重组蛋白表达系统的选择

重组蛋白表达系统的选择、表达策略和方法学研究

张宁

1. 前言

在生命科学的很多研究和应用领域中，如何获得大量、均一、高纯、有活性的蛋白质都是一个关键问题。现代重组蛋白表达技术为我们提供了多种选择：传统的大肠杆菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞表达系统以及较新的植物和体外表达系统。每种表达系统都有很多成功的例子，但重组蛋白的个性不尽相同，没有任何一个系统和方法是普遍适用的，为目的蛋白选择一个恰当的表达系统也就成为表达工作的重中之重。

关于目的蛋白的一切信息，对表达系统的选择都是有帮助的，有几个最基本的问题一定要在表达之前回答清楚：目的蛋白的来源是原核还是真核生物具有什么样的功能分子量和聚合状态是膜蛋白还是水溶蛋白胞内表达还是分泌表达是否需要以及需要何种翻译后修饰有没有配体、底物或产物类似物可以利用对蛋白酶是否敏感有多少分子内及分子间二硫键对目的蛋白的表达量、活性、表达速度和成本有怎样的要求除了摸清目的蛋白的脾性，还要清楚各个表达系统的特点、优势和局限性，才能找到表达工作的大略方向，要获得最适合目的蛋白的表达方案，还需要在具体实验中调整优化。

表1比较了目前常用的表达系统的特点，并给出了粗略的适用范围。

大肠杆菌酵母昆虫细胞哺乳动物细胞

流程简单简单复杂复杂

培养基简单简单复杂复杂

成本低低中高

产率高中中低

表达量高高较高较低

蛋白折叠中较好较好好

胞外表达周质空间分泌至培养基分泌至培养基分泌至培养基

细胞增殖周期30min90min18H24H

折叠常有错误折叠偶有不当折叠正确折叠正确

二硫键难以形成有有有

N-糖基化无甘露糖残基，高无唾液酸，简单复杂

O-糖基化无有有有

磷酸化无有有有

酰化无有有有

γ-羧基化无无无有

适用原核蛋白、简单

真核蛋白

真核蛋白、分泌

表达蛋白

真核蛋白、分泌

表达蛋白

复杂高等真核生

物蛋白

表1：常用表达系统比较

2. 原核表达系统

原核表达系统发展完善、流程简单快速、成本低、产量高，对大部分蛋白来说都值得一试，尤其适宜于表达原核来源的以及不需要翻译后修饰的真核蛋白。

表达菌株

原核表达系统刚用的宿主菌有E. coli，Bacillus等。其中革兰式阳性的Bacillus更适宜在其周质空间分泌表达重组蛋白；革兰氏阴性的E. coli能够广谱表达异源蛋白。

大肠杆菌表达系统是目前发展最完善的重组蛋白表达系统。常用大肠杆菌菌株有BL21（DE3）、

BL21（DE3）Star、B834（DE3）等，这些菌株都敲除了蛋白酶，并溶源了噬菌体DE3。DE3是的一种衍生λ噬菌体，带有噬菌体21抗性区和lacI基因，lac UV5启动子，以及T7 RNA聚合酶基因。这一区段被插入int基因，因此阻止了DE3在没有辅助噬菌体时整合到染色体上或从染色体切出。一旦形成DE3溶原状态，就只有受IPTG诱导的lac UV5启动子指导T7 RNA聚合酶基因转录，在溶原培养体系中加入IPTG诱导T7 RNA聚合酶生产，继而质粒上的目的DNA开始转录。同时，还有一些特殊设计的菌株以表达有特殊需要的重组蛋白，如甲硫氨酸营养缺陷型表达硒代甲硫氨酸蛋白，溶解性增强的菌株表达毒性蛋白，补充了稀有密码子的菌株表达真核蛋白等，表2给出了常用的大肠杆菌表达菌株。

常用表达菌株应用抗生素抗性

B834met营养缺陷性，对照株，不能使用

T7启动子，蛋白酶敲除

无

B834(DE3)met营养缺陷性，蛋白酶敲除无

BL21对照株，不能使用T7启动子，蛋白

酶敲除

无

BL21(DE3)常规表达宿主菌，蛋白酶敲除无

BL21(DE3)高严紧表达宿主菌，蛋白酶敲除氯霉素（34μg/ml）

BL21trxB(DE3)常规表达宿主菌，在胞质中形成二硫

键，蛋白酶敲除

卡那霉素（15μg/ml）

BL21trxB(DE3)pLysS 高严紧表达宿主菌，在胞质内形成二

硫键，蛋白酶敲除

卡那霉素（15μg/ml）氯

霉素（34μg/ml）

Origami对照株，不能使用T7启动子四环素（μg/ml）卡那霉素（15μg/ml）

Origami(DE3)常规表达宿主菌，更好的在中形成二

硫键

四环素（μg/ml）卡那霉

素（15μg/ml）

Origami(DE3)pLysS 高严紧表达宿主菌，更好的在中形成

二硫键

四环素（μg/ml）卡那霉

素（15μg/ml）氯霉素

（34μg/ml）

Rosetta 对照株，不能使用T7启动子，蛋白

酶敲除

氯霉素（34μg/ml）

Rosetta(DE3)常规表达宿主菌，lac

透性酶突变，可以控制表达水平，提

供稀有密码子tRNAs，蛋白酶敲除

氯霉素（34μg/ml）

Rosetta(DE3)pLysS 高严紧表达宿主菌，lac透性酶突变，

可以控制表达水平，提供稀有密码子

tRNAs，蛋白酶敲除

氯霉素（34μg/ml）

Rosetta-gami对照株，不能使用T7启动子四环素（μg/ml）卡那霉素（15μg/ml）氯霉素（34μg/ml）

Rosetta-gami(DE3)常规表达宿主菌，更好的在胞质内形

成二硫键，提供稀有密码子tRNAs

四环素（μg/ml）卡那霉

素（15μg/ml）氯霉素

（34μg/ml）

Rosetta-gami(DE3)pLysS 高严紧表达宿主菌，更好的在胞质内

形成二硫键，提供稀有密码子tRNAs

四环素（μg/ml）卡那霉

素（15μg/ml）氯霉素

（35μg/ml）

表2：常用E. coli表达菌株

质粒载体：

大肠杆菌表达系统采用质粒为表达载体，质粒上的重要元件包括复制子，启动子，终止子，多克隆位点，信号肽，融合标签，筛选标记等（图1）。原核表达载体已经发展得比较完善，有多种质粒可供选择(表4)。

复制子：

复制子决定着质粒载体在宿主中的拷贝数。通常情况下质粒拷贝数越高，重组蛋白的表达量就越高，但是高拷贝的质粒也会严重影响宿主的生长，质粒本身也不稳定，容易丢失和突变。克隆载体常采用拷贝数低、严谨复制的复制子，如pSC101；表达载体通常选用高拷贝的复制子，如pCoE1，pMBI（pUC），等。如果需要进行多个质粒的共转化，就要根据复制子的相容性选用不同复制系统的复制子，如pSC101和pUC共表达。

启动子：

表达重组蛋白时，我们需要考虑启动子的强弱、作用方式、调控方式和本底表达水平。表达载体通常选用强启动子以提高表达量，但弱启动子也有其优点，如降低本底表达、增加可溶表达、表达小量伴侣蛋白等。按照作用方式，启动子可以分为两类：组成型表达的启动子使宿主不停地表达重组蛋白，常用于工业生产，如σS等；诱导型表达的启动子使宿主仅在受到诱导（诱导剂、温度等）时表达目的蛋白，诱导型启动子使重组蛋白的表达容易控制，同时降低了外源蛋白对细菌生长的影响。

图1：大肠杆菌表达质粒pET-22b(+)图谱及多克隆位点

早期大肠杆菌表达体系中，常见的启动子是lac和lac UV5。lac是一个弱启动子，很难使外源基因得到高表达。目前使用的含有需要小量共表达的蛋白(如分子伴侣，蛋白抑制剂等)的载体，有很多都采用了经典的lac启动子。

强启动子中，tac和trc是lac启动子的变体，其重组蛋白产率能够达到细胞总蛋白量的15-30%。araBAD启动子的诱导剂是便宜无毒的L-阿拉伯糖，本底表达量低，启动能力比tac稍弱。T7则是目前原核表达系统中最高效的启动子，pET表达系统即是以它为中心构建的。T7启动子来源于λ噬菌体，专一与T7启动子结合的T7 RNA聚合酶则被整合在宿主菌的基因组中。在λ噬菌体溶源的表达宿主菌，如BL21（DE3）中，lacI抑制T7 RNA聚合酶的表达，IPTG的加入可以解除这种抑制。当受到诱导时，T7 RNA聚合酶开始表达并结合在T7启动子上，启动重组蛋白的表达。T7 RNA聚合酶活性很高，转录速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍，使其下游的重组蛋白得到高

效表达，其产率可以达到细菌总蛋白量的50%以上。T7lac启动子则在T7启动子下游加入了一个lac操纵子，其中带有一个常规启动子和lac阻遏蛋白的编码序列。lac阻遏蛋白可以抑制宿主合成T7 RNA聚合酶，并阻断T7 RNA聚合酶导致的目的基因转录，从而降低重组蛋白的本底表达水平。

P L、cspA启动子使宿主菌能够进行温度依赖型的表达。在温度敏感型突变体菌株中，P L等启动子使得宿主在30℃时抑制重组蛋白表达，而在42 ℃时诱导重组蛋白表达；cspA启动子则被高温（37℃）抑制，低温（10℃）启动。温度诱导型的启动子避免了诱导剂的引入，降低了使用成本，同时也降低了诱导剂对细胞的伤害。

终止子：

转录终止子按照是否依赖和不依赖ρ因子的作用分为两类，这两类终止子均在终止点前含有一段7-20bp的回文序列。终止子可以保护mRNA在核外不被降解，显著延长mRNA的寿命，由此提高重组蛋白的表达量。但是对于T7系统来说，由于T7 RNA聚合酶效率极高，宿主中随时都有充足的mRNA以供翻译，因此大部分在T7系统中表达的重组蛋白并不在意质粒上是否有终止子，只有一些自身带有翻译起始信号的外源基因需要终止子。

启动子受细胞类型的限制，在不同的细胞系中有很大不同，因此需根据宿主细胞（尤其是真核宿主）的类型选择不同的启动子以便于目的基因的高效表达。

融合标签：

融合标签是与目的蛋白共表达的一段多肽，方便重组蛋白的纯化、固定和检测，表3给出了常用的重组标签。如果不需要对重组蛋白进行纯化，尽量不要引入融合标签，以免影响蛋白性质；如果重组蛋白本身能够结合某种亲和柱，如某些金属结合蛋白可以结合Ni-NTA，某些糖结合蛋白能够特异识别糖类，也不必引入标签。

融合标签的引入能够大大简化重组蛋白的纯化流程，并提高蛋白溶解度。商业化表达质粒，如pET、pGEX等提供了各种纯化标签和融合蛋白供选，应根据蛋白具体情况进行选择。

His-tag是最常用的纯化标签，它具有很多优点：标签较短（10-20个氨基酸残基），不带电（），免疫原性差，通常不影响重组蛋白的结构和功能，Ni2+亲和力高，能够通过一步纯化达到60%-90%的纯度。

如果蛋白质溶解度不高，导致折叠困难、表达量低，可以选择较大的融合标签（GST、MBP、Trx 等）帮助重组蛋白表达和折叠，提高重组蛋白溶解度，从而提高表达量。较大的融合标签有时也会导致翻译困难甚至提前中止，纯化后发现大部分都是标签蛋白也是常见现象。翻译的提前中止会大大影响重组蛋白产率和后续纯化，所以在短标签能够达到目的的时候，尽量不要选择大的融合标签。

标签位置的选择也很重要：N端标签（短的或长的）自身带有启动子和适应宿主偏好的密码子，可以帮助目的蛋白表达，提高表达量，但是提前中止翻译的蛋白片段也会被一并纯化出来，降低重组蛋白纯度，对蛋白酶敏感的、自身容易降解的以及一级序列中有集中的疏水残基区的蛋白尤其要避免使用N端标签；C端标签则可以保证只有完整蛋白得到纯化。另外，如果蛋白的近N 端或近C端有重要功能区，如酶活中心、配体结合位点、二硫键、多聚体稳定界面、相互作用界面等，则要避免纯化标签位于该末端，以免影响重组蛋白的结构和功能。

