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蛋白质纯化实验服务

蛋白质纯化实验服务

实验技术:双向电泳(two-dimensional electrophoresis)是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合,即先进行等电聚焦电泳(按照pI分离),然后再进行SDS-PAGE (按照分子大小),经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。[晶莱生物]

实验操作流程:

1、样本制备

2、固相预制胶条水化

3、第一向等电聚焦(IEF)

4、胶条平衡

5、第二向SDS-PAGE电泳

6、凝胶染色检测

7、图片扫描

实验注意事项:

客户提供:

1、原样(组织、细胞、菌体等)湿重不少于200mg。

2、蛋白提取物,浓度不少于4ug/ul,总量不少于5mg。

3、寄样须知:样品需低温保存,用干冰保存快递。

交付标准:

1、双向电泳电子图片及定量分析结果,包括差异点号码、差异倍数。

2、差异点的一级质谱或二级质谱峰图,质谱鉴定结果,包括pI和MW等。

3、双向电泳完整的实验步骤、使用仪器、软件检索参数等。

一、仪器设备

色析管柱(Pharmacia C column, 1.6×100 cm)、铁架、铁夹及水平仪;部分收集器(fraction collector, 需准备干净试管约100 支);浓缩用离心机(低速5,000 rpm);浓缩用离心管Centriprep-30 (Amicon 4322)请注意其使用方法。

二、药品试剂

胶体Sephacryl S-300 (Pharmacia):a. 预先以缓冲液buffer A-150 平衡好,并且使完全沈降后的胶体体积,占全部体积的七至八成;要先预估好胶体的使用量。b. 胶体温度要与操作场所的温度一致,否则温度变化会产生气泡。c. Sephacryl 系列胶体有相当大的吸附力,因此要在缓冲液加入0.15 M 以上的NaCl 以除去非专一性吸附。Buffer A-150:注意使用时的温度要与管柱胶体的温度一致标准分子量组合(Bio-Rad 151-1901):溶于1 mL 后每组取0.4 mL.含有thyroglobulin (670 kD), bovine gamma globulin (158 kD), chicken ovalbumin (44 kD), equine myoglobin (17 kD), vitamin B12 (1 350)

三、管柱装填

1.以纯水冲洗玻璃管柱(以纯水上下冲洗即可,严禁使用试管刷);并请了解

管柱的构造与拆装方法,垂直架好管柱,以软管连接部分收集器,并以

bufferA-150 试看管路是否通畅;可以用止血钳或长尾文书夹夹住出口软管,则可控制溶离的进行。注意系统的摆设要适当,不要装置于交通要冲。

2.依预估量取出Sephacryl 胶体,注意胶体的温度与缓冲液是否已平衡;将瓶中的胶体上下震荡,使的完全悬浮,但勿产生太多气泡。

3.在管柱内加入约10 cm 高缓冲液,然后将胶体慢慢沿着管壁倒入管柱,一直加到管柱顶端,开始流洗后胶体沈降很快。当胶体上方的液面逐渐降低时,可于顶端添加胶体,以达所要高度;胶体高度约90 cm。

4.胶体完全沈降后,小心以buffer A-150 加满管柱,关闭出口,装上顶端端盖并连通缓冲液瓶,打开出口以重力流洗。调整缓冲液瓶高度,使流速约每五~六秒一滴,并设定收集体积为2.5 mL/tube。

5.胶柱流洗约100 mL 后,关闭出口,拆开顶端端盖,先以滴管吸出胶体上方的溶液到剩约1 cm 高,注意勿破坏胶体表面平整;然后打开出口,使液面下降至胶体面,再关闭出口,准备注入样本。

四、样本色析进行

1.以微量移液器或滴管吸取样本(样本体积不得超过胶体总体积的3%),沿着胶体上方管壁缓慢加入,注意切勿破坏胶体的平整表面!(样本确实体积 _______ mL)

2.打开出口,同时开启部分收集器;当样本完全没入胶体时,关闭出口,缓缓加入与样本相等体积的buffer A-150,打开出口待其慢慢进入胶体中,如此重复二次。不得扰动胶体表面,造成凹陷。

3.暂时关闭出口,将液面高度加满至管柱顶端,并把顶端端盖锁上;然后打开出口开始溶离,调整缓冲液瓶的高度,使流速为6 s 一滴。

4.要留心观察前面几个分划,确定整个系统运转无碍,小心部分收集器最容易出问题。管柱预计将流洗过夜,收集约80 管。

5.收集GUS 活性区,以Centriprep-30 浓缩至10 mL 后,加buffer A-0 稀释至20 mL,再次浓缩至 _______ mL (GF),保留100 μL。

6.管柱请再以buffer A-150 流洗100 mL 后,小心放置一旁,准备以后进行分子量测定。

五、分子量测定

1.进行分子量测定前一天,请先以buffer A-150 流洗100 mL,并检查胶柱内有无气泡产生,若有严重的气泡或干裂,必须重新装填管柱。

2.取标准分子量溶液0.4 mL,加上纯质目标酶0.5 mL (以亲和层析法所得的AF 部份),如上法注入管柱中,立刻开始进行胶体过滤,并收集各分划。请依循上述所有管柱及分划收集器的操作要点。

3.收集所得,进行蛋白质定量分析,可定出数个蛋白质尖峰,以作为分子量依据;另以目测法,决定红色高峰的管数,则可定出vitamin B12的溶离管数。利用以上数据,可画出分子量与溶离管数间的直线关系,作为分子量判定的标准校正线。

4.同样的一批分划,请进行酶活性分析(GUS),则可定出酶的溶离体积,对照上述标准校正线,则可求出酶的分子量。

六、拆除管柱及保存胶体

1.若管柱长期不用,应当自管柱中取出胶体,以缓冲液清洗后,置冷藏室中保存,但绝对不要放在冷冻箱中。胶体若装填太紧,有时可能不易取出,要有耐心地以缓冲液慢慢冲出来。

2.胶体可以加0.01% NaN3防止霉菌生长,但使用前记得要洗去;再度使用时,请检查胶体中有无灰黑色霉菌颗粒,若有结块而不易打散者,也不要使用。

蛋白质的分离纯化方法

(1)根据分子大小不同进行分离纯化。蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。

(2)根据溶解度不同进行分离纯化。影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。

(3)根据电荷不同进行分离纯化。根据蛋白质的电荷即酸碱性质不同分离蛋白质的方法有电泳和离子交换层析两类。电泳是在外电场的作用下,带电颗粒(如不处于等电点状态的蛋白质分子)将向着与其电性相反的电极移动的现象。聚丙烯酰胺电泳是一种以聚丙烯酰胺为介质的区带电泳,常用于分离蛋白质。离子交换层析是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。

(4)利用对配体的特异亲和力进行分离纯化。亲和层析是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力建立起来的一种有效的纯化方法。近年来,亲和层析技术被广泛应用于融合蛋白的分离纯化上,因为融合蛋白具有特异性结合能力。但是在实际工作中,很难用单一方法实现蛋白质的分离纯化,往往要综合几种方法才能提纯出一种蛋白质。理想的蛋白质分离提纯方法,要求产品纯度和总回收率越高越好,但实际上两者难以兼顾。随着生物分离技术的发展、新的生物分离技术的不断出现,为蛋白质的分离纯化提供了许多新的方法和途径。