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HE组织切片制备标准操作程序

HE染色标准化操作程序

一、目的

保证病理切片质量,以达到准确的病理诊断。

二、范围

石蜡包埋组织

三、试剂,仪器

酒精、二甲苯、苏木素、伊红、盐酸酒精、脱水机、包埋机、切片机、漂烘仪、染色机。

四、工作流程

(一)制片前

制片前过程从标本送到实验室至包埋结束为止。包括:

1.标本的交接编号记录及检查

(1)实验室人员收检标本时人必须认真执行查对制度,包括:送检标本种类和数量与送检单上填写的是否一致;容器上的联号或姓名与送检单上是否符合;固定液的种类(通常要求为10%中性缓冲甲醛液)和量是否符合要求;送检单是否按规定用墨水笔逐项填写清楚。若发现有错误、疑问或不符合要求时,应立即查询清楚和适当处理,在合格后方可签名接收。如标本已干涸、腐败或其它明显不符则不应接收。接收标本应在初级人员接收后,再由中级人员和主检或具体负责人员复核,以确保没有差错发生。

(2)收到标本后应按标本顺序逐一在申请单上编上病理检查号,并在标本容器外壁贴上相应的号码,然后按号码先后顺序排列放好,再在申请单上打上收到日期。将收检的标本,按申请单逐一向负责处理的医师交代清楚,包括标本种类、数量、临床诊断及有无特殊注意事项等。

(3)取检过程中,实验室人员应认真记录填写好工作单,包括标本号、块(包)数、有无特殊处理、标本名称,如标本全取、标本过小等均应记录在案以备日后查对。对一些易碎、小而少的标本应用尼龙丝小袋或擦镜纸包裹好后再做上机处理,以防丢失。标本的取材块通常控制在2cm×2cm×0.3cm左右。标本取检多于一个包埋块者,在标本病理检查号后缀写-1或-2等,以便于查找校对。取好的标本应及时浸泡在指定的固定液中,来不及取完的标本特别是大标本应缝上号码投入固定池内以备次日再取。标本取检完后,自报告发出之日起,通常规定小标本保留1月以上,大标本保留6月以上。

(4)标本在上机处理之前,必须由初级和中级实验技术人员共同检查标本总数与申请单和工作单是否一致,确定无疑后方可上机处理。

2.标本的处理

利用全自动脱水机处理。(根据组织的大小、分类分别设置程序)

所有试剂由专人负责定时检测定期更换,并做好详细记录。

3.标本的包埋

首先清点检查标本,确认完好无缺后方可开始包埋操作,操作时应注意核对标本与工作单记录是否吻合。包埋的石蜡温度应尽量与标本浸蜡温度一致,大约控制在65℃~70℃之间,温度太低会造成包埋平面凹凸不平,尤其是内镜活检等小块标本,易出现切片不完整而发生漏诊现象。

包埋时,先取大小合适的不锈钢模型,注入蜡液置于热台上,液面刚好与模型的上缘平齐,不得低于或高于此限。取出包埋盒内的组织,校对正确后用干净的热镊子将所有组织悉数放入模型的底部,待组织与模型内的蜡液充分融合后,按要求排列后迅速移动模型至冷台,至底部石蜡刚开始凝固,用镊子轻压组织数秒,待组织埋平后,迅速盖上包埋盒注上蜡液,约过10s ~15s ,包埋盒与模型周边的蜡液凝固后,再次补充注入少许蜡液,以增加包埋盒的稳固性,注意液面高度不得高于包埋盒上缘,加盖包埋盒时一定要保持与模型底部平面平行,无前后左右倾斜的现象。待蜡块在冷冻台彻底冷却后,从模型内取出修去包埋盒周边多余的石蜡。清点包埋好的蜡块总数,按大小类别放好,冷冻备切。

(二)切片

1、将切片刀安装在持刀座上;

2、将蜡块固定于支持器上;

3.、细心移动刀座或蜡块支持器,使蜡块与刀刃接近,旋紧刀座,观察蜡块面是否与刀座相平,如不平须调节支持器,使蜡块面与刀面平行;

4、修块(粗切):用右手匀速旋转切片机轮,修切蜡块表面至包埋其中的组织块全部切到。修块粗切片的厚度为15-20微米(注意:对于医嘱再次深切片特别是在原切片中发现了有意义病变而进行的深切片应尽量少修块,以尽量好地获得有关病变的连续性);

5、调节切片厚度调节器(一般为2-4 微米),进行切片。切出的蜡片应连续成带状,完整无缺,厚度适宜(3-5 微米)、均匀,无刀痕、颤痕、皱褶、开裂、缺损、松解等;

6、以专用镊子轻轻夹取完整、无刀痕、厚薄均匀、干净的蜡片,放入漂片机的温水中(40-50℃左右),使切片全面展开;每切完一个蜡块后必须认真清理水面,不得遗留其它病例的组织碎片以免污染。

7、将蜡片附贴于处理过的载玻片上,蜡片应放在载玻片右2/3处的中央,留出载玻片左1/3的位置用于贴附标签;蜡片与载玻片之间无气泡;为防止蜡片滑落,蜡片的一角(远离组织的)可粘在载玻片边缘上;若一片载玻片上捞两片以上的蜡片,必须把蜡片均匀贴附在载玻片上,保持制片的美观。

