胶体金

金免疫技术的特点是以胶体金作为标记物。这一技术在70年代初期由Faulk和Taylor始创，最初用于免疫电镜技术。迄今为止，金标记仍主要用于免疫组织化学中。在免疫测定中，金标记常与膜载体配合，形成特定的测定模式，典型的如斑点免疫渗滤试验和斑点免疫层析试验等，已是目前应用广泛的简便、快速检验方法。

第一节免疫胶体金的制备

一、胶体金的特性和制备

（一）胶体金的结构

胶体金（colloidalgold）也称金溶胶（goldsol），是由金盐被还原成原金后形成的金颗粒悬液。胶体金颗粒由一个基础金核（原子金Au）及包围在外的双离子层构成，紧连在金核表面的是内层负离子（AuC12－），外层离子层H+则分散在胶体间溶液中，以维持胶体金游离于溶胶间的悬液状态。胶体金颗粒的基础金核并非是理想的圆球核，较小的胶体金颗粒基本是圆球形的，较大的胶体金颗粒（一般指大于30nm以上的）多呈椭圆形。在电子显微镜下可观察胶体金的颗粒形态。

（二）胶体金的特性

1．胶体性质胶体金颗粒大小多在1～100nm，微小金颗粒稳定地、均匀地、呈单一分散状态悬浮在液体中，成为胶体金溶液。胶体金因而具有胶体的多种特性，特别是对电解质的敏感性。电解质能破坏胶体金颗粒的外周永水化层，从而打破胶体的稳定状态，使分散的单一金颗粒凝聚成大颗粒，而从液体中沉淀下来。某些蛋白质等大分子物质有保护胶体金、加强其稳定性的作用。

2．呈色性微小颗粒胶体呈红色，但不同大小的胶体呈色有一定的差别。最小的胶体金（2～5nm）是橙黄色的，中等大小的胶体金（10～20nm）是酒红色的，较大颗粒的胶体金（30～80nm）则是紫红色的。根据这一特点，用肉眼观察胶体金的颜色可粗略估计金颗粒的大小。

3．光吸收性胶体金在可见光范围内有一单一光吸收峰，这个光吸收峰的波长（λmax）在510～550nm范围内，随胶体金颗粒大小而变化，大颗粒胶体金的λmax偏向长波长，反之，小颗粒胶体金的λmax则偏于短波长，表19-1所列为部分胶体金的λmax。

（三）胶体金的制备

1．制备方法胶体金的制备多采用还原法。氯金酸（HauC14）是主要还原材料，常用还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。根据还原剂类型以及还原作用的强弱，可以制备0.8nm～150nm不等的胶体金。最常用的制备方法为柠檬酸盐还原法。具体操作方法如下：

（1）将HauC14先配制成0.01％水溶液，取100ml加热至沸。

（2）搅动下准确加入一定量的1％柠檬酸三钠（Na3C6H5O7?2H2O）水溶液。

（3）继续加热煮沸15min。此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快变灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成红色。全过程约2～3min。

（4）冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积。

用此法可制备16～147nm粒径的胶体金。金颗粒的大小取决于制备时加入的柠檬酸三钠的量。表19-1列举制备4种不同粒径胶体金时柠檬酸三钠的用量。

表19-1 四种粒径胶体金的制备及特性

胶体金粒径（nm）1％柠檬酸三钠加入量（ml）*胶体金特性

呈色λmax

16 2.00 橙色518nm

24.5 1.50 橙红522nm

41 1.00 红色525nm

71.5 0.70 紫色535nm

*还原100ml0.01％HauC14所需量

2．注意事项

（1）氯金酸易潮解，应干燥、避光保存。

（2）氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，因此在配制氯金酸水溶液时，不应使用金属药匙称量氯金酸。

（3）用于制备胶体金的蒸馏水应是双蒸馏水或三蒸馏水，或者是高质量的去离子水。

（4）是以制备胶体金的玻璃容器必须是绝对清洁的，用前应先经酸洗并用蒸馏水冲净。最好是经硅化处理的，硅化方法可用5％二氯甲硅烷的氯仿溶液浸泡数分钟，用蒸馏水冲净后干燥备用。

（5）胶体金的鉴定和保存：胶体金的制备并不难，但要制好高质量的胶体金却也并非易事。因此对每次制好的胶体金应加以检定，主要检查指标有颗粒大小，粒径的均一程度及有无凝集颗粒等。

肉眼观察是最基本也是最简单和方便的检定方法，但需要一定的经验。良好的胶体金应该是清亮透明的，若制备的胶体金混浊或液体表面有漂浮物，提示此次制备的胶体金有较多的凝集颗粒。在日光下仔细观察比较胶体金的颜色，可以粗略估计制得的金颗粒的大小。当然也可用分光光度计扫描λmax来估计金颗粒的粒径。结制备的胶体金最好作电镜观察，并选一些代表性的作显微摄影，可以比较精确地测定胶体金的平均粒径。

胶体金在洁净的玻璃器皿中可较长时间保存，加入少许防腐剂（如0.02％NaN3）可有利于保存。保存不当时会有细菌生长或有凝集颗粒形成。少量凝集颗粒并不影响以后胶体金的标记，使用时为提高标记效率可先低速离心去除凝集颗粒。

二、免疫金的特性和制备

（一）免疫金的特性

胶体金可以和蛋白质等各种大分子物质结合，在免疫组织化学技术中，习惯上将胶体金结合蛋白质的复合物称为金探针。用于免疫测定时胶体金多与免疫活性物质（抗原或抗体）结合，这类胶体金结合物常称为免疫金复合物，或简称免疫金（immunogold）。

胶体金与蛋白质结合的机制尚有十分清楚，一般认为是物理吸附性的。胶体金颗粒带有一层表面阴性电荷，与蛋白质表面的阳性电荷通过静电感应相附。因此环境pH和离子强度是影响吸附的主要因素，其他如胶体金颗粒的大小、蛋白质的分子量及蛋白质浓度等也会影响蛋白质的吸附。

（二）免疫金的制备

1．用0.2mol/LK2CO3或0.1mol/LHC1调节胶体金溶液的pH至选定值。原则上可选择待标记蛋白质等电点，也可略为偏碱。但通常最适反应pH往往需经多次试验才能确定。在调节胶体金的pH值时应注意，胶体金会阻塞pH计的电极，不可直接将电极插入胶体金溶液中，宜先用终浓度为0.15的聚乙二醇（PEG，20000）稳定胶体金后，再胶体金的pH值。

