动物细胞工程基础实验

(完整word版)2015 动物细胞培养技术实验报告

一、实验目的 1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。 2、学习并掌握细胞传代培养的方法。 3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。 二、实验原理 细胞培养（cell culture）：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。 动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。由于细胞具有生长和自我复制的能力，为细胞体外培养和研究提供可能。 动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。 原代培养（primary culture）即直接从动物机体分离、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。 传代培养（subculture）当细胞生长增值达到一定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的，但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则方便简单的多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 三、细胞培养相关设施及材料 1、细胞培养室 无菌操作区：只限于细胞培养及其它无菌操作，与外界隔离。 孵育区：培养箱设定的条件为37℃，5%CO2。 制备区：培养液及有关培养用液体的制备，液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。 储藏区：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。 清洗区和消毒灭菌区：清洗区为相对污染区，消毒灭菌区与清洗区分开。 2、细胞培养常用基本设施： 荧光显微镜、超净工作台、孵箱、电热鼓风干燥箱、冰箱、液氮罐、消毒器、恒温水浴槽、滤器等。 细胞培养常用器皿：培养瓶、培养板、培养皿，玻璃瓶、吸管，离心管、冻存管，注射器，烧杯、量筒等。 3、细胞培养用品的清洗、消毒 新玻璃器皿要用5%稀盐酸浸泡，以中和其表面碱性物质：刷洗： 硫酸清洁液浸泡：浓硫酸+重铬酸钾+蒸馏水； 冲洗：流水冲洗15-20次，蒸馏水冲洗3次，三蒸水漂洗1-3次。 所有需灭菌的器械、物品灭菌前均需包装，防止灭菌后污染。使用时放入超净工

人教版高中生物选修3作业测试练习2.1.1植物细胞工程的基本技术

ZHUAN TI ER | 专题2细胞工程 2．1植物细胞工程 2．1.1植物细胞工程的基本技术 课堂知能验收 对应学生用书P025 1．下列关于细胞全能性的叙述中，错误的是() A．理论上，生物体的每个细胞都含有该生物的全套基因，具有全能性 B．植物细胞虽然具有全能性，但并不是所有的细胞都能表现出来C．植物体只有生长点细胞具有全能性，而其他部位细胞没有全能性 D．植物细胞具有全能性，而其他生物细胞一般不表现出全能性 答案 C 解析具有某种生物全部遗传信息的任何一个细胞，都具有发育成完整生物体的潜能，也就是说，每个细胞都具有全能性，但并不是所有的细胞都能表现出来，一般来说植物细胞的全能性较高，动物细胞的全能性较低，C错误。

2．下列发生了细胞分化且能体现体细胞全能性的生物学过程是() A．玉米种子萌发长成新植株 B．小鼠骨髓造血干细胞形成各种血细胞 C．小麦花粉经离体培养发育成单倍体植株 D．胡萝卜根韧皮部细胞经组织培养发育成新植株 答案 D 解析种子萌发长成植株是由幼体到成体的正常生长发育过程，虽有细胞分化，但不能体现细胞的全能性，A错误；骨髓造血干细胞形成各种血细胞，仅仅是细胞分化的过程，没有形成完整的个体，不能体现细胞的全能性，B错误；花粉离体培养发育成单倍体植株，经历了细胞分化，体现的是花粉(生殖细胞)的全能性，没有体现体细胞的全能性，C错误；胡萝卜根韧皮部细胞经植物组织培养发育成新植株体现出体细胞的全能性，D正确。 3．植物组织培养依据的原理、方法步骤及诱导的植物激素分别是() ①细胞的全能性②离体的植物器官、组织或细胞③根、芽④生长素和细胞分裂素⑤生长素和乙烯 ⑥愈伤组织⑦再分化⑧脱分化⑨植物体

动物实验操作的基本知识

动物实验操作的基本知识 一、实验动物抓拿固定 （一）小白鼠(mouse) 右手抓住其尾，放在鼠笼铁纱网上，然后用左手拇指及食指沿其背向前抓住其颈部，并以左手的小拇指和掌部夹住其尾固定在手上(图3-1)。取尾血及尾静脉注射时，可将mouse固定在金属或木制的固定器上。 （二）大白鼠(rat) 实验者应戴帆布手套，用右手将鼠尾抓住提起，放在粗糙的台面或鼠笼上，抓住鼠尾向后轻拉，左手抓紧两耳和头颈部皮肤，余下三指紧捏鼠背部皮肤，如果rat后肢挣扎厉害，可将鼠尾放在小指和无名指之间夹住，将整个鼠固定在左手中，右手进行操作（图3-2）。若进行手术或解剖，则应事先麻醉或处死，然后用棉线活结缚四肢，用棉线固定门齿，背卧位固定在大鼠固定板上。需取尾血及尾静脉注射时，可将其固定在大鼠固定盒里，将鼠尾留在外面供实验操作。 （三）豚鼠(cavy) Cavy具有胆小易惊的特性，因此抓取时要求快、稳、准。一般方法是：以右手拇指和食指夹住两前肢及头部，使整个颈胸部皆在手掌中（不要抓得太紧以免窒息），左手抓住两后肢，使腹部向上，而后进行操作（图3-3）。 （四）蛙或蟾蜍(frog or toad) 捉拿方法宜用左手将动物背部贴紧手掌固定，以中指、无名指、小拇指压住其左腹侧和后肢，拇指和食指分别压住左，右前肢，右手进行操作（图3-4）。 在捉拿toad时，注意勿挤压其两侧耳部突起之毒腺，以免毒液射到眼中。 实验如需长时间观察，可破坏其脑和脊髓以后放在蛙板上固定进行操作。 （五）家兔(rabbit) 用右手抓住其颈背部皮毛，轻提动物，再以左手托住其臀部，使家兔的体重主要落在左手掌心，然后按实验要求固定（图3-5）。作兔耳血管注射或取血时，可用兔盒固定。作各种手术时，可将家兔麻醉后固定在手术台上。固定方法常采用仰卧位固定，四肢用粗棉线固定，头用兔头固定夹固定或用棉线钩住家兔门齿再固定在兔台头端铁柱上。 （六）狗(dog)

