Western blot

蛋白免疫印迹流程

2016.09.25

注意事项：

1.蛋白印记实验的步骤及需要注意的细节繁多、耗时长，稍有懈怠或疏漏都会

导致实验结果的不佳或失败，因此要特别的认真仔细，心细如丝，并保持这一状态至最后，这也是恒心、韧劲、精力集中的良好训练。细节决定成败！

2.蛋白印记实验的目的是获得充分分离的、充分转膜的、均匀干净的（sharp）

目的蛋白条带，能充分反映实际蛋白水平并可进行后续统计学分析的显色成像结果。所有的实验细节都是围绕这个中心目的进行的。

3.试剂：试剂质量达标、称量准确；缓冲液PH值正确、保质。

4.玻璃板装载：玻璃板及支架干净、无异物；装载严密（不漏胶、漏液）。

5.制胶：胶板成分比例准确、浓度适当、均匀、干净（无异物、无气泡）。

6.样品准备：量取精确、变性充分、无沉淀。

7.上样：无溢出、样本溶液均匀分布、胶板无裂隙。

8.电泳：低温；电流通畅（上层电泳缓冲液充分）；电压、电流相匹配。

9.转膜：胶、膜标记准确；转膜单位之间无气泡；胶、膜、滤纸大小一致；低

温；电压、电流相匹配。

10.切膜：分子量准确；标记准确；湿润（不干燥）。

11.封闭：脱脂奶粉溶解充分；孵育温度、时间适当。

12.一抗、二抗：质量无疑问；浓度适当；孵育温度、时间适当。

13.洗膜：摇速、时间适当。

14.显色：淋干；显色液充分接触、无流失。

15.膜：以上操作要求PVDF膜完整无损伤，不碰触、刮擦、冲刷样本蛋白面。

一、分离胶和浓缩胶的制备

1、装载玻璃板

彻底擦净玻璃板和支架，仔细检查，确保无异物，将玻璃板固定在支架上。

备注：①玻璃板内外面要彻底用酒精擦干净，特别是内面，确保无杂质异物及脂质、手印等，如有上述异物杂质，就易出现胶中有斑点、蛋白

条带扭曲、转膜效率下降、PVDF膜不干净等现象。

②玻璃板之间之间要严密接触，无异物，如有异物（如有胶块干固在

上面），则易造成上紧旋钮时，异物致使玻璃板碎裂，如没有碎裂，

就会出现漏胶的现象，使胶凝固不均匀（蛋白条带扭曲），胶面下

降，有效分离胶距缩短，蛋白条带分离不充分的现象。

③玻璃板与装置之间要严密接触，无异物，如有异物（如有胶块干固

在上面），则易造成上紧旋钮时，异物致使玻璃板碎裂，如没有碎

裂，就会出现在电泳时漏电泳缓冲液的现象，使电泳效果不佳，并

需频频补充上层的电泳缓冲液。

④上紧螺扭时，要4个旋钮均匀同时逐渐上紧，如先上紧1个，再上

紧其他的，易出现各点松紧不一、错位，导致漏胶或漏电泳缓冲液

的现象。

2、配置分离胶：

依照目的蛋白分子大小和所需胶板的数量，配制适当浓度和体积的分离胶。（详见表附1）

备注：①按照试剂的排列顺序依次加入到小烧杯中，每加入一种试剂后需要即时充分混匀（小烧杯有利于充分混匀），再加入下一种试剂，要

稳健，不要着急，在TEMED和AP加入前不会凝胶。

②特别是，TEMED和10% AP要同时加入，并迅速充分混匀，防止

局部凝固并大量消耗TEMED和10% AP，其他部分凝固慢或不凝

胶的现象。

③混匀后的分离胶要尽快加入到玻璃夹层中，防止加入前凝固。

④配胶过程中液体的量取要准确，如果Marker的带宽与胶的浓度不

匹配，则说明胶的浓度配制有误，胶中的成分比也会随之改变，将

影响蛋白条带的分离。随着胶浓度的升高，大分子量蛋白条带间距

会变窄，聚在一起，而小分子量蛋白条带的间距会变宽，所以高浓

度的胶适用于小分子蛋白的分离。相反，随着胶浓度的的降低，大

分子量蛋白条带间距会变宽，而小分子量蛋白条带的间距会变窄，

聚在一起，所以低浓度的胶适用于大分子蛋白的分离。因此，依据

Marker的带宽的变化，可以判断自己配制的胶浓度是否正确（若

上面条带宽，下面条带窄，则说明胶的实际浓度小于所需配制浓度；

若上面条带窄，下面条带宽，则说明胶的实际浓度高于所需配制浓

度）

3、灌注分离胶及封胶：

（1）立即将配制好的分离胶用移液枪灌注于安装好的玻璃板夹层内，至胶的液面距内侧短玻璃板上沿的1.5-2 cm处时停止。

备注：①灌胶时，开始可以快一些，胶面快到所需高度时，要放慢速度，防止加过量。

②灌胶时，将移液管贴靠在长玻璃板的内壁上，使胶沿玻璃板流下，

以避免胶中产生气泡，气泡将使蛋白条带扭曲，转膜效率下降。

③胶面一定要与内侧短玻璃板上沿相距1.5-2cm，宁长勿短，过短会

导致浓缩胶胶距减少，蛋白样本不能被有效的浓缩。

（2）上层注满干净的蒸馏水封胶，等待胶聚合凝固。

备注：①加水封胶的目的是压平分离胶面，如没有压平，胶面会坑洼不齐，造成蛋白条带的参差不齐。另外，水封还可防止胶和空气接触氧化。

②加水封胶时，要轻慢，并沿长玻璃板的内壁往复移动加注，使水均

匀分布在分离胶上。如仅在一点快速灌注，易使胶浓度及形状发生

改变，影响胶的均一性和蛋白条带的水平性，因分离胶本身也是含

有大量水的，加水过快和不均匀，会稀释上层的分离胶并造成胶的

浓度不均。

③夏天胶凝固的时间约30 min，夏天室温较高，凝固较快，冬天室温

较低，凝固较慢，要适当延长凝胶时间。可通过观察凝胶面的形成

（水和胶之间有一条折射线）判断凝胶是否充分。如果凝固时间过

长，并且凝固不充分，要考虑制胶的个个组成成分是否存在问题，

特别要考虑到TEMED和10% AP这两个试剂是否失效。

④注满蒸馏水有利于观察是否有漏胶。如在分离胶凝固的过程中，蒸

馏水的液面有稍微的下降（水蒸发所至），说明没有漏胶。如蒸馏水

的液面有大幅下降，则说明出现了漏胶。如漏胶严重，则需重新制

作分离胶。

（3）待分离胶聚合完全，倾倒出上层蒸馏水，用滤纸吸干多余的水分。

备注：①滤纸切勿触及分离胶，造成胶面不平整，导致蛋白条带扭曲的现象。

②先将玻璃板以一定角度（45度角）倾斜倒扣在桌面上1-2 min，使

蒸馏水沿分离胶的斜面集中流向一侧。然后用折叠的双层滤纸插入

玻璃板间隙吸干剩余的蒸馏水。要事先弹打滤纸，以去除其上面粘

附的碎屑，避免将碎屑带入玻璃板间。

4、配制浓缩胶：

依照胶板的数量，厚度和长度，配制适当体积的分离胶。（详见表附2）

备注：注意事项同分离胶配置。此步骤的要点是，浓缩胶比分离胶凝固快，操作要稳健迅速，在加入TEMED和10% AP后，迅速混匀并加入到

玻璃板内。

5、灌注浓缩胶及插梳子：

用1 ml加样枪将混匀的浓缩胶迅速灌注于分离胶上至内侧小玻璃板夹层上沿，立即插入梳子，在室温下聚合。

备注：①用枪吸净浓缩胶表面的气泡，并将浓缩胶灌满至溢出为止，这样插梳子时不易产生气泡。

②梳子要提前彻底擦净、晾干，不能有杂质附着在梳子上。

③插梳子时，注意梳子的反正面，将平面对着长玻璃板内侧，有楞的

一面对着短玻璃板一侧。

④先将梳子倾斜，使梳子齿的一端接触浓缩胶面，然后使其他梳子齿

依次与浓缩胶面接触，直至梳子齿的底面水平，这样可有效避免梳

子齿的底面与浓缩胶接触时产生气泡。然后将梳子水平插到底。

⑤插好梳子后，用镊子夹住一纸团，将溢出的还未凝固的浓缩胶擦净，

避免其凝固干燥后不易清除。注意用一只手按住固定梳子，防止在

擦拭时碰到梳子使梳子移位甚至拔出梳子的现象。

⑥等待浓缩胶凝固时，准备样本（详见样本处理部分）

6、拔梳子及洗胶孔

待浓缩胶聚合凝固后，拔出梳子，卸下玻璃板架，将玻璃板架装载到电泳槽内，向上电泳槽和下电泳槽内加入电泳缓冲液（1×Tris-Glycine Buffer （SDS-PAGE）），用1 ml移液枪冲洗胶孔后，待上样。