2．将1/10体积的合适浓度的蛋白质溶液加于胶体金溶液中，放置室温反应2～5min。由于盐类成分能影响胶体金对蛋白质的吸附，并可使胶体金聚沉，因此待标记蛋白质溶液若含有较高的离子浓度，应在标记前先对低离子强度的蒸馏水透析去盐。

3．加入浓度为0.2％的PEG或BSA以饱和游离的胶体金。

4．离心分离，去除上清液中未结合的蛋白质。离心条件视胶体金颗粒的粒径而异：对5nm金颗粒可选用40000r/min离心1h；8nm金颗粒用25000r/min离心45min；14nm金颗粒用25000r/min离心30min，40nm 金颗粒用15000r/min离心30min。

5．轻吸上清液。沉淀用含PEG或BSA的缓冲液悬浮，恢复原体积后再离心。如此洗涤2～4次。以彻底除去未结合的蛋白质。

6．免疫金复合物最终用稀释液配制成工作浓度保存。稀释液通常是加入稳定剂的缓冲液。缓冲溶液常用中性的PBS或Tris缓冲液。

多种蛋白质、葡聚糖、PEG2000、明胶等均为良好的高分子稳定剂，PEG和BSA是最常用的稳定剂。稳定剂有两大作用：一为保护胶体金的稳定性，使之便于长期保存；二为防止或减少免疫金复合物的非特异性吸附反应。稳定剂的合理选择是十分重要的，不适当的稳定剂有时也会导致非特异性反应。

一、胶体金

即金的水溶液，它也具有一般溶胶的特性。分散体系的分类：体系就是一定空间范围内作为我们研究对象的物质，某一种或几种物质分散到另一种物质中所组成的体系叫做分散体系。被分散相质点的大小而改变，因此，按分散相质点的大小不同，可将分散体系分为三类。

（一）离子分散体系

指分数散相以小分子或离子状态分散着。这种溶液具有高度稳定性，无论放置多久，分散相颗粒都不会因重力而下沉，不会从溶液中分离出来

（二）胶体分散体系

是指分散相颗粒在1～100nm之间的分散体系叫做胶体分散系。胶体溶液外观透明不浑浊，在普通显微镜下看不见它的分散相粒子，不易受重力影响与分散介质分离沉降，但其中的溶胶粒子有聚结变大的倾向，即具有聚结不稳定性。

（三）粗分散体系

分散相颗粒是由许多分子组成，因粒子较大，用肉眼或显微镜即可看见，不稳定，极易因重力而自动沉降，外观浑浊不透明。

二、胶体金的一般性状

（一）胶体金的颜色

溶胶的颜色决定于分散相物质的颜色、分散相物质的散度和入射光线和种类，是散射光还是透射光，粒子越小，分散度越高，则散射光的波长越短，对同一种物质的水溶胶来说，粒子大小不同，颜色亦不同，胶体金颗粒在5～20nm之间，吸收波长520nm，呈葡萄酒红色，20～40?nm之间吸收波长530nm，液体为深红色，60nm的金溶液主要吸收波长600nm，金溶液呈兰紫色，若离心去掉较大的金颗粒，溶胶呈红色。

（二）胶体金的稳定性

溶胶的稳定性介于小分子离子溶液和粗分散系之间，溶胶的颗粒作布朗运动，不易受重力影响下沉。然而溶胶又是不稳定体系，它的胶粒溶剂化作用很弱，总表面积较大，当胶粒相互碰撞时，有自动合并为较大、较重的颗粒倾向。胶体颗粒变大以致超出胶体范围而从介质中沉淀出来的现象叫聚沉。影响溶胶稳定性的主要原因有三点：①胶粒间的相互吸引力。当胶粒相距很近时，这种吸引力可能导致胶粒合并变大。②胶粒及其溶剂化层（溶剂是水就是水化层）的带电情况。一种溶胶的各个胶粒都带有相同的电荷。同性电荷相斥，双电层愈厚，胶粒带电量愈大，排斥力愈大，愈能阻止胶粒合并聚结，溶胶愈稳定。③胶体界面的溶剂膜，当二固体间夹有一厚层液体时，这层液体膜有一个反抗二固体接近的排斥力。两个胶粒要进一步接近，只有克服它们之间的溶剂化膜的斥力才有可能，因此溶剂膜的斥力是使溶胶稳定的原因之一。

（三）溶胶的聚沉现象

胶粒之间存在吸引力与排斥力这对矛盾，在溶胶颗粒带电及溶剂化的情况下，排斥力成为矛盾的主要方面，溶胶稳定而不聚沉。因为某种原因使溶胶颗粒带电量减到很小甚至中和；其所带电荷并能去溶剂化膜，胶粒之间可在更近的距离互相接近，引力成为主要矛盾，引力超过斥力时胶粒便聚结发生聚沉。引起溶胶聚沉的原因有：

1．少量电介质对溶胶的聚沉作用少量电介质即可使溶胶聚沉，但各种电介质的聚沉能力可用聚沉值来表示，聚沉值愈小，聚沉能力愈大，聚沉值从实验中得出如下的离子价规则：①电介质负离子对带正电的溶胶起主要聚沉作用，正离子对带负电的溶胶起主要聚沉作用。②同价离子聚沉能力几乎相等，不同价离子的聚沉能力随离子价的增加而显著增加。电介质为什么能使溶胶聚沉呢？这是由于电介质与胶粒带相反电荷的离子的作用，中和了胶粒所带的一部分电荷，使胶粒电荷量减少，扩散层缩小，溶剂化层变薄，而当双电层厚度缩至很小的溶剂化层变得很薄时，两个胶粒间便可以更加接近即不产生斥力，两个胶粒间因引力加大而合并的趋势增强，甚至引力占绝对优势以致使胶粒聚结而发生聚沉。胶粒的双电层结构见图5

2．温度对溶胶稳定性的影响一般影响不大，当温度升高时，吸附能力减弱，溶剂化程度降低，溶剂

化层变薄，胶粒聚结，不稳定性增加。

3．浓度对溶胶的稳定性的影响浓度增大时，粒子间距离缩小，引力增加，容易聚结而发生聚沉，所以制备比较稳定的溶胶，要有一定的合适浓度。

第三节胶体金的制备技术

胶体金溶液的制备有许多种方法，其中最常用的是化学还原法，基本的原理是向一定浓度的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子变成金原子。目前常用的还原剂有：白磷、乙醇、过氧化氢、硼氢化钠、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等，下面分别介绍制备不同大小颗粒的胶体金溶液。

