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孔石莼多糖铁复合物的合成及其性质研究

姜

峻1，牟

谦1

，陈

嘉1，綦慧敏2，张忠山

（1．湖州师范学院生命科学学院，浙江湖州313000；

2．潍坊医学院药学与生物科学学院，山东潍坊261053）

摘

要：研究了孔石莼多糖铁复合物的人工合成及其性质。用水提醇沉法制备孔石莼多糖，在碱

性条件下以三氯化铁为底物反应合成孔石莼多糖铁复合物；正交实验确定孔石莼多糖铁制备的最佳条件。测定了多糖铁的一般理化性质和红外光谱。通过邻菲罗啉比色法，测定了多糖铁中铁含

量，并对多糖铁进行还原性实验。结果表明实验三因素中，pH 影响最大，反应时间次之，用料比影响较小。最佳反应条件为pH 8，

反应时间4h ，多糖与柠檬酸三钠用料比为1?2。理化性质和红外光谱表明所得孔石莼多糖铁为新生成物质。经过铁的配合，使得多糖原料的总糖含量有所降低。在5h 左右的时间内，孔石莼多糖铁基本被抗坏血酸完全还原。孔石莼多糖铁将来有望发展成为优良的补铁剂。

关键词：孔石莼多糖；多糖铁；合成；理化性质

中图分类号：TS 201．2+

6文献标识码：A 文章编号：1007－7561（2013）06－0062－04

Ｒesearch on compound and properties of ulva pertusa polysaccharide iron complex

JIANG Jun 1，MOU Qian 1，CHEN Jia 1，QI Hui －min 2，ZHANG Zhong －shan 1（1．College of Life Science ，Huzhou Teachers College ，Huzhou Zhejiang 313000；2．College of Pharmaceutical and Biological Sciences ，Weifang Medical University ，

Weifang Shandong 261053）

Abstract ：The method to synthesize ulva pertusa polysaccharide iron complex and the properties was stud-ied．The ulva pertusa polysaccharide was extracted by water extraction and alcohol precipitation．The poly-saccharide was reacted with ferric chloride to obtain polysaccharide iron complex under alkaline condi-tion．The optimized conditions were confirmed by orthogonal experiment．The physicochemical characteris-tics and infrared spectrum of the polysaccharide iron were determined．The iron content in the polysac-charide iron was determined by phenanthroline colorimetry ，and reduction experiment was carried out．The results showed that pH value influenced the compound most ，and then reacting time and the ratio of sub-stances．The optimal conditions were pH value 8，time 4h and the ratio of polysaccharides to trisodium cit-rate 1?2．The ulva pertusa polysaccharide iron was a new forming substance according to physicochemical properties and infrared spectroscopy．The total sugar content in polysaccharide decreased because of iron．The ulva pertusa polysaccharide iron basically was completely reduced by ascorbic acid in 5h．The results indicate that ulva pertusa polysaccharide iron was expected to be a good iron supplement agent．Key words ：ulva pertusa polysaccharide ；polysaccharide iron ；compound ；physicochemical properties 收稿日期：2013－04－18

基金项目：浙江省大学生科技创新活动计划暨新苗人才计划项目

（2012Ｒ425013）；国家自然科学基金（41206129）；山东省自然科学基金（ZＲ2012DL13）

作者简介：姜峻，1989年出生，男，在读本科生．

通讯作者：张忠山，1982年出生，男，博士，讲师．

铁是人体中的必需微量元素，在人体代谢过程中起着极其重要的作用。当体内铁缺乏时，会出现缺铁症或缺铁性贫血。防治缺铁性贫血最主要的方法是给机体补充足够的铁，补充铁最常用、最方