如果融合标签对蛋白性质有较大影响，但又是纯化所必须的，就可以考虑在纯化过程中去除标签。主要有三种方法：化学裂解，如溴化氰（CNBr）、羟胺（NH2OH）等，能够简单有效地去除标签，但反应条件苛刻（羟胺需要在下反应），特异性较差，而且会引入不必要的修饰，除包含体蛋白的处理外已经很少使用了；酶解，如PPase等，其底物一般是一段比较长的肽链，特异性强，是目前比较常用的方法，缺点是酶切反应需要较长的时间，也增加了蛋白纯化的步骤，使纯化变得繁琐；IMPACT质粒，该质粒在纯化标签和目的蛋白之间插入了一个蛋白质内含子（intein），intein 具有可诱导的自切割活性，使用IMPACT质粒表达的重组蛋白，只需要改变缓冲液的pH和温度，

即可切掉融合标签。

标签N/C端或内部

（I）

大小（氨基酸残

基）

鉴定/纯化原理

T7-Tag N，I11单克隆抗体

S-Tag N，I15S-蛋白亲和

His-Tag N，C，I6金属螯合层析

HSV-Tag C11单克隆抗体

pelBlampT N20细胞周质定位

KSI N125疏水区

Trx-Tag N109提高细胞质可溶性，单克隆抗体

PKA site I5蛋白激酶A识别位点

CBDclos-Tag N156纤维素结合

CBDcenA-Tag N114纤维素结合，细胞周至/培养基定位CBDcex-Tag C107纤维素结合，细胞周至/培养基定位DsbA-Tag N208细胞周质定位

DsbC-Tag N236细胞周质定位

GST-Tag N220提高细胞质可溶性，谷胱甘肽亲和

MBP-Tag N，I370提高细胞质可溶性，麦芽糖亲和

Nus-Tag N，I495提高细胞质可溶性，单克隆抗体

表3：常用融合标签

筛选标记：

在没有压力的环境下培养时，细菌中的外源质粒常常随着细胞复制而丢失。为了稳定质粒、表达重组蛋白，需要在载体中加入筛选标记，使宿主菌在原则压力下生长。原核系统中，常见的筛选标记有蓝白斑筛选（主要用于克隆）、营养缺陷性筛选和抗生素筛选，也可以将几种筛选手段混合起来使用。

常见的抗生素筛选标记有：青霉素抗性、卡那霉素抗性、氯霉素抗性、四环素抗性等。氨苄青霉素由于会被抗性细菌分泌的β-内酰胺酶和酸性环境破坏掉，其筛选效果会随时间降低，不适宜连续发酵，将抗性基因反转或换用对低pH不敏感的羧苄青霉素可以部分解决这个问题；卡那霉素不会被破坏，抗性较强，但是不同菌株的抗性差异较大，平板培养和悬浮培养液有所不同，使用时常需要针对个别菌株摸索适宜浓度；氯霉素抗性常见于有特殊用途的菌株和质粒，如pLysS。抗生素浓度的过高或过低都会降低重组蛋白的表达量，另外在使用多个载体进行共表达时，应注意不同的质粒要携带不同的筛选标记，抗生素浓度也要比单独表达适当降低。

分泌表达：

如果不希望重组蛋白表达在细胞质中，可以在重组蛋白的N端加入信号肽，引导蛋白穿越细胞膜。大肠杆菌的分泌表达一般是分泌到周质空间，各种芽孢杆菌则可以分泌到培养基中，简化纯

化流程。分泌表达的表达量通常远远低于胞质表达，但是也有其优势：跨膜过程可以帮助重组蛋白折叠，提高其溶解性和活性；周至空间和培养基的氧化环境能够帮助二硫键形成；也可用于除去牢固结合在蛋白上的配体；分泌到细胞外还能降低有毒重组蛋白对细胞的影响。

载体启动子抗生素

抗性

融合标签1蛋白酶信号肽

pET: Novagen

pET-3a-d T7amp R T7

pET-11a-d T7lac amp R T7

pET-15b T7lac amp R His凝血酶

pET-17b T7amp R T7

pET-19b T7lac amp R His肠激酶

pET-20b T7amp R His有pET-21a-d T7lac amp R His，T7

pET-22b T7lac amp R His有pET-23a-d T7amp R His，T7

pET-24a-d T7lac kana R His，T7

pET-28a T7lac kana R His，T7凝血酶

pET-30a-c T7lac kana R His，S凝血酶，肠激酶

pET-31b T7lac amp R His凝血酶，肠激酶

pET-32a-c T7lac amp R His，S，Trx凝血酶，肠激酶

pET-35b T7lac kana R His，S，CBD凝血酶，Xa因子

pET-37b T7lac kana R His，S，CBD凝血酶，Xa因子有pET-39b T7lac kana R His，S，Dsb凝血酶，肠激酶

pET-41a-c T7lac kana R His，S，GST凝血酶，肠激酶

T7lac amp R His，S，HSV，Nus凝血酶，肠激酶

pGEX: GE

pGEX-1λT tac amp R GST凝血酶

pGEX-2TK tac amp R GST凝血酶，肠激酶

pGEX-3X tac amp R GST Xa因子

pGEX-4T-1tac amp R GST凝血酶

pGEX-5X-1tac amp R GST Xa因子

pGEX-6P-2tac amp R GST Ppase pMAL: NEB

pMAL-c2X/E/G tac amp R MBP Xa因子/肠激酶/Genease

pMAL-p2X/E/G tac amp R MBP Xa因子/肠激酶

/Genease

有

表4：常用原核表达载体质粒

优化表达条件

重组蛋白的表达流程很少有一次成形的，为了提高蛋白表达量、改善蛋白质量，表达条件和流程的优化是必须的。

当重组蛋白不表达时：

如果重组蛋白不表达（包含体和可溶蛋白都没有），首先检查cDNA和质粒是否正确，蛋白对宿主菌是否有很大毒性，然后尝试更换菌株、质粒载体和融合标签。原核蛋白在大肠杆菌中不能表达的情况很少见，通常是真核蛋白不能表达。不能表达的重组蛋白，即使在更换了宿主、载体后可以表达，表达量也不会很高，如果需要大规模生产，最好尝试酵母和昆虫细胞表达系统。

当表达量不理想时：

检查密码子构成，使其适应宿主菌的密码子偏好。稀有密码子，尤其是位于重组蛋白N端的和大量集中的稀有密码子，会降低mRNA稳定性，显著降低翻译速度，引起翻译提前中止、翻译移码和突变。将这些稀有密码子（尤其是N端！）突变为宿主偏好的密码子，能够显著提高表达水平，必要时可以根据宿主的偏好重新合成cDNA。另一个解决办法是与能够表达稀有tRNA 的质粒共表达或直接采用带有该质粒的宿主菌，如BL21 codon plus、Rosetta等。更换菌株容易引起一系列问题，如启动子相溶性、额外的抗生素抗性等，使用时要多加注意。

检查外源基因cDNA5’端结构，高GC含量、回文结构和相距较近的两个起始密码子会阻碍转录起始，表达量不理想时应予以去除；

检查终止密码，mRNA的通读会降低重组蛋白的质量和稳定性。不同终止密码子的终止效率在不同的物种中有很大差异，酵母和哺乳动物偏爱UAA和UGA，昆虫和大肠杆菌倾向于用UAA；终止密码子3’端紧邻的碱基也会影响终止效率，对于UAG来说，终止效率U、A>C>G，其他终止密码G>U、A>C；也可以多加一个终止密码子，以确保翻译在正确的位点结束。

改变融合标签的位置，N端的标签可以帮助翻译起始，从而提高蛋白的表达量。

可溶表达低时：

错误折叠是引起重组蛋白可溶表达量低，包含体表达量高的一个重要原因。改善重组蛋白折叠的方法有：

降低诱导后培养温度。重组蛋白表达得越慢，其折叠效果就越好，大肠杆菌在4℃时依然可以表达重组蛋白，而将培养温度降低至25-30℃就能显著改善蛋白折叠。此方法不适用于温度诱导的重组蛋白表达；

减少诱导剂。诱导剂浓度可以降低至1/10；选用Lac渗透酶缺陷型菌株，如Tuner、Rosetta等，也有很好的效果。这类菌株能够使进入每个细胞的诱导剂浓度相同。重组蛋白在所有细胞中的表达水平相当时，减少诱导剂的效果更好；

增加一个融合标签，或者更换一个分子量更大的标签。一般来说，越大的融合标签在提高重组蛋白溶解度方面效果越好，如MBP、GST的效果要优于His6标签。以改善溶解度为目的的融合标签最好放置在目的蛋白的N端；

改善二硫键的形成。大肠杆菌细胞内的还原环境会阻碍二硫键的形成，如果要表达有一对或多对

二硫键、特别是需要二硫键来稳定分子内和分子间结构的重组蛋白，最好选用经过特别设计的载体和菌株，如pET39b(+)和pET40b质粒、BL21trxB，Origami和Rosetta-gami菌株。也可以考虑将蛋白分泌至周至空间，利用周至空间的氧化环境和酶来帮助二硫键的形成；

只表达蛋白的可溶片段。可溶片段突变体与全蛋白之间经常有很大差异，如等电点、抗原性、寡聚状态、活性、细胞定位等，突变时一定要谨慎考虑；

突变掉可能引起顺反异构的Pro。顺反异构伴随着很高的能量跃迁，是蛋白折叠的能量壁垒。突变掉这样的Pro可以显著帮助重组蛋白折叠，但是同样会改变蛋白性质，要谨慎考虑；

与分子伴侣和折叠酶共表达。微量的分子伴侣即可显著改善重组蛋白的折叠状况，与重组蛋白同源的分子伴侣效果更加明显。引入分子伴侣同样也会引起复制子相容性、额外的抗生素抗性等问题，常用的分子伴侣有ATP依赖的DnaK-DnaJ-GrpE和GroEL-GroES，以及定位于周质空间的分子伴侣SurA、PpiD等。折叠酶可以帮助蛋白跨过折叠过程的能量壁垒，使重组蛋白更快更好的折叠；

在重组蛋白N端加入信号肽，将其引导至周质空间，用跨膜过程来帮助蛋白折叠和二硫键形成，并减轻蛋白降解；

在培养基中加入重组蛋白的配体或底物类似物。配体结合，有时仅仅是配体的存在就能大幅度的改善蛋白的折叠和稳定性，此法不适用于无法被细菌摄取的配体；

如果是多个蛋白共表达，可以考虑用一段柔软的linker将两个蛋白连接起来，使溶解度好的蛋白帮助溶解度差的蛋白折叠；

改善蛋白稳定性。能够引起蛋白降解的因素很多，从蛋白自身性质到宿主性质不一而足，如果重组蛋白在表达时就被降解，表达量和稳定性就会受到很大影响。在大肠杆菌中表达重组蛋白，需要牢记N端法则：当N端第二个残基是Leu、Arg、Lys、Phe、Tyr和Trp时，重组蛋白半衰期只有2分钟，而小侧链的氨基酸残基，如Ala，则可以提高蛋白稳定性。因此在设计载体时，要特别注意第二个密码子，避免上述残基的出现。

处理高毒性蛋白：

外源基因的表达对大肠杆菌总有或多或少的影响，一般来说，经过改造的宿主可以在很大程度上容忍重组蛋白，重组蛋白可以占到细胞总蛋白量的50%或更高。但少数毒性极高的重组蛋白，其本底表达就会杀死原核宿主，质粒容易丢失，使其在大肠杆菌中很难得到高表达。以下方法可以降低重组蛋白的本底表达量。

在培养基中加入1%的葡萄糖。葡萄糖是大肠杆菌的第一碳源，它的存在可以显著降低由其他碳源引起的本底表达。

采用严格启动的载体和宿主。如PBAD载体、pLacI宿主。

采用低拷贝数的载体。降低表达载体质粒的拷贝数，可以明显降低基础表达水平。如pETcoco载体在每个细胞中仅一个拷贝，而受到IPTG诱导时又可以高效表达重组蛋白。

采用可表达T7溶菌酶的宿主。T7溶菌酶是T7RNA聚合酶的抑制剂，采用含有T7溶菌酶质粒的宿主，如pLysS，可以降低重组蛋白在大肠杆菌快速生长期的本底表达量，在受到IPTG诱导时也能较好的表达蛋白。

