金属β-内酰胺酶综述
金属类β-内酰胺酶
β-内酰胺酶是革兰阴性杆菌对内酰胺类抗生素耐药的主要机制，细菌产生的β-内酰胺酶大部分系活性部位带丝氨酸残基的酶类，也有一小部分是活性部位为金属离子的酶类，称为金属β-内酰胺酶（metallo-β-lactamase,MBL），简称为金属酶。金属β-内酰胺酶，属Bush分类3群，Ambler分类B类，该群酶最大特点是可以水解碳青霉烯类等抗生素，而对哌拉西林和氨曲南影响较小。酶活性中心需金属锌离子的参与而发挥催化活性，故称为金属β-内酰胺酶。底物为包括碳青霉烯类在内的一大类β-内酰胺抗生素，其活性不被常见的β-内酰胺酶酶抑制剂如克拉维酸等所抑制，但可被离子鳌合剂乙二胺四乙酸（EDTA）、菲咯啉或硫基化合物抑制所抑制。金属β-内酰胺酶可由染色体和质粒介导，可在铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、粘质沙雷菌、肠杆菌属菌、肺炎克雷伯菌、嗜水气单胞菌和不动杆菌、脆弱类杆菌属、等细菌中检出此类酶。
一、发现和分布
第一个报道的金属酶是从蜡样芽孢杆菌( Bacill us cereus) 中发现的，该酶为锌依赖酶。20 世纪80 年代初期日本从嗜麦芽窄食单胞菌中鉴定出第二种锌依赖青霉素酶L1 型酶，随后又从嗜水气单胞菌和脆弱拟杆菌中鉴定出多种能水解亚胺培南的金属酶。这些酶都由染色体基因编码。该类金属酶分布在蜡样芽孢杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、脆弱拟杆菌、气单胞菌属和戈氏军团菌中，除嗜麦芽窄食单胞菌外,在临床上都极为罕见,而且都是单株散发的。1991年日本学者在铜绿假单胞菌中发现了第一种质粒介导的金属酶( IMP21) ，不久又从脆弱拟杆菌中发现了一种可转移金属酶，这两个酶的发现意味着金属酶已经从单株散发向随机分布过渡。现在已报道了10多种可转移金属酶: IMP21～8 和VIM21～3，分布在铜绿假单胞菌、不动杆菌和肠杆菌科细菌中，地域分布上已经不再局限于日本，现已分布至亚洲、欧洲和美洲的多个国家（见表1）。
二、生化分类和生化性质
1995 年Bush 等将金属酶全部归入功能类型3群,主要分类依据为：能被金属螯合剂螯合，不被β-内酰胺酶抑制剂克拉维酸、舒巴坦和三唑巴坦抑制。当时没有再作进一步分类。随着金属酶报道的增多，1997 年Rasmussen 和Bush 将金属酶按功能分成三个亚群：3a、3b 和3c 。
1) 3a 亚群绝大多数金属酶属于3a 亚群。其特点是底物谱宽，水解青霉素的速度与水解亚胺培南的速度相近或更快，还能有效水解头孢菌素，因此，3a亚群金属酶是β-内酰胺酶中最危险的单一酶种。许多3a 亚群酶需添加Zn2+才能达到最大活性或被激活，提示该亚群与Zn2+的亲和力低。
2) 3b 亚群分布于气单胞菌中，包括亲水气单胞、杀蛙气单胞、温和气单胞和简达气单胞菌。特点是底物特异性高，优先水解碳青霉烯，弱水解青霉素(A2h 除外) 和头孢菌素，不水解nitrocefin ，因此不能用nitrocefin 纸片法检出。等电聚焦电泳和凝胶柱层析时必须用亚胺培南作底物才能检测到。能被EDTA抑制，加EDTA 后，再加Z2+又可恢复酶活性。高浓度Zn2+可增加酶活性而在低浓度时酶活性受抑制。当Zn2+在15μmol 或更低时，至少有3 种3b 酶的活性受抑制。
3) 3c 亚群只有一种，来源于戈氏军团菌，至今尚未命名。能高效水解头孢菌素，弱水解碳青霉烯类。这三群金属酶不水解氨曲南，不被克拉维酸、舒巴坦和三唑巴坦抑制,水解较新的碳青霉烯的能力比水解亚胺培南弱(3a 亚群的Bacill us cereus Ⅱ和3b 亚群的AsbM1除外) 。
三、金属酶的分子生物学亚型分类法及分子生物学特点
Philippon等研究了金属酶的基因编码序列的多样性，根据其序列相似度的类型，将金属酶３a，３b两个亚群又进一步细分为３个亚类：B1、B2、B3。
1）B1亚群：包括了绝大多数已知的金属酶，蜡样芽胞杆菌产生的Ⅱ酶（ＢｃⅡ），脆弱拟杆菌产生的CcrA（又名CfiA），脑膜炎败血黄杆菌产生的酶BlaB，吲哚黄杆菌产生的IND-１，在铜绿假单胞菌、黏质沙雷菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌中发现的IMP类以及VIM类都属于该亚型。酶分子量在28kD左右，其氨基酸同源性≥23%，有3个组氨酸和1个半胱氨酸残基参与活性部位Zn2+和／或水分子的结合，其活性都能被EDTA所抑制，加入Zn2+后能恢复活性，大多数由质粒介导。B1亚群金属酶都含有与酶的活性基团相关的3个组氨酸和一个半胱氨酸。
（2）B2亚群：包括气单胞菌金属酶CphA、CphA2 及Imis和居泉沙雷菌产生的SFH-１。本亚群与B1亚群的分子大小相近，但同源性低，两亚群间仅23个氨基酸相同（约11％）。只有一个Zn2+活性位点，以碳青霉烯类作为底物。
（3）B3亚群只有一个来源于嗜麦芽窄食单胞菌的L1酶。本亚群酶只有9个氨基酸与其它金属酶相同。L1酶的结构是四聚体，与其它金属酶显著不同（其它金属酶都是单体）。来自不同菌株的L1等电点（pI）不同，表明L1可能是一大家族。军团菌的FEZ-1 酶是该亚型的新成员，与L1有29.7%的氨基酸同源性，结合Zn2+的残基也相同（His87，His86，Asp88，His89，His160，His225）。
四、MBL的分子结构特点
很长一段时间以来，MBL在临床上没有得到足够的重视，但随着MB L的广泛的扩散，越来越多的研究者在MBL的产生、流行、治疗演变、结构和机制上加以深层次的研究。由于带M B L的细菌对所有已知的碳青霉烯类抗生素耐药，因此，研究者集中于MBL的三维结构和其与相应的靶蛋白结合机制，为探寻有效的MBL抑制剂以应用于临床。
金属酶由一大群遗传异质性的酶类组成，虽然一级结构显示很低的同源性（经常<40%，有时甚至不到１％），但是它们的三维结构(酶蛋白形成的立体结构)却显示很高的相似性都表现为αβ/ βα夹心结构，该结构可分为2个半球，2个半球结构相似，各有一个金属离子。提示它们在进化上是相关的，但进化途径与丝氨酸活性β-内酰胺酶不相同（丝氨酸活性β-内酶胺酶进化于青霉素结合蛋白PBPs）。金属酶中的关键残基，尤其是形成金属键的氨基酸残基高度保守，都有一个HXHXD……H·Zn2+保守序列。酶的活性部位存在一个氢氧根离子和1 ~2个锌离子，氢氧根离子由水分子与金属酶肽链第90位的天冬氨酸残基（Asp90）相互作用产生，作为2个锌离子之间的桥联配体。酶分子中存在2个锌离子结合位点：第1个结合位点中与锌离子结合的配基由组氨酸His86，His88，His149和水分子提供；第2个结合位点的配基由Asp90、Cys168 以及His210提供。