便、最重要的方法是口服。以往治疗缺铁性贫血的传统药物硫酸亚铁具有明显的副作用，从而限制了它的应用

［1］

。自从多糖类物质的免疫调节作用被

全面揭示之后，以三价铁（Fe 3+

）为核心，多糖为配

合物的复合补血制剂成为新型口服补铁制剂。多糖铁（Polysaccharide Ion Complex ，

PIC ）具有副作用小、配合性稳定、溶解度好，含铁量高等优点。国内外医药工作者一直在开发研究各种各样的治疗缺

铁性贫血的PIC作为高效低毒的补铁剂。Ｒobert S．Molday制备了右旋糖酐铁复合物［2］；StephenＲ．Ash 制备的糊精铁与右旋糖酐铁复合物注射剂可用于胃肠外治疗动物与人类的缺铁性贫血［3］；H．B．安德里森和L．克里斯坦森制得了分子量在400 3000的糊精多糖铁［4］；Giovanna Pitarresi等利用菊粉作为载体，合成了菊粉－琥珀酸酐－铁和菊粉－琥珀酸酐－半胱氨酸－铁［5］。德国许瓦兹制药有限公司生产的主要成分为多糖铁的力蜚能胶囊，含铁量高，副作用小，日均费用高［6］。国内文献报道了多种多糖铁的制备，化橘红多糖铁配合物［7］、银耳多糖铁配合物［8］、茶叶多糖铁配合物［9］、当归多糖铁配合物［10］、地黄多糖铁配合物［11］、南瓜多糖铁配合物［12］、白芍多糖铁配合物［13］等有望作为新的、生物利用度较高的补铁剂，但是未见动物实验及深一步的研究。

孔石莼（Ulva pertusa）属绿藻门（Chlorophyta）石莼科（Ulvaceae）石莼属（Ulva），是一种可食用的大型绿藻。孔石莼多糖属细胞间产物，在藻体中以杂多糖形式存在。研究表明孔石莼多糖具有较高的生物活性，主要有降血脂、降胆固醇、抗凝血、抗病毒、抗肿瘤活性［14］，并已经证明了其低毒、药效好、用量小的优点。孔石莼的高活性组分和医学药用方面的潜力已逐渐吸引了许多学者的注意，他们开始系统深入地开展研究工作，以期研究清楚确切的活性物质和作用机理，进一步阐明结构与活性之间的构效关系。

虽然利用生物多糖与铁配合生成补铁剂的研究国内已有很多报道，但有关绿藻孔石莼多糖与铁的配合未曾见报道。本文选用沿海常见的孔石莼为原料制备孔石莼多糖铁配合物，并对其理化性质进行了研究。有望开发一种有药用价值的新型生物活性补铁剂。

1材料与方法

1．1实验仪器

BS124S型电子天平：赛多利斯科技仪器有限公司；SP－752紫外－可见光分光光度计：上海光谱仪器有限公司；DK－524恒温水浴锅：金坛市杰瑞尔电器有限公司；SHB－ⅢA循环水式多用真空泵：河南省太康科技教材厂；GZX－9076MBE数显鼓风干燥箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；Nicold5700傅立叶红外光谱仪：Thermo electron corporation。1．2材料及试剂

孔石莼于2011年5月采自青岛沿海水域。

2mol/L三氯化铁溶液：用电子天平称取5g FeCl

·6H

O于20mL容量瓶中，加水定容至刻度；5%苯酚：准确称取0．5000g苯酚固体溶于9．5

g蒸馏水中，使其完全溶解；0．12%邻菲罗啉溶液：准确称取0．06g邻菲罗啉固体，加水至50mL；标准铁（含Fe20μg/mL）：准确称取0．0964g FeCl3·

O，加水至1L，然后从中量取125mL，加水稀释至500mL；10%抗坏血酸溶液：准确称取0．1g抗坏血酸固体，加水0．9mL。

1．3方法与步骤

1．3．1孔石莼多糖的制备

称取孔石莼干藻100g，加40倍量水，120?下提取3h，用筛绢初滤后用硅藻土过滤，滤液于截留3600Da分子量的透析袋中透析后减压浓缩至原体积的1/4左右，加入4倍95%的乙醇沉淀。将沉淀用无水乙醇洗涤2次后烘干称重。