除此之外，也可以通过共表达重组蛋白的抑制剂、提高抗生素浓度等方法提高毒性蛋白的表达量。

包涵体表达：

在使用高效的E. coli表达系统时，过量表达的重组蛋白常会在细胞内凝聚，形成无活性的包涵体沉淀。在早期实验中，包涵体被认为是重组蛋白表达的大敌：包涵体蛋白折叠混乱、二硫键配对混乱、没有生物活性、变复性条件需要长时间摸索等，即使包涵体蛋白成功复性，其均一性和活性依然备受质疑。但是包涵体表达也有其优势：能够很轻松的获得超高的表达量，不可溶的重组蛋白不会被宿主内的蛋白酶降解，重组蛋白的毒性被大大抑制，杂蛋白含量低（~10%），容易

纯化等。由于这些优点以及蛋白质复性条件的不断发展，表达包涵体蛋白逐渐为人们所接受，成为重组蛋白表达的一个常用方案。

与可溶蛋白相反，提高培养温度、延长培养时间、在较高的菌密度下诱导都有利于包涵体的形成；在破菌和变性溶解时加入还原剂能够打开错配的二硫键；在复性液中加入二硫键异构酶、脯氨酸异构酶、分子伴侣和蛋白的辅助因子可以帮助重组蛋白折叠；精氨酸和高分子量PEG能减轻蛋白分子的聚集；尝试多种物理手段，如透析、快速稀释和柱上复性等，有时对复性有奇效。包涵体的表达相对简单，但其复性过程仍是依赖经验的，没有通用的方法可以套用。

3. 酵母表达系统

酵母表达系统兼有原核和高等真核系统的优点。酵母是一种单细胞低等真核生物，培养条件普通，生长繁殖速度迅速，能够耐受较高的流体静压，用于表达基因工程产品时，可以大规模生产，有效降低了生产成本。酵母表达外源基因具有一定的翻译后加工能力，收获的外源蛋白质具有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰，性质较原核表达的蛋白质更加稳定，特别适合于表达真核生物基因和制备有功能的表达蛋白质。某些酵母表达系统具有外分泌信号序列，能够将所表达的外源蛋白质分泌到细胞外，因此很容易纯化。

应用酵母表达系统生产外源基因的蛋白质产物时也有不足之处，如产物蛋白质的不均一、信号肽加工不完全、内部降解、多聚体形成等，造成表达蛋白质在结构上的不一致。另外，还时常遇到表达产物的过度糖基化情况。因此，表达系统应根据具体情况作适当的改进。

常用酵母表达系统(宿主-载体系统)

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达系统

由于遗传和生理背景清楚而且安全，酿酒酵母是最早应用于重组蛋白表达的酵母宿主菌。

表达菌株：

INVSC1是酿酒酵母表达系统的常用菌株，它是一种双倍体营养缺陷细胞株，在缺少组氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶的培养基中（如SC基本培养基）不能生长。GAL1是酿酒酵母表达系统中常用的启动子，以半乳糖作为碳源可以诱导转录起始，葡萄糖则抑制转录。在葡萄糖培养基中，重组蛋白只有本底水平的表达，收集菌体并转入只含半乳糖的培养基可以诱导重组蛋白表达。也可以使用棉子糖代替葡萄糖作为碳源，棉子糖对GAL1启动子没有影响，既不会抑制也不会激活，在菌体达到一定浓度之后直接加入半乳糖即可诱导重组蛋白表达。

酿酒酵母可以对重组蛋白进行乙酰化修饰，以及没有位点特异性的Ser/Thr磷酸化修饰，还可以进行Asn N-糖基化和Ser/Thr O-糖基化修饰。酿酒酵母的糖基化修饰采用单一的甘露糖残基，N-糖基化修饰由1，3-和1，6-甘露糖残基构成，往往形成40-200个甘露糖残基的较大糖链，通过基因改造可以阻断N-糖基化过程，使糖链缩短为Man8GlcNAc2核心糖链，糖链末端为1,3-甘露糖，使重组蛋白的抗原性明显增强。O-糖基化则由不超过5个的甘露糖残基聚合而成。

表达质粒

真核表达系统常采用穿梭质粒为表达载体。穿梭质粒含有两套复制子和启动子，以及相应的筛选标记，可以在原核和真核两种宿主中分别完成复制和表达，以方便对质粒进行遗传操作和大量制备。

酿酒酵母本身含有质粒，其表达载体可以有自主复制型和整合型两种。自主复制型质粒中，高拷贝载体通常采用酵母天然质粒的复制子，如2μ复制子，以使载体在宿主中达到较高的拷贝数（10-40），并独立于宿主染色体进行复制；低拷贝复制子则采用从酵母染色体中的自主复制序列（ARS）作为复制子，在宿主中严紧复制，通常一个细胞只有1-2个拷贝。真核表达载体常用的筛选标记有营养缺陷型（如URA3、TRP1）和抗生素抗性（如灭瘟素、G418等）。

载体启动子筛选标记融合标签

pYES2μ2URA3无

pYES2/NTμ2URA3Xpress

pYES2CTμ2URA3V5, His

pYES3/CTμ2TRP1V5, His

pYES6/CTμ2灭瘟素V5, His

pYC2/NT CNE6/ARSH4URA3Xpress

pYC2/CT CNE6/ARSH4URA3V5, His

pYC6/CT CNE6/ARSH4灭瘟素V5, His

表5：常用酿酒酵母表达载体

整合型质粒（如Yip5）不含ARS，必需整合到染色体上，随染色体复制而复制。整合过程是高特异性的，但是拷贝数一般很低。多拷贝整合载体pMIRY2通过将目的基因靶向整合到rDNA簇上(rDNA簇为酵母基因组中串联存在的150个重复序列)克服了这个缺点，利用pMIRY2质粒可以得到100个以上的拷贝。

酿酒酵母作为表达菌株具有一定的局限性，如缺乏强有力的启动子，重组蛋白产率往往只有全细胞蛋白的5%左右；难于高密度培养；分泌效率低，几乎不分泌分子量大于30 kD的外源蛋白，有时蛋白只被分泌到周至空间而非培养基中；重组蛋白容易过度糖基化；内部降解复杂，重组蛋白的C端往往被截短。因此，现在一般使用甲醇酵母代替酿酒酵母，用于重组蛋白质的真核表达。

毕赤酵母（P. Pastoris）表达系统

毕赤酵母是一种甲醇营养型酵母，可以依赖甲醇作为唯一碳源生长，甲醇可以诱导代谢所需的酶的表达。目前发现的所有甲醇营养型酵母，其甲醇代谢途径都是相同的，甲醇首先被乙醇氧化酶（AOX）氧化，生成甲醛和过氧化氢。为了避免过氧化氢毒害细胞，这步反应在过氧化物酶体中进行。在毕赤酵母中，AOX有两个编码基因：AOX1和AOX2，其中AOX1基因编码了细胞内绝大多数的乙醇氧化酶。AOX1的表达受AOX启动子的严格调控，本底表达水平极低，而甲醇诱导表达量可以达到细胞总蛋白的30%以上，使用AOX启动子使得重组蛋白可以达到很高的表达量。

毕赤酵母中，His+转化子可以自发的进行高拷贝整合，概率为1-10%，选择带有HIS4基因的表达载体即可以提高外源基因的拷贝数，从而提高重组蛋白的表达水平。

毕赤酵母也是重组蛋白分泌表达的理想宿主。毕赤酵母本身只分泌表达少量蛋白，而且可以使用不含蛋白的培养基，因此分泌表达的重组蛋白在培养基中占据了绝对优势，大大简化了纯化步骤。表达菌株：

毕赤酵母的表达菌株都是由野生型石油酵母NRRL-Y11430改造而来，含有一种或几种营养缺陷（如his4、arg4等）以方便筛选（表6）。研究发现，敲除了AOX基因的菌株有时能更好的表达外源蛋白，而且诱导所需的甲醇量也大大降低了。按照AOX基因的敲除情况和利用甲醇的能力，毕赤酵母表达菌株可以分为3类：在甲醇培养基中快速生长的Mut+；敲除了AOX1，在甲醇培养基中慢速生长的Mut S和敲除了两个AOX基因，不能利用甲醇的Mut-。不同的表型可以用来

检测外源基因在毕赤酵母转化子中的整合方式。除此之外，还有敲除了蛋白酶（prb1、pep4）的菌株，以保护重组蛋白不受宿主蛋白酶的攻击。蛋白酶缺陷型的菌株生长比较缓慢。

与酿酒酵母相同，毕赤酵母也可以进行二硫键形成、磷酸化、乙酰化、糖基化等翻译后修饰，也只能利用甘露糖残基对蛋白进行糖基化修饰。毕赤酵母的N-糖基化糖链较短，平均每个支链8-14个甘露糖残基，有利于重组蛋白的分子均一性；而且糖链中和糖链末端都没有1,3-甘露糖，对重组蛋白抗原性的影响也比酿酒酵母低。

毕赤酵母表达菌株甲醇利用表型营养缺陷蛋白酶敲除

X-33Mut+--

GS115Mut+组氨酸缺陷-

KM71Mut S组氨酸、精氨酸缺陷-

KM71H Mut S精氨酸缺陷-

MCIO0-3Mut-组氨酸、精氨酸缺陷-

SMD1163Mut+组氨酸缺陷PEP、PRB敲除

SMD1165Mut+组氨酸缺陷PRB敲除

SMD1168Mut+组氨酸缺陷PEP敲除

SMD1168H Mut+-PEP敲除

表6：常用毕赤酵母表达菌株

表达载体：

毕赤酵母本身没有质粒，自主复制型载体通常不稳定，因此一般采用整合型载体。整合型载体的外源基因表达盒由几部分组成：AOX启动子、多克隆位点、融合标签、AOX终止子，有时还有一段AOX1基因的3’端非编码区，以便将外源基因表达盒导入基因组中的AOX1位点。一些载体还含有外分泌信号肽，使重组蛋白分泌至培养基中。某些载体允许构建多个串联的外源基因表达盒，以弥补整合型载体拷贝数量的缺陷。组成型表达的GAP启动子可以替代AOX启动子：GAP 启动子不需要甲醇诱导，表达水平较高，操作简单，但不能表达对宿主有高毒性的蛋白。

除表达盒之外，载体上还有筛选标记（营养缺陷互补基因、抗生素抗性基因）和在细菌中进行拷贝增殖所必须的序列（启动子、终止子、复制子、抗生素抗性基因等）。遗传霉素G418抗性和博来霉素Zeocin抗性是常用的抗生素筛选标记，常用于外源基因多拷贝的筛选。博来霉素抗性由于基因很小（375bp），易于操作，而且也能对原核宿主进行筛选，逐渐成为人们偏爱的筛选标记。

载体质粒需要首先进行线性化，才能重组到宿主染色体中。克隆载体上一般有多个线性化酶切位点供选。基因重组可以发生在基因组中AOX基因区域和相应的质粒AOX区域之间，包括AOX启动子、终止子和3’非编码区。通过选择不同的线性化位点控制重组和外源基因的插入，可以导致宿主的不同甲醇利用表型（Mut+/Mut s）。如选择AOX启动子和3’端非编码区的酶切位点，会导致染色体中的AOX基因被置换下来，使Mut+表型的宿主变为Mut s。如果需要多拷贝的外源基因，可以使用带有HIS4基因的载体，并选择HIS4中的酶切位点进行线性化。这个线性化位点不会影响宿主的甲醇利用表型，最终得到的表达菌株表型与宿主相同。

图2：酵母表达载体pPIC9K质粒图谱

常用毕赤酵母表达

载体

启动子拷贝数分泌信号肽筛选标记融合标签

AOX1低-HIS4-

AOX1高-HIS4，遗传霉素-

pPIC9AOX1低α因子HIS4-

pPIC9k AOX1高α因子HIS4，遗传霉素-

pAO815AOX1高-HIS4-

pHIL-S1AOX1低PHO1HIS4-

pHIL-D2AOX1低-HIS4-

pPIC6A,B,C AOX1低-灭瘟素c-myc抗原，His

pPIC6αA,B,C AOX1低α因子灭瘟素c-myc抗原，His

pPICZαA,B,C AOX1低α因子博来霉素c-myc抗原，His

pPICZA,B,C AOX1低-博来霉素c-myc抗原，His

pGAPZαA,B,C GAP低α因子博来霉素c-myc抗原，His

pGAPZA,B,C GAP低-博来霉素c-myc抗原，His

表7：常用毕赤酵母表达载体表达条件的优化：

检查外源基因的一级序列：5’端不能有回文结构；密码子构成需要适应宿主的密码子偏好，特别是N端前几个，如使用了酵母厌恶的密码子会大大影响表达量；高AT含量的序列会使转录提前中止；检查重组蛋白序列，分泌表达时需要糖基化位点Asn-X-Ser/Thr。

