miRNA的研究进展
miRNA在病毒感染诱发的免疫反应研究进展
摘要：miRNA的发现给生物医药领域的研究带来了巨大的价值。miRNA通过结合mRNA引起基因转录后沉默，达到调控基因表达的目的。研究病毒感染细胞的miRNA表达谱是否可作为一种新的策略治疗病毒感染导致的疾病，本文就RNA 病毒与miRNA、miRNA与RNA病毒的复制、病毒与细胞miRNA这三个方面的研究进展进行综述。
关键词：miRNA, 病毒RNA，细胞miRNA，病毒miRNA
1.miRNA的简介
成熟miRNA是一条长约18-24nt的单链RNA，并由前体miRNA加工而成。miRNA具有亚型，A.thaliana miRNA有稳定的miRNA亚型，比其本身多1-2个核苷酸。miRNA亚型与miRNA共表达，常常显示为差异argonaute 复合物联系。这些亚型是由父母剪接体miRNA的差异剪切形成的[4]。miRNA首先在RNA 聚合酶II的作用下转录出前体miRNA，再经过Dicer加工，形成22nt的成熟miRNA。成熟的miRNA将与RNA沉默复合体(RISC）相结合。其中，RISC是由miRNA和mRNA靶点、Argonaute蛋白家族成员和辅助因子组成[1]。其作用机理是miRNA与靶mRNA 3’-UTR内的靶序列互补配对，调节靶基因的表达[2]。并且，一般不完全的互补配对导致靶基因的翻译受到抑制。miRNA介导的翻译抑制或mRNA降解有可能在一种P小体中进行[3]。
真核生物基因组转录的98%是非编码RNA，占这么大比例的非编码RNA参与基因表达调控（101）。miRNA参与多个生物过程，包括，转录、染色体结构、RNA形成和修饰、mRNA稳定性和翻译、以及蛋白稳定性和转运（12.，30,34）。
2.RNA病毒可以产生miRNA
miRNA是由22个碱基组成的非编码RNA。其最主要的生物功能就是引起转录后基因沉默和调控基因表达。目前，已有上百种保守细胞和病毒衍生的miRNA被识别和分离，发现miRNA对细胞转录组和病毒生命循环都具有调节作用。且发现在病毒衍生的miRNA探测中目前仅局限于DNA病毒的研究，造成一个RNA病毒不可能利用miRNA参与转录调控的假象。因此，将RNA病毒不
产生miRNA这一现象归因于在复制上的限制，复制限制是随着基因组发夹的RNaseIII的过程而发生。3经过修饰的传染病毒A可以表达细胞水平的microRNA-124，microRNA发夹插入核外输出蛋白的内含子中，microRNA转录导致内源基因加工和功能miRNA-124的产生。这一研究表明，RNA病毒基因组整合一个发夹，不会使基因片段不稳定，也不改变miRNA介导的基因组靶位。因而，RNA病毒能够产生miRNA，并对病毒复制没有负面影响。
3 RNA病毒在宿主细胞中的复制
已有大量文献报道，病毒感染会显著影响细胞水平的miRNA表达，RNA病毒可与细胞miRNA直接互作或间接影响细胞miRNA的表达，从而达到放大RNA 病毒复制的潜能。已有研究显示病毒svRNA参与基因的复制，并可作为发现新药的靶标(文献)。1.svRNA通过与病毒多聚酶装置的互作影响流行病毒A从转录到复制的转换。敲除svRNA对mRNA和cRNA有轻微的影响。但是，会导致vRNA以片段特异性的方式急剧丢失，影响病毒基因组的保守性复制[1]。许多研究表明流行病毒A中svRNA的生物合成和分子特征的像细胞，可以利用RNA 进行核酸与蛋白质水平的联系，诸如剪接，端粒保持，翻译。
svRNA的合成，RdRp具有切断vRNA片段和从RNA合成svRNA的功能。产生svRNA的快速方法是切断svRNA，但是svRNA的切断会破坏基因组模板，对病毒的生命循环是致命的。替代方法是cRNA合成svRNA，并且cRNA以独立于svRNA的方式产生。病毒从转录到复制的转换，关键在于cRNA的稳定性，这个结果可以由阻断svRNA主要导致vRNA的选择性丢失支持[27]。svRNA独立于cRNA的合成，也可由NP功能的研究支持，NP积聚与病毒从转录到复制转换有关，NP暂时阻断panhandle的二级结构，完整的cRNA才得以合成[48]。NEP/NS2[38]和结合svRNA的RdRp组成RdRp复制酶，转录酶是缺乏svRNA。