它通过半胱氨酸、组氨酸、天冬氨酸等活性位点的氨基酸与锌结合，再结合水分子使其活化，成为亲核试剂，对β-内胺类抗生素具有广泛的水解作用，导致对头孢菌素、碳青霉烯类抗生素等产生耐药。
五、金属酶的分子生物学基础
金属酶又分为先天型和获得型。先天型金属酶又称为天然金属酶，其基因稳定地镶嵌在宿主染色体中。20世纪90年代以前报道的金属酶均为染色体编码，不能转移，其基因的表达可为诱导型，也可为非诱导型。有L1、BlaB、GOB、IND-1、CGB-1、TUS-1、MUS-1、JOHN-1、EBR-1、BcⅡ、CfiA或CcrA、CphA、THIN-B、SFH-1、FEZ等。存在于临床罕见的细菌中（芽胞杆菌属、气单胞菌属、黄杆菌属），一般一种酶基因只被一种细菌所携带，且这些菌属的产酶菌比例也较小，携带金属酶的细菌也一般不致病，引起严重感染的罕见。在脆弱拟杆菌中还发现了沉默型金属酶基因，在正常情况下不表达或低水平表达，对亚胺培南敏感，可因暴露于碳青霉烯类抗生素，操纵子基因发生突变或在操纵子SD序列上游插入插入序列（insertionsqeuence,IS）而使金属酶高水平表达，IS提供持续高水平转录所需的转录起始信号。
近来发现铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、黏质沙雷菌和其他肠杆菌属类如：大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌、弗氏构椽酸菌等均可产生获得性金属酶。获得性金属酶主要分布于铜绿假单胞菌和不动杆菌属中，通过质粒或Ⅰ类整合子介导进行水平传播，已在美洲、欧洲和东南亚发现。获得性金属酶相较检出数量多，分布的菌属和地域广泛，是临床关注的热点。迄今为止发现的细菌的获得性金属酶有5类基因型：IMP、VIM、SPM和GIM、SIM，其中最主要的IMP和VIM，根据基因和翻译的氨基酸序列不同分为很多亚型，现已发展到IMP-22 和VIM-12。除少数IMP型位于Ⅲ型整合子、少数金属酶通过可移动的共同区域（CR）进行转移外，大多数金属酶位于Ⅰ型整合子中。
六、检测方法
金属酶目前还没有一个标准的表型检测方法，检测标准同样是依靠该菌是否携带MBL相关基因来确定。目前常用的金属酶的检测方法类似于其它MBL的检测方法，以十二烷基硫酸钠- 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 确定分子量，等电聚焦测定等电点，根据酶对不同底物的水解能力确定其酶的性质及底物轮廓。检测金属酶的关键是将其与底物轮廓相似的丝氨酸内酰胺酶(如Amp C 酶) 区分开来。国内外已有较多关于金属酶检测方法的报道，但目前国际上仍没有推荐方法。但两种酶抑制剂同时使用可以使对各种金属酶不同结构活性中心的抑制作用相互弥补，提高检出率。
金属酶由于其独特的作用机制，使其几乎能水解现有的各类β－内酰胺抗生素，而整合子介导的金属酶的存在，提示今后几年内，金属酶可能快速传播，同时碳青霉烯的使用量增加，由此将会给金属酶提供选择压力，使沉默金属酶基因激活而表达。所以，一方面临床要加强抗生素的合理应用和规范化管理，减少整合子发生、分子进化的外部诱导及选择环境，尽可能控制耐药菌株的
发生；另一方面相关科室如何快速、准确检测金属酶，监测产酶菌在临床上流行情况，为设计有效的金属酶抑制剂提供准确数据，将是今后研究的重要内容。
-内酰胺酶来源分析
β-内酰胺酶来源分析 β-内酰胺酶（β-lactamase）的产生是细菌对(β内酰胺类)抗菌药物耐药最常见的机制，在各种耐药机制中占80%。β-内酰胺酶是由多种酶组成的酶家族，能水解β-内酰胺类抗生素，这些酶的基因存在于细菌的染色体或质粒中。至今β-内酰胺酶的数量已超过200种，其中超广谱β-内酰胺酶(extended spectrum β-lactamase,ESBL)已超过50种。 β-内酰胺酶是指能催化水解6-氨基青霉烷酸(6-APA)和7-氨基头孢烷酸(7-ACA)及其 N -酰基衍生物分子中β-内酰胺环酰胺键的灭活酶。细菌产生β-内酰胺酶是细菌对β-内酰胺类抗生素耐药的主要机制。β-内酰胺酶分为染色体介导酶和耐药质粒介导酶二大类，以其水解对象可分为青霉素酶、头孢菌素酶、广谱酶和超广谱酶四种。质粒是一种密闭环状双股螺旋结构的DNA，存在于胞浆内，也是具有遗传功能的基因成分，质粒带有各种基因，包括耐药基因，但不是细菌存活所不可缺少的组成物质。染色体基因决定细菌对抗生素固有耐药性，近代研究证明在院内感染病人中产生质粒介导酶的耐药菌，其产生耐药性大多是在接触抗生素后获得的，并通过耐药基因的转移而播散，也可由基因表达而传至下代。 β-内酰胺酶掺杂于饲料中或直接喂食的可能性：可操作性几乎为零。 1.成品饲料的保存条件下（温度和氧化），β-内酰胺酶会很快失活。 2.β-内酰胺酶直接喂食：β-内酰胺酶在进入动物胃肠道后，会在胃酸，及各种胃肠道内 的蛋白酶（如胃蛋白酶，胰蛋白酶，胆汁，糜蛋白酶等等）作用下水解失活，而不能进入血液循环。即便有微量β-内酰胺酶进入血液循环，其也会在肝脏解毒分解失活或经肾脏排出。 内源性β-内酰胺酶 —— 本身存在于动物体内的β-内酰胺酶：微乎其微 β - 内酰胺酶是由细菌产生的酶类,生成后存在于细菌内，通过水解或非水解方式破坏进入菌体内的β - 内酰胺环,导致β - 内酰胺类抗生素失活,这是大多数致病菌对β - 内酰胺类抗生素耐药性的主要机制。因此，产生β - 内酰胺酶的耐药菌在保持其本身结构完整时，是不会将其自身的β - 内酰胺酶释放至宿主（动物）体内的；而当产生β - 内酰胺酶的耐药菌被宿主细胞（如白细胞或淋巴细胞）吞噬破坏后，细菌内的β - 内酰胺酶会释放至动物体细胞内（如白细胞或淋巴细胞），而动物细胞内部的蛋白酶会自动识别作为异体蛋白的
β内酰胺类抗生素β内酰胺酶抑制剂合剂临床应用专家共识
β-内酰胺类抗生素/β-内酰胺酶抑制剂合剂临床应用专家共识 一、概述 革兰阴性菌是我国细菌感染性疾病最常见的病原体。近年来，革兰阴性菌对β-内酰胺类抗生素的耐药性不断增加，最重要的耐药机制是细菌产生各种β-内酰胺酶。β-内酰胺酶抑制剂能够抑制大部分β-内酰胺酶，恢复β-内酰胺类抗生素的抗菌活性。因此，β-内酰胺类抗生素/β-内酰胺酶抑制剂合剂在临床抗感染中的地位不断提升，已成为临床治疗多种耐药细菌感染的重要选择。目前我国临床使用的β-内酰胺类抗生素/β-内酰胺酶抑制剂合剂的种类和规格繁多，临床医师对该类合剂的特点了解不够，临床不合理使用问题较突出。为规范β-内酰胺类抗生素/β-内酰胺酶抑制剂合剂的临床应用，延缓其耐药性的发生和发展，特制定本共识。 二、主要β-内酰胺酶及β-内酰胺酶抑制剂 β-内酰胺酶是由细菌产生的能水解β-内酰胺类抗生素的一大类酶。β-内酰胺酶种类繁多，有多种分类方法，最主要的分类方法有根据β-内酰胺酶的底物、生化特性及是否被酶抑制剂所抑制的功能分类法（Bush分类法），将β-内酰胺酶分为青霉素酶、广谱酶、超广谱β-内酰胺酶、头孢菌素酶和碳青霉烯酶等；根据β-内酰胺酶末端的氨基酸序列特征的分子生物学分类法（Ambler分类法），将β-内酰胺酶分为丝氨酸酶和金属酶。目前引用较多的是基于上述2种方法建立的分类方法。见表1。 表1：β-内酰胺酶的分类和3种主要酶抑制剂的作用 功能分类分 子 分 型 主要底物 可被抑制 代表性酶 克 拉 维 酸 舒 巴 坦 他 唑 巴 坦 1 C 头孢菌素类- - - AmpC,ACT-1,CMY-2,FOX-1,MIR-1 2a A 青霉素类+ + + 青霉素酶 2b A 青霉素类，窄谱头孢菌素类+ + + TEM-1，TEM-2，SHV-1 2be A 青霉素类，超广谱头孢菌素类，单环酰胺类+ + + TEM-3,SHV-2,CTX-M-15,PER-1,VER-1 2br A 青霉素类- - - TEM-30,SHV-10,TRC-1