宿主表型：尝试Mut+/Mut S/Mut-表型的宿主，不同的基因在不同的宿主菌中可能表达量截然不同，多试几种菌株，挑选最优的表达体系。胞内表达尽量使用Mut S和Mut-的宿主菌，以降低乙醇氧化酶的表达，提高重组蛋白产率。

多拷贝转化子的筛选：在使用、pPIC9等多拷贝载体时，需要对转化子进行大量的筛选工作。以抗生素为筛选标记时，由于酵母的耐受能力与细胞密度有关，可能会出现假阳性，对挑选出来的高抗性转化子，还应做进一步的PCR验证，也可以省略平板筛选，直接做PCR鉴定。高克隆并不能一定带来高表达，表达菌株的最终确定应以表达量为准。在表达分子量不大的蛋白时可以考虑换用pAO815载体，pAO815可以精确控制外源基因拷贝数，一次转化即可获得含有正确数目插入的转化子，从而省去了转化子的筛选工作，其缺点是克隆复杂，载体较大。

细胞定位：不是所有蛋白都适合分泌表达，如果重组蛋白本身定位于胞质中而且没有糖基化位点，应该尝试胞内表达。

培养基：重组蛋白分泌表达时，最好选用pH可在较宽范围内变化的磷酸缓冲液培养基，优化培养基pH值能提高蛋白表达量和稳定性。基本培养基可以简化纯化过程，丰富培养基则使表达菌株的生长更好，还有助于稳定重组蛋白，表达量偏低时最好使用丰富培养基。培养基中的甘油浓度有时也会影响重组蛋白的表达量和活性，甘油浓度过高会影响培养基溶氧量，需注意。

甲醇浓度：不同的宿主-载体-重组蛋白体系的最优甲醇诱导浓度是不同的，从%-5%都有可能，是需要优化的一个重要表达条件。摇瓶培养时甲醇浓度不易监测，需要根据经验补加；发酵培养则可以实现甲醇浓度的精确控制，有利于重组蛋白的高表达。

细胞密度：提高细胞密度能够显著提高重组蛋白的表达量。在培养基中添加不会抑制AOX启动子的碳源，如山梨糖醇、甘露糖、海藻糖、丙氨酸等，可以提高生物量。摇瓶培养效果不佳时，可以考虑发酵培养。

蛋白酶：酵母细胞中有多种蛋白酶，也会分泌一些中性蛋白酶至培养基中。如果重组蛋白对这些酶敏感，可以通过几种方法减轻蛋白酶的影响：降低培养基pH值，使蛋白酶失活；提高培养基中的蛋白含量，加入1%酪蛋白水解物，用杂蛋白保护重组蛋白；换用蛋白酶敲除的宿主菌。

溶氧量：越高越好。毕赤酵母的生长对氧气要求不高，高效表达则需要大量氧气。使用摇瓶表达时，减少培养基体积并提高转速可以显著提高菌液溶氧量，如果培养基中加有抗生素，甚至可以去掉棉塞，只用4-8层纱布封口。

温度：培养温度超过30℃将使酵母的生长和表达趋于停滞，如果摇床或发酵罐温度不稳，设置在28℃。

过糖基化：重组蛋白的过糖基化不仅影响均一性，而且有时还会影响表达量。尝试胞内表达、敲除N-糖基化位点可以降低重组蛋白的糖基化水平，也可以在纯化时加入酶切除过长的糖链以提高蛋白均一性。

菌株老化：表达菌株多次传代后表达量会明显降低，有时表达第一次、第二次产量都很高，然后突然下降。长期表达时应注意保持菌株的新鲜：用原始菌株多做一些甘油菌，-80℃冻存，每次表达之前都取出一管重新划线。

重组蛋白不分泌或分泌量低：在分泌之前，重组蛋白必须正确折叠并形成正确的二硫键，错误和不当折叠都会干扰分泌通路。共表达辅助因子，如分子伴侣（Hsp70、90家族）、二硫键异构酶Pdi，过表达未折叠蛋白相应转录因子Hac1p（诱导分子伴侣和分泌通路酶的表达）等方法可以帮助重组蛋白进入分泌通路，提高分泌表达量和蛋白活性。

4. 昆虫细胞表达系统

昆虫细胞表达体统适宜表达高等真核生物蛋白。昆虫细胞在培养中可以达到较高的细胞密度，具有复杂的翻译后修饰，如蛋白质的正确折叠与切割、二硫键形成、糖基化、磷酸化、酰化、酰胺化、羧甲基化等，很多修饰过程与哺乳动物都是相同的。与酵母相同，昆虫细胞也可以进行胞内和分泌表达，启动子很强，重组蛋白表达量高，而且更适宜表达多元蛋白复合物。

昆虫细胞表达外源重组蛋白可利用质粒转染和病毒载体的感染。利用质粒转染可以获得稳定的转染细胞，但实验周期较长，需几周甚至几个月时间，适宜连续发酵培养；利用病毒表达系统则可快速感染细胞，在几天内使外源基因整合到病毒载体中，适用于目的蛋白的表达检测。

昆虫细胞表达系统

目前常用的昆虫细胞表达系统有杆状病毒-昆虫系统、InsectSelect稳定表达系统和果蝇表达系统三种。

杆状病毒-昆虫（Baculovirus Expression Vector System, BEVS）表达系统：

杆状病毒（baculovirus）是一类以昆虫细胞为天然宿主的核型多角体病毒，其基因组为80-160kb 大小的单一闭合双链超螺旋DNA，约编码154个基因。目前研究较多的是苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)。AcNPV基因组具有较大的柔韧性，可以容忍较大片断的外源基因和多个外源基因的插入，病毒感染后期，宿主细胞会被裂解，因此BEVS不适于连续培养。

AcNPV能够感染大约30种鳞翅类昆虫细胞，在一定条件下也可以感染果蝇细胞，其中草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda，Sf)卵巢细胞和粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）胚胎细胞被发展成最常用的表达宿主。杆状病毒常用的表达宿主有来源于草地贪夜蛾的Sf9、Sf21和来源于粉纹夜蛾的High-Five、Tn-368，这些细胞质生长较快，能够达到较高的细胞密度，适应悬浮培养，可以使用无血清培养基，是重组蛋白表达的理想宿主。由于昆虫细胞的N-糖基化与哺乳动物细胞有较大差异，人们设计了能够持续表达多种糖基转移酶的Mimic Sf9细胞，用以表达更高等生物的蛋白。AcNPV的基因表达分为立早期表达、早期表达、晚期表达、极晚期表达4个阶段。前两个阶段的基因表达早于DNA复制，而后两个阶段的基因表达则伴随着一系列的病毒DNA合成。其中在极晚期基因表达过程中，有两种高效表达的蛋白：多角体蛋白和P10蛋白。多角体蛋白是形成包含体的主要成分，感染后期在细胞中的积累可高达30％~50％，是病毒复制非必需成分，但对病毒粒子却有保护作用，可使之保持稳定和感染能力；P10蛋白也是病毒复制非必需成分，可在细胞中形成纤维状物质，可能与细胞溶解有关。多角体基因和P10基因的启动子具有较强的启动能力，因此这两个基因位点成为杆状病毒表达载体系统理想的外源基因插入位点。如将外源基因取代多角体蛋白基因构成重组病毒，病毒体内不含有包含体。不形成包含体的病毒和形成包含体的病毒在平板中形成的空斑不同,利用这一特征筛选含有外源基因的重组病毒。

使用BEVS系统需要将外源基因整合入杆状病毒基因组中。解决这个问题主要有两种思路：Bac-to-Bac系统改造了AcNPV基因组，将之构建成为一个超大的穿梭质粒（130k），使其能够在大肠杆菌中复制（单拷贝），再将带有外源基因的供体质粒转入带有病毒质粒的大肠杆菌中，使它们在原核宿主体内完成重组过程，将表达盒插入多角蛋白启动子下游，纯化后感染昆虫细胞收集重组病毒；In-Fusion系统将野生型杆状病毒线性化，与带有外源基因和同源重组序列的载体直接共转染宿主细胞，只有正确重组的病毒才能进行自我复制并裂解宿主，以此来制备重组病毒。不论使用哪种方法，都需要在收集到大量重组病毒后再感染新鲜宿主，以获得高质量的重组蛋白。

稳定表达系统

InsectSelect系统和果蝇表达系统都是使用整合型质粒载体的重组蛋白表达系统。整合型载体可以实现重组蛋白的连续发酵，外源基因随机整合入染色体，表达受插入位点的影响，同时还可能会改变宿主细胞的生长特性，因此需要做大量的筛选工作才能获得稳定的表达菌株。InsectSelect（IS）系统：

IS系统可以进行重组蛋白的昆虫细胞连续分泌培养。此系统使用的载体为pMIB/V5-His A，B，C 质粒，包括OpIE2、OpIE1启动子、蜜蜂蜂毒分泌信号肽（HBM）、灭瘟素抗性基因、C端V5抗原和His标签，以及在大肠杆菌中复制所必须的组分。

OpIE2、OpIE1启动子来源于杆状病毒Op MNPV，该病毒的天然宿主为冷杉合毒蛾Orgyia pseudotsugata，常用的表达宿主有Sf9、Sf21、High Five、Kc1（果蝇）、S2（果蝇）。OpIE2启动子比OpIE1强5-10倍，用于外源基因的表达，后者则用于灭瘟素抗性基因的表达。OpIE2为组成型强启动子，与HBM信号肽协同，使得重组蛋白能够在昆虫细胞中进行连续分泌培养。质粒C端有可选的V5抗原和His标签，方便重组蛋白检测和纯化。

外源基因插入载体后在大肠杆菌中扩增，纯化后转染宿主细胞。一旦宿主细胞成功表达重组蛋白，即可利用灭瘟素抗性进行筛选，获得高拷贝的细胞株进行连续发酵。

IS系统使用的质粒很小（），易于操作，表达流程相对简单，可以进行连续发酵，有些重组蛋白在IS中的表达量比BEVS还高，是一种比较实用的昆虫表达系统。

表3：昆虫表达载体pMIB/V5-His B质粒图谱

果蝇表达系统（Drosophila Expression System，DES)：

果蝇表达系统使用S2果蝇细胞为表达宿主，可以进行重组蛋白的胞内、分泌表达，可以连续表达。在培养瓶中，S2松散半贴壁单层生长，同时也可以很好的适应摇瓶和发酵罐的悬浮培养，可以使用无血清培养基。外源基因在S2细胞系一般能够达到500-1000个拷贝。DES有多种表达载体，包括组成型/诱导表达、胞内/分泌表达，可以适应不同的需要。

诱导表达的载体使用果蝇金属硫蛋白基因（MT）启动子。MT启动子是一个严紧调控的强启动子，

即使在很高的拷贝数下也可以维持低水平的本底表达。硫酸铜或氯化镉可以解除抑制，表达MT 启动子的下游基因。MT启动子在其他昆虫细胞系（如Sf9，Sf21，High Five）中表现不佳，仅能在S2细胞系中使用。

DES的表达载体均没有果蝇细胞的筛选标记，只能用于短期表达，要建立稳定表达的细胞株，必须将带有外源基因的载体和筛选载体共转染。常用的筛选载体有携带潮霉素抗性基因的pCoHygro和携带灭瘟素抗性基因的pCoBlast。将筛选载体和表达载体共转染宿主细胞，即可根据宿主耐药性选出高拷贝的细胞株。

图4：果蝇细胞表达载体pMT/V5-His质粒图谱

果蝇表达体统常用载体启动子表达类型细胞定位融合标签

pMT/V5-His MT诱导胞内V5，His

V5-His Ac5组成胞内V5，His

pMT/BiP/V5-His MT诱导分泌V5，His

pMT/BioEase –DEST MT诱导胞内生物素

表8：果蝇表达体统常用载体

昆虫细胞表达优化：

检查外源基因的一级序列：外源基因5’端不能有回文结构；密码子构成需要适应宿主的密码子偏

好，特别是N端前几个；高AT含量的序列会使转录提前中止；检查重组蛋白序列，分泌表达时需要糖基化位点Asn-X-Ser/Thr，避免蛋白N端出现“PEST”——脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸，N端PEST使重组蛋白容易降解。

尝试各种外源基因-载体-宿主组合：不同的载体-宿主体统适合表达的蛋白是不同的，重组蛋白表达量不高时应多尝试几种组合。

宿主细胞状态：杆状病毒应在适合的时机感染宿主细胞，生长阶段、细胞密度、病毒量、收获时间都值得优化，特别是使用无血清培养基时，细胞密度要相应增加。诱导表达系统同样如此。培养基：培养基成分对重组蛋白表达量和质量都有影响，可以考虑增加或减少培养基中某种组分（如血清等），也可以考虑将几种培养基按比例混合使用。