备注：①拔出梳子时要缓慢，不能过急。快速拔梳子，会使胶孔内形成真空，吸压胶孔两侧的胶柱，使其弯曲变形，弯曲变形的胶柱很难用针拨

正，弯曲的胶孔会直接影响蛋白条带的质量。因此要缓慢，并在中

途稍等片刻，待充足的空气进入后再拔。也可将胶放入到4℃冰箱

中适当降温，通过热胀冷缩的原理，使胶柱收缩，增大梳子齿和胶

柱的空隙，以利于拔梳子时空气的进入，避免形成真空。另外，拨

梳子时需要两侧同时均匀用力，避免因梳子倾斜而导致胶孔变形或

缺损的情况。

②上电泳槽内的电泳缓冲液要加满（必须没过短玻璃板的上沿），下电

泳槽内的电泳缓冲液要没过胶板的底沿。因为电流是从上电泳槽的

玻璃板中间进入，向下流入到下电泳槽中，从而带动蛋白样本向下

移动，所以上下缓冲液必须接触到胶板，确保电流顺畅。如电泳时，

上电泳槽内的电泳缓冲液的液面下降较快，则说明有漏液现象，要

及时修正，否则对电泳将造成很大的影响，因为大部分电流将从漏

液处流出。在电泳期间，也要时常检查液面的下降程度，并及时补

充上电泳槽内的电泳缓冲液（蒸发使电泳液液面下降）。如电泳缓冲

液低于短玻璃板的上沿，蛋白条带将停滞不前。

③要用1 ml移液枪吸取电泳液，冲洗每个胶孔，去除胶孔中可能残留

的胶粒和气泡等，防止残留物影响样本的均匀分布，最终造成带型

扭曲的现象。如果有顽固胶粒附着在胶孔中难以用电泳液冲洗出来，

可直接吸取空气冲洗，利用气泡的强大力量将异物冲出。

④卸载下来的支架要即时放到水中浸泡，防止干燥后不易清洗。并在

电泳期间及时用洗涤剂清洗，用自来水冲洗干净后，放到架子上晾

干备用。

二、样品的处理与上样

1、调样品浓度：

在冰上将所有蛋白样品调至等浓度（调蛋白浓度方法详见表附3）

备注：①要用相同的枪和硅化的枪头加样，以减少上样误差。

②调蛋白样本浓度时的加样顺序为：水、上样缓冲液、样本。每次加完

一种试剂都要即时混匀。

③在样本煮沸变性前，都要在冰上操作，避免蛋白样本变化。原样本溶

液用完后要及时放入-80℃保存，避免蛋白样本变化影响下一次实验结

果。

④上样缓冲液的作用有：使蛋白质变性（含SDS）；使蛋白质均匀分布；

上样时使样本溶液沉于胶孔底部；可观测电泳时最小蛋白样本的位置

（溴酚蓝颜料）。

⑤5xSDS在使用前要在振荡器上剧烈震荡混匀，短暂离心沉淀大颗粒杂

质后，吸取上清液使用。

⑥依据胶孔的体积不同，上样量不同：

2、样品变性处理：

将样品直接置于PCR仪器中加热变性，程序设置（99℃；7 min → 25℃；5 min），Spinning down(短暂离心)收集管内液体，Tapping混匀，再次Spinning down，室温下放置，待上样。

备注：①此环节非常关键，变性7 min。变性时间短，变性不充分，变性时间长，易使蛋白凝固沉淀。蛋白样本中有沉淀会使电泳中出现纵向条带，因

此上样前要Spinning down，尽可能去除样本中可能存在的大颗粒。

②用0.1 ml的PCR管。注意PCR管的盖一定要盖严实，不能呲边或翘

边。

③一个PCR管只准备一个胶孔的样本，以保证加样量的准确性。

④如果一次处理的样本较多，逐个震荡混匀，费时费力，可在Spinning

down（短暂离心）收集管内液体后，将PCR管插入到PCR管托板中，

用另一个PCR托板压在上面固定，然后放到震荡仪器上一起震荡混

匀，震荡混匀后，用大容量离心机，800-900 rpm/min离心15s取出。

如没有PCR仪可用，需用煮沸的方法变性，此时要注意以下操作要点：

①需用定时器准确记时。

②用0.5 ml的离心管，该离心管盖扣的比较严实。注意离心管的盖一定

要盖严实，不能呲边或翘边。如盖不严，会在加热时造成挥发或进水

的现象，导致样本无法应用，还需重新准备。

③将样品装载到浮漂上时，要注意离心管盖要距离浮漂有一小段距离，

防止煮沸时。翻腾的沸水越过浮漂侵泡管盖，因热胀冷缩，使离心管

体壁扩张，管盖和管体产生空隙，水将进入到离心管内。

④煮样品的容器不盖盖。防止因内部蒸汽压力大，温度高，水浸入离心

管中（道理同③）。

⑤水浴锅内要加足够量的水，防止离心管底部接触锅底，造成离心管内

温度过高，出现蛋白凝固沉淀的现象。

3、上样：

两边的胶孔各加3 ul 的Marker，中间胶孔加样品。例如：

注：上样顺序为反向上样，这样配合切角的位置，可把曝光时的上下位置调整过来，既大Size (KDa)的蛋白在上方，小Size (KDa)的蛋白在下方。避免了作图时调整上下方向的麻烦。

