适的位置。组织培养液或水溅到载物台上、物镜上或显微镜镜架上可能会损伤设备。如果溅上后，应该立即从墙上插座拔下电源线，擦去溅出液或水。一定要轻柔转动光强调节钮，不要试图将旋钮转过终点位置。使用后一定要先将灯的强度调至最小再关电源。使用后要旋转三孔转换器，使物镜镜片置于载物台下侧，防止灰尘的沉降。 （三）实体显微镜又称体视显微镜或解剖显微镜。操作步骤基本和双筒正置显微镜类似：取用解剖镜时，移动需用双手，保持稳重。若需连镜箱搬动，应将镜箱锁好，同时镜箱的钥匙必须拔除。镜管上若有防尘罩，应取下并换上目镜及眼罩。将样品置于玻片上或蜡盘中再放到载物盘上待观察。拧开锁紧螺丝，把镜
光学显微镜的分类及应用领域
显微镜的主要分类、功能及应用领域 一、显微镜的分类 (一)、按使用目镜的数目可分为单目、双目和三目显微镜。 单目价格比较便宜，可以作为初学爱好者的选择，双目稍贵点，观察的时候两眼可以同时观察，观察得舒适些，三目又多了一目，它的作用主要是连接数码相机或电脑用，比较适合长时间工作的人员选用。 (二)、根据其用途以及应用范围分为生物显微镜、金相显微镜、体视显微镜等。 1、生物显微镜是最常见的一种显微镜，在很多实验室中都可以见到，主要是用来观察生物切片、生物细胞、细菌以及活体组织培养、流质沉淀等的观察和研究，同时可以观察其他透明或者半透明物体以及粉末、细小颗粒等物体。生物显微镜供医疗卫生单位、高等院校、研究所用于微生物、细胞、细菌、组织培养、悬浮体、沉淀物等的观察，可连续观察细胞、细菌等在培养液中繁殖分裂的过程等。在细胞学、寄生虫学、肿瘤学、免疫学、遗传工程学、工业微生物学、植物学等领域中应用广泛。 2、体视显微镜又称为实体显微镜、立体显微镜，解剖镜，是一种具有正像立体感的目视仪器，广泛的应用于生物学、医学、农林等。它具有两个完整的光路，所以观察时物体呈现立体感。主要用途有：①作为动物学、植物学、昆虫学、组织学、考古学等的研究和解剖工具。②做纺织工业中原料及棉毛织物的检验。③在电子工业，做晶体等装配工具。④对各种材料气孔形状腐蚀情况等表面现象的检查。⑤对文书纸币的真假判断。⑥透镜、棱镜或其它透明物质的表面质量，以及精密刻度的质量检查等。 3、金相显微镜主要是用来鉴定和分析金属表面组织结构，是金属学研究金相的重要仪器，是工
业部门鉴定产品质量的关键设备，专门用于观察金属和矿物等不透明物体金相组织的显微镜。这些不透明物体无法在普通的透射光显微镜中观察，故金相和普通显微镜的主要差别在于前者以反射光，而后者以透射光照明。不仅可以鉴别和分析各种金属、合金材料、非金属物质的组织结构及集成电路、微颗粒、线材、纤维、表面喷涂等的一些表面状况，金相显微镜还可以广泛地应用于电子、化工和仪器仪表行业观察不透明的物质和透明的物质。如金属、陶瓷、集成电路、电子芯片、印刷电路板、液晶板、薄膜、粉末、碳粉、线材、纤维、镀涂层以及其它非金属材在金相显微镜中照明光束从物镜方向射到被观察物体表面，被物面反射后再返回物镜成像。所以用金相显微镜来检验分析金属内部的组织结构在工业生产中是十分重要的。体视显微镜在工业生产中也可以用到，但是它只是用来观察金属表面划伤、划痕等，放大倍数一般在10X-50X之间，金相的放大倍数一般在40X-400X，有些可以达到800X。 (三)、按光学原理可分为偏光、相衬和微差干涉对比显微镜等。 1、偏光显微是鉴定物质细微结构光学性质的一种显微镜。凡具有双折射性的物质，在偏光显微镜下就能分辨的清楚，当然这些物质也可用染色法来进行观察，但有些则不可能，而必须利用偏光显微镜。