转速和溶氧量：娇嫩的昆虫细胞不一定能适应高转速培养，这就使培养基中的溶氧量受到了限制，优化转速使细胞状态达到最佳，发酵培养时还应优化培养基氧气饱和度，以提高外源蛋白的表达量。

共表达辅助因子：在杆状病毒表达系统中，过表达抗凋亡基因，如人源bcl-2和杆状病毒P35可以延长宿主寿命；P-vank-1基因则可以提高分泌表达量。

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5. 哺乳动物表达系统

与其它系统相比，哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N-糖基化和准确的O-糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。

表达宿主：

哺乳动物细胞表达外源蛋白最初是将抗体基因重新导人淋巴细胞中由病毒(如SV40)或lgG的启动子增强子引导。产生的抗体具有相应的结合能力和数应功能，但表达量很低。

常用的非淋巴细胞类有中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小仓鼠肾(BHK)细胞、非洲绿猴肾（COS）细胞、人类肾细胞（293）、幼仓鼠肾细胞（BHK）等。不同宿主表达的重组蛋白其稳定性和翻译后修饰有所不同，需根据目的蛋白选择最佳的宿主细胞。

CHO细胞是目前较常用的哺乳动物宿主细胞，被美国FDA确认为安全的基因工程受体细胞（GRAS），广泛应用于医疗用重组蛋白的生产。它遗传背景清楚，生理代谢稳定，与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确，基因转移和载体表达系统完善，对剪切力的耐受性好，便于大规模培养，而且能在无血清和蛋白培养基中生长。缺点是产率较低，重组蛋白一般仅占细胞总蛋白的%。CHO细胞有多种亚细胞株，如脯氨酸缺陷型CHO-K1、紫外线敏感型UV20、UV41，二氢叶酸还原酶双倍体基因缺失型(DHFR-) CHO和转入了胰岛素生长因子IGF基因和转铁蛋白基因、更加适应无血清培养基的超级CHO等。

COS细胞是进行外源基因瞬时表达时最常用的宿主，源于1-1细胞株，基因组内含有腺病毒SV40的T抗原基因，允许SV40进行裂解生长，允许SV40早期突变体的复制。COS细胞载体易于构建，便于使用，而且对插入DNA的量或者采用基因组DNA 序列的情况都没有什么限制，可以通过检测表达情况来确证cDNA的阳性克隆，也利于快速分析引入克隆化cDNA序列中的突变。

来源于MadIin-Darby犬肾的高分化内皮细胞株(MDCK)，悬浮培养时重组蛋白产率可以达到细胞

总蛋白量的20％，在细胞单层贴壁培养情况下表达量也可达到10 mg/L。在多种肾细胞获得成功后，人源肾脏细胞293细胞也经过改造成为常用的表达宿主。293细胞株整合了人类腺病毒5DNA 的片段，显著强化了宿主的部分启动子，使得重组蛋白可以达到较高的表达量。293细胞能在无血清培养基中生长，其变种有快速生长型293-F、整合了猴腺病毒大T抗原的293-FT、融合了腺病毒部分基因的AD293和HEK293、贴壁好适宜锚定筛选的293-H等。

表达载体

与酵母和昆虫细胞类似，哺乳动物细胞表达外源重组蛋白也可以利用质粒转染和病毒载体的感染。

病毒载体

哺乳动物可用的病毒载体很多，有猿猴空泡病毒（SV40）、腺病毒（Adenovirus）、腺相关病毒（Adeno-associated virus）、人牛痘病毒（Vaccinia virus）、杆状病毒（Baculovirus）、冠状病毒（Coronavirus）、埃-巴二氏病毒（Epstein-Barr virus）、单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus）、慢病毒（Lentiviruses）、脊髓灰质炎病毒（Poliovirus）、逆转录病毒（Retroviruses）、塞姆利基森林病毒（Semliki Forest virus）等。不同的病毒载体能够裂解增殖或复制的宿主各不相同，应根据需要选择。

腺病毒（Adenovirus）：

腺病毒为线状双链DNA病毒，基因组长36kb，DNA两端各有一个反向重复序列ITR。腺病毒宿主范围广，可感染一系列哺乳动物细胞，其中人源细胞是腺病毒的允许细胞，腺病毒可以完成复制增殖裂解宿主的周期，不会插入人源细胞基因组中，因而不会致癌；而对啮齿动物，大部分腺病毒都可以致癌。腺病毒基因按转录时间的先后，可以分为早期（E1-E4）和晚期转录单位（L1-L5）。E1蛋白调节细胞代谢并激活其他早期基因的启动子，E2启动病毒DNA复制，E3与病毒复制无关，主要帮助病毒的成熟，E4主要与病毒mRNA的代谢有关。

pAdEasy-1载体以人腺病毒AD5基因组为蓝本，敲除了E1和E3，扩大载体容量的同时，使病毒不能在非允许细胞中复制。目的基因首先克隆在一个带有ITR和筛选标记的穿梭质粒（如pShuttle-CMV）中，线性化后与pAdEasy共转染大肠杆菌，以抗生素筛选带有重组病毒的原核宿主，提取纯化后在融合有腺病毒E1基因的293细胞株（如AD293）中增殖和表达。重组病毒中，表达盒插入在腺病毒E1区，使用E1强启动子表达重组蛋白。

使用人源细胞株作为表达宿主时，腺病毒载体最终会裂解宿主，因此不适于连续表达。

慢病毒（Lentivirus）：

慢病毒是逆转录病毒的一种，由潜伏期较长而得名。慢病毒既可以转染处于有丝分裂活跃期的细胞，又可以转染分裂缓慢及处于分裂终末期的细胞，包括造血干细胞，神经干细胞，处于分化终末的神经元，肝实质细胞等。根据其来源不同，慢病毒可以分为以下几类：HIV I型、HIV II型、猿类免疫缺陷病毒、猫免疫缺陷病毒。其中HIV I型是目前最常用的慢病毒载体。慢病毒感染宿主细胞后马上形成前病毒，前病毒的主要基因编码区为5’LTR-Ψ-gag-pro-pol-env-3’LTR，其中LTR 为长末端重复序列、Ψ为整合信号，gag基因编码病毒的核心蛋白，pol基因编码病毒复制所需的酶类，env基因编码病毒的包膜糖蛋白，pro基因则编码切割蛋白前体所需的蛋白酶。

HIV-I载体系统由辅助和载体两个质粒组成。载体质粒含有整合信号Ψ、启动子、多克隆位点以及包装、逆转录和整合所需的序列；辅助质粒则与载体互补，编码了产生病毒颗粒所必须的蛋白。将两个质粒共转化到宿主中，由于辅助质粒不含整合信号，新生成的病毒中就只有目的基因。将重组病毒感染普通表达宿主，即可进行重组蛋白的稳定表达；如感染整合了gag、pol、env基因的宿主，即可进行瞬时表达。

慢病毒表达系统的一个主要缺陷是：载体和辅助质粒有时会在宿主中发生同源重组，产生野生型

融合蛋白表达系统

研究者们在分离到某一基因后，要对其编码蛋白质进行研究最理所当然的工作就是表达，即：有目的性地合成外源基因产物。在重组 DNA技术的发展早期，人 们认为在基因的前面有一个强启动子和一个起始密码子就足以在大肠杆菌中获 得很好的表达。随后，认识到获得有效的翻译所需的条件要复杂得多，除了要有强启动子和起始密码子外，良好的表达尚需编码目的蛋白的mRNA中含有核糖体结合位点，表达水平受密码子喜好程度的影响，也受编码序列中其他目前尚未明了的因素影响。通过改变起始密码子前端的序列，或者在不改变蛋白质序列的条件下利用密码子的简并性改变5’末端编码序列往往有助于解决问题。 通常，两个基因之间的融合表达能更快地解决这些问题。在这种方式中，目的基因被引入某个高表达蛋白序列(fusion tag)的3’末端，比如大肠杆菌的一段 序列，或者任一可在大肠杆菌中高度表达的基因，它提供良好表达所必需的信号，而表达出的融合蛋白的N末端含有由fusion tag编码的片段。fusion tag所编码的可能是整个功能蛋白或是其中的部分。比如6x His Tag、β-半乳糖苷酶融合蛋白和trpE融合蛋白、谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白以及硫氧还蛋 白(Trx)融合蛋白等。 由于利用tag 选择融合表达是为了简化重组一是fusion tag位于目的蛋白的N端，这时tag 帮助提高目的蛋白的表达，缺点是纯化的表达产物中可能会有不完整的目的蛋白，原因是在翻译过程中意外中断的少量(C端)不完整的表达产物会一起被纯化。另一是fusion tag位于目的蛋白的C端，这可以保证只有完整的表达产物才会被纯化。当目的蛋白的功能区位于N端时，fusion tag位于C端可能减少对其功 能的影响，反之亦然。 进行融合蛋白的表达经常会遇到三个问题，它们是：表达蛋白的溶解性、稳定性和fusion tag的存在。前两个问题在融合蛋白表达系统和非融合蛋白表达系统都会遇到，而第三个问题是融合蛋白系统所独有的。 裂解融合蛋白以除去fusion tag 为了对目的蛋白进行生化及功能分析，通常要从目的蛋白上去除fusion tag部分。早期已建立了数种对融合蛋白进行位点特异性裂解的方法。化学裂解如溴化氰(Met↓)、BNPS-3-甲基吲哚(Trp↓)、羟胺(Asn↓Gly)等，不但便宜且有效，往往还可以在变性条件下进行反应。但由于裂解位点的特异性低和可能对目的蛋白产生的不必要修饰，使该法渐渐被酶解法取代。酶解的方法相对来说反应条件较温和，更重要的是，普遍用于此用途的蛋白酶都具有高度的特异性。其中有用的酶有：Xa因子、凝血酶、肠激酶、凝乳酶、胶原酶。所有这些 酶都具有较长的底物识别序列(如在凝乳酶中为7个氨基酸)，从而降低了蛋白质中其他无关部位生断裂的可能性。而酶解法存在成本高(这些蛋白酶价格一般都相当昂贵)，反应时间长等问题，更重要的是蛋白酶本身不可避免地会混入目的蛋白中，造成新的污染，提高纯化的复杂性。

重组蛋白表达系统的选择

重组蛋白表达系统的选择、表达策略和方法学研究 宁

1. 前言 在生命科学的很多研究和应用领域中，如何获得大量、均一、高纯、有活性的蛋白质都是一个关键问题。现代重组蛋白表达技术为我们提供了多种选择：传统的大肠杆菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞表达系统以及较新的植物和体外表达系统。每种表达系统都有很多成功的例子，但重组蛋白的个性不尽相同，没有任何一个系统和方法是普遍适用的，为目的蛋白选择一个恰当的表达系统也就成为表达工作的重中之重。 关于目的蛋白的一切信息，对表达系统的选择都是有帮助的，有几个最基本的问题一定要在表达之前回答清楚：目的蛋白的来源是原核还是真核生物？具有什么样的功能？分子量和聚合状态？是膜蛋白还是水溶蛋白？胞表达还是分泌表达？是否需要以及需要何种翻译后修饰？有没有配体、底物或产物类似物可以利用？对蛋白酶是否敏感？有多少分子及分子间二硫键？对目的蛋白的表达量、活性、表达速度和成本有怎样的要求？除了摸清目的蛋白的脾性，还要清楚各个表达系统的特点、优势和局限性，才能找到表达工作的大略方向，要获得最适合目的蛋白的表达方案，还需要在具体实验中调整优化。 表1比较了目前常用的表达系统的特点，并给出了粗略的适用围。 大肠杆菌酵母昆虫细胞哺乳动物细胞流程简单简单复杂复杂 培养基简单简单复杂复杂 成本低低中高 产率高中中低 表达量高高较高较低 蛋白折叠中较好较好好 胞外表达周质空间分泌至培养基分泌至培养基分泌至培养基 细胞增殖周期30min 90min 18H 24H 折叠常有错误折叠偶有不当折叠正确折叠正确 二硫键难以形成有有有 N-糖基化无甘露糖残基，高无唾液酸，简单复杂 O-糖基化无有有有 磷酸化无有有有 酰化无有有有 γ-羧基化无无无有 适用原核蛋白、简单 真核蛋白 真核蛋白、分泌 表达蛋白 真核蛋白、分泌 表达蛋白 复杂高等真核生 物蛋白 表1：常用表达系统比较

1-大肠杆菌重组蛋白表达提取及纯化实验(最新整理)

