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胡萝卜素的柱层析分离

胡萝卜素的柱层析法测定

Determination of carotene by column chromatography

摘要:胡萝卜素存在于辣椒、胡萝卜、菠菜等绿色植物中,由于各种胡萝卜素的化学结构不同,它们被氧化铝吸附的强度以及有机溶剂中溶解度都不相同,同植物其他色素比较,胡萝卜素的吸附最差,故最先被洗脱下来。层析法是近代生物学中应用较为广泛的物理化学分析方法之一,为了胡萝卜素分离试验的结果较好,生物化学课中也开设了柱层析法分离胡萝卜素的试验。

关键词:胡萝卜素菠菜柱层析法

胡萝卜素存在于辣椒和胡萝卜等黄绿色植物中,因其在动物体内可转变成维生素A,故称为维生素A原。胡萝卜素可用酒精、石油醚和丙酮等有机溶剂从食

物中提取出来,且能被氧化铝(Al

2O

3

)所吸附,先用高温处理氧化铝以除去水分,

提高氧化铝的吸附力。由于胡萝卜素与其它植物色素的化学结构不同,它们被氧化铝吸附的强度以及在有机溶剂中的溶解度都不相同,故将提取液利用氧化铝层析,再用石油醚等冲洗层析柱,即可分离成不同的色带。同植物其它色素比较,胡萝卜素吸附最差,跑在最前面,故最先被洗脱下来.

层析法(Chromatography)是近代生物化学中应用较为广泛的物理化学分析方法之一。1906年俄国植物学家米哈伊尔·茨维特将此法用于植物色素的分离,故又称色层分析法,最初命名采用Chromatography这一词来描述这一技术(源于希腊文Chromatos,颜色)[1]。该法是利用混合物中各组分分子结构互不相同,理化性质(溶解度、吸附力、分子大小形状及分子极性等)各异,因而在支持物(吸附剂)上分布于不同的区带,以达到分离的目的。层析法一般利用两个相,一个称固定相,一个称流动相。目前常用的层析法根据分离原理不同而分为吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析法等。其中吸附层析法又可根据操作形式的不同分为柱层析法和薄板层析法等。[2]柱层析法是用一根玻璃

柱(1cm×16cm)内装吸附剂粉末(MgO、Al

2O

3

、硅胶等),在柱顶部加入要分离

的样品溶液,再加入一定的有机溶剂(流动相)以洗脱样品中各组分,由于吸附剂对各组分的吸附力不同及各组分在洗脱剂中的溶解度不同,因而在洗脱过程中各组分随洗脱剂向下流动时,层析柱中连续不断地产生吸附、溶解(解吸附),再吸附、再解吸附的现象。经过一段时间的吸附、解吸附后,样品中各组分即以不同的速度向下移动,逐渐分离,在柱上形成不同的区带,先后从柱下端流出,分步收集,可供进一步鉴定[3]。丙酮提取直接比色法及柱层析法在胡萝卜素的测定上存在极显著差异。经分析可知, 柱层析法所得到的数据体现了β胡萝卜素的含量, 而丙酮法所测出的除β胡萝卜素外, 还有α、γ等胡萝卜素的异构体, 另外可能还含有类胡萝卜素、叶黄素及硫化物等分子结构与β胡萝卜素相似的物质, 经相关性分析可知,丙酮法在测定胡萝卜素中取代柱层析法不合适。[4] 材料为菠菜叶时,各条色带清晰,经过几次重复实验后,结果也很稳定,每次均能看出4 条清晰色带,尤其是胡萝卜素远远地被分离开;材料为胡萝卜和红辣椒时,经过重复实验发现虽然胡萝卜素含量很高,也能清晰地看到,但由于其他红色的色素过多,与胡萝卜素混在一起,影响了实验结果,不能使学生一目了然,同时其他色素含量较少,也不能清晰地看到。由实验结果可以看出,菠菜叶

是胡萝卜素柱层析分离实验的最佳材料,实验结果较稳定,每条色带都很清晰,可以清楚地看到4 条色带,从下至上依次为:胡萝卜素(橘黄色)、叶黄素(金黄色)、叶绿素a(蓝绿色)和叶绿素b(黄绿色)。[5]在用柱层析法测定胡萝

卜素含量的过程中洗脱剂用以洗脱混和提取液中的胡萝卜素,洗脱剂由丙酮一石油醚组成, 丙酮所占比例越多,洗脱力越大,但必须注意丙酮用量,控制在只将胡萝卜素洗下来而不洗下其它色素。胡萝卜素在光下易分解破坏, 应在较暗处操作, 标准溶液现用现配。

本实验在提取操作中可以进行实验性尝试,在研磨过程中加入了3g的无水

Na

2SO

4

以增强研磨强度,有利于有效成分的提取。在选用提取液时未使用乙醇,

而使用了15ml乙醚,10ml丙酮X2次,10ml石油醚X5次,采用在研钵中加提取剂,研磨,然后倾其上层液体过滤。这样避免了将混合物全部倒入漏斗,造成过滤难以进行的后果。也可选用硅胶柱层析,硅胶的预处理,我们以浓盐酸浸泡硅胶14小时,然后用蒸馏水洗涤硅胶4次后,将起进行减压抽滤,后不断加蒸馏水冲洗。在1小时之后,抽滤的水呈中性,但仍然含有氯离子。经过4小时不断的冲洗才使得抽滤液中基本不含氯离子。晾干一周后,在110℃烘箱中活化2小时。活化后的硅胶加石油醚浸泡并搅拌均匀。在装柱时,宜使用口径较大的玻璃漏斗置于层析柱上部,注入1/2高的石油醚,打开下部活塞,然后尽量均匀地将硅胶倾入漏斗,这样可以防止层析柱中形成断层(这一步是实验的关键步骤)。

实验时要注意:用高温处理氧化铝以除去水分,提高氧化铝的吸附力;样品-石油醚提取液中的乙醇必须洗净,否则吸附不好,色素也弥散不清;样品称量时, 颜色较深的菠菜可以适量少称, 颜色较浅的应多称;[6]展层剂中的丙酮可增强洗脱效果,但含量不宜过高,以免洗脱过快使色带分离不清晰;防止层析柱出现断层,加时要均匀。

综合多次试验得出结论:菠菜比较合适做胡萝卜素提取的试验,丙酮法在测定胡萝卜素中取代柱层析法不合适,较好的实验结果可以清楚地看到4条色带,从下至上依次为:胡萝卜素(橘黄色)、叶黄素(金黄色)、叶绿素a(蓝绿色)和叶绿素b(黄绿色)。

参考文献:

[1]谢庆娟. 分析化学[M]. 北京:人民卫生出版社,2005.

[2]尹桂山. 生物化学实验指导[M]. 石家庄:河北科学技术出版社,1989.

[3]王秀奇,秦淑媛,高天慧等. 基础生物化学实验[M]. 2版.北京:高等教育出版社,1996.

[4]耿三省.胡萝卜中胡萝卜素含量测定法[J].北京农业科学,1996(02).

[5]武洋.胡萝卜素柱层析分离试验最佳材料的研究[J].卫生职业教育,2012.

[6]赵胜芳、郝卫东.菠菜叶中色素成分的分离和鉴定[J].黄冈师范学院报,2008.

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