一、制备胶体金的

（一）玻璃器皿的清洁

制备胶体金的成功与失败除试剂因素以外玻璃器皿清洁是非常关键的一步。如果玻璃器皿内不干净或者有灰尘落入就会干扰胶体金颗粒的生成，形成的颗粒大小不一，颜色微红、无色或混浊不透明。我们的经验是制备胶体金的所有玻璃器皿先用自来水把玻璃器皿上的灰尘流水冲洗干净，加入清洁液（重铬酸钾1000g,加入浓硫酸2500ml，加蒸馏水至10000ml）浸泡24h，自来水洗净清洁液，然后每个玻璃器皿用洗洁剂洗3～4次，自来水冲洗掉洗洁剂，用蒸馏水洗3～4次，再用双蒸水把每个器皿洗3～4次，烤箱干燥后备用。通过此方法的处理玻璃器皿不需要硅化处理，而直接制备胶体金。也可用已经制备的胶体金溶液，用同等大不颗粒的金溶液去包被所用的玻璃器皿的表面，然后弃去，再用双蒸水洗净，即可使用，这样效果更好，因为减少了金颗粒的吸附作用。

（二）试剂的配制要求

（1）所有配制试剂的容器均按以上要求酸处理洗净，配制试剂用双蒸馏水或三蒸馏水。

（2）氯化金（HauCl4水溶液的配制：将lg的氯化金一次溶解于双蒸水中配成1%的水溶液。放在4”c冰箱内保存长达几个月至1年左右，仍保持稳定。

（3）白磷或黄磷乙醚溶液的配制：白磷在空气中易燃烧，要格外小心操作。把白磷在双蒸水中切成小块，放在滤纸上吸于水份后，迅速放入已准备好的乙醚中去，轻轻摇动，等完全溶解后即得饱和溶液。储藏于棕色密闭瓶内，放在阴凉处保存。

二、制备胶体金的方法和步骤

（一）白磷还原法

1．白磷还原法（Z Sigmondy 1905年）

（1）取1%的HAuCl4水溶液1ml，加双蒸水99ml配成0.01%的HAuCl4水溶液。

（2）用0.2mol/L K2CO3调pH至7.2。

（3）加热煮沸腾，迅速加入0.5ml

20%白磷的饱和乙醚溶液，振荡数分钟至溶液呈现橙红色时即成。胶体金的颗粒直径为3nm左右，大小较均匀。

2．白磷还原法（Z Sigmondy 1905及Z Sigmondy Thiessen 1925）

（1）取0.6%的HAuCl4水溶液2.5ml,加双蒸水120ml 。

（2）用0.2mol/L K2CO3,调pH至中性。

（3）加入1/5饱和度的白磷乙醚溶液1ml（1份白磷4份乙醚），在室温振荡约15min，溶液呈红褐色，再加热至典型的葡萄酒红色，加热可使乙醚蒸发，胶体金液体内过量的白磷通入空气后被氧化，此方法获得胶体金颗粒的直径在5～12nm之间。

3．白磷还原法的改良法（Henegouwen 1986）

（1）取20%饱和度白磷乙醚溶液0.5ml,加双蒸水60ml 。

（2）用1%的HAuCl4水溶液0.75ml, 加0.1mol/L K2CO30.6ml, 振荡变成棕红色。

（3）加热煮沸，至溶液变成透明红色。

使用上述方法增加还原次数使金颗粒直径不断增大，二者之间的关系见表5-1。

表5-1 胶体金颗粒大小与还原次数之间的关系

还原次数颗粒直径（nm）正负误差

15.60.9

26.70.9

37.90.9

49.81.3

5121.0

此方法主要优点是简化了制备不同大小的颗粒胶体金的手续和其它试剂的配制,经济、操作简单。另外，在多次还原过程中氯化金不再形成新的金颗粒，只是在原先金粒子基础上使它的直径变大。第一次金颗粒起着“晶核”的作用。由于这一特点，制备的金颗粒相对均匀一致。

（二）抗体血酸还原法（Stathis and Fabrikanos 1958）

（1）将在4℃预冷的1%HAuCl4水溶液1ml,0.2mol/L K2CO31.5ml、双蒸水25ml混匀。

（2）在搅拌下加入1ml 0.7%抗坏血酸水溶液，立即呈现紫红色。

（3）加双蒸水至100ml，加热至溶液变为透明红色为止。胶体金颗粒直径为8～13nm。

（三）柠檬酸三钠还原法（Frens 1973）

此方法是由Frens在1973年创立的，制备程序很简单，胶体金的颗粒大小较一致，广为采用。该法一般先将0.01%的HAuCl4溶液加热至沸腾，迅速加入一定量1%柠檬酸三钠水溶液，开始有些蓝色，然后浅蓝、蓝色，再加热出现红色，煮沸7～10min出现透明的橙红色。各种颗粒的胶体金制备详见表5-2。

表5-2 柠檬酸三钠用量与胶体金颗粒直径的关系

0.01%的HAuCl4（ml）1%柠檬酸三钠(ml)直径（ml）

1005.010.0

1004.015.0

1001.525.0

1001.050.0

1000.7560.0

1000.6070.0

1000.4298.0

1000.32147.0

1000.25160

按照Frens法还可以制备出其它不同颗粒大小的胶体金出来。许多研究证明用该法制备胶体金时金颗粒的大小是柠檬酸三钠用量的函数，基本的规律是柠檬酸三钠用量多，胶体金颗粒直径小，柠檬酸三钠用量越少，腔体金颗粒直径越大。

（四）鞣酸?柠檬酸三钠还原法（Slot与Gueeze1985年）

该法是以1982年Muhlpfordt法为基础，1985年Slot与Geuze对该法进行了改良，特点是通过改变鞣酸的用量制备出多种颗粒直径的胶体金，而且颗粒的直径均匀一致，很适合于双标及多标研究。制备3nm、5nm、10nm、15nm的胶体金颗粒见表5-3。