备注：①如果样品少，优先在中间的胶孔上样，避免两边的电泳边缘效应（电泳边缘效应使边缘的蛋白条带弯曲变形），也可节省膜的面积。空余的

胶孔内加入等量的上样缓冲液，用以平衡，减少边缘效应。

②加样量依据胶孔的体积而定，如1.0 mm厚的十齿梳子制作出的胶孔

体积约为20 ul，那么每份样品的总体就不要超过15 ul，要有富余，

如过满则样本容易溢出，造成样本的丢失和污染旁边胶孔样本的现象。

③加样时，枪尖要放在胶孔的中间，缓慢加入样品。枪尖放在胶孔的中

间，可使样本从胶孔中间的底部向两边扩散，有利于样本的均匀分布。

另外，在上样时，样本会向上窜一小段距离，加的越快，上窜的距离

越高，这种现象易使的样本溢出，因此要缓慢。

④加样时，枪不能垂直插入到胶孔中，要以45度角度搭靠在短玻璃板的

上沿上。如果插入到胶孔中，枪尖会撑开玻璃板，使玻璃板间隙变大，

造成胶板与玻璃板间出现裂隙，电泳时样本就会沿裂隙快速流动，出

现向下的蓝色条纹，损失样本并使蛋白条带变形。另外插入胶孔中的

枪尖被玻璃板夹紧，拔出时的阻力较大，用力拔出时，会突然加速，

容易带出部分样本，造成样本的损失。各种操作原因造成的样本损失，

会使样本的含量不一致，直接影响实验结果。

⑤样本加完后，不能马上电泳，要停留10 min，待样本在胶孔中平衡均

一化后，再进行电泳。如马上电泳，由于样本在胶孔中的分布不均一，

会出现蛋白条带变形的现象。比如：枪尖位于胶孔的中间，加入样本

时，样本会从胶孔的底部向两边冲击，加完样后，胶孔中的蛋白样本

会两边多，中间少，如马上电泳，蛋白条带会出现哑铃形；如枪尖位

于胶孔的一侧，加入样本时，样本会从胶孔的底部的一侧向另一侧冲

击，加完样后，胶孔中的蛋白样本会一边多，一边少，如马上电泳，

蛋白条带会出现一头大一头小的形状（逗点形）。

⑥样本加完后，如需移动，移动要缓慢稳健，避免因剧烈晃动造成电泳

缓冲液的波动，进而带动样本溶液的晃动，使样本不均一，或样本溢

出胶孔的现象。

⑦样本加完后，如上电泳槽中的电泳缓冲液的液面有所下降，不可在此

时补充电泳缓冲液，如在此时补充，液流会造成样本的波动，出现样

本不均一，或样本溢出胶孔的现象。可在电泳一段时间，样本进入胶

板后，再补充缓冲液。

⑧加入下一个样品时，需要换新的移液枪头，避免样本间污染。

三、电泳

1、连接好电源，电压调至80V，电泳，至样品电泳至分离胶，压缩成一条线，

Marker刚开始分带时为止。

备注：①在电泳前一定要将自己配制的1x电泳缓冲液进行PH校正，PH在

8.3-8.9之间方可进行电泳。

②本步骤的目的是浓缩蛋白样本。蛋白样本电泳至分离胶时，浓缩成一

条细线，使蛋白样本在分离前站在同一条起跑线上。因此采用低电压

（80V）、低浓度胶（5%的低密度胶，网孔大）、低pH（浓缩胶pH为

6.8），以利于蛋白样本浓缩。样本一定要跑到分离胶内时才能加压分

离（宁晚勿早），如提前加压，会使样本浓缩不充分，条带加宽拖尾。

③电压和电流可以反映电泳的状况。电泳时一般是恒压电泳，此时电流

会随着电泳时间的延长而逐渐缩小，这是由于负电荷粒子由上层电泳

槽向下层电泳槽的流动后，有效负电荷粒子量逐渐减少所致，是正常

现象。另外电流的大小与胶板的数量有关，胶板是并联的，胶板越多，

电流越大。也和胶板的厚度有关，胶板越厚，电流越大，因为流动的

负电荷粒子较多所致。另外，电压越高，电流越大。如两个1 mm厚

的胶板同时跑电泳，浓缩胶时80V的电压，初始电流应该是40 mA

左右，分离胶时155V的电压，初始电流应该是30 mA左右。

④如电流过大，说明有漏液现象，漏液直接连接上下电泳槽的正负极，

电阻降低，电流加大。如电流过小，说明电泳液pH值过低，负电荷

粒子量过少。也可能是配制胶的pH值过低，电流阻力加大所致。出

现不正常的现象，要及时查明原因，并及时修正。因此，要在上样前，

进行预电泳，检查电泳液是否正常。

⑤电泳缓冲液要完全溶解，不能有异物和大的颗粒，否则蛋白电泳中会

出现的纵向条带，如出现这一状况，要及时重新配制电泳缓冲液。

⑥使用电压的V数依据胶板的长短而定。对于浓缩胶，一般为： 8 V/ cm；

对于分离胶，一般为： 15 V/ cm。因此使用97mm的长板胶时，浓缩

电压为80 V，分离电压为150 V。使用73 mm的短板胶时，浓缩电

压为60 V，分离电压为110 V。

2、将电压调至150V，继续电游，待蛋白样品中分子量最小的蛋白电泳至胶板

的底部，但尚未溢出时（约距胶板底缘1 cm 左右），停止电泳。

备注：①Loading Buffer中的溴酚蓝燃料分子量小，其涌动的位置可代表蛋白样本中最小蛋白的泳动位置。溴酚蓝为蓝色，如溢出胶外，电泳

缓冲液将呈现蓝色。后期转膜时，如不切除含溴酚蓝的胶，转膜缓

冲液也会呈现蓝色，但这些不会影响后续的实验结果。

②但是，在电泳时，如溴酚蓝溢出胶外，会使胶下缘的蛋白条发生扭

曲的现象，影响本次实验小分子量蛋白的水平性。因此，当溴酚蓝

迁移至约距胶板底缘1 cm 左右时，要及时停止电泳。

③两侧Marker的分带清晰和平直程度可大致反应出蛋白样本的分离

状况。但如果Marker本身有问题，个别条带（特别是粉色条带）

跑散的情况，则不能说明什么，要依据实际情况，具体分析。

④如蛋白条带分散、模糊，可适当提高分离胶电压（可高至200V），

高电压可促使蛋白压成较细的线（集中），分离时间缩短，同时电

泳液温度也较高。200V的电压，初始电流应该是100-110 mA左右。

⑤电泳期间要时常检查上层电泳槽中电泳液液面的下降程度，并及时

补充电泳液，勿使液面低于短玻璃板的上沿。有时电泳液低至短玻

璃板的上沿时，由于桌子不完全水平，会出现一部分胶板接触电泳

液，有电流，一部分不接触，无电流，结果使蛋白条带扭曲变形，

完全低于短玻璃板的上沿时，因无电流，蛋白条带将停止不前。冰

浴电泳中，时间约为3-4 h，如常温电泳，时间约为2 h。

⑥在电泳期间配制5%脱脂奶粉溶液，并准备下一步的转膜的溶液和

器材。

四、转膜及封闭

1、将PVDF膜剪下左上角作标记，先用甲醇浸泡1分钟，再放到1×Transfer

Buffer中浸泡待用。

备注：①PVDF膜用甲醇浸泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电集团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合。做小分子的蛋白转移时，多加甲醇也

是这个目的。

②另外，甲醇浸泡的PVDF膜，才能被转膜缓冲液均匀浸湿、浸透，所以

要浸湿PVDF膜，一定先用甲醇浸泡后，再放到缓冲液中，后续的实验

过程中如出现PVDF膜干燥的情况，要采用这一方法操作。

③这一步应在电泳结束前准备好。一般浸膜时间为30 min，宁长勿短。

2、在托盘中加入1×Transfer Buffer转膜缓冲液，从电泳装置上卸下玻璃板，

长玻璃板在下，短玻璃板在上，用尺子小心撬开两玻璃板，用尺子切除浓缩胶和溴酚蓝部分，切去左上角作标记，将带胶的长玻璃板泡在1×Transfer Buffer中，用尺子小心将胶与长玻璃板剥离，将胶板浸泡在1×Transfer Buffer中10 min。

M……样本3 样本2 样本1 M

备注：①长玻璃板在下，这样胶就会粘附在长玻璃板上，因短玻璃板两侧有固定的玻璃夹条，不易对胶进行切割操作，所以让胶粘附在长玻璃板上，

长玻璃板是平面的，易于操作。

②可沿浓缩胶和分离胶的分界线（显而易见）切除浓缩胶。溴酚蓝可使

溶液变蓝，可切除。另外，切除带有溴酚蓝的胶，还可节省PVDF膜。

但是，如过是检测的小分子蛋白，则要保留，溴酚蓝不会对实验结果

有影响。在切割胶板时，切割尺要从上向下竖直切，不能左右滑动，

滑动会撕裂胶板，对实验结果造成严重的影响。

③ 胶本身没有正反方向，但上样是有顺序的（从右向左方向），如果样本顺序弄反了，实验结果将无法分析。因此要标注样本的上样方向。分

离胶板时，要把胶粘附在短玻璃板上，切去左上角作标记，切角的一

侧是上样的末端。

④ 要浸泡在液体中进行胶和玻璃板的剥离，因为液体润滑，易剥离。 ⑤ 胶板在不同的缓冲液中，以及不同温度下，有伸缩现象。因此，将胶板浸泡在转膜缓冲液中10 min ，可平衡胶的伸缩状态，避免在转膜时，胶的伸缩造成蛋白条带模糊的现象。另外，保持转膜过程中的低温状

态，也可有效避免胶板的伸缩现象。

⑥ 卸载下来的玻璃板、支架要即时放到水中浸泡，防止干燥后不易清洗。并在转膜期间及时用洗涤剂清洗，用自来水冲洗干净后，放到架子上

晾干备用。

3、 在托盘的转移液内，按下图依次铺好转移单位，逐层铺平，各层之间勿有气

泡和皱折。

注意：① 此操作要在液体中操作，这样可有效避免气泡的产生。

② 胶板的标记角要朝向右下，PVDF 膜的方向与胶板相吻合。

③

滤纸要均匀、完整，不能有破损，如滤纸有破损，将使电流变形，造透明板（+极）

海 绵

滤 纸

PVDF 膜

凝 胶

海 绵

滤 纸

黑 板（－极）

成蛋白样本不能有效均匀的转膜，对结果造成很大的影响。由于滤纸

的价格较高，没有破损的滤纸可以重复利用。

④胶板、PVDF膜、滤纸的大小要一致（滤纸不能大于膜），如偏差较大，

则造成电流不均一，蛋白样本不能有效均匀的转膜的现象，对结果造

成很大的影响。

⑤胶板、PVDF膜、滤纸要在海绵的中间，海绵要在转移塑料板的中间，

以保持电流的均匀稳定。

⑥切膜时，要准确切出相应大小的膜（一般为7×8 cm, 8×8 cm, 6×8 cm）,

膜要为正方形，不能出现撕裂、豁齿獠牙、四边形、梯形、皱褶等现

象，给后续实验造成不便。

4、转膜：将安装好的转移单位垂直放入转移槽中，卡子向下，黑板朝向黑色负

极面，放入冰盒，加入1×Transfer Buffer，将转移槽放在泡沫盒中，周围用冰填充，接通电源，选择电压100V，按照所检测蛋白的大小选择转移时间，100 KD以下转移时间为1-1.5 h，100-200 KD转移时间为2-3 h。