动物细胞培养技术实验

实验十五动物细胞培养技术及其应用 一．实验目的 通过本实验使学生掌握细胞培养、细胞检测和细胞表达等成套技术的原理和方法。 二. 实验内容 1.培养基配制、细胞培养、细胞冻存与复苏等基本技术； 2.细胞生长曲线测定、细胞活性检测等常用技术； 3.细胞污染检测方法与技术； 4.病毒在细胞中的感染与增殖、重组病毒异源蛋白的细胞表达等实用技术。 三．实验用品 1. 材料：Sf 细胞、Hi5 细胞等 2. 器材：CO2培养箱、超净工作台、倒置显微镜、培养基抽滤装置、电泳仪、离心机、pH 计、液氮罐（含液氮）、水浴锅、温度计、培养瓶、血清瓶、5 ml和10 ml 移液 管、不锈钢移液管筒、大小不锈钢饭盒、酒精灯、吸耳球、血球计数板、96孔板、 24孔板、无菌冻存管、离心管、记号笔、一次性过滤器、微量加样器、精密pH 试纸、酒精棉球等 3. 试剂与药品：Grace培养基、胎牛血清、甘油、DMSO、双抗（青霉素、链霉素）100 u/ml、 Hank’s液、胰蛋白酶、台盼蓝、液氮、分析纯无水酒精、95%医用酒精、Tris 碱、硼酸、EDTA、琼脂糖粉（电泳用）、dNTPs、Taq酶、支原体检测试剂盒、 DNA提取试剂盒DNeasy Blood & Tissue kit （Qiagen）等。 四．实验方法与步骤 （一）培养基配制、细胞培养、细胞冻存与复苏 1. 缓冲液及培养基配制 Hank’s液：KH2PO4 0.06g，NaCl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g，Na2HPO4·H2O 0.06g，加H2O至 1000ml，高压灭菌。4℃下保存。 胰蛋白酶液： 称取0.25克胰酶蛋白酶（活力为1：250），加入100ml无Ca2+、Mg2+的Hank’s 液溶解，滤器过滤除菌，4℃保存，用前可在37℃下回温。 4%台盼蓝染液：称取台盼蓝4克，加双蒸水至100 ml。 MTT溶液：MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液或无酚红的Hank’s液中。4℃下保存。Grace培养基：取一份GIBCO公司的Grace培养基粉剂，按说明用量加入1000ml三蒸水100单位／毫升青、链霉素，充分混匀使溶解，调节pH值至6.8左右。 0.22 μm 滤膜抽滤除菌，4℃下保存。此为基础培养基。使用前加入10%胎牛 血清。 细胞冻存液：基础培养基加入10%DSMO，20%胎牛血清，用前配制。 PBS缓冲液：137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 8.1 mmol/L Na2HPO4, 1.5 mmol/L KH2PO4,

动物细胞培养总结!!!!

动物细胞培养总结 一．实验准备 1.实验器械、器皿的清洗和消毒 （1）清洗和包装 离心管，2ml,15ml)若干，冻存管若干放进铝饭盒，用牛皮纸包裹，系紧棉绳，用笔在饭盒上和牛皮纸上标记盒内所装物品名称、数量、日期和所属人名称。 蓝枪头两盒，黄枪头白枪头各一盒用牛皮纸包裹，用棉绳扎紧。 取适量蒸馏水于4L玻璃瓶，瓶盖拧松半圈。 过滤器，250ml玻璃瓶，500ml玻璃瓶用自来水毛刷洗涤剂刷洗，蒸馏水润洗，烘干。 过滤器两部分分别包裹，先将瓶口部位用锡纸包裹后，再罩以牛皮纸，再用棉布密包起来，用棉绳扎紧。 玻璃瓶拧下瓶盖，瓶身浸酸。浸酸时应注意安全，须穿戴耐酸手套和白大褂，注意保护好面部和身体裸露部分，提前备好一盆水在旁以便浸酸结束后清洗耐酸手套，防止走动时酸液滴到地板上不好清洗。瓶口慢慢沉入液面下，注意缓慢降低瓶身，使液体慢慢浸入瓶内，以免产生气泡溅出酸液，发生危险。浸酸时器皿要充满酸液，勿留气泡，浸泡过夜。取出瓶身时，须穿戴耐酸手套和白大褂，注意保护好面部和身体裸露部分，提前备好一盆水在旁，取出后将瓶身放入盆内水中在转移至水池边清洗，以免酸液滴落地板不好清洗。换水洗几次，待水澄清后开始冲洗，每瓶都用自来水灌满，倒掉，重复15次，再用

蒸馏水漂洗5次，去离子水漂洗3次，烘干备用。 （2）消毒灭菌 1>全自动高压灭菌锅：插电源，打开开关，检查水位，若水位不足加蒸馏水补足，放入物品，瓶类物体须拧松盖子后放最上面一筐，盖上灭菌锅盖，拧紧盖子至温度显示栏的左上角有一红点亮灯，按start开始升温。若灭有无菌水或玻璃瓶待降温至常温再打开，打开后立即拧紧，无菌水瓶口封上封口膜。若没灭瓶类物品，降温至80度左右即可打开灭菌锅，须戴上线手套取出。 2>手提式高压灭菌锅：插电源，打开开关，检查水位，若水位不足加蒸馏水补足，检查设定是否为121度20分钟，放入物品，盖上灭菌锅盖，注意导气管一定插到锅底并不能堵塞，用手对称地拧紧锅盖螺栓，再用扳手继续拧紧。加温升压之前，先打开排气阀门，加温约半小时后见排气阀处开始排残留在锅内的冷空气，排气五分钟，关闭排气阀，继而开始升压。灭菌后不要立即打开气阀放气以免水汽喷出。待自然降温至常压才能打开气阀。 玻璃瓶须拧紧，饭盒，枪头灭菌后放入烘箱烘干备用。 2.无菌间消毒及设备检查 用84消毒液拖地，用原液按照1：29的比例兑水，抹布、拖把擦洗。配400ml 75%酒精于盆中，用酒精棉仔细擦拭CO2培养箱，超净台，超净台内物品，显微镜，桌面，若培养箱内未培养细胞可以再打开高温灭菌模式将培养箱灭菌一次。 用蒸馏水擦拭清洗水浴锅内壁，注意底座不要沾水。