8、必须立即在置放了蜡片的载玻片一端(待贴标签处),用铅笔准确清楚地标记其相应的病理号(包括次级号),外借白片,需在每张白片上注明对应的病理号。

9、将置放了蜡片的载玻片呈45度斜置片刻;待载玻上的水分流下后,将其插入专用的染色架中,最后置于恒温箱中烘烤(72℃左右,15分钟),然后即可进行染色。

10、切片注意事项

(1)切片前蜡块要冷冻,这样容易切片(甲状腺、淋巴结及胃镜等特殊组织,必须控制冰冻时间)。

(2)如遇难切的蜡片时,可用与蜡块切面差不多大小的薄纸潮湿后贴在蜡块上切片,然后将附有蜡片的一面朝上放入水中漂片。

(3)如遇易脱片组织(如血凝块、脑组织)时,可用多聚赖氨酸或APES 处理过的玻片来捞片。

(4)总是切不出完整的蜡片,或皱缩或卷片,可能是刀不利。

(5)切出的蜡片总是皱缩,可能是蜡块冷冻时间不够,或是组织脱水、浸蜡效果不好。

(6)切片厚薄不匀或空片,可能是刀未固定紧或蜡块未夹紧,也可能是切片机

有问题。

(7)烤片时间与温度有关,一般时间宁长勿短,否则会造成脱片。一般烤片温度控制在62℃,时间为30min左右。

(8)连续切片放入热水漂片时,不要捞取第一、二张蜡片,因为前2 张蜡片厚、组织有空洞(镜下可见)。

(9)用于展片漂片仪的温水必须认真清理水面,不得遗留其它病例的组织碎片以免污染。

(三)HE染色

1、自动染色:见《染色机使用及维护标准操作程序》

2、手工染色

(1)脱蜡

①二甲苯Ⅰ 5分钟

②二甲苯Ⅱ 5分钟

③100%酒精Ⅰ 1分钟

④100%酒精Ⅱ 1分钟

⑤95%酒精 1分钟

⑥80%酒精 1分钟

⑦自来水浸洗 1分钟

(2)染色

①苏木素染液 6分钟

②水冼 1分钟

③0.5-1%盐酸酒精分化片刻(颜色由蓝变红即可)

④自来水冲冼10分钟左右(颜色由红变蓝)。(然后95%酒精片刻,主要是避免所带的水份稀释以下的伊红酒精,此步可免)

⑤伊红染液浸染

(3)脱水、透明、封固

①75%酒精 0.5分钟

②85%酒精Ⅰ 1分钟

③95%酒精Ⅱ 1分钟

④100%酒精Ⅰ 1分钟

⑤100%酒精Ⅱ 1分钟

⑥石炭酸二甲苯(1:3) 10秒钟

⑦二甲苯Ⅰ透明 1分钟

⑧二甲苯Ⅱ透明 1分钟

⑨取出后用中性树胶封固。

3、H&E染色注意事项

(1)二甲苯脱蜡时间冬季长些,夏季可短些,为防止脱蜡不净影响染色,脱蜡时间宁长勿短。

(2)盐酸酒精分化时间灵活掌握,可以在切片蓝化后镜下观察。

(3)染色后的脱水透明也很重要,若脱水不完全,切片会模糊不清,脱水的乙醇要保持纯度,切片在进入脱水乙醇前尽量把水份去掉。

(4)结束染色的切片用中性树胶封固。操作时用滤纸轻轻吸去组织周围的液体,

保持组织切片的轻度湿润,滴少许树胶,用镊子取盖玻片轻轻盖上。注意封片时不能让组织切片干涸,否则会出现人为色素即“中性树胶色素”。封片动作要轻,以防产生气泡或溢胶。树胶浓度要适当,预先可用二甲苯调试好备用。太稠不宜操作,太稀易出现气泡或溢胶。

(四)制片后

制片后过程由封固切片结束到上交切片为止。

1.封固好的切片,由初级实验技术人员按号码顺序排放在切片夹内,与相应的蜡块进行校对,检查切片与蜡块的号码是否一致,有无错号。检查切片与蜡块中组织的形状是否一致,是否切全。仔细粘贴标签后交上级人员复查。

2.上级人员根据申请单或工作单上的记录全面仔细检查切片,评分内容、标准及其分值如下。

外观(5分):清洁,无溢胶。载玻片及盖玻片完整。

标签(5分):清洁,号码清晰,粘贴牢固,贴在指定位置。

裱片(5分):组织裱贴在适当位置上,方向合适。

厚薄(5分):切片厚薄均匀一致。

平整(7分):切片平整无皱折。

切痕(8分):切片完整,无破裂或划痕。

透明(10分):切片透明,无云雾状,组织固定脱水彻底。

颜色(18分):核浆着色正,对比度清晰明显。

层次、气泡(5分):染色有层次,深浅分明,无气泡。

细胞形态(12分):无挤压、皱缩及膨胀变形。

污染(15分):无异物或其它组织混入切片。

洁净度(5分):玻片内无残留染料。

如有上述不合格项目,按评分表格标准扣分,总分为100分,90分以上为甲级片,90分~80分为乙级片,80分以下为丙级片。

3.切片检查完毕后登记交接给负责诊断的医师。

五、相关文件

(一)《染色机使用及维护标准操作程序》

(二)《切片设备使用及维护标准操作程序》

(三)中华医学会《临床技术操作规范-病理学分册》

(四)浙江省医疗机构管理与诊疗技术规范丛书《病理诊断与技术规范》

六、相关记录

(一)《组织切片机使用及维护记录表》

(二)《染色机使用与维护记录表》

(三)《病理实验室恒温箱温度记录表》

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