1．3．2孔石莼多糖铁复合物的制备

依次精确称取孔石莼多糖0．5g、一定质量的柠檬酸三钠溶于30mL水中，于一定温度水浴中加热溶解，并不断搅拌使溶液均一澄清。逐滴加入20%氢氧化钠溶液，此时缓缓加入一定量的2mol/L三氯化铁溶液，保证整个过程溶液维持在一定的pH。当反应液中出现红棕色沉淀时，停止滴加氢氧化钠溶液和三氯化铁溶液。继续加热反应1h后趁热离心除去沉淀，收集上层深红棕色离心液，加乙醇至溶液中（乙醇浓度为75%），并不断搅拌生成沉淀。沉淀依次用无水乙醇和乙醚洗涤后抽滤、干燥。将得到的沉淀重新溶于水中，装入透析袋中透析除盐后，浓缩并冷冻干燥得到孔石莼多糖铁复合物，称重。1．3．3正交实验

以复合物中铁含量为考察指标，通过正交实验确定制备过程中主要影响因素的适宜水平及各因素水平的最佳组合。考察因素为反应时间（A）、pH 值（B）以及多糖与柠檬酸三钠用料比（C），采用

（34）正交表进行试验。

1．3．4红外光谱测定

在石英研钵中加入适量溴化钾，不断研磨直至变成粉末状。取适量溴化钾粉末和少许的样品放入压片机中于10 15Pa压强范围内研磨至粉末状，在4000 400cm－1波长范围内进行红外光谱扫描。

1．3．5总糖含量测定

用苯酚－硫酸法分别测定孔石莼多糖原料以及孔石莼多糖铁复合物中总糖含量，以鼠李糖做标准品制作标准曲线。

1．3．6

多糖铁中铁含量测定

精密称取FeCl 3配成含Fe 20μg /mL 的标准溶液，

分别吸取此标准液1mL 和样品溶液0．1mL ，置于10mL 容量瓶中，依次加入1mL 0．2mol ·L －1

的邻苯二甲酸氢钾溶液、

2mL 0．3%的邻菲罗啉溶液和0．24mL 10%抗坏血酸溶液，加蒸馏水定容后摇匀。取上述反应液在37?反应10min 后在400 700nm 处进行扫描，记录最大吸收波长。分别准确吸取上述FeCl 3标准溶液0、

0．1、0．2、0．4、0．6、0．8、1．0mL ，按照上述步骤在最大吸收波长处测定吸光度，

以蒸馏水加试剂溶液为空白。以铁质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标制作标准曲线，见图1

。

图1

铁含量测定实验标准曲线

称取孔石莼多糖铁粉末0．1g 在10mL 容量瓶中加水溶解定容。精确吸取0．5mL 样品溶液按照标准曲线制作实验步骤测定复合物吸光度，并计算多糖铁复合物中的铁含量。1．3．7

孔石莼多糖铁的还原性实验

取1mL 孔石莼多糖铁溶液，

依次加0．2mL 抗坏血酸溶液（20%）、

0．1mL 邻菲罗啉溶液（0．12%），混合溶液在37?下摇匀反应一段时间。取不同时刻的反应液于最大吸收波长处测吸光度。以相应量的邻菲罗啉试剂代替抗坏血酸溶液得到上述反应液作为空白对照，记录测定结果。

结果与分析

2．1

正交实验结果

经过前期单因素试验结果，我们确认了正交试

验主要影响因素和水平，见表1。实验中所用柠檬酸三钠和多糖都是铁的配体，随着多糖铁复合物的形成，分子量逐渐增大，柠檬酸钠会逐渐从多糖铁上解离，参与新的合成

［15］

。以含铁量为指标，通过

正交实验确定最佳反应条件，结果见表2。由表2可见，三因素中，pH 影响最大，反应时间次之，用料比影响较小。最佳反应条件为pH 8，反应时间4h ，两者用料比为1?2。