表5-3 鞣酸?柠檬酸三钠还原法

A 液

B 液

直径（nm）1%柠檬酸钠（ml）0.1mol/L

K2CO3ml1%鞣酸（ml）H2O（ml）1%HAuCl4（ml）H2O（ml）

3.340.2411.8179

540.20.715.1179

1040.0250.115.875179

1540.00250.0115.987179

操作步骤：

（1）根据所需要的胶体金颗粒分别配制A液和B液。

（2）将配制好的A、B两液在水浴内加热到60℃，并通过控温装置使温度保持稳定。

（3）在电磁搅拌器上搅拌A液迅速加入B液，继续加热直至胶体金变成葡萄酒色，时间大约7～10min。在A、B两液混合后可见溶液立即变成蓝色，大约1～3 min就变成红色。

用鞣酸?柠檬酸三钠还原法，柠檬酸三钠主要为还原剂，而鞣酸则有双重作用，一是还原作用，二是保护作用，控制“晶核”的形成过程，也就是说鞣酸的用量多少决定胶体金颗粒的大小形成，因此改变鞣酸的用量就可以改变胶体金的颗粒大小，达到制备不同直径颗粒的胶体金之目的。

（五）乙醇超声波还原法（Baigent and Muller 1980）

（1）1%HAuCl4水溶浓0.2ml加入100ml双蒸水。

（2）用0.2molK2CO3调pH至中性，再加入1ml乙醇。

（3）用20KC、125w超声波探头浸入溶液内进行超声振荡，由此法制得的胶体金颗粒为6～10nm。（六）硼氢化钠还原法（Tschopp et al 1982）

（1）将预冷在4℃的40ml双蒸水中加入0.6ml 1%的HAuCl4。

（2）再加入0.2molK2CO3，0.2ml。

（3）在搅拌下，迅速加入新鲜配制的硼氢化钠水溶液（0.5mg/ml）0.4ml,一般重复加入3～5次，直至溶液的兰紫色变为橙红色为至。然后再搅拌5min，获得的金颗粒直径在2～5nm之间。

（七）放射性胶体金的制备方法（Kent and Allen 1981）

（1）取0.01% HAuCl4 上水溶液100ml，加热至沸腾。

（2）加入40μl195Au。

（3）迅速加入4ml1% 柠檬酸三钠水溶液，5～7min出现透明的橙红色。

（4）其含量为I×106脉冲数/min。

（八）微波制备液体金方法。

第四节胶体金的质量鉴定

胶体金制备完毕后须经电镜下质量鉴定才能应用

一、胶体金颗粒直径测定

用预先处理好的覆有Formvar膜的镍网浸入胶体金溶液内，取现放在空气中干燥或37℃烤箱烤干。然后在透射电镜下观察，主要观察金颗粒的大小，符合不符合所需要的颗粒直径，金颗粒是否均匀一致，有无椭圆形及多角形金颗粒存在。理想的金颗粒是大小基本相等，均匀一致，无椭圆形及多角形的金颗粒存在，还可以拍片放大后测量金颗粒直径的大小。

二、胶体金金颗粒均匀度测定

一般需测量100个以上的胶体金颗粒，然后用统计学处理，计算胶体金颗粒的平均直径及标准差，前者反映颗粒的大小，后者说明颗粒是否均匀一致。

三、影响胶体金颗粒大小的因素

如果有较多的大小不等的金颗粒及有椭圆形，三角形金颗粒存在应重新制备。一般造成这种情况的主要原因是在加还原剂的时候不是迅速一次加入，而是多次加入。再者搅拌不均匀，速度太慢没有搅拌起来，造成了颗粒大小不等。制备量的多少，容器的大小，加热的时间等也影响胶体金颗粒的大小。制备了合格的胶体金以后，放在室温或4℃保存。避免低温冻存，因为冻存可导致胶体金凝集，破坏了胶体状态。胶体金在室温避光无灰尘的环境中可放置3个月左右。冰箱内半年左右。根据胶体金的性质，有不稳定和聚沉的可能性，因此，制备完毕后最好在20天以内进行标记。

第五节胶体金标记物的制备

胶体金标记蛋白质的原理，一般认为是由于pH值等于或稍偏碱于蛋白质等电点时，蛋白质呈电中性，此时蛋白质分子与胶体金颗粒相互间的静电作用较小，但蛋白质分子的表面张力却最大，处于一种微弱的水化状态，较易吸附于金颗粒的表面，由于蛋白质分子牢固地结合在金颗粒的表面，形成一个蛋白层，阻止了胶体金颗粒的相互接触，而使胶体金处于稳定状态，如果＝低于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电荷，胶体金带负电荷，二者极易静电结合形成大的聚合物。如果pH高于蛋白质等电点时，蛋白质带负电荷，与金颗粒的负电荷相互排斥而不能互相结合。为防止蛋白质与胶体金的聚合与沉淀，常用牛血清白蛋白，卵白蛋白，聚乙二醇或明胶作稳定剂。用Sephacryb

S?400 （丙烯葡聚糖S?400 ）层析分离纯化胶体金蛋白标记物只适用于以BSA作稳定剂者。

一、待标记蛋白质的准备

（1）透析除盐：蛋白质溶液内应除去多余的电解质，不然过高的盐类物质会降低胶体金颗粒的Zeta电位，影响蛋白质的吸附，因此，标记之前必须彻底除盐。一般将蛋白质置入透析袋中然后直接放入双蒸水或极低浓度的盐水（0.005mol/L NaCl , pH7.0）透析。

（2）去除蛋白质中的沉淀：长期低温保存的蛋白质或4℃较长时间保存的抗体，特别是在浓度高于2mg/ml 的情况下，很容易形成聚合物，聚合物对标记过程及免疫金探针的稳定性有一定影响，因此，标记之前须离心以除去这些聚合物。一般以100000r/min 4℃离心60min取上清液，调整蛋白质浓度至1mg./ml即可用于标记。

二、胶体金pH值的调整

胶体金与蛋白质的结合成功与否，取决于pH值，一般只有在蛋白质等电点（PI）略偏碱的条件下二者才能牢固地结合，因此，标记之前须将胶体金溶液的pH值调至待标记蛋白质的等电点略偏碱。需要提高胶体金的pH值时可用0.1molK2CO3，需要降低胶体金的pH值时可用0.1N HCl。测定金溶液的pH可能损害pH测定计的探头，因此，一般用精密的pH试纸测定其pH即可。