B内酰胺酶的检测方法
B-内酰胺酶的检测方法 牛乳中非法添加β-内酰胺酶检测方法 随着国家对食品安全问题的关注和部分乳制品企业2010年无抗奶目标的提出，抗生素残留问题成为影响乳制品安全的重要因素之一。目前，青霉素作为β- 内酰胺类药物是治疗牛乳腺炎的首选药物，是牛奶中最常见的残留抗生素。由于国内多数乳品企业对抗生素残留超标的牛乳采取降价收购的原则，出于经济利益的驱动，一些不法奶站为了谋求自己的经济利益，人为的使用一些生物制剂去降解牛乳中残留的抗生素，生产人造“无抗奶”。2005年至今，已有数家公司公开宣称出售分解牛乳中残留抗生素的解抗剂。迄今为止，还没有针对这种人造“无抗奶”的相应检测方法、检测标准，无法从源头上监测、把控原奶质量。 奶制品中三聚氰胺问题出现后，检科院按照国家局科技司的安排，对奶制品中可能的添加物进行了调查。经过前期的调研工作，初步判断市售解抗剂的主要成分是β-内酰胺酶，它是由革兰氏阳性细菌产生和分泌的，可选择性分解牛奶中残留的β- 内酰胺类抗生素。β-内酰胺酶为我国不允许使用的食品添加剂,该酶的使用掩盖了牛奶中实际含有的抗生素。β-内酰胺酶能够使青霉素内酰胺结构破坏而失去活性，导致青霉素、头孢菌素等抗生素类药物耐药性增高，从而大大降低了人们抵抗传染病的能力，给消费者的身体健康带来危害。 微生物方法和理化方法均利用β-内酰胺酶能够裂解青霉素的β-内酰胺环形成青霉噻唑酸的原理检测乳制品中是否添加解抗剂。 一、理化方法 （一）高效液相色谱法 1、间接法 方法原理：利用β-内酰胺酶能够酶解青霉素的原理，向牛奶中添加一定量的青霉素，如果牛奶中存在一定浓度的β-内酰胺酶，那么青霉素经β-内酰胺酶酶解后浓度会减少，从而判断牛奶中是否存在β-内酰胺酶。 实验步骤：称取20 g试样，在4℃、16000rpm条件下离心10 min。取下层清液10 g于50 mL塑料离心管，并将塑料离心管置于37℃水浴锅中振荡孵育30 min。向孵育后的离心管中加入无水乙醇15 mL。振荡提取30 min后离心，将上层清液过滤纸后收集于梨形瓶中。减压浓缩蒸发掉乙醇。向旋蒸后的梨形瓶中加入10 mL磷酸盐缓冲液（pH=8.5），涡旋1 min后调节pH为8.5。以1 mL/min的速度将提取液通过经过预处理的Oasis HLB固相萃取柱，用2 mL磷酸缓冲液（pH=8.5）淋洗萃取柱，再用2 mL水淋洗。最后用3 mL乙腈洗脱。将洗脱液在40℃下氮气吹干，用0.025 M磷酸盐缓冲液（pH=7.0）定容残渣至1 mL,待上机测定。 色谱条件：色谱柱Agilent Zorbax SB C18，4.6mm×150mm×5μm； 流动相甲醇/0.004 M磷酸二氢钾（pH=4.5）＝40/60； 检测波长 268 nm 讨论：该方法只能给出定性结论即牛奶中是否含有β-内酰胺酶，而无法给出确切定量结果即牛奶中含有β-内酰胺酶的量（U/ml）；前处理方法相对复杂、费时。
β内酰胺酶抑制剂对比
β-内酰胺类抗生素：联合酶抑制剂，提升抗菌能力 文张永信（复旦大学附属华山医院传染科教授） 基层医院2013年5月20日D11版 【问】氨曲南属于窄谱抗生素，有哪些药理特点？其临床适应证是什么？ 【答】氨曲南是单环类β-内酰胺抗生素，主要针对革兰阴性（G-）菌。对肠杆菌和铜绿假单胞菌有效，但对不动杆菌、产碱杆菌以及革兰阳性（G+）菌和厌氧菌无效。该药化学结构特殊，对β-内酰胺酶稳定，毒性低；对青霉素和头孢菌素过敏的患者仍可选用该药。临床适用于敏感菌引起的脑膜炎、严重感染、院内感染、免疫缺陷者感染，以及不能使用青霉素和头孢菌素的患者。如合并有G+菌感染，应加用林可霉素或克林霉素。 【问】头霉素与二代头孢菌素，氧头孢烯类与三代头孢菌素的抗菌谱有什么不同？对临床适应证有何影响？ 【答】头霉素与二代头孢菌素、氧头孢烯类与三代头孢菌素抗菌谱上的不同在于：头霉素、氧头孢烯类对各种厌氧菌(包括脆弱类杆菌)有良好的抗菌活性。由于头霉素和氧头孢烯类对需氧菌和厌氧菌均有良好的抗菌作用，常适用于需氧菌和厌氧菌的混合感染。 【问】β-内酰胺酶抑制剂与β-内酰胺类抗生素联用，有什么作用？舒巴坦、克拉维酸和三唑巴坦(他唑巴坦)在透过血脑屏障方面有何差异？ 【答】β-内酰胺酶抑制剂可以保护β-内酰胺类抗生素免受细菌产生的β-内酰胺酶破坏，两者联合应用具有协同作用，能增强β-内酰胺类抗生素的抗菌效果。而且扩大了β-内酰胺类抗生素的抗菌谱。如原来对产酶葡萄球菌无效的药物，在联用后对产酶葡萄球菌有效。β-内酰胺类抗生素对脆弱类杆菌等厌氧菌的抗菌活性较弱，但联用后的复合制剂对厌氧菌具有良好的抗菌活性。 舒巴坦、克拉维酸和三唑巴坦对β-内酰胺酶都有抑制作用，但以三唑巴坦最强，其次为克拉维酸，舒巴坦最弱。在血脑屏障穿透力方面，舒巴坦比三唑巴坦更易透过，而克拉维酸基本不能透过。所以克拉维酸的复合制剂不宜用于中枢神经系统感染。 【问】氨苄西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉维酸、替卡西林/克拉维酸、头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/三唑巴坦这5种复合制剂在抗菌谱、临床适应证及不良反应方面有何异同？ 【答】在抗菌谱方面，对厌氧菌的差别不大，对需氧菌有所不同。氨苄西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉维酸对肠杆菌科细菌有良好的抗菌作用，但对铜绿假单胞菌和沙雷菌等没有抗菌作用；其他3种药物不仅对肠杆菌科细菌有良好抗菌作用，且优于前两者，对铜绿假单胞菌和沙雷菌、不动杆菌等葡萄糖不发酵菌也有良好的抗菌活性。 由于抗菌谱不同，临床适应证也就不同。氨苄西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉维酸主要应用于肠杆菌科或肠杆菌科与厌氧菌的混合感染；由于克拉维酸的抑酶作用优于舒巴坦，阿莫