第一天 1、配置LB培养基： 酵母粉15g、胰蛋白胨30g、氯化钠30g，定容至3000ml。调节PH至 7.4（2M NaOH），高压蒸汽灭菌20分钟，37℃保存。分装成15瓶（每瓶200ml）。 2、接种（超净台要提前杀菌通风） 取4瓶上述培养基，每瓶加200μlAMP（1:1000）、60μl菌液。37℃过夜。 第二天 1、扩大培养（超净台） 4瓶扩至16瓶，每瓶培养基加200μlAMP，摇床培养1小时左右。 2、诱导（超净台） 加40μlIPTG，加完后去除封口的除牛皮纸，扎口较松。25℃摇床培养4小时。 3、离心获取菌体 4℃，8000rpm离心25分钟。注意配平。 4、超声波破碎菌体 离心后去上清，向沉淀加入（600mlPB裂解液、300μl溶菌酶、3mlPMSF）。将菌液转入2个烧杯中，冰浴超声波破菌，400W，75次，每次6秒，间隔2秒。离心收集上清液。 600mlPB裂解液：20mM/L PB，10mM/L EDTA，5%甘油，1mM/L DTT，调节PH至7.4。 超声波破碎：首先用去离子水清洗探头，再将盛有菌液的小烧杯置于有冰 水混合物的大烧杯中，冰水界面略高于菌液面即可。探头浸没于菌液中，不可伸入过长。注意破菌过程中由于冰的融化导致的液面变化。 5、抽滤（双层滤纸) 洗胶（GST）。将上述上清液抽滤，滤液与GST胶混合，磁力搅拌过夜。 第三天

1、抽滤蛋白-胶混合液，滤液取样20μl，留电泳。 2、洗杂蛋白，用1×PBS+PMSF(1000:1)约400ml，洗脱若干次，用移液枪吸去上层泡沫（杂蛋白），至胶上无泡沫为止。 3、洗脱目的蛋白，洗脱液加50ml，分3次进行（15+15+15），每次加入后间歇搅拌，自然静置洗脱15分钟，抽滤，勿使胶干，合并洗脱液，取样20μl，留电泳。用洗脱液调零，测OD280。（OD值达到1.5为佳） 4、将洗脱液置于透析袋中（透析袋应提前煮好），将透析袋置于2L透析液1中，加入磁珠置于4℃冰箱内磁力搅拌器上，4小时后换为透析液2。胶的回收：用3M氯化钠溶液（用1×PBS溶液溶解）、1×PBS（无沉淀）洗涤，20%乙醇洗脱，装瓶。 洗脱液：50mM/LTRIS-HCL 、10mM/LGSH 透析液1：20mM/L TRIS-HCL、1mM/L EDTA 、0.15mM/L DTT 透析液2：:0.5mM/L EDTA、1×PBS

pET 表达系统

pET 原核表达 pET 载体中，目标基因克隆到T7 噬菌体强转录和翻译信号控制之下，并通过在宿主细胞提供T7 RNA 聚合酶来诱导表达。Novagen 的pET 系统不断扩大，提供了用于表达的新技术和选择，目前共包括36 种载体类型、15 种不同宿主菌和设计用于有效检测和纯化目标蛋白的许多其它相关产品。 优点 ·是原核蛋白表达引用最多的系统 ·在任何大肠杆菌表达系统中，基础表达水平最低 ·真正的调节表达水平的“变阻器”控制 ·提供各种不同融合标签和表达系统配置 ·可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌 ·许多载体以LIC 载体试剂盒提供，用于迅速定向克隆PCR 产物 ·许多宿主菌株以感受态细胞形式提供，可立即用于转化 阳性pFORCE TM 克隆系统具有高效克隆PCR 产物、阳性选择重组体和高水平表达目标蛋白等特点。 pET 系统概述 pET 系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统。根据最初由Studier 等开发的T7 启动子驱动系统，Novagen 的pET 系统已用于表达成千上万种不同蛋白。 控制基础表达水平 pET 系统提供6 种载体- 宿主菌组合，能够调节基础表达水平以优化目标基因的表达。没有单一策略或条件适用于所有目标蛋白，所以进行优化选择是必要的。 宿主菌株 质粒在非表达宿主菌中构建完成后，通常转化到一个带有T7 RNA 聚合酶基因的宿主菌（λDE3 溶原菌）中表达目标蛋白。在λDE3 溶原菌中，T7 RNA 聚合酶基因由lacUV5 启动子控制。未诱导时便有一定程度转录，因此适合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。而宿主菌带有pLysS 和pLyE 时调控会更严紧。pLys 质粒编码T7 溶菌酶，它是T7 RNA 聚合酶的天然抑制物，因此可降低其在未诱导细胞中转录目标基因的能力。pLysS 宿主菌产生低量T7 溶菌酶，而pLysE 宿主菌产生更多酶，因此是最严紧控制的λDE3 溶原菌。 有11 种不同DE3 溶原化宿主菌。使用最广泛的为BL21 及其衍生菌株，它的优点在于缺失lon 和ompT 蛋白酶。B834 菌株为甲硫氨酸营养缺陷型，因此可用35 S- 甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记。BLR 为recA - 衍生菌株，改善了质粒单体产量，有助于稳定含有重复序列的目标质粒。两个硫氧还蛋白还原酶( trxB ) 突变菌株(AD494,BL21 trxB ) ，有利于大肠杆菌胞浆中二硫键形成。Origami TM 和OrigamiB 菌株为trxB/gor 双突变，这两个酶是主要还原途径的关键酶。Origami 和OrigamiB 宿主菌的主要优点是能形成正确折迭的含有二硫键的蛋白。新的Rosetta TM 菌株补充了四种大肠杆菌稀有密码子的tRNA ，改善了由于密码子使用频率不同而引起的一些真核蛋白低表达。其它菌株背景包括K-12 菌株HMS174 和NovaBlue ，象BLR 一样为recA - 。这些菌株可稳定表达其产物可能导致DE3 噬菌体丢失的某些目标基因。由于存在F 附加体编码

合成多肽 & 重组蛋白质抗原、

抗体制备: 合成多肽抗原 抗体制备：合成多肽抗原 synthetic peptide recombinant fragment 目前抗体制备常采用多肽抗原及重组蛋白质抗原，这两种方法各有优缺点，需结合实验需求进行选择。 重组蛋白质抗原上往往带有多个不同的抗原决定簇，其中有些是顺序决定簇，有些为结构决定簇。利用变性的抗原免疫动物获得多克隆抗体是针对各个抗原决定簇的抗体的混合物，在一般应用中能够用于检测天然结构或变性的目标蛋白。利用变性蛋白做为免疫原的一个附带的好处是变性蛋白往往有更强的免疫原性，能够刺激动物产生强的免疫应答。 用做抗原目的的蛋白质一般选择使用大肠杆菌表达体系，因为该体系时间与金钱成本最低。为了提高目标蛋白质表达的可能性与纯化的方便性，人们有时只表达目标蛋白的一个小的片段如特定的结构域。大肠杆菌系统是欣百诺最早建立的成熟表达体系，有一系列设计完美的表达载体与非常成熟的表达培养条件，能够在较短时间内获得基因表达产物，且所需的成本相对较低。 如果制备抗体的目的单纯用于wb检测，采用合成的小肽作为抗原是经济快速的，但是存在由于肽段选择不合适造成的免疫原性弱或者无反应原性的风险，由于抗体制备需要较长的周期，因此利用多肽抗原制备抗体时，常常选取两三段不同的肽段以保证实验的成功率。 ·抗体制备（合成多肽抗原）——步骤1. 多肽合成 免疫用的多肽抗原纯度要求大于80%，更高的纯度虽然理论上可以获得特异性更好的抗体，实际操作过程中动物总是要产生大量非特异性抗体，从而掩盖了抗原纯度所带来的收益。 客户需要提供的材料： 委托我们合成时请提供您的目标多肽序列或蛋白质序列，由我们与你讨论决定具体采用的序列。 提供客户：合成好的多肽，多肽高效液相图谱 时间：2周 ·抗体制备（合成多肽抗原）——步骤2. KLH交联 用小片段多肽制备抗体时必须交联到适当的载体抗原上以增强其免疫原性。我们提供KLH与白蛋白两种抗原载体。 客户需要提供的材料： 若多肽由客户提供，要求多肽量大于5毫克，N端或C端加入一个半胱氨酸，长度在10-15氨基酸。 提供客户：交联好的蛋白或直接用于下一步免疫 时间：3个工作日

重组蛋白的表达

重组蛋白的概述 1.概述 分离纯化组成了基因工程的下游处理（downstream processing）阶段，这一过程又和上游过程紧密相联系，上游过程的诸方面影响到下游的分离纯化，所以在进行目标蛋白质表达纯化时要统一考虑和整体设计，并充分考虑上游因素对下游的影响，如是否带有亲和标签，是否进行分泌表达。目前应用最广泛的表达系统有三大类，分别是大肠杆菌表达系统、酵母表达系统和CHO细胞表达系统，不同的表达系统和培养方法显著影响下游的处理过程，目标蛋白表达是否形成包涵体，目标蛋白表达的定位（胞内、细胞内膜、周质空间和胞外），蛋白表达的量都依赖于所选择的表达系统。选择将所表达的蛋白分泌到细胞外或周质空间可以避免破碎细胞的步骤，并且由于蛋白质种类少，目标蛋白容易纯化；而在细胞质内表达蛋白，可能是可溶性表达，可能形成包涵体，可溶性的蛋白往往需要复杂的纯化步骤，而包涵体易于分离，纯度较高，但回收具有生物活性的蛋白却变的相当困难，需要对聚集的蛋白进行变复性，通常活性蛋白的得率比较低，表1列出了不同策略对表达、纯化的影响，对于其中的有些缺点可以通过一定的方法进行克服和避免，如利用DNA重组技术给外源蛋白加上一个亲和纯化的标签，有助于可溶性外源蛋白的选择性纯化，并能保护目标蛋白不被降解（96）。 表 1 重组蛋白不同表达策略的优点和缺点 表达策略优点缺点 分泌表达至细胞外增强正确二硫键的形成 降低蛋白酶对表达蛋白的降解 可获得确定的N末端 显著减少杂蛋白水平，简化纯化 不需要细胞破碎 表达水平低 多数蛋白不能进行分泌表达表达蛋白需要进行浓缩 细胞周质空间表达增强正确二硫键的形成 可获得确定的N末端 显著减少杂蛋白水平，简化纯化好些蛋白不能分泌进入周质空间没有大规模选择性的释放周质空 间蛋白的技术 周质蛋白酶可引起重组蛋白酶解 胞内包涵体表达包涵体易于分离 保护蛋白质不被降解 蛋白质不具有活性对宿主细胞生 长没有大的影响，通常可获得高的 表达水平需要体外的折叠和溶解，得率较低具有不确定N末端 胞内可溶性蛋白表达不需要体外溶解和折叠 一般具有正确的结构和功能高水平的表达常难以得到需要复杂的纯化 可发生蛋白质的酶解具有不确定的N末端 在细胞的提取物中，除了目标蛋白外，还含有其它各种性质的蛋白、核酸、多糖等。在这样一个混合体系中，蛋白质纯化要求将目标蛋白与其它的成分分离，得到一定的量，达到一定的纯度，同时要尽可能保留蛋白的生物活性，并使蛋白保持完整。所以蛋白质的分离纯化可以看作是一系列的分部收集过程，总是希望目标蛋白富集于其中的一个收集部位，而大量的杂蛋白存在于其它的收集部位。当然对目标蛋白纯度的要求要根据纯化蛋白的用途而定，对于治疗性的蛋白要求有大于99%的纯度，并对处方有活性和稳定性的要求，对于某些酶的纯度则要求较低，需要在纯度和得率之间进行一个平衡，所以下游的工艺流程取决于最终对目标蛋白的要求。 蛋白质的功能依赖于蛋白质的结构，对于有生物活性的蛋白质，在分离纯化过程中必须根据目标蛋白的特点，采用合适的操作条件和方法，保证目标蛋白的活性尽量不损失。除了在分离纯化的