备注：①低温有利于转膜，因此转膜缓冲液要4℃预冷，并且转移槽用冰包裹。

②如果转膜时间为2 h，中间需要换一次冰盒，以有效保持低温。冰

盒用完后，及时放入-20℃冷冻，以备下次实验使用。

③转膜缓冲液反复利用不能超过三次，并且注意补充甲醇。

④ 100V电压，对于遇冷的转膜缓冲液，初始电流应为200 mA，1 h

后，电流应为500 mA。也可设置恒流转膜，200 mA转膜2 h，恒

流转膜时，初始电压为100V，之后逐渐下降。如电压或电流异常，

说明转膜缓冲液的pH值或成分有问题，需及时更换缓冲液。因此，

在转膜前，要预先通电检查转膜缓冲液是否正常，避免在转膜时发

现问题，手忙脚乱。

⑤转膜缓冲液一定要充分，要达到转膜单位两侧夹板的上沿。

5、转膜完毕后，取出PVDF膜，根据待检目的蛋白的分子量，切割PVDF膜，从大分子量到小分子量方向切膜并做好右上角标记，蛋白面朝上，放入含3 ml 5%脱脂奶粉的孵育槽中，置于摇床上，摇速调至10，室温封闭1 h。

备注：①切割膜的目的是节省一抗，以及在一次实验中尽量检测多个蛋白。

因此要根据实验待检目的蛋白的分子量，依据Marker相应的分子

量条带的位置，对PVDF膜进行切割。切膜的原则是：确保待检目

的蛋白在所切割的膜上。因此，如果两个待检目的蛋白的分子量较

近，不能确保准确的切割，就只检测其中的一个，不能贪多，最终

落个鸡飞蛋打。

②在膜的操作中，只能用镊子夹膜的边缘，不能碰触膜的中间，特别

是蛋白样本面。

③切割膜的切刀和切板要用70%的酒精反复擦拭，清除切刀和切板上

的杂质和污物（如锈迹等），并晾干待用。如切刀和切板上有杂质

和污物，粘到PVDF膜上，会对后期的封闭、一抗和二抗孵育、显

色等步骤造成重要的影响，特别是发光的杂质。

④如切刀和切板之间松弛，要及时上紧螺丝。如切刀和切板的间隙过

大，在切割时易将膜夹在切刀和切板之间，形成擦蹭膜的现象，对

膜上的样本蛋白造成损失。另外，在下刀时，持刀的手要向切板侧

用力，使切刀和切板间紧密接触，利于膜的切割。

⑤在切割膜的期间，要保持PVDF膜的湿润，不能干燥，因此时常要

将膜浸入转膜缓冲液中。如出现干燥现象，要用甲醇浸泡后，再放

入转膜缓冲液中，使其湿润。

⑥切割PVDF膜时，要及时在右下角剪切标记，该标记与未切割前的

PVDF膜右下角相一致，明确样本上样的方向。为了避免在切膜时，

被切掉的膜掉落、翻转等现象发生时，弄混右下角位置，要在PVDF

膜的右下角处（小蛋白分子量一侧）向大分子量蛋白一侧切，并在

切完一刀后，即时用剪子剪下右下角做好标记。

⑦封闭的目的是防止一抗、二抗粘附到PVDF膜上，造成显色成像时

背景高的现象。

⑧膜放入孵育槽中时，样本蛋白面要朝上，即切膜时标记的右下角一

定要朝向右上方。样本蛋白面朝上对有效的封闭、一抗和二抗孵育、

显色等步骤都具有至关重要的作用。

注：蛋白面向上时，膜的位置：

⑨封闭前，要确认孵育槽是否完好，孵育槽之间是否有渗漏现象。渗

漏的孵育槽会造成一抗的相互污染，严重影响一抗的孵育效果，因

此渗漏的孵育槽要弃之不用。为保险起见，可隔一个孵育槽放一个

膜，如在孵育期间有渗漏现象，可及时发现并调换。

6、加入10 ml的1×TBST 洗液，轻摇洗涤残存的一抗孵育液，倒掉。

7、洗膜：加入10 ml的1×TBST Buffer洗液，置于摇床上，摇速调至20，洗

膜5 min，倒掉洗液。反复洗膜3次。（此期间，准备一抗孵育液）

备注：加洗液时用15 ml的移液器或冲洗瓶，将管头顶在孵育槽的一底角，缓慢加入洗液，严禁将液体直接浇注在PVDF膜的表面，避免因洗液的冲刷，导致抗体、样本蛋白、封闭蛋白遗失的现象发生。抗体、样本蛋白的遗失，会造成显色成像时蛋白条带的缺失，不能反映实际情况。封闭蛋白的遗失会造成显色成像时，PVDF膜的背景不干净，出现黑斑。以下洗膜的注意要点相同。