β-内酰胺类抗生素β内酰胺酶抑制剂复方制剂临床应用专家共识(2020年版)
β-内酰胺类抗生素β内酰胺酶抑制剂复方制剂临床应用 专家共识（2020年版） 一、概述 革兰阴性菌及少数革兰阳性菌对β-内酰胺类抗生素耐药的最重要机制是产生各种β-内酰胺酶。β-内酰胺酶抑制剂能够抑制部分β-内酰胺酶，避免β-内酰胺类抗生素被水解而失活。因此，β-内酰胺类抗生素/β-内酰胺酶抑制剂复方制剂（简称β-内酰胺酶抑制剂复方制剂）是临床治疗产β-内酰胺酶细菌感染的重要选择。我国临床使用的β-内酰胺酶抑制剂复方制剂的种类和规格繁多，临床工作者对该类制剂的特点了解参差不齐，临床不合理使用问题比较突出。 二、主要β-内酰胺酶及产酶菌流行情况 β-内酰胺酶是由细菌产生的，能水解β-内酰胺类抗生素的一大类酶。β-内酰胺酶种类繁多，有多种分类方法，最主要的分类方法有两种： 一、是根据β-内酰胺酶的底物、生化特性及是否被酶抑制剂所抑制的功能分类法（Bush分类法），其将β-内酰胺酶分为青霉素酶、广谱酶、超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）、头孢菌素酶（AmpC酶）和碳青霉烯酶等； 二、是根据β-内酰胺酶末端的氨基酸序列特征的分子生物学分类法（Ambler分类法），将β-内酰胺酶分为丝氨酸酶（包括A类、C类酶和D 类酶）及金属酶（B类酶）。目前引用较多的是1995年Bush等基于上述二种方法建立的分类方法，2019年Bush等又将该分类表进一步完善和细化（表1）。其中临床意义最大的是下列三类β-内酰胺酶： 表1 常见β-内酰胺酶分类及特点，常见酶抑制剂抑酶活性
1、ESBLs主要属2be\2br\2ber类酶，是由质粒介导的能水解青霉素类、头孢菌素及单环酰胺类等β-内酰胺类抗生素的β-内酰胺酶，其对碳青霉烯类和头霉素类水解能力弱。ESBLs主要由肠杆菌科细菌产生，以肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、变形杆菌最为常见。根据编码基因的同源性，ESBLs可分为TEM型、SHV型、CTX-M 型、OXA型和其他型共5大类型。 2、AmpC酶属C类酶，通常由染色体介导，可以被β-内酰胺类抗生素诱导。部分由质粒介导，常呈持续高水平表达。其对第一、二、三代头孢菌素水解能力强，但对碳青霉烯类抗生素和第四代头孢菌素的水解能力弱。该酶主要存在于肠杆菌属、柠檬酸杆菌属、普鲁菲登菌属、黏质沙雷菌属和摩根菌属等细菌，非发酵菌中主要见于铜绿假单胞菌。质粒介导的β-内酰胺酶可分为CMY-2组、CMY-1组、MIR-1/ACT-1组、DHA-1组和ACC-1组等。 3、碳青霉烯酶是指能水解碳青霉烯类抗生素的一大类β-内酰胺酶，分别属于Ambler分子分类中的A类、B类和D类酶。A类、D类为丝氨酸酶，B类为金属酶，以锌离子为活性中心。A类碳青霉烯酶可由染色体介导，也可由质粒介导。前者包括SME、NMC和IMI酶等，后者包括KPC和GES酶等。KPC酶是近年来肠杆菌科细菌尤其是肺炎克雷伯菌对包括碳青霉烯类抗生素在内的几乎所有β-内酰胺类抗生素耐药的最主要机制，我国最常见的是KPC-2，其对头孢吡肟和头孢他啶的水解能力相对较弱。
β-内酰胺酶及其活力测定法
β-内酰胺酶及其活力测定法 培养基胨15g甘油50g氯化钠4g0.1％硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)溶液0.5ml枸橼酸钠5.88g20％硫酸镁(MgSO4·7H2O)溶液1ml磷酸氢二钾4g肉浸液1000ml 混合上述成分，调节pH值使灭菌后为7.0～7.2，分装于500ml锥形瓶内,每瓶80ml,在115℃灭菌30分钟。 酶溶液的制备 取蜡样芽孢杆菌［Bacillus cereus CMCC(B)63301］的斜面培养物,接种至上述一瓶培养基内,在25℃摇床培养18小时后，取此培养物接种至其余各瓶培养基内，每瓶接种10ml，同时每瓶加入无菌青霉素4500单位，在25℃摇床培养24小时，再加无菌青霉素2万单位，继续培养24小时，再加无菌青霉素2万单位,继续培养24小时,离心沉淀菌体，调pH值至约8.5,用滤柱滤过除菌，滤液用无菌操作调pH值至近中性后，分装于适宜容器内，在10℃以下贮存，备用。 酶活力测定法 青霉素溶液 称取青霉素钠（钾）适量，用磷酸盐缓冲液(pH7.0)溶解成每1ml中含青霉素1万单位的溶液。 青霉素酶稀释液 取青霉素酶溶液，按估计单位用磷酸盐缓冲液(pH7.0) 稀释成每1ml中约含青霉素酶8000～12 000单位的溶液，在37℃预热。 测定法 精密量取青霉素溶液50ml,置100ml量瓶中，预热至37℃后，精密加入已预热的青霉素酶稀释液25ml，迅速混匀，在37℃准确放置1小时，精密量取3ml，立即加至已精密量取的碘滴定液(0.01mol/L)［精密量取碘滴定液(0.1mol/L)10ml，置100ml量瓶中，用醋酸钠缓冲液(pH4.5)稀释至刻度］25ml中,在室温暗处放置15分钟，用硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L) 滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失。 空白试验 取已预热的青霉素溶液2ml，在37℃放置1小时，精密加入上述碘滴定液(0.01mol/L)25ml，然后精密加青霉素酶稀释液1ml，在室温暗处放置15分钟，用硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L)滴定。 按下式计算： E＝(B－A)×M×F×D×100 式中 E为青霉素酶活力，（单位／ml）／小时； B为空白滴定所消耗的上述硫代硫酸钠滴定液的容量，ml； A为样品滴定所消耗的上述硫代硫酸钠滴定液的容量，ml； M为硫代硫酸钠滴定液的浓度，mol/L； F为在相同条件下，每1ml的上述碘滴定液(0.01mol/L)相当于青霉素的单位数； D为青霉素酶溶液的稀释倍数。 ［附注］ 磷酸盐缓冲液(pH7.0) 取磷酸氢二钾7.36g与磷酸二氢钾3.14g,加水使成1000ml。 醋酸钠缓冲液(pH4.5) 取冰醋酸13.86ml,加水使成250ml;另取结晶醋酸钠27.30g,加水使成200ml，两液混合均匀
金属β-内酰胺酶综述