常用的五种动物细胞培养方式

?一、半连续式培养 1.半连续式培养又称为重复分批式培养或换液培养。采用机械搅拌式生物反应器系 统，悬浮培养形式。在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，从中取出部分培养物，再用新的培养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变。这种类型的操作是将细胞接种一定体积的培养基，让其生长至一定的密度，在细胞生长至最大密度之前，用新鲜的培养基稀释培养物，每次稀释反应器培养体积的1/2~3/4，以维持细胞的指数生长状态，随着稀释率的增加培养体积逐步增加。或者在细胞增长和产物形成过程中，每隔一定时间，定期取出部分培养物，或是条件培养基，或是连同细胞、载体一起取出，然后补加细胞或载体，或是新鲜的培养基继续进行培养的一种操作模式。剩余的培养物可作为种子，继续培养，从而可维持反复培养，而无需反应器的清洗、消毒等一系列复杂的操作。在半连续式操作中由于细胞适应了生物反应器的培养环境和相当高的接种量，经过几次的稀释、换液培养过程，细胞密度常常会提高。 2.半连续式特点： ·培养物的体积逐步增加； ·可进行多次收获； ·细胞可持续指数生长，并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平，培养过程可延续到很长时间。该操作方式的优点是操作简便，生产效率高，可长时期进行生产，反复收获产品，可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。在动物细胞培养和药品生产中被广泛应用。 二、连续式培养 1.连续式培养是一种常见的悬浮培养模式，采用机械搅拌式生物反应器系统。该模 式是将细胞接种与一定体积的培养基后，为了防止衰退期的出现，在细胞达最大密度之前，以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培养基；同时，含有细胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出，以保持培养体积的恒定。理论上讲，该过程可无限延续下去。

细胞工程实验小结

细胞工程实验小结 专业：生物技术班级：0801 姓名：励丹学号： 在本次暑期短学期的细胞工程实验课上，我们做了细胞工程中基础的几个实验——饲养层细胞的制备、动物细胞的原代培养（组织块法培养小鼠肝脏细胞，消化法培养小鼠肾脏细胞）、免疫脾细胞的制备、免疫脾细胞与骨髓瘤细胞的融合、细胞的超低温冻存与复苏及活性测定（MTT法检测）、抗体IgG的检测（ELISA 法），让我受益菲浅。其中很多知识在平时的学习中都是无法学习到的，其中很多实验都开阔了我们的视野，让我们获得了许多平时课堂上得不到的知识。在细胞工程实验课即将结束的时候，我对这个短学期的学习进行总结，总结细胞工程课程试验来的收获与不足。 这次的实验分成了8个小组，因为细胞工程的实验都须在无菌室内进行，而无菌室较小，所以各小组轮流进无菌室进行实验操作，故没轮到进无菌室的小组在外面的实验室进行简单的操练，所以较为轻松。 我们中的大多数人都是第一次进无菌室，对无菌室充满了好奇。而进无菌室也需要一重重地灭菌，以确保无菌室内的安全。首先需要用新吉尔灭溶液对需要带进无菌室的物品及我们的手进行消毒灭菌，然后进入缓冲间穿戴无菌服、帽、手套及口罩。在进入无菌室后还需要用酒精棉擦拭手、超净台以及一些物品。在无菌室内的操作都需在超净台上进行，而且需要在酒精灯边上进行，不可以远离超净台，否则可能使培养的细胞或培养液等受到污染，从而造成实验失败。 我们小组在细胞培养的实验中较为成功，细胞生长状态良好，没有出现染菌现象。在进行细胞超低温冻存于复苏实验时，我们组将两只小鼠的细胞混在一起，是的细胞数增加，相对的在冻存中损伤的细胞数也增多，这个实验应该算不成功的。 通过9天的细胞工程实验，我发现实验是细胞工程学学的实践，我们学到的许多理论都会最终作用于实验，也学到了许多其他专业课上没有教到的理论。很多实验都是需要花费许多心思去学习的，也是非常复杂的。我们学习理科的同学，更加要重视实验课，因为理论与实际结合是最重要。在每次实验之后，我们都要做实验报告，通过实验讲义和自己参阅资料，得知本次实验的目的、原理、所需仪器、实验步骤、实验中的要求及注意事项等问题。实验操作当然是细胞工程

