这是怎么做到的？Cancer Cell重磅：直接将mRNA转染到T细胞,可强效杀灭肿瘤!

这是怎么做到的？Cancer Cell重磅：直接将mRNA转染到T细胞，可强效杀灭肿瘤！APExBIO

白介素12（IL-12）是一种细胞因子，具有很强的抗肿瘤活性。常用的方法是利用逆转录病毒作为载体将IL-12 DNA转染到T细胞中以发挥抗肿瘤功效，然而临床结果证实会带来严重的毒副作用。近日，国际著名期刊《Cancer Cell》报道了一篇名为“Intratumor Adoptive Transfer of IL-12 mRNA Transiently Engineered Antitumor CD8+ T Cells”的文章。来自西班牙应用医学研究中心（CIMA）的研究团队，在体外合成了IL-12 mRNA，通过电穿孔转染到CD8 + T细胞后可瞬时表达IL-12。小鼠双侧接种肿瘤，单侧肿瘤内注射而非静脉内注射IL-12 mRNA工程化T细胞，显著杀灭双侧肿瘤。当IL-12 mRNA与CD137L mRNA共转染到T细胞后，疗效进一步增强。将小鼠和人肿瘤浸润性T淋巴细胞培养物进行瞬时IL-12 mRNA转染，可达到明显的免疫治疗效果。该研究证实了利用mRNA治疗肿瘤的强大效果。

▲Cancer Cell. November 21, 2019.

▲利用IL-12 mRNA杀灭肿瘤（肿瘤内注射IL-12mRNA工程T细胞可杀灭局部和远处肿瘤，当与抗CD137 mAb共注射或CD137L mRNA共电穿孔后可提高疗效）。白介素12（IL-12）是由两个独立的基因IL-12A（p35）和IL-12B（p40）编码的异二聚体细胞因子。当IL-12结合其受体时，构象变化导致位点磷酸化，通过Jak-STAT途径激活信号级联，刺激CD4 +和CD8 + T细胞以及自然杀伤（NK）细胞产生干扰素γ（IFN-g）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α），从而增强抗癌免疫力。CD137（也称为4-1BB）是肿瘤坏死因子（TNF）受体家族的成员，表达在活化的T细胞表面，是一种T细胞共刺激分子。通过连接其天然配体CD137L或用CD137激动性单克隆抗体激活CD137，能提供共刺激信号激活T细胞，使T细胞活化增殖并分泌细胞因子。（T细胞需要两个信号才能完全激活。第一信号，是抗原特异性的；第二信号，是共刺激信号，是非抗原特异性的。）该团队在体外合成了带帽（cap）的体外转录（IVT）IL-12 mRNA。通过电穿孔将IL-12 mRNA转染到OT-1 TCR转基因小鼠CD8 + T

细胞中。转然后6小时检测到了高水平的IL-12细胞内表达，并且在培养上清液中检测到IFN-g的产生，说明表达的IL-12具有功能活性。

▲体外转录的单链IL-12（scIL-12）mRNA。

▲转然后导致细胞内高水平的IL-12p40染色。

▲ELISA测定组织培养上清液中IFN-g的分泌。转然后6小时检测到IFN-g的产生，在72小时达到峰值。在小鼠双侧接种了表达OVA的B16黑色素瘤细胞（B16OVA），并将OT-I细胞两次注入右侧肿瘤病变中。IL-12工程化的OT-1细胞发挥了强大的双侧抗肿瘤作用。当IL-12工程化OT-I细胞与抗CD137 mAb一起注射后，抗肿瘤作用更加强大。

▲小鼠肿瘤细胞和IL-12工程化T细胞接种时间。

▲IL-12 mRNA工程化的T细胞显著减小肿瘤体积和提高存活率。与抗CD137 mAb共递送后，疗效更强。为了进一步评估疗效，研究人员分别对B16OVA肿瘤细胞和工程化T 细胞进行荧光标记，接种到小鼠后，用活体显微镜观察。发现跟对照相比，表达scIL-12的OT-I细胞诱导更多的肿瘤细胞凋亡，并且在肿瘤微环境中的传播速度更快。

▲活体成像显示IL-12 mRNA转染OT-1 T细胞后增强的肿瘤细胞凋亡和T细胞活性。B16OVA 核形态（H2bmCh，仅红色）以及OT-1细胞（GFP，仅绿色）和多克隆CD8 T细胞（GFPxRFP，黄色）。每个图像中的圆圈代表凋亡的肿瘤细胞核。为了简化激动性抗CD137抗体的局部给药，该团队在体外合成了编码CD137L的mRNA并电穿孔到活化的OT-1细胞中，CD137L在细胞表面瞬时表达并且具有功能活性。

▲CD137L mRNA转染到T细胞后使其表面的CD25的表达上调，线粒体含量和线粒体跨膜电位增加。当CD137L和IL-12 mRNA共电穿孔到T细胞后，与抗CD137 mAb的肿瘤内共注射相比效果更强，肿瘤几乎完全消退。

▲CD137L和IL-12 mRNA的共转染具有更强的治疗效果。

肿瘤组织中存在浸润的T淋巴细胞——TILs，该团队从B16-OVA和MC38肿瘤中分选出CD8 TILs。培养10天后，用IL-12 mRNA电穿孔。电穿孔的TILs可用于瘤内治疗带有MC38或B16OVA双侧肿瘤的小鼠。

▲IL-12 mRNA电穿孔的肿瘤浸润性T淋巴细胞（TILs）具有显著的免疫治疗效果。如果将IL-12 mRNA转染到来源于人的TILs培养物中呢？研究团队体外合成了人scIL-12 mRNA，其可以电穿孔进入（黑素瘤，肾细胞癌，卵巢癌和子宫内膜癌）患者TILs培养物中，并可以诱导细胞内人IL-12p40的表达和大量IFN-g的产生。这些IL-12 mRNA TIL培养物可用于肿瘤内治疗PDXs（患者来源的异种移植）。

▲IL-12 mRNA可用于PDXs模型。

原始论文：Intratumor Adoptive Transfer of IL-12 mRNA Transiently Engineered Antitumor CD8+ T Cells. Cancer Cell. November 21, 2019.