金属类β-内酰胺酶 β-内酰胺酶是革兰阴性杆菌对内酰胺类抗生素耐药的主要机制，细菌产生的β-内酰胺酶大部分系活性部位带丝氨酸残基的酶类，也有一小部分是活性部位为金属离子的酶类，称为金属β-内酰胺酶（metallo-β-lactamase,MBL），简称为金属酶。金属β-内酰胺酶，属Bush分类3群，Ambler分类B类，该群酶最大特点是可以水解碳青霉烯类等抗生素，而对哌拉西林和氨曲南影响较小。酶活性中心需金属锌离子的参与而发挥催化活性，故称为金属β-内酰胺酶。底物为包括碳青霉烯类在内的一大类β-内酰胺抗生素，其活性不被常见的β-内酰胺酶酶抑制剂如克拉维酸等所抑制，但可被离子鳌合剂乙二胺四乙酸（EDTA）、菲咯啉或硫基化合物抑制所抑制。金属β-内酰胺酶可由染色体和质粒介导，可在铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、粘质沙雷菌、肠杆菌属菌、肺炎克雷伯菌、嗜水气单胞菌和不动杆菌、脆弱类杆菌属、等细菌中检出此类酶。 一、发现和分布 第一个报道的金属酶是从蜡样芽孢杆菌( Bacill us cereus) 中发现的，该酶为锌依赖酶。20 世纪80 年代初期日本从嗜麦芽窄食单胞菌中鉴定出第二种锌依赖青霉素酶L1 型酶，随后又从嗜水气单胞菌和脆弱拟杆菌中鉴定出多种能水解亚胺培南的金属酶。这些酶都由染色体基因编码。该类金属酶分布在蜡样芽孢杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、脆弱拟杆菌、气单胞菌属和戈氏军团菌中，除嗜麦芽窄食单胞菌外,在临床上都极为罕见,而且都是单株散发的。1991年日本学者在铜绿假单胞菌中发现了第一种质粒介导的金属酶( IMP21) ，不久又从脆弱拟杆菌中发现了一种可转移金属酶，这两个酶的发现意味着金属酶已经从单株散发向随机分布过渡。现在已报道了10多种可转移金属酶: IMP21～8 和VIM21～3，分布在铜绿假单胞菌、不动杆菌和肠杆菌科细菌中，地域分布上已经不再局限于日本，现已分布至亚洲、欧洲和美洲的多个国家（见表1）。 二、生化分类和生化性质 1995 年Bush 等将金属酶全部归入功能类型3群,主要分类依据为：能被金属螯合剂螯合，不被β-内酰胺酶抑制剂克拉维酸、舒巴坦和三唑巴坦抑制。当时没有再作进一步分类。随着金属酶报道的增多，1997 年Rasmussen 和Bush 将金属酶按功能分成三个亚群：3a、3b 和3c 。 1) 3a 亚群绝大多数金属酶属于3a 亚群。其特点是底物谱宽，水解青霉素的速度与水解亚胺培南的速度相近或更快，还能有效水解头孢菌素，因此，3a亚群金属酶是β-内酰胺酶中最危险的单一酶种。许多3a 亚群酶需添加Zn2+才能达到最大活性或被激活，提示该亚群与Zn2+的亲和力低。 2) 3b 亚群分布于气单胞菌中，包括亲水气单胞、杀蛙气单胞、温和气单胞和简达气单胞菌。特点是底物特异性高，优先水解碳青霉烯，弱水解青霉素(A2h 除外) 和头孢菌素，不水解nitrocefin ，因此不能用nitrocefin 纸片法检出。等电聚焦电泳和凝胶柱层析时必须用亚胺培南作底物才能检测到。能被EDTA抑制，加EDTA 后，再加Z2+又可恢复酶活性。高浓度Zn2+可增加酶活性而在低浓度时酶活性受抑制。当Zn2+在15μmol 或更低时，至少有3 种3b 酶的活性受抑制。
详解β-内酰胺类抗生素和β-内酰胺酶抑制剂
详解β-内酰胺类抗生素和β-内酰胺酶抑制剂 详解β-内酰胺类抗生素和β-内酰胺酶抑制剂 一、概述 革兰阴性菌是我国细菌感染性疾病最常见的病原体。近年来，革兰阴性菌对β-内酰胺类抗生素的耐药性不断增加，最重要的耐药机制是细菌产生各种β-内酰胺酶。β-内酰胺酶抑制剂能够抑制大部分β-内酰胺酶，恢复β-内酰胺类抗生素的抗菌活性。因此，β-内酰胺类抗生素/β-内酰胺酶抑制剂合剂在临床抗感染中的地位不断提升，已成为临床治疗多种耐药细菌感染的重要选择。目前我国临床使用的β-内酰胺类抗生素/β-内酰胺酶抑制剂合剂的种类和规格繁多，临床医师对该类合剂的特点了解不够，临床不合理使用问题较突出。为规范β-内酰胺类抗生素/β-内酰胺酶抑制剂合剂的临床应用，延缓其耐药性的发生和发展，特制定本共识。 二、主要β-内酰胺酶及β-内酰胺酶抑制剂 β-内酰胺酶是由细菌产生的能水解β-内酰胺类抗生素的一大类酶。β-内酰胺酶种类繁多，有多种分类方法，最主要的分类方法有根据β-内酰胺酶的底物、生化特性及是否被酶抑制剂所抑制的功能分类法（Bush分类法），将β-内酰胺酶分为青霉素酶、广谱酶、超广谱β-内酰胺酶、头孢菌素酶和碳青霉烯酶等；根据β-内酰胺酶末端的氨基酸序列特征的分子生物学分类法（Ambler分类法），将β-内酰胺酶分为丝氨酸酶和金属酶。目前引用较多的是基于上述2种
方法建立的分类方法。 超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）是由质粒介导的能水解青霉素类、头孢菌素及单环酰胺类等β-内酰胺类抗生素的β-内酰胺酶，其对碳青霉烯类和头霉素类水解能力弱。这类酶可被β-内酰胺酶抑制剂如克拉维酸、舒巴坦及他唑巴坦等抑制。ESBLs主要由肠杆菌科细菌产生，以肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、变形杆菌最为常见。到目前为止，全世界共发现了200余种ESBLs。根据编码基因的同源性，ESBLs可分为TEM型、SHV型、CTX-M型、OXA型和其他型共5大类型。 头孢菌素酶（AmpC酶）通常是由染色体介导，对第一、二、三代头孢菌素水解能力强，但其对碳青酶烯类抗生素和第四代头孢菌素的水解能力弱，克拉维酸钾不能抑制其活性，他唑巴坦和舒巴坦有部分抑酶作用，氯唑西林抑制头孢菌素酶作用强。该酶主要存在于肠杆菌属、柠檬酸杆菌属、普鲁菲登菌属、粘质沙雷菌属和摩根菌属等细菌。染色体介导的头孢菌素酶可以被β-内酰胺类抗生素诱导和选择。近年来，质粒介导的头孢菌素酶陆续被报道，主要出现于肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌及沙门菌属细菌中，常呈持续高水平表达，可通过质粒广泛传播。根据其与染色体介导的头孢菌素酶的同源性，可分为CMY-2组、CMY-1组、MIR-1/ACT-1组、DHA-1组和ACC-1组等。 碳青霉烯酶是指能水解碳青霉烯类抗生素的一大类β-内酰胺酶，分别属于Ambler分子分类中的A类、B类和D类酶。A类、D类为丝氨酸酶，B类为金属酶，以锌离子为活性中心。 A类碳青霉烯酶可以由染色体介导，也可由质粒介导，前者包括
β-内酰胺酶的检测方法