几种常用的蛋白质标记时胶体金所用的pH值见表5-4。

表5-4 常用几种蛋白质标记时胶体金所用的pH值如下

蛋白质pH

抗体（γ球蛋白）9.0

亲合层析的IgG7.6

单克隆抗体8.2

F（ab＇）27.2

SPA(葡萄球菌蛋白)6.0

蓖麻子植物凝血素Ⅰ8.0

蓖麻子植物凝血素Ⅱ8.0

花生凝集素6.3

Helix pomatia lectin7.4

大豆凝集素6.1

Lens Culinaris lectin6.9

Lotus Tetragonolobus lectin6.3

荆豆凝集素6.3

Bandeirae simplicifolia lectin6.2

过氧化物酶8.0

类卵粘蛋白4.8

血浆铜兰蛋白7.0

α-胎球蛋白6.5

小牛血清白蛋白6.5

牛血清白蛋白5.5

牛血球白蛋白结合肽4.5

牛血清白蛋白结合胰岛素5.3

霍乱毒素6.9

破伤风毒素6.9

DNAase6.0

RNAase9.0

低密度脂蛋白5.5

α2-巨球蛋白6.0

抗生物素蛋白（亲合素）10.0

链霉抗生物素蛋白6.6

麦胚凝集素9.9

三、待标记蛋白质最适稳定量的测定

（1）光电比色法：制备一系列不同浓度的等体积蛋白质溶液（1ml），分别加入5ml胶体金中，迅速混匀，然后，各加入1ml 10% NaCl溶液，摇匀，静置5min后测各管。根据胶体金颗粒的大小，OD在520～580nm 之间测定，以OD值为纵坐标，蛋白质用量为横坐标作一曲线，取曲线最先与横轴相接近的那一点处的蛋白质用量为最适稳定量。图5.2中10nm的胶体金溶液中蛋白质的最适稳定量为45μg/ml

（2）目测法：以目测法确定胶体金与待标记蛋白质用量比例，将标记的蛋白质逐级稀释后（由5μg～45μg另设对照管），各取等体积顺序加入一系列装有1ml胶体金的试管中，5min后，在上述各管内分别加入0.1ml 10%氯化钠，依表5-5顺序进行。

表5-5 具体的做法是按表内进行

管数12345678910

胶体金（ml）1111111111

蛋白质（μg）510152025303540450

10%NaCl(ml)0.10.10.10.10.10.10.10.10.10.1

①当分别加入0.1ml 10%氯化钠后、混匀静置2h以上观察结果。

②没有加入蛋白质的管为对照管。

③小于5nm颗粒的胶体金溶液，每个管内应加入5μl33%的双氧水，否则有不变蓝色及聚沉现象。未加蛋白及加入蛋白量不足以稳定胶体金的试管，即呈现由红变蓝的聚沉现象，而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的试管则胶体金的红颜色不变。其中含蛋白量最低的试管即含稳定1ml胶体金的必须蛋白量。在此基础上再加上20%即为稳定所需蛋白质的实际用量。

四、蛋白质的胶体金标记

当蛋白质的最适稳定量及标记的最佳pH值被确定以后便可进行标记。具体步骤如下：

（1）根据用以标记的胶体金的总量计算出所需要的待标记蛋白质的总量。

（2）在电磁搅拌下，将蛋白质溶液加入胶体金溶液中（pH已调至PI超过0.5pH），加入蛋白质时应逐滴加入，1mg的蛋白质大约5min加完。

（3）在磁性搅拌下加入5%的牛血清白蛋白（BSA）使其终浓度为1%，或加入3%聚乙二醇（PEG MW20000）使其终浓度为0.05%,

我们对比了BSA和PEG稳定胶体金的效果，BSA稳定的标记胶体金，放在4℃达2年半仍然保持良好性能，而用PEG稳定的标记胶体金放在4℃1年左右就有分层现象，而且染色效果显著下降。因此，我们认为最好还是用BSA作稳定剂。

（4）将标记好的胶体金装入透析袋中，两头扎紧，放入蔗糖或硅胶中浓缩，浓缩到原体积的1/10量，浓缩完毕后纯化。离心法纯化时，不要浓缩。

五、胶体金标记蛋白质的纯化

标记好的免疫金探针必须经过纯化处理以后才能用于免疫细胞化学染色。纯化的目的是除去其中未标记的蛋白质，未充分标记的胶体金以及在标记过程中可能形成的各种聚合物。

（一）调整与超速离心法

（1）将标记的大于10nm的胶体金溶液选用15000r/min 4℃离心15min，吸出上清，弃去沉淀，以去除大的聚合物。

（2）一般在10nm以上所标记的胶体金均可在调整离心机上离心，小于10nm颗粒的胶体金用超速离心机离心，在4℃离心1h左右，弃上清，将沉淀以原体积的0.02mol./L

TBSpH8.2（内含1%BSA，0.05%叠氮钠）溶解，重复离心2～3次，沉淀溶于原体积的1/10TBS中。4℃保存备用。为了得到颗粒均匀一致的免疫金试剂，上述粗提制剂可用10%～30%蔗糖或甘油溶液作密度梯度离心，分带收集不同大小颗粒的胶体金标记蛋白制剂。

几种免疫金探针离心所用转速（见表5-6），离心纯化时所用转速见表5-7，胶体金的OD值见表5-8。

表5-6 几种免疫金探针离心时所用转速参考表

胶体金颗粒直径（nm）蛋白质时间（min）转速（r）

3.0GAR IgG6030000

5.0GAR IgG5025000

10.0RAM IgG5019000

15.0SPA4017000

15.0ALcc IgG4017000

20.0SPA4013000

25.0SPA3512000

说明：GAR IgG=羊抗兔IgG；RAM IgG=兔抗鼠IgG；ALcc IgG=抗肝细胞癌IgG; SPA=葡萄球菌A蛋白表5-7 几种免疫金探针离心纯化时所用转速

胶体金颗粒（nm）pH蛋白质转速（xg）时间（min）

59.0羊抗人IgG4500045

108.2抗胃癌单克隆抗体4500030

156.5链霉亲和素1200045

206.0SPA1200030

将纯化好的胶体金用0.02mol/L TBS缓冲液作1：20稀释，用520nm测OD值。

表5-8 不同大小胶体金的OD值

胶体金颗粒大小（nm）OD（520）nm

52.5

102.5

153.5

205.0

（二）凝胶过滤法

为纯化免疫金探针的最好方法，其特点是简便，过滤的胶体金颗粒比较均匀，不容易凝集，而离心方法转速高，时间长，胶体金颗粒沉淀容易凝集，用凝胶过滤克服了这一弱点。选用本方法时胶体金溶液必须用牛血清白蛋白作稳定剂。具体操作过程如下：