主要用于研究透明与不透明各向异性材料。一般具有双折射的物质都可以用这种显微镜进行观察。双折射性是晶体的基本特征。因此，偏光显微镜被广泛地应用在矿物、化学等领域，如在植物学方面，如鉴别纤维、染色体、纺锤丝、淀粉粒、细胞壁以及细胞质与组织中是否含有晶体等。在植物病理上，病菌的入侵，常引起组织内化学性质的改变，可以偏光显微术进行鉴别。在人体及动物学方面，常利用偏光显微术来鉴别骨骷、牙齿、胆固醇、神经纤维、肿瘤细胞、横纹肌和毛发等。 2、相衬显微镜又称为相差显微镜，最大的特点就是可以观察未经染色的标本和活细胞。这些样品在一般的显微镜下是观察不到的，而相差显微镜则利用物体不同结构成分之间的折射率和厚度的
光学显微镜的发展历史
杨拓拓 (苏州大学现代光学技术研究所，江苏苏州215000) 1基本原理 显微镜成像原理及视角放大率 显微镜由物镜和目镜组成。物体AB 在物镜前焦面稍前处，经物镜成放大、倒立的实像A'B'，它位于目镜前焦面或稍后处，经目镜成放大的虚像，该像位于无穷远或明视距离处。 图1-1显微镜系统光路图 牛顿放大率公式： f f x x ''= 'x 是像点到像方焦点的距离，x 是物点到物方焦点的距离。 根据牛顿放大率公式可得物镜的垂轴放大率为 '1'1'11--f f x ?== β 目镜的视觉放大率为： '22250 f =Γ 组合系统的放大率为 '2'121250f f ? -=Γ=Γβ 显微镜系统的像方焦距 ?-=/'2'1'f f f '250 f = Γ 显微镜系统成倒像轴向放大率 ' 1 f
'2'1'2'1/f f x x =β 若物点A 沿光轴移动很小的距离，则通过显微镜系统的像点'2A 将移动很大的距离，且移动 方向相同。 显微系统的角放大率 '2'1'2'1/x x f f =γ 即入射于物镜为大孔径光束，而由目镜射出为小孔径光束。 显微镜的孔径光阑 单组低倍显微物镜，镜框是孔径光阑。 复杂物镜一般以最后一组透镜的镜框作为孔径光阑。 对于测量显微镜，孔阑在物镜的象方焦面上，构成物方远心光路。 显微镜的视场光阑和视场 在显微物镜的象平面上设置了视场光阑来限制视场。由于显微物镜的视场很小，而且要求象面上有均匀的照度，故不设渐晕光阑。 显微镜是小视场大孔径成像，为获得大孔径并保证轴上点成像质量，显微镜线视场不超过物镜的1/20,线视场要求： 1 '120202β?=≤f y 显微镜的分辨率和有效放大率 光学仪器分辨率 瑞利判据：两个相邻的“点”光源所成的像是两个衍射斑，若两个等光强的非相干点像之间的间隔等于艾里圆的半径，即一个像斑的中心恰好落在另一个像斑的第一暗环处，则这两个点就是可分辨的点。当物面在无穷远时，以两点对光学系统的张角可表示两分辨点的距离，其值为：
几种显微镜种类的介绍
几种显微镜种类的介绍 00 暗视野显微镜在普通光学显微镜台下配一个暗视野聚光器（图4）,来自下面光源的光线被抛物面聚光器反射，形成了横过显微镜视野而不进入物镜的强烈光束。因此视野是暗的，视野中直径大于0.3m的微粒将光线散射，其大小和形态可清楚看到。甚至可看到普通明视野显微镜中看不见的几个毫微米的微粒。因此在某些细菌、细胞等活体检查中常常使用。 实体显微镜由双筒目镜和物镜构成。放大率7～80倍。利用侧上方或下方显微镜灯照明。在目镜内形成一个直立的放大实像，可以观察未经加工的物体的立体形状、颜色及表面微细结构,并能进行显微解剖操作,也可以观察生物机体的组织切片。 荧光显微镜在短波长光波(紫外光或紫蓝色光,波长250～400nm）照射下，某些物质吸收光能，受到激发并释放出一种能量降级的较长的光波（蓝、绿、黄或红光，波长400～800 nm），这种光称荧光。