细胞实验室

一．建设方案之动物细胞培养实验室（设备片） 在生命科学科领域中细胞学有着至关重要的地位，近年来细胞学发展迅速，并取得了相当大的进展，细胞学相关实验室的建设也是各个研究院及院校生物学科必备的实验室。 细胞相关实验所需仪器及耗材种类繁多，接下来就细胞培养实验室常用仪器作下简单介绍：一、纯水系统 细胞培养用水一般要求双蒸水（0.8MΩ以上），实际上普通蒸馏水经玻璃器皿中按标准方法蒸馏二次得到的双蒸水是不能满足要求的，而且水中的内毒素直接参与细胞凋亡，血清中内毒素含量越低，对细胞毒性越小，越利于细胞的生长和传代；内毒素含量过高，会直接导致细胞提前老化。因此建议配置正式的水纯化系统。 二、液氮罐 为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般为液氮温度-196℃，因此，需要液氮罐。在此环境中，一般细胞可以保存十年具有活性。 三、超净工作台/生物安全柜 细胞培养对无菌环境要求很高，在细胞操作时，一般需要在100级空气质量条件下进行，因此超净工作台或生物安全柜就必须配备。 四、CO2培养箱 CO2培养箱是细胞培养的必备仪器，它为细胞提供了一个体外培养的舒适环境，如适宜的温度、湿度、酸碱度、O2浓度等。细胞在体外培养时很容易受到各种细菌、微生物的感染，因此，CO2培养箱的灭菌和抑菌能力就显得尤为重要。 五、恒温水浴 从液氮或超低温冰箱中取出细胞冻存管需要立即放于37℃水浴中快速复苏之后才传代培养，因此，恒温水浴也是细胞实验室必备仪器。 六、超低温冰箱 细胞的冻存过程需要一系列程序降温，一般4℃下存放30 min，转放-20℃ 1 hour，再转入-70至-80℃过夜，之后才可以转移到液氮内(-196℃)，这时就必须配备一台-86℃超低温冰箱。一般超低温冰箱保存细胞可达数月，对于不需要长期冻存的细胞，可暂时放于超低温冰箱保存。 七、离心机 细胞培养需要离心收集传代细胞，所以需要配置低速的常温离心机，对于后期细胞内容物的

动物细胞培养及应用发展史

细胞培养技术

细胞培养发展史及其应用 （一）前言 20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harriso n)从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后，在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培养。 所谓动物细胞培养(亦称组织培养)既有别于植物细胞培养，又与微生物的培养完全不同。所谓动物细胞培养是指离散的动物活细胞在体外人工条件下的生长、增殖过程，在此过程中细胞不再形成组织。 由于动物细胞培养是在人工条件下进行的，便于调控和观察，因而成为现今研究动物的物质代谢过程、染色体的形态变化、以及遗传物质的表达调控等高难领域的既便利而又有效的新方法。同时，随着现代生物化学、分子生物学、分子遗传学、以及现代医学的发展，细胞培养也在许多应用领域充分展示了其巨大的发展潜力，并已为世人所关注。尽管如此，动物细胞培养仍是一门年轻的新学科，在发展之初被混淆于动物组织培养之中。 （二）细胞培养技术及其历史 细胞培养的历史最早可追溯到19 世纪末，据可考证的资料记载W ilhelm Roux是第一个进行动物组织培养实验的人。 1885年Wilhelm Roux 将鸡胚髓板放置于温热盐水中使之维持存活了数天，是有记录的第一个体外移植成功的例子。 1887年Arnold把恺木的木髓碎片接种到蛙的身上。当白细胞侵入这些木髓碎片后，他把这些白细胞收集在盛将盐水的小碟中，接下来观察到这些白细胞在运动，并存活了一个短的时间。

动物细胞培养常用方法

一.细胞增殖周期（cell proliferatinal cycle）概念 细胞周期是描述细胞增殖和分化交替发生变化的概念。而细胞增殖周期主要是从细胞增殖角度赋予细胞活动的概念，两者不应混为一谈。细胞增殖周期是指细胞从一次分裂结束开始生长，到下一次分裂结束所经历的过程。根据细胞增殖周期不同时期的生化特点，划分为四个连续的时期，即G1期（DNA合成前期），S期（DNA合成期），G2期（DNA合成后期），M期（有丝分裂期）。如以G1期为起点，那么细胞增殖周期的各时期应循着G1-S-G2-M的顺序进行，G1、S、G2三期合称为细胞间期，此期完成细胞生长过程。M期完成遗传物质的分配。 因此，细胞增殖周期=间期（G1期+S期+G2期）+分裂期（M期）。 二.培养细胞生命期（life span of culture cells） 很多细胞特别是正常细胞，在体外的生存不是无限的，而是具有一个生命期。索维培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。培养细胞的生命期与细胞的种类、性状和原供体的年龄、健康等情况有关。人胚二倍体成纤维细胞，在不冻存和反复传代条件下，科传30~50代，相当于150~300个细胞

增殖周期，能维持1年左右的生存时间，最后衰老凋亡。如供体为成体或衰老个体，则生存时间较短；其他细胞如肝细胞或肾细胞，生存时间更短，仅能传几代或十几代。只有当细胞发生遗传性改变，如获永生性或恶性转化时，细胞的生存期才可能发生改变。正常细胞培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞生命的全过程中，大致都经历以下三个阶段：原代培养期、传代期、衰退期。 三.培养细胞一代生存期 培养细胞的生存空间和营养是有限的，当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代（Passage或Subculture）。每次传代以后，细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞的数量和细胞增殖的速度等有关。接种细胞数量大，细胞基数大。相同增殖速度条件下，细胞数量增加与饱和速度相对要快（实际上细胞接种数量大时细胞增殖速度比稀少时要快）；连续细胞系和肿瘤细胞系比初代培养细胞增值快；；培养液中血清含量多时细胞增殖比少时快。以上情况都会缩短传代时间。 所谓细胞“一代”一词，仅指从细胞接种到分离培养时的一段时间，这已成

基本动物实验知识

当动物有病时，常表现为精神不振、行动迟缓、毛发蓬乱无光泽、鼻部皮肤干燥并流鼻水、眼有分泌物等。 1.大白鼠的生物学特征是什么？主要用于哪些实验？ 大白鼠性情温顺，行动迟缓，易于捕捉，但受惊吓或粗暴操作时，会紧张不安甚至攻击人。 大鼠嗅觉发达，对外界刺激敏感，抵抗力较强。大鼠无胆囊，肾单位表浅，肝再生能力强。大鼠的血压反应比兔稳定，可用它作血压实验，也可用于慢性实验、抗炎、降脂、利胆、子宫实验及心血管系统的实验。药典规定该动物为催产素效价测定及药品指控中升压物质检查指定动物。 2.动物实验的常用方法有哪些？ 动物实验方法已成为医学科学研究和实验教学及相关学科研究中不可缺少的重要手段。 动物的实验方法是多种多样的，在医学的各个学科领域内都有其不同的应用，但基本的实验方法则是共同的， ⑴如健康动物的识别、选择、抓取、固定、麻醉、动物分组、编号、脱毛、给药、采血、取尿、急救、处死、尸检等，不论从事何种课题的医学研究都涉及到这套实验动物基本操作方法。