（1）将浓缩好的胶体金以1500r/min离心去掉大的聚合物。吸出上清待过柱。

（2）柱高34cm,直径1cm,加样体积为柱床体积的1/10。

（3）丙烯葡聚糖S-400（Sephacryls?400 , Pharmacia, Sweden）装柱后用0.02mol/L pH8.2

TBS平衡层析柱（pH7.4者用于标记的SPA），平衡好后，吸取上清胶体金液体加入层析柱内，加样时请注

意不要破坏S?400的界面。

（4）用0.02mol/L pH8.2

TBS洗脱，先行滤出的液体有少量微黄不透亮的液体，紧接着是浓度高红色而透亮的胶体金，注意颜色的变化，如红色变淡，变黄立刻停止收集。如Sephacryls?400没有，也可以用Sepharose ?4B或6B代替（Pharmacia, Sweden）也能收到较好的效果。

六、免疫金探针的鉴定

（1）用有Formvar

膜的镍网沾取金标蛋白溶液，空气中干燥后醋酸铀复染，在TEM下观察，可见金颗粒周围有一明显的空晕，表示颗粒表面吸附有蛋白质分子。

（2）纯化后免疫金探针是否保持很好的生物学活性是判断其质量好坏的主要指标，因此，在使用之前必须对它的特异性，敏感性进行鉴定。鉴定举例，用阳性抗原片，脱蜡至水，胰蛋白酶消化，加第一抗体（多克隆或单克隆），一般过夜再加标记抗同一抗特异性抗体结合的胶体金溶液（多克隆或单克隆抗体标记的胶体金）详细方法步骤见后IgGS法，一般做1：2，1：4，1：8，1：16，稀释SPA-金，做1：10，1：20，1：40，1：80稀释，37℃45min，冲洗，显色，观察结果，染色效价以阳性结果明确，背景浅的稀释度为标准。免疫细胞化学染色试验可以较全面地反应免疫金探针的质量。

胶体金法的定义和分类

胶体金是一种常用的标记技术，是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术，有其独特的优点。近年已在各种生物学研究中广泛使用。在临床使用的免疫印迹技术几乎都使用其标记。同时在流式、电镜、免疫、分子生物学以至生物芯片中都可能例用到。 1971年Faulk 和Taytor将胶体金引入免疫化学，此后免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法，在生物医学各领域得到了日益广泛的应用。目前在医学检验中的应用主要是免疫层析法(immunochromatogra-phy)和快速免疫金渗滤法(Dot-immuogold filtration assay DIGFA)，用于检测 HBsAg、HCG 和抗双链ＤＮＡ抗体等，具有简单、快速、准确和无污染等优点。 免疫胶体金技术的基本原理： 胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，形成带负电的疏水胶溶液，由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。 胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA 等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。 胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌Ａ蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽缀合物等非共价结合，因而在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。 免疫金标记技术(Immunogold labelling techique) 主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中，这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色。

免疫胶体金技术常见影响因素分析

免疫胶体金技术常见影响因素分析 自胶体金作为特殊标记物进行研究以来,建立的各种免疫胶体金技术以其特异性强、灵敏度高、操作简捷等特点,在医学、农牧业、环境及食品检测等领域被广泛应用。免疫胶体金技术的反应过程是一个由金颗粒、抗原与抗体动态结合的反应过程,在这个过程中每个环节的好坏都直接影响试验的成败。而试验过程中每个环节又受到很多因素的影响和制约,下面将影响免疫胶体金技术的因素作一分析,为成功制备胶体金检测产品提供参考。 1耗材的选择 1.1不同型号膜的筛选。硝酸纤维素膜的型号在试验中至关重要,作为反应载体影响到整个试验的成败。不同的生产厂家生产硝酸纤维素膜时使用的聚合物和表面活性剂的来源、类型和数量均大不相同,对生产出的膜的性能产生较大影响——膜的孔径和分布结构不同。膜孔径减小,膜的实际可用表面积递增,膜结合蛋白的量也递增;膜孔径越小,层析速度也越慢,金标复合物通过T线的时间就越长,反应也就越充分;因此膜孔径越小灵敏度越高,但是同时也减慢了跑板速度,增加了非特异性结合的机会,也就是假阳性越高。用于金标免疫快速试验的膜多为硝酸纤维素膜或硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜,不同的包被蛋白对膜有特定要求,试验者应根据蛋白质的性质选择适合孔径大小和分布结构的膜,找到合适的平衡点,使胶体金的标记物在膜上的流动速率为最佳。 1.2结合垫的选择。结合垫位于层析系统的中间,一般要求结合垫的网格均一且非特异性吸附低,能很好地负载胶体金标记物和待检测样品,而不被吸附;玻璃纤维素膜具备以上优点,同时具有一定的硬度,为试验中常用。 1.3样品垫及吸水纸的选择。样品垫和吸水纸位于胶体金免疫层析系统的两端,对于胶体金层析系统功能的实现起着举足轻重的作用。试验中应根据试纸条检测样品的性质选择合适的样品垫和吸水纸,保证样品在样品垫形成的通道中快速地流动而不被非特异性地吸附或者改变样品的性质。如检测样品为血清,则可选择网格较疏松的玻璃纤维素膜即可;如果检测样品为毒素,则可选择质量好的吸水纸和样品垫。吸水纸则要有很好的蓄水能力,保证样品中所用的液体都经过膜的反应区而被样品垫吸收和蓄积。 2关于胶体金的制备 制备颗粒均匀、分散度好的胶体金在金标免疫快速试验中非常关键,如果金颗粒直径的变异范围太大就会影响到试验的稳定性和重复性,如果金颗粒的形状不规则或粒径不均一,使得胶体金标记物容易解离和沉淀而产生金标扩散不完全、反应区底色过深和假阳性现象;而且胶体金质量不好,胶体

免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique)