某种物质在短光波照射下即可发生荧光，如组织内大部分脂质和蛋白质经照射均可发出淡蓝色荧光，称为自发性荧光。但大部分物质需要用荧光染料（如吖啶橙、异硫氰酸荧光素等）染色后，在短光波照射下才能发出荧光。荧光显微镜的光源为高压汞灯，发出的紫外光源经过激发滤光片(此滤光片可通过对标本中荧光物质合宜的激发光)过滤后射向普勒姆 氏分色镜分色镜将激发光向下反射,通过物镜投射向经荧光染料染色的标本。染料被激发并释放出荧光,通过物镜,穿过分色镜和目镜即可进行观察。目镜下方安置有屏障滤片(只允许特定波长的荧光通过)以保护眼眼及降低视野暗度。荧光显微镜的特点是灵敏度高，在暗视野中低浓度荧光染色即可显示出标本内样品的存在，其对比约为可见光显微镜的100倍。30年代荧光染色即已用于细菌、霉菌等微生物及细胞、纤维等的形态观察和研究。如用抗酸菌荧光染色法可帮助在痰中找到结核杆菌。40年代创造了荧光染料标记蛋白质的技术，这种技术现已广泛应用于免疫荧光抗体染色的常规技术中，可检查和定位病毒、细菌、霉菌、原虫、寄生虫及动物和人的组织抗原与抗体，可用以探讨病因及发病机理，如肾小球疾病的分类及诊断，乳头瘤病毒与子宫颈癌的关系等。在医学实验研究及疾病诊断方面的用途日益广泛。 偏光显微镜从光源发出的光线通过空气和普通玻璃时，在与光线垂直的平面内的各个方向以同一振幅进行振动并迅速向前方传递，这是光的波动性原理。空气与普通玻璃为各向同性体，又称单折射体。如果该光源的光通过一种各向异性体（又称双折射体）时，会将一束光线分为各只有一个振动平面的，而且振动方向互相垂直的两束光线。这两束光线的振动方向、速度、折光率和波长都不相同。这样只有一个振动平面的光线称偏振光。偏光显微镜即利用这一现象而设计。偏光显微镜内，在物镜与目镜间插入一个检偏镜片，光源与聚光器间镶有起偏镜片，圆形载物台可以作360°旋转。起偏与检偏镜片处于正交检偏位时，视野完全变黑。将被检物体放在显微镜台上。若被检物为单折射体，则旋转镜台，视野始终黑暗。若旋转镜台一周，视野内被检物四明四暗，则说明被检物是双折射体。许多结晶物质（如痛风结节中的尿酸盐结晶、尿结石、胆结石等），人体组织内的弹力纤维、胶原纤维、染色体和淀粉样原纤维等都是双折射体，可借偏振光显微镜术检验，进行定性和定量分析。
显微镜分类简介
显微镜分类简介 光学显微镜有多种分类方法：按使用目镜的数目可分为双目和单目显微镜；按图像是否有立体感可分为立体视觉和非立体视觉显微镜；按观察对像可分为生物和金相显微镜等；按光学原理可分为偏光、相衬和微差干涉对比显微镜等；按光源类型可分为普通光、荧光、紫外光、红外光和激光显微镜等；按接收器类型可分为目视、数码（摄像）显微镜等。常用的显微镜有双目体视显微镜、金相显微镜、偏光显微镜、荧光显微镜等。 1．双目体视显微镜 双目体视显微镜又称"实体显微镜"或"解剖镜"，是一种具有正象立体感地目视仪器。在生物、医学领域广泛用于切片操作和显微外科手术；在工业中用于微小零件和集成电路的观测、装配、检查等工作。它利用双通道光路，双目镜筒中的左右两光束不是平行，而是具有一定的夹角－－体视角（一般为12度－－15度），为左右两眼提供一个具有立体感的图像。它实质上是两个单镜筒显微镜并列放置，两个镜筒的光轴构成相当于人们用双目观察一个物体时所形成的视角，以此形成三维空间的立体视觉图像。 