五、一抗孵育

1、配制一抗孵育液：按照1:500-2000的比例配制一抗孵育液（依照抗体说明书

配制），并在离心管上注明一抗的序号、名称、配制人及日期。

举例说明：配制1:2000的一抗

1×TBST Buffer 3ml

10% NaN3 6μl

1抗 1.5μl

备注：①配制的一抗孵育液，4℃保存可反复使用至少3个月，但如发现抗体效价降低，需及时重新配制。

② NaN3的作用是抗菌，预防一抗腐败变性，其工作浓度为0.02%。

③如蛋白条带较弱，可适当增加一抗的比例，如蛋白条带很强，可适当

减少一抗的比例。要依据实际情况及时调整。

2、倒掉孵育槽中的1×TBST洗液，加入配制好的一抗孵育液，置于摇床上，摇

速调至10，4℃冰箱摇床上孵育过夜（12-16 h）。

备注：4℃过夜孵育的目的是保持一抗的活性，以利于重复使用，应为一抗比较贵。另外，给实验人员一个休息的间隔，避免过于劳累。如37℃，则孵育2 h。

3、回收一抗：从4℃冰箱摇床中取出孵育槽，用1 ml移液枪回收一抗，置于4℃

冰箱保存。

备注：回收不同的一抗时，需更换新的枪头，避免抗体间的相互污染。

4、加入10 ml的1×TBST 洗液，轻摇洗涤残存的一抗孵育液，倒掉。

5、洗膜：加入10 ml的1×TBST Buffer洗液，置于摇床上，摇速调至20，洗

膜5 min，倒掉洗液。反复洗膜3次。（此期间，准备二抗孵育液）

六、二抗孵育

1、配制二抗孵育液：按照1:5000的比例配制二抗孵育液。

5%脱脂奶粉 3 ml

二抗 0.6 ul

备注：①依据一抗的来源选择二抗。

②二抗孵育液需现用现配，不可多次使用，不加NaN3，因NaN3会影响

二抗上辣根过氧化物酶的活性。

③如一抗比例较大的情况下，蛋白条带依旧较弱，可适当增加二抗的比

例。

④如一抗比例较小的情况下，蛋白条带依旧很强，可适当减少二抗的比

例。

2、倒掉孵育槽中的1×TBST洗液，加入配制好的二抗孵育液，置于摇床上，摇

速调至10，室温孵育1 h。

3、倒掉孵育槽中的二抗孵育液，加入10 ml的1×TBST 洗液，轻摇洗涤残存的

二抗孵育液，倒掉。

4、洗膜：加入10 ml的1×TBST Buffer洗液，置摇床上，摇速调至40，洗膜

10 min，倒掉洗液。反复洗膜3次。

备注：①此为最后一次洗膜，摇速大（40），洗膜时间长（10 min），其目的是将PVDF膜上粘附不牢固的一抗、二抗洗掉，防止非特异斑点的出现，

此时也会有少部分封闭蛋白脱落，但不会影响成像结果，因为不在会

有一抗、二抗的粘附。

②而前述的洗膜操作，摇速小（20），洗膜时间短（5 min），其目的是防

止封闭蛋白脱落。封闭蛋白脱落会暴露PVDF膜，后期的一抗、二抗孵

育时，一抗、二抗会粘附在PVDF膜上，最终成像时会出现斑点的背景。

③封闭、一抗、二抗孵育时，摇速小（10），其目的是有利于封闭蛋白、

一抗、二抗的有效粘附。

七、显色液孵育

1、配制BeyoECL Plus显色液: 洗膜期间，取一个新的15 ml离心管，用锡箔纸

包裹避光。根据需要量（0.5 cm宽的膜约需0.3 ml，1 cm宽的膜约需0.6 ml），配制BeyoECL Plus显色液(A液：B液=1:1混合)。

2、将一塑料薄膜放置在一水平的桌面上，用75%的酒精擦拭干净，晾干。

注意：①本步骤的要点是保持PVDF膜的水平。因此，桌面一定要水平，不能倾斜。塑料薄膜和桌面上不能有异物、气泡和凸凹不平的现象。如不平，

在显色液孵育的时候，就无法在PVDF膜表面形成具有表面张力的、均

匀的显色液液面。液面容易流失，造成显色液孵育不充分，蛋白条带

显色不全的现象，不能反应蛋白表达的实际情况。

②塑料薄膜一定要晾干。如有水分，将无法形成有表面张力的显色液液

面，造成显色液流失，蛋白条带显色不全的现象。

3、用宽口平镊子从孵育槽中取出PVDF膜，在滤纸上淋干洗液，蛋白样本面朝上，

放置在塑料薄膜上。

注意：①要用宽口平镊子。不能用尖头带齿的镊子，尖头带齿的镊子会对PVDF 膜造成损伤，造成边缘不平整，翘边等现象，不利于后期成像检测。

另外，镊子要仅夹住PVDF膜的边缘，不能碰触膜的中间，防止损伤蛋

白条带或划掉抗体。

②镊子一定要擦拭干净，不能有异物，更不能有发光物质。有时因镊子

不干净，对成像结果造成严重的影响。

③ PVDF膜一定要淋干，放到塑料薄膜上的时候，周围不能有水的痕迹，

如有水的痕迹在膜周围，将无法形成有表面张力的显色液液面，造成

显色液流失，蛋白条带显色不充分的现象。

④如多个PVDF膜同时显色，则摆放PVDF膜时，PVDF膜之间一定要拉开

距离，防止因靠的太近，一个膜的液面流失，影响其他膜，造成联排

流失的现象。

4、用1 ml的移液枪，将显色液滴在PVDF膜上，使其在PVDF膜上形成具有表面张力的、均匀的显色液液面，用铁盖子罩住PVDF膜，避光孵育5 min。

注意：①移液枪的枪尖不能离膜太近，避免划伤膜表面，以至于划掉蛋白条带。

也不能太远，造成滴液冲刷PVDF膜，影响抗体的粘附及液面流失的现

象。

②显色液不能加的过多。过多的显色液会破坏液面的表面张力，造成液

面流失的现象。

5、孵育完成后，用宽口平镊子夹住PVDF膜的一边，在滤纸上淋干显色液，放入成像仪的暗箱托盘中，成像。

注意：以上步骤要连贯，稳健快速，中间不能有长时间的间隔。间隔时间过长，会出现PVDF膜干燥、显色效果不佳等现象。

八、蛋白条带化学发光成像

1、打开成像仪及电脑，预热10 min。

2、抽出成像仪的暗箱托盘，将待检的PVDF膜放置于托盘的中央位置（蛋白条

带面向上），用纸擦净PVDF膜周围的液体，关好暗箱托盘。

3、在Image Lab起始页面上的“实验验协仪”框中单击“新建”或在工具栏

中单击“新建实验验协仪”。

4、在“实验协议设置”中选择“凝胶成像”。

5、在“凝胶成像”对话框中

（1）“应用程序”选择“cheml”；

（2）“图像曝光”—“信号累积模式”—“设置”，设置曝光起始时间和照片数量。

（3）“显示选项”中，去除“高亮显示饱合像素”前面的“√”。图像颜色选择“Gray”。

6、点击“放置凝胶”根据图像显示调整凝胶位置，记录图形区域，如9.1*6.8。

7、点击“运行实验协议”成像仪开始成像，所记录的照片在图形区域下方显示。

8、成像完成后，选择“另存为”，保存在自己的文件夹内（以实验人员的名字

命名）。然后，选择“导出”—“导出以便发布”，保存一份，tif格式文件。

备注：一个实验结果要保存在同一个子文件夹内。文件夹要标注日期及实验内容，以便后期查阅。如20150614 mTOR/ERK/NFkB鼠肝组织的表达。

9、选择“凝胶成像”—“自定义”—“管理应用程序”—“Normal”、选择和之

前相同的“图形区域”，点击“运行实验协议”、拍的图片同样以两种方式保存。

10、清楚的标注：western blot 结果出来后，首先要做的、最重要的就是清楚

标注结果（当时标注不清楚，后期就忘了，自己不知道，别人更无法知道了，那实验就白做了），包括：蛋白的名称、样本号（一定要和蛋白条带准确对应上）、Marker位置和大小（一定要准确）、实验日期等信息。选择标注的显影图片一定要是最具代表性的，能够反映蛋白实际表达水平的图片。过曝光和曝光不足，都不能反映蛋白的确切表达量。写实验报告的时候，直接贴标注好的原图，这样可以反映实验的实际情况。如果确定哪个实验数据可用，要

添加到论文里，再进行修饰，变成漂亮的数据图。（标注的具体原则参看Western数据标注）

九、二次显色

当用一个膜检测两个目的蛋白时，可对膜进行二次显色。实验步骤与上述的从封闭到检测的步骤完全相同。只是封闭前，加一步洗膜的步骤即可：加入10 ml的1×TBST Buffer洗液，置摇床上，摇速调至40，洗膜10 min，倒掉洗液。反复洗膜3次。

备注：①用一个膜检测两个目的蛋白时，要先检测显色较弱的目的蛋白，再检测显色强的目的蛋白，如GAPDH和其他目的蛋白搭配。

②两个目的蛋白的分子量要有明显的差距，不能相同。

十、结果分析

实验结果分析（详见图像结果分析规程），确定下一步的实验计划。

westernblot详细图解

Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以

检测电泳分离的特异性目的基因表 达的蛋白成分。该技术也广泛应用 于检测蛋白水平的表达。 实验材料蛋白质样品 试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒 仪器、耗材 电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素 膜匀浆器剪刀移液枪刮棒 实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。

ImageJ对WesternBlot进行灰度分析

Image J 对Western blot 条带进行灰度分析 Image J软件：Windows 版本 第一步：软件安装 1.下载地址：https://www.wendangku.net/doc/3f3605813.html,/ij/download.html 2.下载windows 32位带Java版本，双击软件安装。 第二步：界面介绍 1.软件界面 第三步：图片分析 1.下图为样板图片 2.导入图片：File> Open> Sample1.jpg 图片导入后，Sample1.jpg在新的窗口中打开

3.图片类型设置：Image> Type> 8 bit 4.去除图片背景：Process> Subtract Background> …

4.1Subtract Background 窗口：Rolling ball radius 设为50 pixels， 勾选light background，可选preview，点击“OK”确定 5.工具栏:选择“矩形选框”

6.最大化“Sample1.jpg”窗口，便于矩形选择，矩形选择第一个泳道 7.标记“矩形选框”为1：矩形选择后，调整矩形至合适大小，按下数字键 “1”，或者Analyze> Gels> Select Fist Lane。 8.选择“泳道2”：拖动“1”的矩形框，会出现两个矩形选框，拖动矩形框 至泳道2，调整位置，并按下数字键“2”，Image J 会自动调整大小使“矩形框2”与“矩形框1”保持同一水平。 9.继续拖动，会出项新的“矩形选框”，调增至泳道3，并按下数字键“2” （注意：是按下数字键“2”），重复9至6个泳道全部选择。 10.所有泳道选择后，按下数字键“3”，出现分析图谱。

westernblot原理及步骤

westernblot原理及步骤 1.western blot 即蛋白免疫印迹( Western Blot) 是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。 2.原理 简单来说就是原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息 3.步骤 （一）蛋白样品制备 培养的细胞（定性） 1.去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。 2.对于6孔板来说每孔加200~300uL，60~80℃的1×loading buffer。 3.刮下的细胞在EP管中煮沸10min，期间vortex 2~3次。 4.用干净的针尖挑丝，将团块弃掉，如果没有团块但有拉丝现象，可将EP管置于0℃后在 5.14000~16000g离心2min，再次挑丝。若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠，可使用1ml注射器反 6.复抽吸来降低溶液粘滞度，便于上样。 7.待样品恢复到室温后上样。 培养的细胞（定量） 1.去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。

2.加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。 3.刮下的细胞收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。 4.12000g离心，4℃，2min。 5.取少量上清进行定量。 6.将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min。 （二）SDS－PAGE电泳 （1）清洗玻璃板 （2）灌胶与上样 （3）电泳 （三）转膜 （四）免疫反应 （五）化学发光，显影，定影 （六）凝胶图象分析将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。