⑵动物实验按机体水平不同可分为整体实验和离体实验。还可进一步具体分为分子、亚细胞、细胞、组织、器官、整体动物和无损伤动物等水平的实验。按动物时间的长短则可分为急性实验和慢性实验。 ⑶按学科的实验方法可分为生理学的动物实验方法，病理生理学的动物实验方法，药理学的动物实验方法，病理解剖学、组织学的动实验方法等。 3.实验动物的捉持与固定 如何正确捉拿及固定大白鼠？ 以防大鼠在惊恐或激怒时咬伤手指，捉拿时最好带上防护手套， 右手抓住鼠尾立即提起，放在易攀抓的粗糟面上， 用左手拇指和食指抓住其两颊及后枕部皮肤，充分固定慎防咬伤， 其余手指握住整个鼠体，注意握力不要太大，以免大鼠窒息死亡。 然后将其腹部向上，作腹腔麻醉，最后固定。 4．实验动物性别的鉴别？ （1）如何鉴别小、大鼠的性别？ 根据外生殖器（阴蒂或阴茎）与肛门之间的距离来判断这些动物新生仔的性别， 一般间隔短的是雄性，外生殖器阴茎与阴蒂大，但是对此判别要有一定经验，成熟期雌性有阴道口，有膨起的阴囊和阴茎。 5．实验动物编号标记的方法 （1）为什么要对实验动物进行编号标记？标记的方法有几种？ 动物在实验前常常需要作适当的分组，不同的体重或相同的体重放在同一个笼时，这就 需要编号标记。标记的方法很多，良好的标记方法应满足标号清晰、耐久、简便、适用、无 明显损伤、无毒和易辨认等要求。标记的方法有染色标记法、号牌法、打孔剪口法和剃毛、 剪毛法。

动物细胞培养技术小鼠脾脏细胞

姓名：XX 系年级：2013级XX班学号：201300XXXXXXX 实验题目:动物细胞培养同组者: XXXXX 动物细胞培养技术 【实验目的】 1.学习掌握细胞培养的基本原理以及具体方法，并对小鼠脾细胞进行原代培养； 2.掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用； 3.学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法； 4.学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数，计算细胞存活率； 【实验原理】 （一）. 动物细胞培养技术 动物细胞培养技术是指从动物体内取出组织或细胞，在体外模拟动物体内的生理坏境，在无菌，适当温度和一定的营养条件下，使之生存，生长和繁殖，并维持其结构和功能的方法。 细胞培养的意义:⑴.具有其他生物技术无可比拟的优点；⑵.培养条件易改变和控制，便于 单因子分析；⑶.便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察；⑷.在生物学的各个领域（如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已被广泛应用 细胞培养的局限性：（1）.在脱离机体复杂环境下，细胞培养条件与躯体环境有一定距离； (2).观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况；(3).细胞培养得到的产物少。 培养细胞的生存条件有水的质量、无菌环境，最适温度、渗透压、气体条件、最适PH、营养条件和培养基质等。 细胞培养的方法：1. 原代培养：直接从生物体内获取细胞，组织或器官，进行体外培养直 至第一次传代为止。2. 传代培养：当培养的细胞增殖达到一定密度之后，则需要再做培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1:2或其他比例转移到另一个容器中的扩大培养。原代细胞培养的方法有：单层细胞培养法和组织块培养法 细胞传代培养包括：贴附生长细胞的传代：洗细胞——酶消化——接种——观察 悬浮生长细胞的传代：A.直接传代 B.离心传代 单层培养细胞的生长过程分为：游离期，吸附期，繁殖期，维持期，衰退期 培养细胞的形态分型：A. 贴附型 B.悬浮型 （二）. 细胞死活鉴定 细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。 活细胞和死亡细胞在生理技能和性质上主要存在一下差异： ①细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只

药理学实验基础知识与总论实验

实验一、药理学实验的基础知识和药理学总论实验 一、实验动物的基本技能和实验技术基础 1、实验动物的标记 大、小鼠和白色家兔的标记常用3～5％黄色苦味酸溶液涂于皮毛上标号。常用的方法：1号 --- 左前腿 2号 --- 左腰部 3号 --- 左后腿 4号 --- 头部 5号 --- 正中 6号 --- 尾根部 7号 --- 右前腿 8号 --- 右腰部 9号 --- 右后腿 10号 ---不标记 2、实验动物的捉持（大、小鼠） (1)小鼠的捉持用右手提起鼠尾，放在粗糙物（如鼠笼盖）上面，向后轻拉鼠尾；用左手拇指和食指捏住其两耳颈背部皮肤，将小鼠固定在掌中，使其腹部朝上，然后以无名指和小指夹住鼠尾或小鼠的左后肢。 （2）大鼠的捉持捉持和固定方法基本同小鼠，无经验者可戴上防护手套，并应动作轻柔。用右手捉住鼠尾，放在鼠笼盖上，向后轻拉鼠尾；左手掌面向鼠背，食指和中指压住鼠的头顶，拇指和无名指分别从鼠的两腋下插入，将鼠的两前肢卡住；或拽紧鼠后颈及后背皮肤即可。 3、实验动物的给药方法（大、小鼠） （1）小鼠的给药方法 灌胃（ig）：将小鼠固定后，使颈部拉直，右手持装有灌胃针头的注射器，自口角插入口腔，压其头部，使口腔与食道成一直线，沿上腭壁向鼠口腔的后下方轻轻插入食道。如遇阻力，可将针头抽出再插，以免刺破食管或误入气管。一般给药量为0.1-0.3ml/10g（体重）。 皮下注射（H或sc）：常在背部皮下。轻轻捏起背部皮肤，将注射针头刺入皮下，稍稍摆动针头，若容易摆动则表明针尖位于皮下。然后注入药液。一般给药量为0.1-0.20ml/10g （体重）。 腹腔注射（ip）：左手固定动物，右手持注射器，从下腹部外侧，呈45度角刺入腹腔，进针约3～5mm（注意：进针不宜过深，以免伤及肝脏和脾脏。注药前回抽一下，无回血时再注药）。一般给药量为0.1-0.3ml/10g（体重）。 肌内注射(im)：多注射于后肢股部肌肉，一般每侧不超过0.1ml。 尾静脉注射（iv）：将小鼠置于固定筒内，使尾部露在外面，用70％～75％的乙醇棉球擦尾部，或将鼠尾浸入45～59oC温水中，待尾部左右侧静脉扩张后，左手拉尾，右手进针。一般给药量为0.1-0.2ml/10g （2）大鼠的给药方法 均同小鼠。一般情况下，灌胃剂量为1～2ml/100g，皮下注射、尾静脉注射<1ml / 只，腹腔注射为1.5ml /只，肌内注射为