目前体视镜的光学结构是：由一个共用的初级物镜，对物体成象后的两光束被两组中间物镜－－－－变焦镜分开，并成一体视角再经各自的目镜成象，它的倍率变化是由改变中间镜组之间的距离而获得的，因此又称为"连续变倍体视显微镜"（Zoom-stereomicroscope）。随着应用的要求，目前体视镜可选配丰富的选购附件，如荧光，照相，摄象，冷光源等等。2．金相显微镜 金相显微镜是专门用于观察金属和矿物等不透明物体金相组织的显微镜。这些不透明物体无法在普通的透射光显微镜中观察，故金相和普通显微镜的主要差别在于前者以反射光，而后者以透射光照明。在金相显微镜中照明光束从物镜方向射到被观察物体表面，被物面反射后再返回物镜成像。这种反射照明方式也广泛用于集成电路硅片的检测工作。 3．偏光显微镜（Polarizingmicroscope） 偏光显微镜是用于研究所谓透明与不透明各向异性材料的一种显微镜。凡具有双折射的物质，在偏光显微镜下就能分辨的清楚，当然这些物质也可用染色法来进行观察，但有些则不可能，而必须利用偏光显微镜。将普通光改变为偏振光进行镜检的方法，以鉴别某一物质是单折射（各向同行）或双折射性（各向异性）。双折射性是晶体的基本特性。因此，偏光显微镜被广泛地应用在矿物、化学等领域，在生物学和植物学也有应用。 4．荧光显微镜 荧光显微镜是用短波长的光线照射用荧光素染色过的被检物体，使之受激发后而产生长波长的荧光，然后观察。荧光显微镜广泛应用于生物，医学等领域。 荧光显微镜一般分为透射和落射式两种类型。透射式：激发光来自被检物体的下方，聚光镜为暗视野聚光镜，使激发光不进入物镜，而使荧光进入物镜。它在低倍情况下明亮，而高倍则暗，在油浸和调中时，较难操作，尤以低倍的照明范围难于确定，但能得到很暗的视野背景。透射式不使用于非透明的被检物体。落射式：透射式目前几乎被淘汰，新型的荧光显微镜多为落射式，光源来自被检物体的上方，在光路中具有分光镜，所以对透明和不透明的被检物体都适用。由于物镜起了聚光镜的作用，不仅便于操作，而且从低倍到高倍，可以实现整个视场的均匀照明。 目前许多新兴生物研究领域应用到荧光显微镜，如基因原位杂交（FISH）等等。 5．相衬显微镜（Phasecontrastmicroscope） 在光学显微镜的发展过程中，相衬镜检术的发明成功，是近代显微镜技术中的重要成就。我们知道，人眼只能区分光波的波长（颜色）和振幅（亮度），对于无色通明的生物标本，当光线通过时，波长和振幅变化不大，在明场观察时很难观察到标本。相衬显微镜利用被检
光学显微镜操作规程
光学显微镜操作规程标准化管理处编码[BBX968T-XBB8968-NNJ668-MM9N]
光学显微镜操作规程使用说明： 1. 将标本切片放在载物台上，用切片压片压紧。 2. 将各倍率的物镜顺序装入物镜转换器，将所选用的目镜插入目镜 筒中。使用双目时，应使双目间距调至适合瞳距。 3. 转动反光镜，使照明光线射入镜筒（或接通电照明光源），然后 调节聚光镜下光栏的孔径大小，使视场明暗适度。 4. 观察时，先用低倍物镜寻找观察物，然后将被观察物移至视场中 心，再换高倍物镜观察。当使用 100X （油弹）物镜时，应先用干 净的细木棒蘸少许香柏油滴于物镜端部，再转入视场。必须使物镜 端部和盖玻片之间充满香油柏油液体，方可观察操作。 5. 调焦时，一般先用粗调焦旋钮调节物镜至能看到标本轮廓，然后 再用微调旋钮进行调节，直至物像最清晰为止。使用高倍物镜时最 好由下到上进行调节，以避免镜头因碰到切片而损坏。 6. 调节聚光镜的高低和孔径光栏口径大小，至标本像对比度适宜， 像质清晰。 7. 观察时，可拉动目镜滑板至瞳距位置，调节目镜调节圈，使目镜 筒升降位置与目镜滑板在标尺上所处的位置相一致，直至调节像质 清晰为止。 注意事项：