WB实验步骤

Western blotting实验步骤 1．蛋白质的样品制备： 取心肌组织50mg，待组织块自行溶解，用滤纸吸去其表面水分，将组织块放入玻璃匀浆器球状部位，用组织剪尽量将其剪碎，将剪碎的心肌组织放入玻璃匀浆器的杆状部，按1mlRIPA+10ulPMSF/100mg心肌组织的比例加入RIPA和PMSF（先加RIPA再加PMSF），将玻璃匀浆器插入冰中，匀浆约30分钟。 将心肌组织匀浆转移到离心管中，4℃12000g离心5分钟，收集上清（如有粘稠物进一步用超声处理），样品分装冻存于-20℃备用。 2 .测定蛋白浓度： 2.1 按50：1配置BCA工作液。 2.2 10ulC液（蛋白标准）+90ulPBS液稀释成0.5mg/ml的蛋白标准液。 2.3 分别以0、1、2、4、8、12、16、20ul将蛋白标准液加入96孔板的第1~8标准孔中，在其他样品孔中加入10ul待测样品。 2.4 分别加PBS定容至20ul。 2.5 各孔中加入200ulBCA工作液，室温放置2小时。 2.6 用酶标仪测定蛋白浓度：测定A562，依标准曲线算出蛋白浓度。 3 SDS-PAGE电泳： 3.1 制胶: 按比例配制分离胶，缓缓地摇动溶液，使激活剂混合均匀，将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中，再在液面上小心注入一层水，以阻止氧气进入凝胶溶液中，静置40min。同前按比例配制浓缩胶，但混匀溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气。吸去不连续系统中下层分离胶上的水分，连续

平稳的注入凝胶溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡，静制60min以上以保证完全聚合。 3.2 预电泳：将聚合好的凝胶安置于电泳槽中，小心拔去梳子，加入电泳缓冲液后低电压10-20V的预电泳20-30min。（目的是清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通）。 3.3 样品准备：首先计算上样体积，然后按样品：上样buffer=4：1的比例加入上样bufer混匀，沸水煮10分钟，冰上5分钟。 3.4 加样：预电泳后依次加入标准品（Marker）和待分析样品。（加样时间要尽量短，以免样品扩散，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液避免边缘效应。每个泳道加5ul。 3.5 电泳：加样完毕，选择80V恒压进行电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿到达两胶交界处（一般约20分钟），更换至100V恒压电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳（一般约为1小时20分钟）。 4．转膜： 4.1 切胶：将电泳完毕的胶完整的放在盛有电转液的玻璃皿中，将目的蛋白所在区域切下来，测量其长宽，并记录。 4.2 剪膜和滤纸：按胶的尺寸剪膜和滤纸（滤纸长宽较凝胶小0.5~1mm，PVDF 膜长宽较凝胶大0.5~1mm），滤纸浸入盛有电转液的玻璃皿中10秒钟，膜放入盛有10%甲醇的玻璃皿中10秒钟，然后将两者都放入盛有去离子水的玻璃皿中3分钟，进一步放入盛有电转液的玻璃皿中3分钟。 4.3 向电转槽中倒入部分电转液，将海绵浸入。按如下顺序制作“三明治”（注意避免两边滤纸相互接触，以免发生短路）。从正极到负极按如下顺序排列：

westernblot实验详细步骤(1)

Western Blot实验技术一、制胶 SDS-PAGE分离胶配方表 1、检查制胶器是否漏水，吸干玻璃中水分

2、配置分离胶，加入玻璃板中（注意：不能有气泡和杂物），距离玻璃上口1.5mL停止加胶。 3、再加ddH2O或异丁醇水封除去气泡，凝胶后倒掉水，吸干水到浓缩胶插梳。 二、上样 1、先在内槽加满电泳液才可以拔梳子。 2、拔梳子时垂直向上拔出，不可左右摇晃梳子。 3、拔完梳子后观察梳子孔，是否有缺口和歪，用针头拨正。 4、上样时从左到右依次上样。 5、若上样组不多时，左右第一孔不加样。 6、要预留Marker的上样孔。 三、电泳 四、转膜

PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。 （转膜缓冲液：需4度预冷，现配现用，不能放太久。） 1、转印滤纸：全胶长8.5cm，宽5.5cm，需剪裁成7层滤纸，压平后约3mm。需在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。 2、海绵垫：在转膜液中平衡浸泡备用。 3、PVDF膜：剪裁8.5cm*5.5cm ，需在甲醇中浸润2min（活化膜上正电基团），然后在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。 4、凝胶：凝胶也需要在预冷的转膜转膜缓冲液中平衡浸泡3－5分钟。否则在转膜过程中会出现皱缩，导致出现转移的条带变形。 三明治夹心法：负极（黑）-海绵垫-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫-正极（白） 转膜时间：通电恒流，60V，一个槽100mA左右，1h

（注意：在操作过程中用玻棒赶走气泡。 装置转膜仪时注意黑对黑（负对负），白对红（正对正）。 装置运行时需冰浴。） 五、封闭 在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封闭，以防止抗体对非转印蛋白区域的非特异性吸附。 封闭一般采用异源性蛋白质或去污剂，本实验室常用的有5%BSA，10%脱脂奶等，至于选择哪一类封闭液，首先应考虑与检测目的相适应（做l酪氨酸磷酸化时不推荐non-fat milk 封闭）。 1、将脱脂奶粉封闭液（1xTBST:脱脂奶粉=20mL：2g一块膜用量。牛血清蛋白、5%BSA 效果更好）倒好。 2、将PVDF膜取出放入封闭液中，盖子改好。 3、封膜一般常温1-2小时即可，也可4℃封闭过夜。 六、一抗 抗体反应主要采用间接法: 即先加入未标记特异性一抗与膜上抗原结合后，再加入标记的二抗进行杂交检测，标记二

westernblot原理及步骤

westernblot原理及步骤 Western blot基本原理： 在电场的作用下将电泳分离的多肽从SDS-PAGE凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。 Western blot应用： 目的蛋白的表达特性分析； 目的蛋白与其他蛋白的互作； 目的蛋白的组织定位； 目的蛋白的表达量分析； 蛋白样品的制备： 1 水溶液提取法：稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大，是提取蛋白质最常用的的溶剂，操作相对麻烦，重复性一般； 2 有机溶剂提取法； 3 离心管柱提取法：超快速，易用，高产及重复性强； 4 通过层析或电洗脱法制备目的蛋白。 Western blot注意事项和常见问题：

1 我的细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？ 答：有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS 浓度，同时将样品煮沸时间延长；也不排除你的抗原浓度过高，这时再加入适量上样缓冲液即可。 2 我做的蛋白质分子量很小（10 KD），请问怎么做WB？ 答：可以选择0.2 μm的膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。 3 最后显色时用DAB好还是ECM好？ 答：DAB 有毒，但是比较灵敏，是HRP 最敏感的底物；ECM结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg 级蛋白，具体可以根据你实验的情况。 4 要验证某个细胞上有无该蛋白的存在，需要做免疫组化和western blot试验吗？做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗？ 答：①免疫组化可以用来进行定位，但是不能精确定量，而且有时会有假阳性，不易与背景区分；Western blot可以特异性检测某个蛋白质分子，进行定量，但是不能定位。

Westernblot基本操作步骤

W e s t e r n b l o t基本操作步骤 一、细胞蛋白的提取 弃去培养基，加入预冷的PBS洗一遍，加入的RIPA裂解液（含1mM PMSF(100×)，每10ml加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂各一片，六孔板每孔150-250μl，60mm×15mm 培养皿300-400μl，），于冰上裂解约5分钟，裂解总液12000rpm离心10 min。取上清，用BCA法测定蛋白浓度。用于western blot的蛋白样品取一定量加4×loading buffer，10×reducing，再用裂解液补齐到所需上样体积。离心，使蛋白沉底。将EP管于沸水中煮5min，变性，之后再离心后准备上样。 二、BCA法测蛋白浓度操作步骤 将蛋白标准配制溶液溶解蛋白标准（BSA），配制成5mg/ml的蛋白标准溶液，10μl 分装，-20℃冷冻保存。 完全溶解蛋白标准品，取10μl用PBS稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml。 据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。 将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20μl加到96孔板的标准品孔中，加稀释标准品的溶液补足到20μl。 加适当体积样品到96孔板的样品孔中（可以通过预实验摸索稀释倍数），加PBS 到20μl。 各孔加入100μl BCA工作液，37℃放置30分钟。 测定580nm条件下吸光度。根据标准曲线计算出蛋白浓度。 三、Western blot基本操作步骤 1、溶液配制： ①Runnig Buffer(1×)：SDS Runnig Buffer（20×）50mL，加MiliQ水至1L； ②Transfer Buffer(1×): Transfer Buffer(10×)100mL,甲醇200mL（20%，v/v），加MiliQ水至1L； ③TBST缓冲液 1M Tris·HCl（pH7.6）：60.5g Tris-base，加入约30ml浓盐酸，调PH至7.6，加MiliQ 水至500ml。 TBS缓冲液（10×）：1M Tris·HCl 100ml+80g NaCl加MiliQ水1L TBST缓冲液（1×）：TBS缓冲液（10×）100ml+0.5ml Tween-20（0.05%，v/v），加MiliQ水至1L。 ④封闭液：5% BSA（5g/100ml，称取1g BSA至20ml TBST，充分混匀溶解） 2、样品准备与加样 ①用4×SDS loading buffer, 10×reducing与蛋白质样品混合，并将此EP 管放在水浴锅中沸水煮5min，使蛋白质变性。 ②将预制胶固定到电泳装置中，并在装置中加满Runnig Buffer(1×)，内槽加入0.5mL 抗氧化剂，小心拔下梳子； ③向上样孔中加入一定体积的蛋白样品（总蛋白量20μg以上）。向marker孔中加入2.5μl marker（按照实验要求设定marker量），向空白孔中加入一定体积的加样缓冲液(loading buffer)。注意采用相同（或相近）的上样体积，以保证蛋白的各带宽度相同。防止体积较大的上样孔中的蛋白质将向相邻的泳道扩散。 3、电泳