（2）试剂配制必须保持严格的纯净，所有试剂都必须使用双馏水或三馏水并去离子后配制，或者在临用前将配好的试剂经超滤或微孔滤膜（0.45μm）过滤，以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。 （3）配制胶体金溶液的pH以中性（pH7.2）较好。 （4）氯金酸的质量要求上乘，杂质少。最好是进口的。 （5）氯金酸配成1％水溶液在4℃可保持数月稳定，由于氯金酸易潮解，因此在配制时，最好将整个小包装一次性溶解。 （三）胶体金标记蛋白的制备 胶体金对蛋白的吸附主要取决于pH值，在接近蛋白质的等电点或偏碱的条件下，二者容易形成牢固的结合物。如果胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时，则会聚集而失去结合能力。除此以外胶体金颗粒的大小、离子强度、蛋白质的分子量等都影响胶体金与蛋白质的结合。 1、待标记蛋白溶液的制备将待标记蛋白预先对0.005Mol/L pH7.0 NaCl溶液中4℃透析过夜，以除去多余的盐离子，然后100 000g4℃离心1h，去除聚合物。 2、待标胶体金溶液的准备以0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L HCl调胶体金液的pH值。标记IgG时，调至9.0；标记McAb时,调至8.2；标记亲和层析抗体时，调至7.6；标记SPA 时，调至5.9～6.2；标记ConA时，调至8.0；标记亲和素时，调至9～10。 由于胶体金溶液可能损坏pH计的电板，因此，在调节pH时，采用精密pH试纸测定为宜。 3、胶体金与标记蛋白用量之比的确定 （1）根据待标记蛋白的要求，将胶体金调好pH之后，分装10管，每管1ml。 （2）将标记蛋白（以IgG为例）以0.005Mol/L pH9.0硼酸盐缓冲液做系列稀释为 5μg/ml～50μg/ml，分别取1ml，加入上列金胶溶液中，混匀。对照管只加1ml稀释液。 （3）5min后，在上述各管中加入0.1ml 10％NaCl溶液，混匀后静置2h，观察结果。 （4）结果观察，对照管（未加蛋白质）和加入蛋白质的量不足以稳定胶体金的各管，均呈现出由红变蓝的聚沉现象；而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变。以稳定1ml胶体金溶液红色不变的最低蛋白质用量，即为该标记蛋白质的最低用量，在实际工作中，可适当增加10％～20％。 4、胶体金与蛋白质（IgG）的结合将胶体金和IgG溶液分别以0.1Mol/L K2CO3调pH至9.0，电磁搅拌IgG溶液，加入胶体金溶液，继续搅拌10min，加入一定量的稳定剂以防止抗体蛋白与胶体金聚合发生沉淀。常用稳定剂是5％胎牛血清（BSA）和1％聚乙二醇（分子量20KD）。加入的量：5％BSA使溶液终浓度为1％；1％聚乙二醇加至总溶液的1／10。 5、胶体金标记蛋白的纯化 （1）超速离心法：根据胶体金颗粒的大小，标记蛋白的种类及稳定剂的不同选用不同的离心速度和离心时间。 用BSA做稳定剂的胶体金—羊抗兔IgG结合物可先低速离心（20nm金胶粒用1 200r/min，5nm金胶粒用1 800r/min）20min，弃去凝聚的沉淀。然后将5nm胶体金结合物用6 000g，4℃离心1h；20nm～40nm胶体金结合物，14 000g，4℃离心1h。仔细吸出上清，沉淀物用含1％BSA的PB液（含0.02％NaN3），将沉淀重悬为原体积的1／10，4℃保存。如在结合物内加50％甘油可贮存于-18℃保存一年以上。 为了得到颗粒均一的免疫金试剂，可将上述初步纯化的结合物再进一步用10％～30％蔗糖或甘油进行密度梯度离心,分带收集不同梯度的胶体金与蛋白的结合物。

几种胶体金技术详解

胶体金免疫分析技术详解 随着免疫分析日益广泛应用于以临床为主以及非临床领域的诊断工业，免疫分析正在向两个方向发展：一类为全自动化的免疫分析；另一类为以硝酸纤维膜为载体的快速免疫分析。前者需要价格昂贵的全自动仪器及与仪器严格配套的各种试剂盒，目前只能在医疗及检测中心应用，虽也能较快速给出结果，但仍需一定时间，不适合远离医疗及检测中心的地区，更不能用于“患者床旁检验”和普查的需要，在酶免疫分析的基础上，主要以硝酸纤维素膜为载体的快速诊断方法迅速和广泛地发展起来。这类方法目前在文献及市场上的命名还很不统一。它实际上属于快速斑点免疫结合分析，主要有以下两种方法：斑点免疫渗滤分析DIFA和斑点免疫层析分析DICA。本篇主要介绍以金作为标志物的胶体金免疫分析技术。 金标记免疫分析技术也称免疫胶体金技术，是于1971年建立的一种信号显示技术。此技术最初用于免疫电镜检查，由胶体金颗粒标记抗原或抗体，与组织或细胞中相应的抗体或抗原相结合，在电子显微镜的检查时可起特异的示踪作用。此后，此技术与银染技术相结合建立的免疫金银染色法，使抗原抗体特异反应信号可在光学显微镜下观察。近10多年来，利用硝酸纤维素膜（NC）等为固相载体，以胶体金标记的抗原或抗体与特异配体的反应在膜上进行，建立了快速的金标记免疫渗滤技术和金标记免疫层析技术，并在传染病、心血管病、风湿病、自身免疫病的免疫学检测中广泛应用。 胶体金是指金微小粒子（0-100nm）分散在另一种物质中所形成的体系，通常指金以微小粒子分散在溶液中所形成的金溶胶，用此金溶胶标记蛋白质（抗原、抗体或SPA、SPG），胶体金颗粒具有高电子密度的特性，故在金标蛋白的抗原抗体结合处，显微镜下可见黑褐色颗粒；当这些标记物在相应的标记处大量聚集时，可在载体膜上呈现红色或粉红色斑点，从而用于抗原或抗体物质的半定量或定性。 与ELISA不同之处便是反应时间大大缩短，仅需要数分钟就完成了ELISA需数小时才能显示的结果。因为在GIFA和GICA中，高浓度的抗体集中固定在纤维素的微孔中，待测抗原在渗滤或层析时，流经微孔与固定的高浓度抗体紧密接触，很快完成免疫结合反应。这就是以膜为基础的胶体金快速免疫结合分析中的免疫浓缩作用。在ELISA中，待测抗原要在液相中经过扩散作用，逐渐与吸附在固相表面的抗体结合。同时，标记抗体也需要同样的扩散结合过程形成抗体-抗原-标记抗体复合物，故需时间较长。故此技术做到了名副其实的POCT。 原理： 将氯金酸（HAuCl4）用还原法制成一定直径的金溶胶颗粒（胶体金），标记金黄色葡萄球菌A