1. 仪器使用完毕后，用吹风球吹去镜头上的灰尘，用细软布蘸二甲苯擦试镜头上的油污。用清洁的细软布擦试整机上的灰尘和污迹。运动部分应随即涂上薄薄一层无腐蚀性的润滑剂，然后放入泡沫包装，装回木箱，并放在干燥、清洁、通风良好和无酸碱蒸汽的地方。 2. 显微镜出厂前已经通过仔细的检验和调整，物镜和目镜不要自行拆卸。 3. 物镜使用后必须装入物镜盒中，以防碰损和沾污。
光学显微镜成像原理
■光学显微镜成像原理 光学显微镜成像原理 使用无限远光学系统的显微镜主要由物镜、管镜和目镜组成。标本经物镜和管镜放大后，形成放大倒立的实象；实象经目镜再次放大后，形成放大的虚象。 标本（AB）在物镜（Lo）焦点上，通过物镜（Lo）和管镜（Le）在象方形成放大倒立的实象（A’B’）；靠近人眼一方的目镜（Le）对中间象（A’B’）再次放大，在明视距离（对人眼来说约为250mm）处形成一个虚象(A”B”)。 人眼通过显微镜所观察到的象就是一个被放大了的虚象A”B”。 ■电子显微镜成像原理 电子显微镜是根据电子光学原理，用电子束和电子透镜代替光束和光学透镜，使物质的细微结构在非常高的放大倍数下成像的仪器。 电子显微镜的分辨能力以它所能分辨的相邻两点的最小间距来表示。20世纪70年代，透射式电子显微镜的分辨率约为0.3纳米(人眼的分辨本领约为0.1毫米)。现在电子显微镜最大放大倍率超过300万倍，而光学显微镜的最大放大倍率约为2000倍，所以通过电子显微镜就能直接观察到某些重金属的原子和晶体中排列整齐的原子点阵 一、折射望远镜用透镜作物镜的望远镜。分为两种类型：由凹透镜作目镜的称伽利略望远镜；由凸透镜作目镜的称开普勒望远镜。因单透镜物镜色差和球差都相当严重，现代的折射望远镜常用两块或两块以上的透镜组作物镜。其中以双透镜物镜应用最普遍。它由相距很近的一块冕牌玻璃制成的凸透镜和一块火石玻璃制成的凹透镜组成，对两个特定的波长完全消除位置色差，对其余波长的位置色差也可相应减弱。在满足一定设计条件时，还可消去球差和彗差。由于剩余色差和其他像差的影响，双透镜物镜的相对口径较小，一般为1/15-1/20，很少大于1/7，可用视场也不大。口径小于8厘米的双透镜物镜可将两块透镜胶合在一起，称双胶合物镜，留有一定间隙未胶合的称双分离物镜。为了增大相对口径和视场，可采用多透镜物镜组。折射望远镜的成像质量比反射望远镜好，视场大，使用方便，易于维护，中小型天文望远镜及许多专用仪器多采用折射系统，但大型折射望远镜制造起来比反射望远镜困难得多。
光学显微镜的使用
显微镜的使用 口诀：一取二放三安装，四转低倍五对光，六上玻片七下降，八升镜筒找物象（找到调清移中央），九换高倍控好光（再调细准边观赏），十步整理和归箱。 使用方法和步骤： 一、取镜和安放 1．右手握住镜臂，左手托住镜座。 2．把显微镜放在实验台上，略偏左（显微镜放在距实验台边缘7厘米左右处）。安装好目镜和物镜。 二、对光 3．转动转换器，使低倍物镜对准通光孔(物镜的前端与载物台要保持2厘米的距离)。 4．把一个较大的光圈对准通光孔。左眼注视目镜内(右眼睁开，便于以后同时画图)。转动反光镜，使光线通过通光孔反射到镜筒内。通过目镜，可以看到白亮的视野。 三、观察 5．把所要观察的玻片标本（也可以用印有“6”字的薄纸片制成）放上载物台，用压片夹压住，标本要正对通光孔的中心。 6．转动粗准焦螺旋，使镜筒缓缓下降，直到物镜接近玻片标本为止（眼睛看着物镜，以免物镜碰到玻片标本）。 7．