《细胞工程学》(实验)教学大纲

《细胞工程学》（实验）教学大纲 课程代码：13.012 课程名称：细胞工程学（Cell Engineering） 学时学分：总学时56学时，实验课学时20学时；课程总学分3.5。先修课程：普通生物学；细胞生物学；遗传学；细胞生物学；发育生物学。实用专业：生物技术、生物学 一、课程性质和任务 细胞工程学是应用细胞生物学和分子生物学原理与方法，在细胞水平上研究改造生物遗传特性，以获得具有目标性状的细胞系或生物体的有关理论和技术的学科。它是一门现代生物科学理论和工程技术相结合的综合性学科。 细胞工程学是生物技术、生物学及生物工程*专业学生的必修专业课，也是我校其它生物类各本科专业学生的重要选修课。先修主要基础课程有普通生物学、发育生物学、遗传学、生理学、生物化学。 细胞工程是现代生物技术的重要组成部分，同时也是现代生物学研究的重要技术工具。要求学生通过本课程的学习掌握生物组织、器官及其细胞离体培养的原理与技术，为从事生物学领域的相关研究及其与细胞工程有关的生物技术产业奠定良好的理论和技术基础。 二、教学目标和要求 （一）理论知识方面 重点掌握本学科的基本原理和基本技术即：细胞全能性学说在细胞工程中的指导作用；培养条件下的细胞分化和器官发生的调控；离体培养条件下的遗传与变异特点。掌握不同组织、器官的培养特点和控制方法。了解细胞工程的各类技术在现代生物学与生物技术领域的应用途径与发展潜力。 （二）实践技能方面 重点掌握细胞工程的基本操作技术—无菌操作；掌握外植体选择、愈伤组织和胚状体诱导、器官发生调控等基本技术；了解细胞大批量培养方法，原生质体分离与体细胞杂交技术。

三、实验内容与学时分配

实验动物知识学习大纲概述

实验动物知识学习大纲 实验动物法规知识 1、1988年，原国家科委颁布了2号令《实验动物管理条例》 2、1988年，广东省人民政府颁布了《广东省实验动物管理条例》 3、1993年，原国家科委颁布了16号令《药物非临床研究质量管理办法》 4、1994年，原国家技术监督局颁布了实验动物的《中华人民共和国国家标准》文件一批 5、1997年，原国家科委、原国家技术监督局颁布了593号文《实验动物质量管理办法》 6、1997年，原国家科委、卫生部、农业部、原国家医药管理局发布了文件《关于“九五”期间实验动物工作发展的若干意见》 7、2001年，国家科技部等7大部委联合颁布了《实验动物许可证管理细则（试行）》 8、2001年，国家质量监督检验检疫总局发布了实验动物的《中华人民共和国国家标准》文件一批，定于2002年5月1日起实施。新的国家标准取消了普通级小鼠、大鼠，取消了亚屏障环境标准。对饲养豚鼠家兔犬和猴的普通级开放系统的环境，增加了换气次数、落下菌数和日温差控制等要求。 9、2002年，广东省科技厅等8大厅局部制定了《广东省实验动物许可证管理细则（试行）》。决定对在广东省行政区域内从事与实验动物有关工作的单位和个人，实行实验动物许可证制度，实验动物许可证由广东省科技厅印发，包括“实验动物生产许可证”和“实验动物使用许可证”，许可证每5年发放一次，每年实行年检。 10、2003年，广东省科技厅下发《关于开展我省首批实验动物许可证评审工作的通知》，对2003年上半年申办实验动物合格证的28家单位进行了首批实验动物许可证评审工作。 11、2003年，广东省科技厅颁发了《关于印发实验动物许可证申领办法的通知》，组织了专家对受理单位进行了现场考察，现场考察主要内容有：⑴申办单位主管领导进行实验动物政策法规考察；⑵对实验动物从业人员进行实验动物知识和技能考察；⑶对申办材料的内容进行现场考察核对。 12、2003年，广东省科技厅下发《关于在我省全面实施实验动物国家标准2001修订版的通知》。通知决定：将小鼠、大鼠分为清洁级SPF级和无菌级，取消普通级。2003年不再发放普通级大小鼠合格证，已取得的普通级大小鼠合格证到2003年5月1日自然失效。各单位要加紧建设SPF级动物设施，以满足科研需要。 实验动物学知识 1、实验动物、实验动物学的概念 实验动物（Laboratory Animal,LA），指由人工培育，来源清楚，遗传背景明确，对其携带的微生物和寄生虫实行监控，用于生命科学研究、药品与生物制品生产和检定，以及其他科学研究的动物。 实验动物科学（Laboratory Animal Sciences），是研究有关实验动物和动物实验的一门新兴科学。简言之，实验动物科学是专门研究实验动物的生物特性、饲养繁殖、遗传育种、质量控制、疾病防治和开发应用的科学。 2、实验动物具有的三大特点： 1）、遗传学特点；2）、微生物与寄生虫的监控特点；3）、应用特点 3、实验动物学的分支学科有哪些：