外源性β-内酰胺酶是我国不允许在食品中使用的化学物质。违法使用的目的，是为了掩盖违规使用大环内脂类等抗生素治疗奶牛疾病的行为。但是，内源性β-内酰胺酶的产生机理也是科学研究基本确认的事实。近几十年来，国际国内畜牧业养殖奶牛过程中无限制使用大环内脂类抗生素治疗动物、家禽等食用动物各种炎症、败血症、水肿病等病症，造成革兰氏阳性细菌对抗生素耐药，细菌对β-内酰胺类抗生素产生耐药性一般通过4种途径。（1）产生β-内酰胺酶使β-内酰胺类抗生素开环失活，这是产生耐药的主要原因。目前发现的β-内酰胺酶已超过300种，它通过与β-内酰胺环上的羰基共价结合，水解酰胺键从而使β-内酰胺类抗生素开环而失活。（2）改变抗生素与青霉素结合蛋白（penicillin binding proteins，PBPs）的亲和力。当β-内酰胺类抗生素与PBP结合后，PBP就会失去酶活性，使细菌细胞壁的形成部位破损而引起溶菌，反之，则成为耐药菌。PBP基因的变异，使β-内酰胺类抗生素无法与之结合或结合能力降低，这是形成耐药的根本原因。（3）细胞膜和细胞壁的结构发生改变，使药物难以进入细菌内。如生物膜的形成。（4）细菌体内的能力依赖性主动转运机制，将已进入细菌内的抗生素泵出体外，也可导致耐药性。由于细菌耐药产生的内源性β-内酰胺酶有300多种，同外源性β-内酰胺酶的分别鉴定检测技术尚未见报道。而目前各检测机构正在研究的乳制品中β-内酰胺酶的检测方法无论是化学仪器分析高效液相色谱法还是微生物法，其检测原理都是：测出的β-内酰胺酶无法判定是人为添加的或是耐药细菌产生的。奶制品中检出的β-内酰胺酶有可能是非法添加的，也有可能是细菌产生的。耐药性产生的机理很复杂，细菌耐药基因的转移、共生菌协同以及基因交叉耐受，等影响都要考虑。另外，根据现有的国际食源性抗生素耐药微生物的风险管理原则，建议加强畜牧业奶业生产全过程，而终产品的β-内酰胺酶检测始终是一个辅助手段，凭检测结果很难处理。化学家们要尽快建立内源性和外源性β-内酰胺酶的分离鉴定技术，当然这种技术要求是非常高的 1.常规方法(1).微生物法：[原理] 以一种对青霉素高度敏感的细菌-枯草芽孢杆菌作为指示剂，试验时如果被测细菌株产生青霉素酶，破坏了青霉素，则此高度敏感菌株即可生长，否则，指示剂则被抑制。[方法] 以枯草芽孢杆菌为指示菌，用棉拭子将枯草芽孢杆菌接种于琼脂培养基上，或倾注方法将枯草芽孢杆菌混于琼脂平板内。然后将被测菌与产青霉素酶阳性及阴性对照菌株，按下图接种划线，在琼脂培养基中央放置一含青霉素G（1单位）纸片。放置35℃培养24小时后观察结果。[结果判断] 如被检菌产生青霉素酶，则沿着被测菌处的枯草芽孢杆菌抑菌环出现凹痕(2).碘量法[3] [原理] β-内酰胺酶能裂解青霉素的β-内酰胺环形成青霉噻唑酸，它与淀粉竞争游离碘，破坏了碘和淀粉的兰色复合物，使兰色变为无色。[方法] ①将0.25克青霉素溶于41.7mlPH6.0的磷酸盐缓冲液中，使其浓度成6000ug/ml。取0.1ml
β-内酰胺类抗生素β内酰胺酶抑制剂复方制剂临床应用专家共识(2020年版)
3-内酰胺类抗生素B内酰胺酶抑制剂复方制剂临床应用 专家共识（2020年版） 一、概述 革兰阴性菌及少数革兰阳性菌对3 -内酰胺类抗生素耐药的最重要机制是产 生各种3 -内酰胺酶。3 -内酰胺酶抑制剂能够抑制部分3 -内酰胺酶，避免3 - 内酰胺类抗生素被水解而失活。因此，3 -内酰胺类抗生素/ 3-内酰胺酶抑制 剂复方制剂（简称3 -内酰胺酶抑制剂复方制剂）是临床治疗产3 -内酰胺酶 细菌感染的重要选择。我国临床使用的3 -内酰胺酶抑制剂复方制剂的种类 和规格繁多，临床工作者对该类制剂的特点了解参差不齐，临床不合理使用问题比较突出。 二、主要3-内酰胺酶及产酶菌流行情况 3-内酰胺酶是由细菌产生的，能水解3 -内酰胺类抗生素的一大类酶。3-内 酰胺酶种类繁多，有多种分类方法，最主要的分类方法有两种： 一、是根据3 -内酰胺酶的底物、生化特性及是否被酶抑制剂所抑制的功能分类法（Bush分类法），其将3 -内酰胺酶分为青霉素酶、广谱酶、超广谱 3-内酰胺酶（ESBLs）、头抱菌素酶（AmpC酶）和碳青霉烯酶等； 二、是根据3-内酰胺酶末端的氨基酸序列特征的分子生物学分类法（Ambler分类法），将3 -内酰胺酶分为丝氨酸酶（包括A类、C类酶和D 类酶）及金属酶（B类酶）。目前引用较多的是1995年Bush等基于上述 二种方法建立的分类方法，2019年Bush等又将该分类表进一步完善和细 化（表1）。其中临床意义最大的是下列三类3 -内酰胺酶:
表1常见B-内酰胺酶分类及特点，常见酶抑制剂抑酶活性
1、E SBLs主要属2be\2br\2ber 类酶，是由质粒介导的能水解青霉素类、头抱 菌素及单环酰胺类等B -内酰胺类抗生素的B -内酰胺酶，其对碳青霉烯类和头霉素类水解能力弱。ESBLs主要由肠杆菌科细菌产生，以肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、变形杆菌最为常见。根据编码基因的同源性，ESBLs可分为TEM型、SHV型、 CTX-M型、OXA型和其他型共5大类型。 2、A mpC酶属C类酶，通常由染色体介导，可以被B -内酰胺类抗生素诱导。部分由质粒介导，常呈持续高水平表达。其对第一、二、三代头抱菌素水解能力强，但对碳青霉烯类抗生素和第四代头抱菌素的水解能力弱。该酶主要存在于肠杆菌 属、柠檬酸杆菌属、普鲁菲登菌属、黏质沙雷菌属和摩根菌属等细菌，非发酵菌
详解β-内酰胺类抗生素和β-内酰胺酶抑制剂
详解β-内酰胺类抗生素和β - 内酰胺酶抑制剂 详解β - 内酰胺类抗生素和β -内酰胺酶抑制剂 一、概述革兰阴性菌是我国细菌感染性疾病最常见的病原体。近年来，革兰阴性菌对β - 内酰胺类抗生素的耐药性不断增加，最重要的耐药机制是细菌产生各种β -内酰胺酶。β- 内酰胺酶抑制剂能够抑制大部分β-内酰胺酶，恢复β - 内酰胺类抗生素的抗菌活性。因此，β - 内酰胺类抗生素/ β- 内酰胺酶抑制剂合剂在临床抗感染中的地位不断提升，已成为临床治疗多种耐药细菌感染的重要选择。目前我国临床使用的β -内酰胺类抗生素/ β-内酰胺酶抑制剂合剂的种类和规格繁多，临床医师对该类合剂的特点了解不够，临床不合理使用问题较突出。为规范β -内酰胺类抗生素/ β-内酰胺酶抑制剂合剂的临床应用，延缓其耐药性的发生和发展，特制定本共识。 二、主要β -内酰胺酶及β - 内酰胺酶抑制剂 β- 内酰胺酶是由细菌产生的能水解β - 内酰胺类抗生素的一大类酶。β -内酰胺酶种类繁多，有多种分类方法，最主要的分类方法有根据β -内酰胺酶的底物、生化特性及是否被酶抑制剂所抑制的功能分类法（Bush 分类法），将β - 内酰胺酶分为青霉素酶、广谱酶、超广谱β -内酰胺酶、头孢菌素酶和碳青霉烯酶等；根据β - 内酰胺酶末端的氨基酸序列特征的分子生物学分类法（Ambler 分类法），将β - 内酰胺酶分为丝氨酸酶和金属酶。目前引用较多的是基于上述 2 种方法建立的分类方法。