左眼向目镜内看，同时反方向转动粗准焦螺旋，使镜筒缓缓上升，直到看清物像为止。再略微调节细准焦螺旋，使看到的物像更加清晰。 8．高倍物镜的使用：使用高倍物镜之前，必须先用低倍物镜找到观察的物象，并移到视野的正中央，然后转动转换器再换高倍镜。换用高倍镜后，视野内亮度变暗，因此一般选用较大的光圈并使用反光镜的凹面增加进光量，然后调节细准焦螺旋使物像清晰。观看的物体数目变少，但是体积变大。 四、整理 9．实验完毕，把显微镜的外表擦拭干净。转动转换器，把两个物镜偏到两旁，并将镜筒缓缓下降到最低处，反光镜竖直放置。最后把显微镜归箱，送回原处。 《注意事项》： 1、严忌单手提取显微镜。 2、若须移动显微镜，务必将显微镜提起再放至适当位置，严忌推动显微镜（推动时造成的震动可能会导致显微镜内部零件的松动，切记!!），使用显微镜请务必小心轻放。 3、使用显微镜时坐椅的高度应适当，观察时更应习惯两眼同时观察，且光圈及光源亮度皆应适当，否则长时间观察时极易感觉疲劳。 4、转动旋转盘时务必将载物台降至最低点，以免因操作不当而刮伤接目镜之镜头。 载物台上操作，以免染剂或其它液体流入显微镜内部或伤及镜头。 6、观察完一种材料，欲更换另一种材料时，务必将载物台下降至最低点，换好玻片后再依标准程序重新对焦，切勿直接抽换标本，以免刮伤镜头或玻片标本。 7、用毕显微镜应将载物台下降至最低点，并将低倍镜对准载物台中央圆孔处，将电源线卷好，盖上防尘罩，并收入存放柜中。
浅谈显微镜物镜的分类和用途
浅谈显微镜物镜的分类和用途 物镜是显微镜的核心光学部件，各个厂家其型号和规格名目繁多，下面来介绍一下分类，供大家参考。大致可以有以下四种分类方式： 1．按色差校正程度分类 （1）一般消色差物镜：这是最常见的物镜，尽管各厂家的标示不一样，但一般都有“Ach”字样。 （2）平场消色差物镜：一般这种物镜标有PLAN字样，这种物镜的视场平坦，非常适合显微照相，观察起来也比较舒适。 （3）半复消色差物镜，一般带有FL字样，能校正红、兰两色的色差和球差。这种可用于荧光观察等，是比较高级的物镜。 （4）复消色差物镜：标有APO字样，是观察和显微照相用的一流物镜，它们的性能只受物理定律的限制。该物镜具有优良的修正性和极其高的数值孔径，所以在观察和显微照相术方面具有最大的分辨率、色彩纯度、对比度以及图象平直度。如奥林巴司 UPLAN SAPO 100X/1.40 OIL物镜。 2．按功能分类 （1）相差物镜（Phase contrast）,用来观察无色透明的标本或活细胞，倒置显微镜上使用广泛，一般带有PH标志，且字体用绿色。 （2）DIC物镜，可以做DIC的物镜，一般要求半复消色差物镜，DIC观察无色样品或或细胞。 （3）HMC物镜，标有HMC标志，一种类似相差物镜的物镜，观察效果有立体感比较强，但不能用于荧光观察。 （4）偏光物镜，一般标有POL字样，这种物镜装配了克服应力设备，是专做偏光的物镜。 （6）多功能物镜，有的厂家生产一种多功能物镜，比如可以同时做相差，DIC，荧光等，这种物镜要稍微贵些。一般带有U标志,比如奥林巴斯的”UPLF LN”物镜和蔡司的”EC PLAN –NEOFLUAR”系列物镜。 3．按工作距离分类 （1）普通物镜：工作距离可以看切片，但不能看培养皿。 （2）长工作距离物镜：一般有LD标志,例如奥林巴斯的LUCPLFLN-PH物镜和蔡司的LD-A-PLAN PH物镜。 这些物镜可以用于培养皿、培养瓶等容器的观察。工作距离高至10.6mm，并可以进行光学修正，适用于0~2mm厚度的盖玻璃，通常由修正环或特殊的玻璃盖帽完成修正。