svRNA具有8种不同RdRp复制酶，并以片段特异的方式调控vRNA。在复制酶结构中，RdRp与svRNA的物理联系促使以片段特异性方式指导反式启动子的继续，并一直延伸到基因组的末端。相反，在病毒mRNA的合成中，由于RdRp 顺式结合于vRNA模板的5末端，转录酶中也不存在svRNA促使5端形成polyA 尾巴结构。
4．病毒感染后细胞miRNA的表达谱变化
病毒感染后细胞miRNA表达谱发生变化，变化的细胞miRNA可促使宿主产生抗病毒防御也可促使宿主产生抗病毒因子，导致细胞环境发生改变。Dicer参与细胞miRNA的成熟，敲除掉dicer的小鼠对VSV特别敏感，至少部分原因是由于miR-24和miR-93表达的缺失（18）。细胞被病毒感染，细胞miRNA表达谱发生改变，在VSV感染BHK细胞中，28个miRNA持续应答VSV感染，12个miRNA下调，16个上调。同时发现miRNA的不仅发生在免疫细胞中，也发生在宿主的其他细胞中。其中上调的miR-706通过降低caspase-3 and -9的活性抑制VSV诱导的凋零（200）。
病毒感染后细胞miRNA表达谱发生变化中，一部分是介导宿主免疫反应起到抗病毒效应，一部分是被病毒感染造成的负效应。EBV的miRNA研究显示，miRNA-155和EBV可诱使B细胞miR-146a的表达（34）miR-146a作用于LPS 激活的复合物（TLR信号途径的TRAF5和IRAK1），形成一个负反馈环以抑制免疫反应[103]。LatencyIII, EBV LMP1激活miR-146a启动子后，可使miR-146a 诱导IFN应答基因表达的下降[21]。LMP诱导miR-29b，miR-29b导致miR-29b 介导的TCL1基因的下调，TCL1在细胞生存和增值方面发挥功能，LMP1是EBV 编码miRNA的靶蛋白。因此，EBV可能协调病毒和细胞miRNA，改变抗病毒IFN信号及扩大感染细胞的存在。p53和Rb途径调控细胞miRNA表达，且由于Oncogenic human papillomaviruses可编码E6 和E7两种病毒蛋白抑制p53和Rb 途径，因而上述两种蛋白会间接影响细胞miRNA的表达。例如，E6可抑制miR-34a 的表达下调，从而诱导细胞的生长[101]。Laminin5 3(LAMB3)是miR-218的靶蛋白，在HPV-16感染的细胞中，E6会使miR-218的表达下降,促使LAMB3的表达上升。并且，经HPV-16感染的细胞可能诱使细胞转移和发生癌变。病毒是否直接作用于细胞miRNA的生物合成干扰宿主的抗病毒防御。腺病毒VA的RNA，与细胞前miRNA竞争在核分布的Exporting，进而抑制细胞质中Dicer的功能，干扰miRNA的合成（2,59,105）。病毒也可能通过自身miRNAs的表达影响细胞miRNA 的表达。在感染期间，KSHV和mCMV的miRNAs是主要的miRNA（31,94）。病毒可能表达蛋白或RNA选择性抑制特异miRNA功能。hCMV感染下调miR-100和miR-101（调控mTOR信号的复合物），mTOR信号途径控制一系列关键细胞功能，包括代谢、生长和生存。因此病毒感染影响细胞miRNA表达的表达调控，有利于病毒进一步控制细胞的关键信号途径，达到病毒最大的感染效应。
病毒感染后细胞miRNA表达谱发生变化中，一部分是介导宿主免疫反应起到抗病毒效应。细胞被病毒感染，细胞miRNA表达谱发生改变，在VSV感染BHK 细胞中，28个miRNA持续应答VSV感染，12个miRNA下调，16个上调。同时发现miRNA的不仅发生在免疫细胞中，也发生在宿主的其他细胞中。其中上调的miR-706通过降低caspase-3 and -9的活性抑制VSV诱导的凋零。Huang等报道（2007）人类的5个miRNAmiR-28,125b,150,-382结合HIV转录体的3’末端，导病毒在CD4+T细胞的溶原。武汉等研究发现，IFN激活导上调抗HIVmiRNA的表达这个结果与IFNI介导细胞miRNA是一种抗病毒机制相一致。宿主细胞抗病毒感染的特征是CIS蛋白（cytokine-inducible Src homology 2）和SOCS(suppressors of cytokine signaling )的表达。Cryptosporidium parvum感染导致miR-98下调，而miR-98的靶向SOCS和CIS，miR-98对这两种蛋白的翻译抑制效应降低，这两种蛋白的表达上调，可能与表皮细胞应对微生物感染所做出相应的调控相关[29]。并参与上皮抗微生物反应的调控。继续研究miRNA在体内上皮抗C.parvum免疫中的作用是很有意义的。