超广谱β - 内酰胺酶（ESBLs）是由质粒介导的能水解青霉素类、头孢菌素及单环酰胺类等β -内酰胺类抗生素的β - 内酰胺酶，其对碳青霉烯类和头霉素类水解能力弱。这类酶可被β - 内酰胺酶抑制剂如克拉维酸、舒巴坦及他唑巴坦等抑制。ESBLs主要由肠杆菌科细菌产生，以肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、变形杆菌最为常见。到目前为止，全世界共发现了200 余种ESBLs。根据编码基因的同源性，ESBLs可分为TEM型、SHV型、CTX-M型、OXA型和其他型共5 大类型。 头孢菌素酶（AmpC酶）通常是由染色体介导，对第一、二、三代头孢菌素水解能力强，但其对碳青酶烯类抗生素和第四代头孢菌素的水解能力弱，克拉维酸钾不能抑制其活性，他唑巴坦和舒巴坦有部分抑酶作用，氯唑西林抑制头孢菌素酶作用强。该酶主要存在于肠杆菌属、柠檬酸杆菌属、普鲁菲登菌属、粘质沙雷菌属和摩根菌属等细菌。染色体介导的头孢菌素酶可以被β - 内酰胺类抗生素诱导和选择。近年来，质粒介导的头孢菌素酶陆续被报道，主要出现于肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌及沙门菌属细菌中，常呈持续高水平表达，可通过质粒广泛传播。根据其与染色体介导的头孢菌素酶的同源性，可分为CMY-2组、CMY-1组、MIR- 1/ACT-1组、DHA-1组和ACC-1组等。 碳青霉烯酶是指能水解碳青霉烯类抗生素的一大类β - 内酰胺酶，分别属于Ambler 分子分类中的A类、B类和D类酶。A类、D类为丝氨酸酶， B 类为金属酶，以锌离子为活性中心。 A类碳青霉烯酶可以由染色体介导，也可由质粒介导，前者包括SME、NMC和IMI 酶等，后者包括KPC和GES酶等。KPC酶是近年
β-内酰胺类抗生素β内酰胺酶抑制剂复方制剂临床应用专家共识(2020版)
β-内酰胺类抗生素β 内酰胺酶抑制剂复方制剂临床应用 专家共识（ 2020 年版） 一、概述 革兰阴性菌及少数革兰阳性菌对β-内酰胺类抗生素耐药的最重要机制是产生各种β-内酰胺酶。β-内酰胺酶抑制剂能够抑制部分β-内酰胺酶，避免 β-内酰胺类抗生素被水解而失活。因此，β-内酰胺类抗生素/β-内酰胺酶抑制剂复方制剂（简称β-内酰胺酶抑制剂复方制剂）是临床治疗产β-内酰胺酶细菌感染的重要选择。我国临床使用的β-内酰胺酶抑制剂复方制剂的种类和规格繁多，临床工作者对该类制剂的特点了解参差不齐，临床不合理使用问题比较突出。 二、主要β-内酰胺酶及产酶菌流行情况 β-内酰胺酶是由细菌产生的，能水解β-内酰胺类抗生素的一大类酶。β-内酰胺酶种类繁多，有多种分类方法，最主要的分类方法有两种： 一、是根据β-内酰胺酶的底物、生化特性及是否被酶抑制剂所抑制的功能分类法（ Bush 分类法），其将β-内酰胺酶分为青霉素酶、广谱酶、超广谱 β-内酰胺酶（ ESBLs）、头孢菌素酶（ AmpC 酶）和碳青霉烯酶等； 二、是根据β-内酰胺酶末端的氨基酸序列特征的分子生物学分类法（Ambler 分类法），将β-内酰胺酶分为丝氨酸酶（包括 A 类、C 类酶和D 类酶）及金属酶（ B 类酶）。目前引用较多的是 1995 年 Bush 等基于上述二种方法建立的分类方法，2019 年Bush 等又将该分类表进一步完善和细化（表1）。其中临床意义最大的是下列三类β-内酰胺酶：
表 1 常见β-内酰胺酶分类及特点，常见酶抑制剂抑酶活性
1、ESBLs 主要属 2be\2br\2ber 类酶，是由质粒介导的能水解青霉素类、头孢菌素及单环酰胺类等β-内酰胺类抗生素的β-内酰胺酶，其对碳青霉烯类和头霉素类水解能力弱。ESBLs 主要由肠杆菌科细菌产生，以肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、变形杆菌最为常见。根据编码基因的同源性，ESBLs 可分为 TEM 型、SHV 型、CTX-M 型、OXA 型和其他型共 5 大类型。 2、AmpC 酶属C 类酶，通常由染色体介导，可以被β-内酰胺类抗生素诱导。部分由质粒介导，常呈持续高水平表达。其对第一、二、三代头孢菌素水解能力强，但对碳青霉烯类抗生素和第四代头孢菌素的水解能力弱。该酶主要存在于肠杆菌属、柠檬酸杆菌属、普鲁菲登菌属、黏质沙雷菌属和摩根菌属等细菌，
β内酰胺酶及其抑制剂简介
β-内酰胺酶及其抑制剂简介 抗菌药是指能抑制或杀灭细菌，用于预防和治疗细菌性感染的药物。抗菌药包括人工合成抗菌药（喹诺酮类等）和抗生素。抗生素（antibiotics）是由微生物（包括细菌、真菌、放线菌属）或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质。现临床常用的抗生素有微生物培养液中提取物以及用化学方法合成或半合成的化合物。随着抗生素药物使用的大量普及，抗生素耐药形势也日趋严峻。抗生素耐药的主要机制为产生β-内酰胺酶。β-内酰胺酶依据分子结构中氨基酸序列差异可主要分为两类，分别是以丝氨酸为活性位点的A、C、D类，还有以金属离子为活性位点的B（金属酶）类。病原菌产生β-内酰胺酶，致使一些药物β-内酰胺环水解而失活，是病原菌对一些常见的β-内酰胺类抗生素（青霉素类、头孢菌素类）耐药的主要方式。随着β-内酰胺酶的泛滥，一些β-内酰胺酶抑制剂应运而生。β-内酰胺酶抑制剂是一类β-内酰胺类药物，可与β-内酰胺酶发生牢固的结合而使酶失活，和其他抗生素联用可增强其抗菌活性，减少其用量。在治疗微生物感染时，常将β-内酰胺类抗生素与β-内酰胺酶抑制剂联用，治疗效果显著。本文将对β-内酰胺酶及当前常用的抑制剂(克拉维酸钾、舒巴坦、他唑巴坦)的作用特点作简要介绍，以便于临床医生在应用这类药物时的选择 β-内酰胺酶分类 根据Bush2-Jacoby-Medeiros的分类法, β-内酰胺酶以底物谱和抑制剂不同分为4组,按各自的氨基酸和核苷酸序列属于A、B、C、D 4 类(表1) 。第1组是不被克拉维酸抑制的头孢菌素酶,分子类别属于C类,本组酶大部分由染色体介导,也可由质粒介导。第 2 组β-内酰胺酶数目最多,可被克拉维酸抑制,多由质粒介导。本组酶根据对青霉素、头孢菌素、肟类β-内酰胺抗生素,邻氯西林、羧苄西林和碳青霉烯类的水解活性分属2a 、2b 、2be 、2c 、2d 、2e 6 个亚组,最近发现的不能被克拉维酸抑制的TEM 型酶和染色体介导的A 类碳青霉烯酶分别属于2br 和2f个亚组,除2d的分子类别为D类,其余各亚组均为类。第3 组酶的作用需金属离子Zn2 +的参与,故称为金属β-内酰胺酶。分子类别属B 类,不被克拉维酸抑制。本类酶底物水解谱广对青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类和β-内酰胺酶抑制剂等广泛耐药。第 4 组酶包括少数青霉素酶,不被克拉维酸抑制,分子类别未定。
AmpCβ内酰胺酶的检测