动物细胞培养室布局设计SICOLAB

动物细胞培养室布局设计SICOLAB 随着动物细胞培养技术在组织学与胚胎学、细胞生物学、肿瘤学、免疫学、营养学、药理学、毒理学等学科的广泛应用，促使细胞培养技术的普及已成为一种可能。目前，有许多基层科研机构正在建立动物细胞培养实验室，SICOLAB就细胞培养室的硬件建设谈点看法，供参考。1总体原则 1.1净、污分流细胞培养室与相关辅助用房必须分开。培养室内环境要求清洁、空气清新、无尘、干燥。 1.2布局合理，方便操作所有实验室的布局要求统一、协调，最好相邻，以利于工作;室内各项设备安排要紧凑，节省空间，方便工作，避免交叉干扰。 2细胞培养实验室 2.1准备室主要用于培养器皿的洗涤、消毒、培养物的准备和物资保存等。为避免相互间不必要的生物或化学污染，可以数间小室组成为佳;准备室应具备良好的通风和采光，但应避免灰尘污染。 2.1.1洗涤区设有水槽、洗涤池，地面应设置地漏，以利水渍快速干燥。 2.1.2消毒区供物品和器械消毒及烘干用，常用消毒方法有干热法和湿热法。因设备耗电量大、产热量高，应单独配备供电线路。 2.1.3制水区用于制备符合实验要求的清洁水，以供洗涤培养器具和配制培养液用。要求供、排水方便。 2.1.4控温设备区主要放置冰箱、低温冷藏箱、培养箱等设备，以保存实验室内需低温保存的物品，如细胞株、某些试剂、酶、培养基、配制好的溶液及供实验室内常规培养和孵化胚胎等需要。 2.1.5精密仪器区主要放置电子天平、酶标仪、分光光度计等设备。要求工作台有较好的水平度、有较高的抗震能力、环境温湿度变化小、无尘等。 2.2培养室 2.2.1缓冲间常设于培养室外，要求清洁、干燥和不通风，并设置紫外灯等必要的环境消毒设备。 2.2.2培养室常称无菌室，是专门用于进行细胞培养和各种无菌操作的实验室，要求清洁、干燥、无菌、不通风。室内除放置CO2培养箱、超净台、倒置镜、水浴摇床、离心机和冰箱等设备外，还应有放置无菌器具的橱柜和一定的操作空间。 2.3其他实验室根据研究方向可配套建立诸如细胞遗传学实验室、细胞生物学实验室、分子生物学实验室、电生理实验室、生化实验室、形态学工作室等。 3配备仪器设备 3.1超净工作台是目前普遍应用的无菌操作装置。按气流方向的不同可分为水平流和垂直流二种，以垂直流超净台较为常用，气流从上向下流动，形成气流屏障，能较好地保持台面无菌和操作条件。 3.2控温设备主要指CO2培养箱、三气(O2、N2、CO2)培养箱、隔水式电热恒温培养箱、生化培养箱、小型孵化器、冰箱、低温冷藏箱、制冰机、水浴摇床、水浴箱等设备。主要提供细胞源(如胚胎)、处理细胞源、培养细胞、保存药品和细胞株。 3.3离心机常用为低速离心机，但某些特殊细胞需要控温故应配置一台冷冻离心机。3.4显微设备必须放置一台倒置显微镜，以便随时观察细胞，掌握情况。最好附带照相装置，以随时拍照，记录细胞生长情况。另外应根据需要选配相差装置、荧光装置、保温装置、缩时拍摄电影装置等。为更好分析处理细胞培养结果，还应配置显微图像捕获装置和相应分析处理系统(含计算机)。 3.5细胞计数设备一般可借助血细胞计数板进行计数，有条件者可选购电子细胞计数仪。

常用实验动物的实验基本操作技术

常用实验动物的实验基本操作技术 第一节常用实验动物的生物学特征 1．蛙（或蟾蜍）的生物学特点是什么？主要用于哪些实验？ 属于两栖变温动物，皮肤光滑湿润，有腺体无外鳞。蛙的心脏有两个心房，一个心室，心房与心室区分不明显，动静脉血液混合，有冬眠习性。生存环境比哺乳动物简单，在机能学实验中有多种实验选择该动物。如：①离体蛙心实验，常用来研究心脏的生理功能及药物对心脏活动的影响。②蛙的腓肠肌和坐骨神经可用于观察外周神经及其肌肉的功能，以及药物对周围神经、骨骼肌或神经肌肉接头的影响。③缝匠肌可用于记录终板电位。脊休克、脊髓反射、反射弧分析、肠系膜微循环等。在临床检验中，可用雄蛙作妊娠反应实验。 2．小白鼠的生物学特征是什么？主要用于哪些实验？ 小白鼠性情温顺，易于捕捉，胆小怕惊，对外来刺激敏感。它胃容量小，不耐饥渴，随时采食。在机能学实验中常选用该动物。故适用于大量的实验动物，如：某些药物的筛选实验、半数致死量（LD50）测定、药效比较、毒性实验、妊娠期20天左右，常用于避孕药实验及抗癌药实验。 3．大白鼠的生物学特征是什么？主要用于哪些实验？ 大白鼠性情温顺，行动迟缓，易于捕捉，但受惊吓或粗暴操作时，会紧张不安甚至攻击人。大鼠嗅觉发达，对外界刺激敏感，抵抗力较强。大鼠无胆囊，肾单位表浅，肝再生能力强。大鼠的血压反应比兔稳定，可用它作血压实验，也可用于慢性实验、抗炎、降脂、利胆、子宫实验及心血管系统的实验。药典规定该动物为催产素效价测定及药品指控中升压物质检查指定动物。 4．豚鼠生物学特征是什么？主要用于哪些实验？ 豚鼠性情温和，胆小，饲养管理方便，可群养。豚鼠耳蜗管发达，听觉灵敏，存在可见的普赖厄反射（听觉耳动反射），乳突部骨质薄弱。豚鼠对组织胺、人型结核杆菌很敏感。能耐受腹腔手术，使用于肾上腺机能的研究。其自身不能制造维生素C，是研究实验性坏血症的唯一动物。 5．家兔生物学特征是什么？主要用于哪些实验？ 家兔属于草食性动物，性情温顺但群居性差，听觉、嗅觉十分灵敏，胆小易惊，具夜行