蛋白质印迹法westernblot

蛋白质印迹法 蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。 其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。 蛋白免疫印迹(Western Blot )是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。 中文名蛋白质印迹法外文名Western Blot 蛋白免疫印迹Western Blot 类似方法1 Southern Blot 杂交方法 类似方法2 Northern Blot 杂交方法 使用材料聚丙烯酰氨凝胶电泳⑴

原理 与Southern Blot 或Northern Blot 杂交方法类似，但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAG（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。⑴ 分类 Western Blot 显色的方法主要有以下几种: i. 放射自显影 ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF iv. 底物DAB呈色

(完整版)WesternBlot(免疫印迹法)实验方法步骤

Western Blot(免疫印迹法)实验方法步骤 发布日期:2008-8-25 热门指数:4360 Western Blot(免疫印迹法) 主要包括以下4个基本步骤： n 样品制备 n 电泳分离 n 蛋白的膜转移 n 免疫杂交与显色――蛋白检测 溶液和试剂 n 1X 磷酸盐缓冲液(PBS) n Modified RIPA buffer Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;P MSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mM n 1X SDS 样品缓冲液 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 于25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT, 0.01% w/v溴酚蓝 n 转移缓冲液 25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇(pH 8.3) n 10X Tris缓冲盐(TBS) 准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl调pH为7.6 n 脱脂奶粉或BSA n 甲醇 n TBS/T缓冲液 1X TBS, 0.1% Tween-20 n 封闭缓冲液（TBS/T）

1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSA n 一抗的稀释 1X TBS, 0.1% Tween-20 加5% BSA (多抗)或5%脱脂奶粉(单抗) Note:一般来说, BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。 n 预染的蛋白质Marker，可用于监测转膜的效率 样品制备 原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。 1．培养细胞或药物处理。 2．弃培养基，用1X PBS漂洗细胞2次，去尽残留培养基。 3．加入1X SDS样品缓冲液(6-well plate, 100 μl /w或75 cm2plate, 500-1000 μl/瓶)，刮落细胞，转移到Ep管。注意：冰上操作。 4．超声10~15秒剪切DNA以减低样品粘性。 5．煮沸样品5 minutes。 6．离心12000g, 5 min，取上清。 7．电泳分离：上样15μl~20 μl 至SDS-PAGE 胶(10 cm x 10 cm)电泳。 如要定量检测某蛋白的表达水平，应用RIPA裂解液(1 ml per 107cells/100 mm dish/150 cm2flask)裂解细胞，收集裂解液至离心管中，在振荡器上混匀4～15min，14000g离心15min（4℃），弃沉淀，用B radford法或其它蛋白质测定方法测定上清中蛋白浓度以调整上样体积和上样量，进行Western杂交时还需设置内或外参照，通常用beta-actin。 注意：一般上样20~30 μg已足够，如待检蛋白为低丰度蛋白，可加大上样量至100μg，但电泳条带易拖尾，可制备亚细胞组份或采用更敏感的检测方法。 电泳分离（参照SDS-PAGE电泳方法） 转膜 杂交膜的选择是决定Western blot成败的重要环节。应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。用于Western blot的膜主要有两种：硝酸纤维素膜(NC) 和PVDF膜。NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被

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Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答) Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术: 一、原理 二、分类 i.放射自显影 ii.底物化学发光ECL ECF iv.底物DAB呈色 三、主要试剂 四、主要步骤 五、实验常见的问题指南 1.参考书推荐 2.针对样品的常见问题 3.抗体 4.滤纸、胶和膜的问题 的相关疑问 6.染色的选择 7.参照的疑问

8.缓冲液配方的常见问题 9.条件的摸索 10.方法的介绍 11.结果分析 一、原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 二、分类 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。

WesternBlot结果条带分析

W e s t e r n B l o t结果条带 分析 Revised final draft November 26, 2020

W e s t e r n B l o t结果条带全面分析 1.空白 原因：比较多，如果单纯一张没有任何显色，最可能是一抗加成其他抗体，或者二抗种属加错了，比如兔的加成鼠的。 解决办法：仔细检查抗体是否加错，确认转膜没有问题。上面的图片展示的是一点信号都没有，如果是这样大部分情况是抗体加错了。如果中间出现了细微的条带，可能原因是蛋白上样量太少，一抗浓度过低，显色液失效。另外如果转膜出现了问题，比如膜放反了，自然是一个白片。 2.高背景 原因：封闭不够好，一抗浓度高，洗膜时间和次数不够。 解决办法：降低一抗浓度，增加洗膜时间和次数。 3.非特异性条带 原因：一抗非特异性与蛋白结合 解决办法：更换一抗 4.条带中出现边缘规则的白圈 原因：电转中膜和胶之间存在气泡。 解决办法：转膜前去掉膜和胶之间的气泡 5.出现黑点和黑斑 原因：膜上其他部位与一抗或者二抗非特异性结合 解决办法：封闭结束之后要洗。 6.条带拖尾 原因：蛋白量太大，一抗浓度和时间太长 解决办法：根据情况调整蛋白量，同时一抗浓度和时间也可以缩短。 7.出现非均一性背景 原因：膜可能曾经干过 解决办法：在每一步的操作过程中，都需要注意不要让膜干。 8.某个条带变形 原因：SDSPAGE胶中存在气泡或者某不溶性颗粒 解决办法：配胶过程中要小心，使用无杂质的液体。另外配胶用的水，SDS，Tris缓冲液要注意不要有杂质。 9.条带呈哑铃状 原因：配置胶有问题，胶凝固后不均一 解决办法：把胶配好，不合格的胶坚决不用 10.最边缘条带弯曲 原因：电泳电流不均一 解决办法：换用新的电泳槽；不使用两边的两孔 其他问题 （1）蛋白分子量偏高或者偏低。可能是胶的浓度与目的蛋白的浓度不对应。 （2）蛋白质降解。蛋白质降解后很可能会在比原来位置低的地方出现主带，然后会出现一些其他带，最主要特点是所有的条带比正常的都低，并且条带模糊不清晰。 （3）所有条带连成一片没有间隔。原因最可能是上样量过多，其次是样品弥散（比如电泳长时间停止样品弥散）。 （4）整个条带呈“︶”状：凝胶冷却不均一，电泳槽老化。 （5）整个条带呈“︵”：凝胶左右两头没有凝固好 （6）溴酚蓝拖尾：样品溶解不好。 （7）纵向的纹理：上样样品中存在不溶性颗粒 （8）溴酚蓝很粗：浓缩胶浓缩效果不好，可能是浓缩胶太短，或者是浓缩胶配错。

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Western免疫印迹（Western Blot） 是将蛋白质转移到膜上，然后利用 抗体进行检测的方法。对已知表达 蛋白，可用相应抗体作为一抗进行 检测，对新基因的表达产物，可通 过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法 类似，但Western Blot采用的是聚 丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋 白质，“探针”是抗体，“显色”用标记 的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转 移到固相载体（例如硝酸纤维素薄 膜）上，固相载体以非共价键形式 吸附蛋白质，且能保持电泳分离的 多肽类型及其生物学活性不变。以 固相载体上的蛋白质或多肽作为抗 原，与对应的抗体起免疫反应，再 与酶或同位素标记的第二抗体起反 应，经过底物显色或放射自显影以 检测电泳分离的特异性目的基因表 达的蛋白成分。该技术也广泛应用 于检测蛋白水平的表达。 实验材料蛋白质样品 试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒 仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒 实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；

SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。 4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml。 5. 膜染色液：考马斯亮兰0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。 6. 显色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸镍胺0.1 ml；H2021.0 μl。 二、蛋白样品制备 1. 单层贴壁细胞总蛋白的提取 （1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 （2）每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS （0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1 min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。 （3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。） （4）每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 （5）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。） （6）于4℃下12000 rpm离心5 min。（提