最近研究报道，mCMV感染导致miR-27ade 的快速下调（15）。前miRNA加工和miR-27a的水平没有受到显著影响，表明成熟miRNA是mCMV的靶标。利用miRNA 模拟物过表达miR-27a降低病毒titers,说明miR-27a或miR-27a调控的基因会抑制mCMV生活周期的某些方面。因而，病毒对特异细胞miRNA的抑制有利于病毒的复制。
5. 细胞miRNA对病毒的影响
miRNA结合mRNA后的结果是基因翻译抑制或mRNA被降解，miRNA也可以把病毒的RNA当成靶标。已有研究报道，293T细胞的miR-32可以抑制I型primate foamy病毒，而miR-24和miR-93可以作用于感染小鼠的VSV的RNA（55,69）。敲除Dicer导致VSV感染的高敏感型（69），P体和miRNA生物合成元件提高了HIV1病毒的生成。这些都显示miRNA在病毒复制中的负面效应（23,67,92）。P 体是通过miR-29a作用于HIV1RNA来限制病毒的复制，进而限制病毒的繁殖。RNA病毒利用宿主细胞miRNA作用于病毒RNA的这一特性，完成病毒RNA的合成与装配。其作用机理及机制是如何实现，需进一步研究验证。
RNA干扰好比是基因组的免疫系统，保护基因组免受有害DNA或者病毒的干扰（100）。在哺乳动物体细胞内，SiRNA指导的基因沉默不能成为一种抵制病毒感染的方法（30.93），但是内源RNA干扰抗病毒反应是基于蛋白水平的一种更高级IFN系统，可由细胞内dsRNA感受器（PKR，PIG-I和MDA-5）的激活所诱发。miRNA的表达与型IFN的刺激相联系。HCV感染促使IFN 上调后，并会快速下调miR-196、miR-296、miR-351、miR-431、miR-448等(71)。细胞miRNA可能抑制病毒复制，导致病毒周期的下调，也可能是一种固有的抗病毒免疫反应。RNA 病毒可能拥有miRNA位点是抑制病毒周期的关键，目前仍未阐明。miRNA的靶标鉴定在此显得非常重要，预测miRNA有多重靶基因，但是在实验方面的鉴定还是相当欠缺的，对这个问题的解决增加了困难。
上述miRNA可以抑制HCV的复制，并直接作用于HCV基因组而。miRNA的抑制可能对病毒诱发疾病的治疗，产生新的思路和方法（54）如果miRNA会影响机体免疫机体的激活或抑制，那么机体感染病毒后，病毒miRNA会影响机体的免疫激活，导致机体的免疫失败，这也是在病毒感染的机体中出现的症状，究其机制如何还是未解。（100）
7.展望
病毒感染造成宿主细胞miRA表达谱变化，一部分是利于病毒自身，一部分是宿主的主动反应，这些miRNA病毒因子激活或抑制细胞miRNA的功能与宿主主动反应造成miRNA的改变，两者较难区分。例如某某文献报道，hCMV对 miR-100和miR-101抑制，是通过病毒因子的抑制还是由于宿主对病毒反应而导致miRNA的下调，两者是很难区分。还有待进一步研究。一部分是宿主的主动反应的细胞miRNA，作用可能是抑制病毒复制，可能是一种固有的抗病毒免疫反应，这些问题还得继续研究。
在哺乳动物体细胞内，SiRNA指导的基因沉默不能成为一种打败病毒感染的方（30.93），但是内源RNA干扰抗病毒反应是一种更高级的基于蛋白水平的IFN 系统，可由细胞内dsRNA感受器（PKR，PIG-I和MDA-5）的激活所诱发。miRNA的表达与I型IFN的刺激相联系。HCV感染上调IFN ，迅速下调miR-196、miR-296、miR-351、miR-431、miR-448等（71）。
这些miRNA可以抵抗HCV的复制并能直接作用于HCV基因组导致病毒周期的下调。RNA病毒是否能保持拥有miRNA位点是抵抗病毒周期的关键，到现在为仍然是个迷惑。miRNA的抑制可能是一种有前途的病毒诱发疾病的治疗新策略（54）。
主要参考文献：
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