第三章实验动物的基本知识

第一节　常用实验动物的种类及应用 从严格意义上讲，教学和科研等工作中使用的动物应称为实验用动物，它主要包括以下三大类动物：①实验动物，指为了科学研究、教学、生物制品或药品鉴定、诊断等目的而经人工培育，对其携带的微生物实行控制，遗传学背景明确或来源清楚的动物；②野生动物，指直接从野外捕获，性状未受人为控制的动物；③家畜（禽），指为满足人类社会生活需要而繁殖和饲养的动物。 现将动物生理学实验中经常用到的蟾蜍、青蛙、家兔、小鼠、大鼠、猪、狗、猫、鸡、鸽、山羊、绵羊、马、牛14种动物分别介绍如下。 一、蟾蜍和青蛙 蟾蜍和青蛙均属两栖纲、无尾目，蟾蜍属蟾蜍科，青蛙属蛙科。它们品种很多，是脊椎动物由水生向陆生过渡的中间类型。 蟾蜍和青蛙生活在田间、池边等潮湿环境中，以昆虫等幼小动物为食料。冬季潜伏在土壤中冬眠，春天出土，水中产卵，体外受精。幼体称为蝌蚪，形似小鱼，用鳃呼吸，有侧线，以水中植物为主要食料。幼体经变态发育为成体，尾巴消失后到陆地上生活，用肺呼吸，同时其皮肤分泌黏液，辅助呼吸。蟾蜍和蛙身体背腹扁平，左右对称，头为三角状，眼大并突出于头部两侧，有上、下眼睑和瞬膜以及鼻、耳等感受器官。前肢有4趾，后肢有5趾，趾间有蹼，适于水中游泳。其器官、系统逐渐完善，反映出由水生向陆生过渡的特征。雄蛙头部两侧各有一个鸣囊，是发声的共鸣器（蟾蜍无鸣囊），雄蛙的叫声特别响亮。蟾蜍背部皮肤上有许多疣状突起的毒腺，可分泌蟾蜍酥，尤以眼后的椭圆状耳腺分泌毒液最多。蟾蜍每年2月下旬至3月上旬发情一次，发情后于4～7月间排卵，产仔1 000～4 000个，寿命10年。蟾蜍和青蛙在我国分布广泛，夏、秋季各地均容易捕捉，也易养活。在捕捉和饲养等方面，蟾蜍比青蛙要方便，故在实验中广泛使用。 蟾蜍和青蛙是生物实验中常用的动物，特别是在生理、药理实验中更为常用。蛙类的心脏在离体情况下仍可有节奏地博动很久，所以常用来研究心脏的生理功能、药物对心脏的作用等。蛙类的腓肠肌和坐骨神经可以用来观察外周神经的生理功能，也可观察药物对横纹肌或神经-肌肉接头的作用等。蛙还常用来作脊髓休克、脊髓反射和反射弧的分析，以及肠系膜上的微循环观察等实验，还常利用蟾蜍下肢血管灌注方法观察肾上腺素和乙酰胆碱等药物对血管的作用等。

动物细胞培养实验室构建方案

动物细胞培养实验室构建方案 细胞学在生命科学科中起着至关重要的作用，近年来细胞学蓬勃发展，并取得了重大的进展，细胞实验室的构建也是各个院校生物学科必备的实验室。 细胞实验谨慎复杂，需要的实验设备种类繁多，下面就一些动物细胞实验室必备仪器进行简单介绍： 一、CO 2培养箱 CO 2培养箱是细胞培养的必备仪器，它为细胞提供了一个体外 培养的舒适环境，如适宜的温度、湿度、酸碱度、O 2浓度等。细 胞在体外培养时很容易受到各种细菌、微生物的感染，因此，CO 2 培养箱的灭菌和抑菌能力就显得尤为重要。 Thermo Scientific 8000系列CO 2培养箱具有专业的灭菌和抑菌 功能。如140℃，12Hour 干热灭菌，能有效杀死各种微生物；Hepa 过滤器，腔体内达到100级空气质量；不锈钢抛光内胆，有效抑制微生物附着；银离子消毒盒防止水盘中水染菌等，为您的细胞培养保驾护航。 二、纯水系统 细胞培养用水一般要求双蒸水（0.8M Ω以上），实际上普通蒸馏水经玻璃器皿 中按标准方法蒸馏二次得到的双蒸水是不能满足要求的，而且水中的内毒素直接参 与细胞凋亡，血清中内毒素含量越低，对细胞毒性越小，越利于细胞的生长和传代；内毒素含量过高，会直接导致细胞提前老化。因此建议配置正式的水纯化系统。 Thermo Scientific Barnstead 纯水机水质稳定有保证，耗材寿命长，运程成本低廉，是您实验室纯水系统优质的选择。 三、超净工作台/生物安全柜 细胞培养对无菌环境要求很高，在细胞操作时，一般需要在100级空气质量条件下进行，因此超净工作台或生物安全柜就必须配备。 新加坡ESCO 超净工作台和生物安全柜，为您提供更加安全的防护。 四、液氮罐 为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般为液氮温度-196℃，因此，需要液氮罐。在此环境中，一般细胞可以保存十年具有活性。 图 1 Thermo Scientific 8000 CO 2培养箱 图2 Thermo Scientific Barnstead 纯水机