简明免疫胶体金技术流程

胶体金标记技术 胶体金是一种常用的标记技术，有其独特的优点。近年已在各种生物学研究中广泛使用。在临床使用的免疫印迹技术几乎都使用其标记。同时在流式、电镜、免疫、分子生物学以至生物芯片中都可能利用到。 1971年Faulk 和Taytor将胶体金引人免疫化学，此后免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法，在生物医学各领域得到了日益广泛的应用。目前在医学检验中的应用主要是免疫层析法(immunochromatogra-phy)和快速免疫金渗滤法(Dot-immuogold filtration assay DIGFA)，用于检测 HBsAg、HCG 和抗双链ＤＮＡ抗体等，具有简单、快速、准确和无污染等优点。 （一）基本原理 免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。 胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。 （二）胶体金的制备 胶体金的制备一般采用还原法，根据不同的还原剂可以制备大小不同的胶体金颗粒。常用来制备胶体金颗粒的方法如下： 1．枸橼酸三钠还原法 （1）10nm胶体金粒的制备：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加入1％枸橼酸三钠水溶液3ml，加热煮沸30min，冷却至4℃，溶液呈红色。 （2）15nm胶体金颗粒的制备：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加入1％枸橼酸三钠水溶液2ml，加热煮沸15min～30min，直至颜色变红。冷却后加入0.1Mol/L K2CO30.5ml，混匀即可。 （3）15nm、18nm～20nm、30nm或50nm胶体金颗粒的制备：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加热煮沸。根据需要迅速加入1％枸橼酸三钠水溶液4ml、2.5ml、1ml或0.75ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒则分别为15nm、18～20nm、30nm和50nm。 金溶胶颗粒的直径和制备时加入的柠檬酸三钠量是密切相关的，保持其他条件恒定，仅改变加入的柠檬酸三钠量，可制得不同颜色的金溶胶，也就是不同粒径的金溶胶，见表1。 2．鞣酸-枸橼酸钠还原法 用此混合还原剂可以得到比较满意的金溶胶 A液：1％HAuCl4水溶液1ml加入79ml双馏水中混匀。 B液：1％枸橼酸三钠4ml，1％鞣酸0.7ml，0.1Mol/L K2CO3液0.2ml，混合，加入双馏水至20ml。

免疫胶体金

第六节免疫胶体金技术 (Immune colloidal gold technique) 一、概况 （一）原理 免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。 胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。 （二）胶体金的制备 根据不同的还原剂可以制备大小不同的胶体金颗粒。常用来制备胶体金颗粒的方法如下。 1．枸橼酸三钠还原法 （1）10nm胶体金粒的制备：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加入1％枸橼酸三钠水溶液3ml，加热煮沸30min，冷却至4℃，溶液呈红色。 （2）15nm胶体金颗粒的制备：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加入1％枸橼酸三钠水溶液2ml，加热煮沸15min～30min，直至颜色变红。冷却后加入0.1Mol/L K2CO30.5ml，混匀即可。 （3）15nm、18nm～20nm、30nm或50nm胶体金颗粒的制备：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加热煮沸。根据需要迅速加入1％枸橼酸三钠水溶液4ml、2.5ml、1ml或0.75ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒则分别为 ? 1 ?

免疫胶体金检测

胶体金免疫试纸技术在食品兽药残留检测中应用 摘要：动物产品中兽药残留是威胁人体健康和影响畜产品质量安全的重要因素。虽然检测兽药残留的方法很多，但皆因其设备昂贵、操作繁琐、费时而受到限制。而胶体金免疫层析技术因其快速、灵敏、简便等特点，在兽药残留检测中广泛研究与应用。论文就胶体免疫层析法的原理，在兽药残留检测中研究应用以及发展前景做了较为详细的阐叙。 关键词：胶体免疫层析法；兽药残留；检测 引言 在残留毒理学意义上比较重要的兽药，按照用途主要有抗微生物类、驱虫类、抗球虫和抗原虫药物、抗生素类生长促进剂、合成代谢荷尔蒙类生长促进剂等[1]。目前，国际上通用的兽药残留检测方法是先采用一种简便的方法对待检样品进行快速初筛，再采用准确性更高的方法对初筛为阳性的样品进行确证分析[2].国内食品受兽药污染问题严重，国家和政府对此已做了大量的投入，但执行情况仍不尽人意，造成该现象的主要原因之一是缺乏快速、灵敏、简便的检测方法[3]。薄层层析、ELISA法、高效液相色谱、质谱检测技术，由于上述方法需借助仪器设备来完成检测过程时间较长不适宜现场快速检测。近年来，胶体金免疫层析法因操作简单，不需辅助仪器和试剂，3~5分钟出结果，并可肉眼判断等特点。因此它在大批量兽药残留现场和初筛检验中得到研究与应用。 1胶体金免疫层析法 胶体金(colloidal gold)是氯金酸( chloroauricacid)的水溶液，是氯金酸在还原剂如白磷、柠檬酸三钠等的作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定胶体溶液。由于胶体金颗粒具有高电子密度的特性,且颗粒聚集达到一定密度时，出现肉眼可见的粉红色斑点，因而可以作为免疫层析试验的指示物。因此胶体金免疫层析法是一种以胶体（红色）作为示踪标记物[4]。让其与蛋白质等各种大分子物质结合，再利用抗原抗体反应以达到检测目的的一种新型的免疫标记方法。GICA主要包括夹心法和竞争抑制法，夹心法包括双抗体夹心法测抗原和双抗原法测抗体，主要用于病毒、细菌和寄生虫等的检测[5]。竞争抑制法主要用于兽药残留、类固醇、农药等小分子（抗原）的检测[6]。 1.1胶体金试纸条 胶体金试纸条一般由样品垫、金标垫、层析膜、吸水垫四部分组成。层析材料有硝化纤维膜（NC）、聚酯膜、尼龙膜和PVDF膜等，根据试验需要可选择不