作者单位:200003上海,第二军医大学附属长征医院实验诊断科?继续教育园地? AmpCβ内酰胺酶的检测赵虎 孔宪涛 AmpCβ内酰胺酶(简称AmpC酶)是由肠杆菌科细菌或/和绿脓假单胞菌的染色体或质粒介导产生的一类β内酰胺酶,属β内酰胺酶Ambler分子结构分类法中的C类和Bush2 Jacoby2Medeiros功能分类法中第一群,即作用于头孢菌素、且不被克拉维酸所抑制的β内酰胺酶。故AmpC酶又称作为头孢菌素酶[1,2]。 AmpC酶按其产生的方式分为3类:诱导高产酶、持续高产酶和持续低产酶[2,3]。(1)诱导高产酶:AmpC酶的合成往往与β2内酰胺类抗生素的存在有关。绝大部分肠杆菌科细菌和绿脓假单胞菌在正常条件下(即无β内酰胺类抗生素存在的条件下)只产生少量的AmpC酶。而当有诱导作用的β内酰胺类抗生素存在的条件下,AmpC酶的产量明显增加,增加的范围在100～1000倍之间。(2)持续高产酶:另有一部分产AmpC酶的菌株不论在有无β内酰胺类抗生素存在的条件下均可持续高水平产生AmpC酶,其原因为去阻遏突变,即调控基因之一的ampD基因发生突变,产生的有缺陷的AmpD蛋白,不能与另一种调控蛋白—AmpR蛋白结合形成复合物,AmpR蛋白即以激活子状态发挥激活作用,引起AmpC酶的大量表达。质粒介导的AmpC酶往往都属于此类AmpC酶。产生这种AmpC酶的细菌对临床的危害最大,是临床微生物实验室检测的重点。(3)持续低产酶:还有极少部分产AmpC酶的菌株,不论在有无β内酰胺类抗生素的存在的条件下均持续低水平的产生AmpC酶,其原因可能是另一种调节基因—ampR基因发生突变,产生有缺陷的AmpR蛋白,不能在无β内酰胺类抗生素存在的条件下起到抑制子的作用,也不能在有β内酰胺类抗生素存在的条件下起到激活子的作用,故AmpC酶得以持续低水平地表达。检测不同类型的AmpC酶或检测产不同类型AmpC酶的菌株,其方法也有所不同。 近年来,随着β内酰胺类抗生素、尤其是头孢菌素的广泛应用,产AmpC酶的革兰阴性杆菌越来越多见,尤其是出现了(去阻遏)持续高产AmpC酶和质粒介导的AmpC酶,导致耐药菌株广泛传播和临床对该类细菌感染的治疗困难,已引起临床的高度重视,故检测AmpC酶具有非常重要的临床意义。 目前已陆续报道了多种检测AmpC酶的方法,除改良的三维试验较为经典外,其他的检测方法还不成熟,尚在摸索、试验阶段,检测的结果也各不相同。现讲述如下。 一、头孢西丁敏感试验[4] AmpC酶可以水解头孢西丁(FOX),即产AmpC酶的菌株对头孢西丁耐药。而ESBLs等其他β内酰胺酶一般不能分解头孢西丁,即产ESBLs的菌株对头孢西丁敏感。利用AmpC酶的这一特性,可以对产AmpC酶的菌株进行初步筛选。 具体操作方法:(1)纸片扩散法:按美国临床实验室标准化委员会(NCCL S)的纸片扩散(K2B)法进行。FOX纸片的含量为30μg。判断标准为抑菌环<18mm,表示待检菌株对FOX耐药。(2)稀释法:手工的(微量)肉汤稀释方法参照NCCL S的方法进行;也可用MicroScan等微生物分析仪进行分析,操作方法按其操作规程进行。判断标准为MIC>16μg/ml,表示待检菌株对FOX耐药。对FOX耐药的菌株,应怀疑产AmpC酶可能。当然,不是所有对头孢西丁耐药的菌株都是产AmpC酶的菌株(目前产ESBLs菌株对头孢西丁的耐药率已超过30%)。故此方法仅仅作为初步筛选。需做三维试验或纸片协同试验等试验,进行进一步的确定。 二、AmpC酶表型筛选试验[5] 根据AmpC酶对大部分头孢菌素、尤其是三代头孢菌素耐药的特性,选用多种头孢菌素纸片对产AmpC酶的菌株进行表型筛选。可选用亚胺培南(IP)、头孢吡肟(FEP)、头孢他啶/克拉维酸(CTD/Cla)、头孢噻肟(CTX)和头孢噻肟/克拉维酸(CTX/Cla)5种抗生素纸片进行筛选试验。 具体操作方法按NCCL S的K2B法进行。 判断标准:(1)IP、FEP敏感,而CTX、CTD/Cla和CTX/ Cla耐药;(2)IP、FEP敏感,而在CTX、CTD/Cla和CTX/Cla 的抑菌环内存在散在的菌落;(3)IP敏感,而FEP、CTD/Cla 和CTX/Cla耐药。以上3种结果提示,待检菌株产AmpC 酶。最后一种表型提示,待检菌株产AmpC酶的同时,产生其他β内酰胺酶,如产ESBLs。 此方法操作简便、快速省时,较三维试验简单得多,结果基本可靠,与三维试验的符合率达89158%。可以在各临床微生物实验室推广应用。 三、氟氯西林(FCC)双抑制剂扩散协同试验[6,7] 氟氯西林(FCC)可抑制AmpC酶的活性,使产AmpC酶的菌株不能及时水解和破坏头孢菌素,保留了这些抗生素的抗菌活性。利用这一特性,可选用FCC与其他超广谱头孢菌素(ESC)进行双抑制剂扩散协同试验(double inhibitors diffuse synergy test,DIDST),观察其有无协同作用。因FCC 在琼脂中扩散能力较差,故试验过程中不直接选用FCC纸片,而是将FCC药液直接加在空白纸片上进行扩散,这样才
β-内酰胺酶研究进展
β-内酰胺酶研究进展 摘要：青霉素于40年代初首次用于临床，几年后就从链球菌中分离到了青霉素酶，以后随着β-内酰胺类抗生素的不断开发和广泛应用，特别是近几十年来超广谱新品种的大量应用，β-内酰胺酶的种类、底物谱和耐药程度均以惊人的速度在发展，不能不引起格外的重视。 关键词：细菌，β-内酰胺酶，耐药 任何生物都试图适应周围环境并生存下去，细菌个体小，易变异,拥有耐药能力，这是自然界的法则。科学界有一种理论叫“中性突变漂变学说”，以“中性突变”为基础的分子进化学已逐渐形成。这个学说认为，在分子水平上看，大部分基因突变对于生命体的生存既不产生有利效应，也不酿成不利后果，因此，这类突变在自然选择中是“中性”的。在亿万年中，生物体内的基因不断产生中性突变，他们不受自然选择的支配，而是通过随机的偶然过程（即遗传漂变）在群体中固定下来或是被淘汰，结果就造成了基因和蛋白质分子的多样性，实现了分子的进化。在药物选择性压力下，产β-内酰胺酶的细菌被筛选出来，得以泛滥。为了对β-内酰胺酶有一个教深入了解，现将β-内酰胺酶的研究综述如下。 1 β-内酰胺类药物作用机理 肽聚糖合成的最后一步是被称为青霉素结合蛋白（penicillin binding proteins，即PBPs）的转肽酶形成的。β内酰胺类抗生素与D-丙氨酰-D-丙氨酸结构上的相似使得它们与青霉素结合蛋白结合（图一）。β-内酰胺核不可逆地与青霉素结合蛋白的Ser403单元结合，使其失活，从而抑制细菌细胞壁的形成。此外这个结合可能还激活细胞壁中的自溶酶。 图1 青霉素与青霉素结合蛋白结合使酶失活 2 β-内酰胺酶起源 β-内酰胺酶是指能催化水解6-氨基青霉烷酸(6-APA)和7-氨基头孢烷酸(7-ACA)及其N-酰基衍生物分子中β-内酰胺环酰胺键的灭活酶。 β-内酰胺酶来源于细菌细胞壁合成酶(即PBPs)，是由于细菌合成PBPs的过程中的基因的变异而造成的（图2）。β-内酰胺类药物在这类酶的作用下，使β-内酰胺环水解开环，而β-内酰胺环是与PBPs结合的活性功能部位，因此β-内酰胺环的破坏使其失去了干扰细菌细胞壁合成的功能。