DNA提取原理

基因组DNA提取原理及方法

Time：2009-12-26 AM 10:54Author:bioer Hits: 5617 times

一、原理

DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。

在酸性溶液中，DNA天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA 时，先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖，RNA 及无机离子等，从中分离DNA 。DNP和RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。DNP在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0.14 mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2倍。RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。因此，在提取时，常用此法分离这两种核蛋白。

苯酚/氯仿作为蛋白变性剂，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA 溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA 。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态，真核细胞DNA的分离通常是在EDTA 及SDS一类去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞获得。诸多生物试剂公司现已有各种类型DNA提取试剂盒出售。

二、材料及试剂

1. GENTRO DNA提取试剂盒

2. 异丙醇

3. 70％酒精

三、操作步骤

（一）、从全血中提取DNA

1. 溶血：加300ul的肝素或EDTA二钠抗凝的全血到含RBC Lysis Solution 900ul 的1.5ml EP管, 室温静置1min,期间，轻轻颠倒混匀10次。13000 ~16000 g离心20s。

2. 弃上清液，将管底的白色沉淀用枪头吹散，使白细胞在残留的液体中悬浮。

3. 加300ul的Cell Lysis Solution于EP管中, 充分混匀。

4. 加100ul的Protein Precipitation Solution于EP管中, 充分混匀,13000 ~16000g离心3min.

5. 取上清液，加300ul的异丙醇，充分混匀颠倒50次，可见白色絮状沉淀，13000 ~16000 g离心1min 。

6. 弃上清液，加入70%的酒精500ul，13000~16000 g离心1min 。

7. 弃上清液，加入DNA Hydration Solution 50ul, 充分混匀，65℃5min使DNA 完全溶解。

8. 紫外分光光度计测定OD260/280，比值大于1.8即可。

（二）、从组织中提取DNA

9. 取液氮冷冻的叶片2-3片，在液氮冷冻下迅速研磨成粉末。

10. 将粉末放入到1.5 ml离心管中，然后加入缓冲液“S”750ul, 充分混匀。

11. 将离心管置于65℃水浴中1-2小时，水浴过程中温和混匀几次。

12. 取出离心管, 每管加入等体积的酚－氯仿(V/V=1:1)溶液600-700ul，混匀后离心，10000rpm, 10分钟。

13. 上清液移入另一离心管中，加入等体积的氯仿，混匀后，10000rpm, 6分钟。

14. 将上清液移入另一离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混匀，静置一段时间，然后用枪头勾出DNA,并用70％乙醇冲洗2次。

15. 勾出的DNA，真空干燥后将其溶于500ul 1×TE中。

16. 加入3ul RNA 酶溶液，37℃保温1 小时。

17. 加入等体积的酚-氯仿溶液, 轻轻混匀后, 10000rpm离心6分钟。

18. 取上清液，加入等体积的氯仿，轻轻混匀后，10000rpm离心6分钟。

19. 取上清液，入1/10体积3M醋酸钠，混匀后，加入2倍体积冷的无水乙醇（或95％乙醇）。

20. 轻轻混匀静置一会儿后，用枪头勾出DNA, 用70％乙醇冲洗2次后，真空干燥。

21. 依所提DNA量加入20-50ul的1×TE溶解DNA。

22. 测定DNA 的浓度，取少量样品跑电泳, Agarose 胶的浓度为0.8%。

23. 样品在4℃下保存备用。

附: 提DNA 所用试剂配方：

1. 1. 1M Tris-Cl (1L：800ml H2O中加121.1g Tris, 用HCl调pH 至8.5后定容至1升，灭菌)

2. 0.5M EDTA pH8 (1L: 800ml H2O中加186.1g EDTANa2 2H2O，用NaOH调pH至8.0，定容至1 升)

3. 20% SDS (2L: 在2L热水中缓慢加400g SDS，边加边搅拌，溶解后放置热地方保存)

4. 5M NaCl (1L: 750ml H2O中加292.2g NaCl，溶解后定容至1升，灭菌)

5. 缓冲液“S” ：配1L缓冲液“S”

1) 100mM Tris.Cl pH8.5 1M Tris.Cl 100ml

2) 100mM NaCl 5M NaCl 20ml

3) 50mM EDTA pH8.0 0.5M EDTA 100ml

4) 2% SDS 20% SDS 100ml

5) H2O 680ml

6. 100x TE (1L: 800ml H2O中加121.1g Tris, 3

7.2 EDTA Na2 2H2O, 用HCl调pH至

8.0, 定容，灭菌)

7. 50x TAE(1L: 500ml H2O中加242g Tris，溶解后加100ml 0.5M EDTA pH8.0和57.1ml冰醋酸，定容)

8. 蛋白酶K溶液的配制(用20mMTris.Cl, pH8, 2mMCaCl2的缓冲液配制浓度为10ug/ul 的蛋白酶K溶液；或用超纯水配制成相同的浓度)

9. RNase (用水溶解RNase, 终浓度10mg/ml, 煮沸20分钟，缓慢冷却，分装，-20℃下保存)

10. 10. 3M NaAc pH5.2 (1L: 600ml H2O中加入408.24gNaAc 3H2O , 溶解后，用冰醋酸调pH至

5.2，然后定容1L，灭菌)

四、注意事项

不同要求时可选择不同抽提方法提取DNA