如何选择合适的蛋白表达系统

如何选择合适的蛋白表达系统？ 金开瑞拥有原核/真核/无细胞等六大重组蛋白表达系统，提供从基因合成到蛋白表达的一站式蛋白服务，并通过表达载体的改造和实验流程的优化，可在最短时间获得最高的产量，满足您的各项需求。 目前，金开瑞已成功为全球各地客户提供3000余种重组蛋白产品，涵盖人类疾病相关蛋白（细胞因子、激素、酶、病毒抗原）、动植物和微生物蛋白等。 根据您所需要表达蛋白的特点，可选择合适的表达系统： 表达系统系统优势 适用 于 金开瑞特色 原核大肠杆 菌 目的基因表达量 高、成本低、培养条件 简单、生产迅速、可拓 展性强、转化操作简单、 容易形成二硫键 原 核蛋 白、简 单真 核蛋 白 在表达包括可溶性 蛋白、包涵体、融合蛋 白等方面，拥有丰富的 经验和专业技术，能解 决蛋白表达过程中的各 种瓶颈问题 枯草芽 孢杆菌 非致病性、无内毒 素、可大量分泌某些胞 外蛋白、培养条件简单、 生产迅速、无明显的密 码子偏爱性、不易形成 包涵体 胞 外蛋 白 采用基因工程突变 改造的枯草芽孢杆菌做 为表达宿主；采用自己 改造的载体，可以提供 胞内或胞外、组成型或 诱导型的表达 真核酵母细 胞 经济高效，放大培 养基廉价、培养条件简 单、生产迅速、可拓展 性强、分泌蛋白或细胞 工 业菌 种改 良、放 自行改造的高效分 泌载体和宿主组合，可 在最大程度上实现最高 质量的蛋白表达；专利

内表达的良好选择、蛋白分泌高效且允许简单纯化、广泛的翻译后修饰、无内毒素大的Biobrick技术，可成 功用于工业菌种的改良 优化 杆状病毒-昆虫细胞 基因容量大，外源 基因表达效率高，有效 的细胞折叠、中度可扩 展性、广泛的翻译后修 饰、糖基化与哺乳动物 细胞类似、相对容易地 酶促的去糖基化、无内 毒素 病 毒疫 苗、信 号蛋 白、细 胞因 子、激 酶等 采用AcNPV-sf9细 胞和BmNPV-BmN细胞两 种表达系统，多表达系 统、多宿主、多载体的 选择性极大的提高了蛋 白表达的成功率 哺乳动物细胞 较高的表达水平、 中度的可扩展性、细胞 的悬浮培养特性可大规 模生产、有效的蛋白折 叠、适合分泌蛋白、充 分的翻译后修饰、无内 毒素 复 杂高 等真 核生 物蛋 白 采用特有的哺乳动 物细胞表达载体和多种 转染方法的组合方式， 优化表达条件，提高转 染效率，大大缩短实验 周期，显著提高表达量 无细胞 操作简便，需时短， 表达量高，系统开放较 灵活，轻松表达特殊蛋 白，制备蛋白复合物， 及平行合成多种不同蛋 白等 膜 蛋白、 毒蛋 白 小量表达条件摸 索，专业解决相关难题， 大大缩短实验周期，提 高表达量。

实验三 重组蛋白的表达及Western boltting鉴定

实验三重组蛋白的表达及Western boltting鉴定 一、实验内容 1．重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达。 2．重组蛋白的Western boltting鉴定。 二、实验要求 通过实验，要求学生掌握外源基因在原核细胞中表达的方法，掌握Western bolt的基本原理、实验操作步骤及注意事项。 三、实验方法 1．重组蛋白的原核表达与SDS-PAGE分析 （1）将含有重组质粒的细胞在LB平板（含抗生素）上划线，37℃培养过夜。（2）从LB平板挑取单菌落分别移至2 mL的LB培养液（含抗生素），37 ℃振荡培养过夜。 （3）将过夜培养物按1：100转接于2 mL的LB培养液（含抗生素），37℃继续振摇培养至细菌生长对数中期（OD600值达0.5～0.6）。 （4）加入IPTG至终浓度0.5 mmol/L，37℃诱导表达3～6 hr。 （5）取200 μL菌液装入1.5 mL Eppendorf管中，以5000 rpm离心1 min，得到菌体细胞。将细胞重悬于30 μL水，再加入10 μL 4 × SDS-PAGE加样缓冲液，混匀，100℃煮沸10 min后，12,000 rpm离心2 min，吸取上清转移至另一新的离心管中。 （6）样品取5~10 μL进行SDS-PAGE分析。 2．Western blot分析 （1）取4 μL阳性克隆诱导后的样品，利用15%SDS-PAGE电泳分离。 （2）用半干式电转移法将蛋白转至NC膜上。 a.将聚丙稀酰胺凝胶浸泡在电转移缓冲液中平衡10 min。 b.裁剪与凝胶大小相同的NC膜，在电转移缓冲液中平衡10 min。 c.裁剪合适大小的滤纸，用电转移缓冲液浸润，按阳极、三层滤纸、NC膜、 凝胶、三层滤纸、阴极的顺序叠放电转移三明治。 d.按0.5 mA/cm2膜恒流电转移30～50 min。 （3）杂交 a.将NC膜在5%脱脂奶封闭液中室温反应1 hr。 b.TBST漂洗3 × 10 min c.转移膜至用TBST1：100稀释的一抗工作液（抗六个组氨酸单克隆抗体）中， 室温反应1 hr。 d.TBST漂洗3 × 10 min e.转移膜至用TBST1：2000稀释的辣根过氧化物酶（HRP）偶联的羊抗兔I gG

蛋白质表达技术

蛋白表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。越来越多的基因被发现，其中多数基因功能不明，利用蛋白表达系统表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。常见的蛋白表达系统包括大肠杆菌/原核蛋白表达系统、酵母/真核蛋白表达系统、哺乳动物细胞蛋白表达系统、昆虫细胞蛋白表达系统、植物蛋白表达系统。 在此针对一些常见的问题进行总结，与大家共享，共同学习。 Q1：为什么蛋白表达出来了，SDS-PAGE检测时大小不符？ A1：进行SDS-PAGE检测的时候蛋白的净电荷会影响迁移率。带电量高的蛋白会结合较少的SDS，因此阻碍了蛋白的泳动。富含脯氨酸的蛋白会在SDS-PAGE胶中移动得特别慢。但是如果蛋白的等电点在5-9之间，并且组成的氨基酸组分没有明显的偏好，那么目的蛋白迁移率与预期相差较远就很有可能不是由于凝胶电泳造成的。 这个时候最好利用C-端或者N-端的标签进行Western Blot，看是否由于蛋白被蛋白酶降解而导致多条目的条带或者比预期小很多的条带出现。如果蛋白酶过高可以尝试换个缺陷菌株。 Q2：如何得到可溶的蛋白？ A2：如果希望得到能行使功能的蛋白，蛋白应该以可溶形式表达。避免包涵体形成的方法很多，比如：选用表达量不高的蛋白表达系统，选择有助于可溶性表达的融合蛋白表达系统等，使用基本培养基等也有助于可溶性表达。另外一个容易忽视的问题是大肠杆菌内还原性过高会导致二硫键不能正确形成，同样容易导致表达产物不溶，更换菌株有助于解决这个问题。 Q3：大肠杆菌蛋白表达实验中需要注意的事项？ A3：（1）所有操作尽量在冰上操作，以避免蛋白质发生变性； （2）根据自己的需要选择不同的表达载体，并注意不同的表达载体上的融合标签和携带的抗性基因，其中有些标签是可以去除的。 （3）构建好的载体最好进行测序验证，保证读码框正确，即没有移码。 （4）长期保存的pET重组子在高浓度甘油中会导致质粒不稳定。 （5）37 ℃生长常常会使一些蛋白累积形成包涵体，而30 ℃生长则可能产生可溶的和有活性的蛋白。在某些情况下，低温（15－20℃）延长诱导时间可以使溶解性蛋白的产量达到最大。 （6）进行SDS-PAGE分析时，需优化电泳上样体积。 Q4：毕赤酵母系统具有哪些优点？ A4：（1）含有特有的强有力的启动子，这是目前最强、调控机理最严格的启动子之一，用甲醇可严格地调控外源基因的表达； 2）表达水平高，既可在胞内表达，又可分泌型表达。毕赤酵母中，报道的最高表达量为破伤风毒素C为12 g/L，一般大于1 g/L。一般毕赤酵母中外源基因都带有指导分泌的信号肽序列，使表达的外源目的蛋白分泌到发酵液中，有利于分离纯化； （3）发酵工艺成熟，易放大。已经有大规模工业化高密度生产的发酵工艺，且细胞干重达100 g/L以上，表达重组蛋白时，已成功放大到10000 L； （4）培养成本低，产物易分离。毕赤酵母所用发酵培养基十分廉价，一般碳源为甘油或葡萄糖及甲醇，其余为无机盐，培养基中不含蛋白，有利于下游产品分离纯化； （5）外源蛋白基因遗传稳定。一般外源蛋白基因整合到毕赤酵母染色体上，随染色体复制而复制，不易丢失； （6）作为真核表达系统，毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能。 Q5：一个理想的可诱导蛋白表达系统需要符合哪几个方面的要求？

大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化

8.大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化 大肠杆菌表达系统遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点, 是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。因此熟练掌握并运用大肠杆菌表达系统的基本原理和常规操作是对每一个研究生来说是非常必要的。本章节介绍了实验室常用的大肠杆菌表达系统的构成特点，归纳了利用大肠杆菌表达系统纯化重组蛋白的基本流程和详细操作步骤，并且结合笔者的操作经验，总结了初学者在操作过程中可能遇到的问题和解决策略。 8.1大肠杆菌表达系统的选择与构建 8.1.1表达载体的选择 根据启动子的不同这些载体大致可以分为热诱导启动子，如λPL，cspA 等和另外一类就是广泛使用的IPTG诱导的启动子，如lac，trc，tac，T5/lac operator，T5/lac operator等。根据表达蛋白质的类型可分为单纯表达载体和融合表达载体。融合表达是在目标蛋白的N端或C端添加特殊的序列，以提高蛋白的可溶性，促进蛋白的正确折叠，实现目的蛋白的快速亲和纯化，或者实现目标蛋白的表达定位。常用的用于亲和纯化融合标签包括Poly-Arg，Poly-His, Strep-Tag Ⅱ，S-tag，MBP等。其中His-Tag 和GST-Tag 是目前使用最多的。His Tag 大多数是连续的六个His 融合于目标蛋白的N端或C端，通过His 与金属离子：Cu2+>Fe2+>Zn2+>Ni2+ 的螯合作用而实现亲和纯化，其中Ni2+是目前使用最广泛的。His 标签具有较小的分子量，融合于目标蛋白的N端和C端不影响目标蛋白的活性，因此纯化过程中大多不需要去除。目前常使用的表达载体主要是由Novagen 提供的pET 系列和Qiagen 公司提供的pQE 系列。 除了His 标签外，还原性谷胱甘肽S-转移酶是另一种实验室常用的融合标签。它可以通过还原性谷胱甘肽琼脂糖亲和层析而快速纯化。此外，与His 相比，GST 很多时候能够促进目标蛋白的正确折叠，提高目标蛋白表达的可溶性，因此，对于那些用his 标签表达易形成包涵体的蛋白，可以尝试用GST融合表达来改进。当然，GST 具有较大的分子量（26kDa），可能对目的蛋白的活性有影响，因此很多时候切除GST是必须的。目前，GST融合表达系统主要是由GE Healthcare （原Amersham）提供。

新颖的融合蛋白表达系统

新颖的融合蛋白表达系统 研究者们在分离到某一基因后，要对其编码蛋白质进行研究最理所当然的工作就是表达——即：有目的性地合成外源基因产物。在重组DNA技术的发展早期，人们认为在基因的前面有一个强启动子和一个起始密码子就足以在大肠杆菌中获得很好的表达。随后，认识到获得有效的翻译所需的条件要复杂得多，除了要有强启动子和起始密码子外，良好的表达尚需编码目的蛋白的mRNA中含有核糖体结合位点，表达水平受密码子喜好程度的影响，也受编码序列中其他目前尚未明了的因素影响。通过改变起始密码子前端的序列，或者在不改变蛋白质序列的条件下利用密码子的简并性改变5’末端编码序列往往有助于解决问题。 通常，两个基因之间的融合表达能更快地解决这些问题。在这种方式中，目的基因被引入某个高表达蛋白序列（fusion tag）的3’末端，比如大肠杆菌的一段序列，或者任一可在大肠杆菌中高度表达的基因，它提供良好表达所必需的信号，而表达出的融合蛋白的N末端含有由fusion tag编码的片段。fusion tag所编码的可能是整个功能蛋白或是其中的部分。比如6x His Tag、β-半乳糖苷酶融合蛋白和trpE融合蛋白、谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白以及硫氧还蛋白(Trx)融合蛋白等。 由于利用tag的特性通常可以对融合蛋白进行亲和层析等分离提纯，更多情况下选择融合表达是为了简化重组蛋白的纯化。因此出现两种融合表达类型：一是fusion tag位于目的蛋白的N端，这时tag可以提供良好表达所必需的信号，帮助提高目的蛋白的表达，缺点是纯化的表达产物中可能会有不完整的目的蛋白，原因是在翻译过程中意外中断的少量（C端）不完整的表达产物会一起被纯化。另一是fusion tag位于目的蛋白的C端，这可以保证只有完整的表达产物才会被纯化。当目的蛋白的功能区位于N端时，fusion tag位于C端可能减少对其功能的影响，反之亦然。 进行融合蛋白的表达经常会遇到三个问题，它们是：表达蛋白的溶解性、稳定性和fusion tag的存在。前两个问题在融合蛋白表达系统和非融合蛋白表达系统都会遇到，而第三个问题是融合蛋白系统所独有的。 裂解融合蛋白以除去fusion tag 为了对目的蛋白进行生化及功能分析，通常要从目的蛋白上去除fusion tag部分。早期已建立了数种对融合蛋白进行位点特异性裂解的方法。化学裂解如溴化氰(Met↓)、BNPS-3-甲