WesternBlot原理和操作方法(全)讲解

Western Blot 原理和操作方法（全） Western Blot 工作原理 蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象.根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等.其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(1-100μg),分辨率高,可检出10-9-10-12mol 的样品,凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广旱挠τ? SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量. PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE(SDS 变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳)的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异,因为SDS-PAGE的样品处理液是在要跑电泳的样品中假如含有SDS和巯基乙醇(2-ME)或二巯基赤藓醇(DTT),其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构,SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级及三级结构,并与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,电泳样品假如样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物,SDS-蛋白质复合物在强还原剂巯基乙醇存在时,蛋白质分子内的二硫键被打开而不被氧化,蛋白质也完全变性和解聚,并形成榛状结构,稳定的存在于均一的溶液中,SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷,平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖,远远超过其原来所带的电荷,从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计,消除了不同分子之间原有的电荷差别,其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小,这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基. 样品处理液中通常加入溴酚蓝染料, 溴酚蓝指示剂是一个较小的分子,可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前沿位置,当指示剂到达凝胶底部时,即可停止电泳. 另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部. 重要参数 ①聚丙烯酰胺凝胶(PAG)制备原则:由于孔径的大小取决于单体和双体丙烯酰胺在凝胶中的总浓度(T)以及双体占总浓度的百分含量即交联度(C)决定的,因而制胶之前必须首先知道这两个参数.一般可以由下述公式计算: T%=(a+b)/m*100%; 和C%=a/(a+b)*100% 其中: a=双体(bis)的重量;b=单体(arc)的重量;m=溶液的体积(ml) ②当分析一个未知样品时,常常先用7.5%的标准凝胶制成4-10的梯度凝胶进行试验,以便选择理想的胶浓度.如果蛋白质的分子量已知,可参考下表选择所需凝胶浓度: 蛋白质分子量范围(Da) 适宜的凝胶浓度(%) <104 20-30

WB操作步骤-自己整理

Western Blot 相关实验方法与试剂（湿转法） 人工肝实验室学习姚瑶 （一）目的蛋白提取： （1）单层贴壁细胞总蛋白的提取： 1、倒掉细胞培养液，加入Hanks液洗涤一次后倒掉，根据所用细胞决定是否用胰酶消化，加入适量（约5ml）新鲜细胞培养液后，将贴壁细胞吹起，并转移至4支离心管内，配平后，1500转离心10min。 2、倒掉上清，用4度预冷PBS溶液洗涤沉淀，1500转离心10min。 共洗三次，每次十分钟。 3、倒掉上清，吸净，每管加入50ul 细胞裂解液RIPA，吹散，加入后由于DNA的释放可迅速变粘稠，故应尽快转移至1.5ml EP 管内，-20℃裂解30min。 4、超声波细胞裂解仪上将各管裂解15s。（可不做） 5、4℃，12000转离心10min。 6、将上清转移至0.5ml EP管中，每管100ul，冰浴待用。 （2）组织中总蛋白的提取： 1、取约100mg肝组织于研磨器内，加入500ul 细胞裂解液RIPA，研磨后吸出于1.5ml EP管内，再加入500ul RIPA，研磨后吸出于上EP管内。冰上裂解30min。

2、配平后，4℃，14000转离心10min。 3、将上清分装于0.5ml EP管内，每管100ul，冰浴待用（二）蛋白含量的测定： 1、稀释标准品：10ul标准品C液+90ul PBS溶液，混匀。 2、按0、1、2、4、8、12、16、20ul将稀释后的标准品加入于96孔板内，并用PBS将各孔补足20ul。 3、将第2、3排96孔板分别加入样品1ul、0.5ul，（可采用倍比稀释法），并用PBS将各孔补足20ul。 4、配制工作液：按A液：B液=50：1配制适量工作液，每孔加入200ul。 5、37℃水浴30min。 6、酶标仪测定各孔OD值（A570，Mode1）。 7、绘制标准曲线，计算样品蛋白浓度。 （三）SDS-PAGE电泳： （1）清洗玻璃板 （2）灌胶与上样： 1、配胶：根据目的蛋白的大小，决定分离胶的浓度。

Westernblot实验步骤及注意事项

Westernblot实验步骤及注意事项 Westernblot 实验步骤 1. 组织块称重 2. 利用液氮、研钵粉碎组织块 3. 加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃ 4. 加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟 5. 移入离心管4℃约20,000 g（约15,000转）15分钟 6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存 7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度 8. 取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液 9. 沸水浴中3分钟 10. 上样 11. 电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA） 12. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟） 13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色 14. Westernblot 试剂盒显色 15. 分析比较记录 western blot的实验步骤及注意事项的资料 1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。 1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。 2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。/凝胶/）将此滤纸3．

4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。 5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。 6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。 2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。 3. 用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。 4. 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。 5. 室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。 6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。 7．袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧。 8．混合：NGS(100微升)，印迹缓冲液中的抗体（10毫升），加在装薄膜的袋中，于室温下摇动2小时（或4℃过夜） 9．用总体积300ml PBS-Tween缓冲液，分4次在一浅盘中洗涤薄膜，每次75ml。 10．将连接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS）加在袋内，于室温下摇动1小时。 11．按步骤9洗涤。 12．加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS），于室温下摇动。 注意事项： western blot中转移在膜上的蛋白处于变性状态，空间结构改变，因此那些识别空间表位的抗体不能用于western blot检测。这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶标记亲和素进行western blot。实验中取胶和膜需带手套。 Western实验步骤 Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western 可以参 考如下步骤进行操作。 1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation) O 可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚 细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒 进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒。 O 收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要 采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用碧云天生

WB实验步骤

蛋白电泳（制胶、SDS-PAGE电泳） 实验材料： SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、电泳缓冲液、提取的蛋白或全细胞裂解液、广谱彩虹预染中分子量蛋白Marker、SDS-PAGE Loading Buffer（还原，5×）、G250蛋白快速染色试剂、若干蒸馏水 实验仪器、耗材： 蛋白电泳仪、制胶仪、水平摇床、15ml离心管、5ml移液器、微量移液器、1.5ml离心管、塑料饭盒（可在微波炉里加热使用） 配制溶液： ●配制10%APS溶液：-20度保存 0.5g APS + 5ml蒸馏水、2.5g APS + 25ml蒸馏水 ●配制200 ml电泳缓冲液：CW0045 Tris-Glycine SDS（ph8.3,10×） 20 ml Tris-Glycine SDS + 180 ml 蒸馏水 ●配制1 ml loading buffer： 200 ul 5×loading buffer +800 ul蒸馏水 实验步骤： 一．制胶： 1.参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。 2.根据分离蛋白的大小配制分离胶和浓缩胶。 3.配制10%分离胶： 将不同体积的30%Acr-Bis(29:1)、分离胶缓冲液和双蒸水在小烧杯或试管中混合。 加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。 配制SDS-PAGE分离胶

4.待胶灌至距离玻璃板顶端1.5cm的时候停止灌胶，加入蒸馏水水封。静置40分钟 至1小时。 5.待分离胶凝固后（水层胶层中间出现折线），倒掉蒸馏水，用滤纸将水溶液吸干。 6.配制5%浓缩胶： 7.将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。 注意：灌胶速度要快，防止凝胶。 8.将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。静置20分钟，等待浓缩胶聚合。 9.待凝胶聚合后，小心地拔出梳子，以免破坏加样孔。赶走气泡。 二．SDS-PAGE电泳: 1. 在电泳槽的内外槽灌至电泳缓冲液。 2. 制备样品： 1）蛋白样品： 根据植物蛋白或动物组织蛋白定量结果，计算蛋白提取液加入量，制备上样溶液。 蛋白提取液+ 5×上样缓冲液+ 蒸馏水，上样量为40-60ug。 制备的样品，煮沸5分钟，12,000 rpm离心5分钟，取上清，上样。

Western_Blot操作步骤

Western Blot操作步骤 一、 Western blot 实验步骤概述 1. 组织取材：组织块称重 2. 利用液氮、研钵粉碎组织块 3. 加入RIPA缓冲液(每克组织3 ml RIPA)，PMSF(每克组织30μl，10 mg/ml PMSF)，利用Polytron进一步匀浆(15,000转/分*1分钟)维持4℃ 4. 加入PMSF(每克组织30μl，10 mg/ml PMSF)，冰上孵育30分钟 5. 移入离心管4℃约20,000 g(约15,000转)15分钟 6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存 7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度 8. 取相同质量的细胞裂解液(体积*蛋白质浓度)，并加等体积的2×电泳加样缓冲液 9. 沸水浴中3分钟 10. 上样 11. 电泳(浓缩胶20mA，分离胶35mA) 12. 电转膜仪转膜(100mA 40分钟) 13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色 14. Westernblot 试剂盒显色 15. 分析比较记录 二、 Western具体实验步骤 Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western可以参考如下步骤进行操作。 1.收集蛋白样品(Protein sample preparation):可以使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提。收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用北京博奥森生物技术公司生产的WIP细胞裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。 2.电泳(Electrophoresis) (1) SDS-PAGE凝胶配制:SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用博奥森生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。