表1

正交实验因素和水平

水平

因素

反应时间/h

B pH 值C

m （多糖）：m （柠檬酸三钠）

1372?12481?13

1?2

表2多糖铁制备的正交实验结果

实验号A B C 产品质量

/g 含铁量/%11110．73216．8421220．91319．3031331．28820．0642120．69417．9352231．18322．1762310．84519．4673131．09216．2083210．96617．5393320．871

18．64

K 156．2050．9753．83K 2

59．5660．1155．87K 352．3757．0558．43Ｒ

7．19

9．14

4．60

注：A 指反应时间，B 指pH 值，C 指m （多糖）?m （柠檬酸三钠）。

2．2

多糖铁的一般物理性质

孔石莼多糖铁是红棕色粉末，易溶于水，不溶

于无水乙醇、

乙醚等有机溶剂。复合物溶于水，该溶液存在丁达尔现象，

表明孔石莼多糖铁溶液是一种胶体。加硫氰酸钾后不发生变化，并以K 4［Fe （CN ）6］检验其水溶液，结果不显示三价铁离子的特殊效应。上述均证明复合物水溶液中不存在游离的Fe 3+

，说明生成了较为稳定的配合物。

2．3

红外光谱鉴定

图2为孔石莼多糖和孔石莼多糖铁配合物的红

外光谱分析图谱。由图2所示，与原料相比，多糖铁

复合物在742cm －1

出现新峰，提示多糖铁复合物中

的铁核是β－FeOOH 核，这与Marshall 的报道一致

［16］

。1722cm －1的新峰表明在多糖铁中出现了新

的－C =O 基团，提示铁可能接在－C =O 上。由于红外光谱仅仅能给出相关官能团类型和连接方式，无法全面揭示多糖铁的结构，下一步实验将深入研究其结构。

图2孔石莼多糖（a ）和孔石莼多糖铁复合物（b ）的红外光谱

2．4总糖含量测定

苯酚硫酸法测定多糖原料和复合物中总糖含

量。经计算，

原料和铁复合物中总糖含量（以鼠李糖计）分别为48．2%和42．6%。由此看出，经过铁的配合，使得多糖原料的总糖含量有所降低。2．5

复合物中铁含量测定

复合物中铁含量的测定采用邻菲罗啉显色法。标准铁（FeCl 3）溶液的吸光度在510nm 处达到最大值。故确定最大吸收波长为510nm 。以标准铁FeCl 3中的Fe

浓度为横坐标，吸光度A 为纵坐标

绘制标准曲线，

线性回归方程为y =0．507x +0．0066，Ｒ2=0．9963。由此方法计算孔石莼多糖铁配合物中含铁量为20%左右，具体数值见正交实验结果。2．6

孔石莼多糖铁还原性实验

孔石莼多糖铁复合物被抗坏血酸还原后，其吸光度随着时间变化逐渐增大。由图3可知，在开始反应后的2 3h 内，吸光度随时间变化增大的幅度较大；3 5h 以后，

幅度减小；5h 以后近似稳定。由此可知，在5h 左右的时间内，孔石莼多糖铁基本被抗坏血酸完全还原

。

图3孔石莼多糖铁复合物还原实验结果3结论

本文通过柠檬酸三钠－三氯化铁法反应制备

得到孔石莼多糖铁复合物。正交实验确定最佳反

应条件为pH 8，反应时间4h ，孔石莼多糖与柠檬酸三钠的用料比为1?2；红外光谱和其他实验证实多糖铁是新生成物质。还原实验表明孔石莼多糖铁在5h 左右的时间内可基本被抗坏血酸完全还原。孔石莼多糖铁复合物有望成为新型生物补铁剂。

我国拥有非常丰富的孔石莼资源，在研究开发这一资源方面有相当大的潜力和优势。随着海洋产业将成为21世纪的高新技术产业，

孔石莼的研究前景十分诱人，其开发利用无疑会大大推动海洋生

物活性物质研究的进程，给人类带来福音。参考文献：

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