重组蛋白IFNGA在大肠杆菌中的表达与纯化

高中组11年级 生物化学 3人项目 重组蛋白IFNGA在大肠杆菌中的表达与纯化

重组蛋白IFNGA在大肠杆菌中的表达与纯化 摘要： 干扰素γ（Interferon gamma，IFN-γ）是体内重要的细胞因子，能够通过调控免疫相关基因的转录协调机体的免疫反应，具有抗病毒、抗肿瘤、增强免疫力能功能。目前对于IFN-α、IFN-β重组表达的较多，而关于IFN-γ 蛋白的纯化表达较少.因此,本研究使用PCR方法扩增IFN-γ基因，将IFN-γ基因分别插入原核表达载体pET-30构建重组表达质粒pET-30--IFN-γ，转化大肠杆菌BL21和Rosetta菌株，在IPTG诱导下表达IFN-γ，SDS-PAGE分析重组表达蛋白。结果表明：成功构建重组表达质粒pET-30-IFN-γ；表达产物主要以包涵体形式存在；经Ni2+-NTA亲和层析纯化，获得高纯度重组蛋白。本实验纯化的蛋白有望在今后用于医学和生物学研究中。 关键词：干扰素；IFN-γ 蛋白；大肠杆菌表达系统；重组表达；蛋白纯化； 一、研究背景 干扰素（IFN）是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制病毒（比如：乙肝病毒）的复制。其类型分为三类，α-（白细胞）型、β-（成纤维细胞）型，γ-（淋巴细胞）型；同时还可增强自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。 其中，IFN-γ是体内重要的免疫调节因子，能通过与细胞表面受体结合，诱导病毒感染细胞产生多种抗病毒蛋白，使细胞内产生抗病毒状态而发挥抗病毒作用。在诱导效应因子表达的同时，由于IFN-γ能够提高细胞表面MHC分子的表达，增强免疫活性细胞对病原体的杀伤作用，从而协同促进了机体对病毒感染细胞的杀灭，而使机体处于抗病毒状态。虽然各种类型的干扰素均能介导细胞对病毒感染的反应，但IFN-γ 的免疫调节活性在协调免疫反应和确定机体长期的抗病毒状态中发挥更为重要的作用。其作用可大致总结为以下几点：①抗增生

大肠杆菌高效表达重组蛋白策略

大肠杆菌高效表达重组蛋白策略 前言 重组蛋白的制备在蛋白结构分析和医疗应用领域十分重要。药物蛋白的研究需要高纯度的重组蛋白来进行药物动力学和物理化学的研究[1]。重组蛋白在检测酶活、连接配体、蛋白相互作用等生物学领域广泛应用。已经表达出多种重组蛋白被证明有很大的应用潜力[2,3]。通过基因工程改造的方法已经获得了许多性状优良的宿主菌表达系统，尤其是通过大肠杆菌可以大量表达外源基因编码的重组蛋白[4]。但是仍然有两个问题制约着大肠杆菌表达系统对重组蛋白的表达：一个是表达量低，还有一个就是表达错误折叠的蛋白包涵体[5]。蛋白的表达和纯化工艺一直在发展进步，但是超过30%的重组蛋白为不具有生物活性的包涵体，严重影响了重组蛋白的生产应用[6,7]。 在理想条件下，重组蛋白由强启动子进行表达，产生大量的具有生物学活性的可溶性重组蛋白。但是，强启动子会导致重组蛋白的过表达,从而影响宿主菌体的生长并产生包涵体[8]。在某些条件下可以通过变性、复性的方法使包涵体恢复活性[9]，但是复性后的蛋白是否能够完全恢复活性仍然未可知。一般来讲，可以通过表达条件的优化来促进蛋白的可溶性表达，比如：诱导温度、培养基组成、宿主菌的种类。还可以通过多种方案来解决蛋白不溶的问题：蛋白重新折叠[10]，构建融合蛋白[11]。另外想要进一步增加蛋白可溶性可以与分子伴侣共表达[8]或者低温诱导[12]。本文对目前主要的促进蛋白可溶表达的方法进行了比较全面的总结。 1.大肠杆菌表达系统的构建 1.1选择表达宿主菌 对于大规模的表达重组蛋白，一般选择胞内表达或者周质空间表达。与周质空间表达相比，胞内表达的表达量更高，因此应用更为广泛。在实验研究和实际生产中，已经有很多大肠杆菌表达系统广泛应用于。在表达体系中较为常用的大肠杆菌为B菌株和K12菌株及它们的衍生菌株（表1[13]）。美国国立研究院已经认证了K12菌株的标准性以及安全的使用方案，因此K12菌株在生产应用中具有极大的优势。但是由B菌株演变而来的BL系列菌株与K12相比，突变了lon 和ompT两个基因[14]，因此具有许多表达优势：产物积累少，缺少蛋白酶，防止产物被降解。这些优势使得BL菌株也具有非常广泛的应用[15,16,17]。 通常来讲，针对不同的重组蛋白，宿主菌的选择也是不同的。如果重组蛋白含有大肠杆菌稀有密码子，就需要宿主能够表达针对这些密码子的tRNA，比如BL21 (DE3) CodonPlus-RIL，Rosetta (DE3)等菌株。如果重组蛋白具有许多二硫

IPTG诱导蛋白表达的原理

IPTG诱导蛋白表达的原理 IPTG诱导的产物是重组后表达载体中的插入序列所能够翻译的蛋白，并可视载体构建情况翻译后续的标签序列。 用乳糖操纵子作为启动子进行蛋白质表达的时候,需要诱导物进行诱导(相当于点火),但乳糖可以被细胞利用掉,所以利用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)在结构上与乳糖的相似性也可以将基因表达启动,但它不能被细胞利用掉,从而实现持续的表达. IPTG是一种诱导外源基因表达的诱导剂，它不仅仅如我们学过的作为乳糖的类似物诱导大肠杆菌表达半乳糖苷酶，它是一种普遍应用的诱导剂，能诱导菌种表达多种外源基因。 但是它能诱导基因表达的具体原理我却了解的不是很多，我在网上查到以下一些内容，供查阅者借鉴。 最早应用于的表达系统是Lac乳糖操纵子，乳糖的类似物IPTG可以和lacI产物结合，使其构象改变离开lacO，从而激活转录. 这种可诱导的转录调控成为了大肠杆菌表达系统载体构建的常用元件。tac启动子是 trp启动子和lacUV5的拼接杂合启动子，且转录水平更高，比lacUV5更优越。trc启动子是trp启动子和lac启动子的拼合启动子，同样具有比trp更高的转录效率和受lacI 阻遏蛋白调控的强启动子特性。在常规的大肠杆菌中，lacI 阻遏蛋白表达量不高，仅能满足细胞自身的lac操纵子，无法应付多拷贝的质粒的需求，导致非诱导条件下较高的本底表达，为了让表达系统严谨调控产物表达，能过量表达lacI阻遏蛋白的 lacIq

突变菌株常被选为Lac/Tac/trc表达系统的表达菌株。现在的Lac/Tac/trc载体上通常还带有lacIq 基因，以表达更多 lacI阻遏蛋白实现严谨的诱导调控。IPTG 广泛用于诱导表达系统，但是IPTG 有一定毒性，有人认为在制备医疗目的的重组蛋白并不合适，因而也有用乳糖代替IPTG作为诱导物的研究。另外一种研究方向是用lacI的温度敏感突变体，30度下抑制转录，42度开发。热诱导不用添加外来的诱导物，成本低，但是由于发酵过程中加热升温比较慢而影响诱导效果，而且热诱导本身会导致大肠杆菌的热休克蛋白激活，一些蛋白酶会影响产物稳定. T7启动子是当今大肠杆菌表达系统的主流，这个功能强大兼专一性高的启动子经过巧妙的设计而成为原核表达的首选，尤其以Novagen公司的pET系统为杰出代表。强大的T7启动子完全专一受控于T7 RNA 聚合酶，而高活性的T7 RNA 聚合酶合成 mRNA 的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍——当二者同时存在时，宿主本身基因的转录竞争不过T7表达系统，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。由于大肠杆菌本身不含T7 RNA 聚合酶，需要将外源的T7 RNA 聚合酶引入宿主菌，因而T7 RNA 聚合酶的调控模式就决定了T7系统的调控模式——非诱导条件下，可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录，从而避免目的基因毒性对宿主细胞以及质粒稳定性的影响；通过控制诱导条件控制T7 RNA 聚合酶的量，就可以控制产物表达量，某些情况下可以提高产物的可溶性部分。

9重组蛋白表达——可溶性表达

1.表达工程菌 蛋白可溶性表达很大原因取决于二硫键和正确折叠的问题，所以选用利于二硫键形成的宿主菌，如Origami(DE3), Origami B(DE3),Rosetta Origami(DE3) 等更利于蛋白表达。 2.促溶标签 前文的列表中已经详细列出，并简要介绍功能特点，值得注意的是选用促溶标签时，一定要考虑载体情况和表达工程菌的配合，如Trx标签主要是促进二硫键的配对，必须配合Origami(DE3)之类的工程菌使用，如果使用BL21(DE3)通常不会使目标蛋白的可溶性得到改善。 3.分子伴侣表达 在表达工程菌内同时装入一个表达伴侣蛋白的表达质粒，表达伴侣蛋白的质粒必须与表达外源蛋白的质粒避免“质粒不相容性”。目前，常用于大肠杆菌表达的分子伴侣主要是DNak(DnaJ,GrpE)和 GroEL(GroES)等，科研人员可根据自己的实验需要构建合适的分子伴侣质粒，含分子伴侣质粒的感受态细胞已经有商业化的产品BL21(pG-KJE8、pGro7、pKJE7、pG-Tf2、pTf16)系列,实验人员可以根据具体情况选购。 4.启动子选择 载体的启动子对于可溶性表达影响至关重要，pET系列的 T7/T7 lac为强启动子，强启动子在提高蛋白产量的同时也增强了包涵体的形成，如果遇到此种情况可以考虑换用弱启动子的载体，如pGEX系列，还可选择含cspA启动子的pCold系列载体。 5.分泌性表达 将外源目标蛋白分泌表达到培养基中，实现这个功能需要将原核蛋白信号肽序列加到外源蛋白的上游即可；目前，福因德生物已经开发出pFRD-pelB系列载体，可以帮助实现在大肠杆菌中分泌表达。 6.培养条件的优化 最常用的优化条件为：诱导温度、诱导剂浓度和诱导时间；还可以优化培养基的营养成分和离子物质，比如，我们使用营养成分稍低的LB培养基，可同时向培养基中添加葡萄糖，镁离子、氯化钠、硫酸铵等盐离子。 1）低温诱导:比如20℃,低温情况下,转录和翻译变慢,蛋白质浓度低,有更多的时间正确折叠； 2）向培养基中加入0.4M蔗糖，高渗引起了渗透性休克反应，该反应增加了细胞内谷氨酸、脯氨酸和海藻糖的水平，为蛋白的正确折叠提供了环境； 3）42℃短暂热休克，然后降温到20℃：热休克增加了DnaK/J和GroEL/ES的水平，通常的程序是37℃培养到A600nm=0.5,然后快速升温到42℃维持15min左右，然后降到20℃并诱导蛋白的表达。 4）自诱导培养基，适合于T7启动子系列的诱导表达，当工程菌增长到一定密度后，自己缓慢开启诱导开