文档库

最新最全的文档下载
当前位置:文档库 > 血样DNA提取方法

血样DNA提取方法

酚-氯仿法从全血中分离DNA

血样DNA提取方法

二、操作步骤

第一阶段:裂解与消化

1、冰冻的血样在室温水浴中融化;

2、将2 mL全血转入一个无菌的2 mL离心管中;

3、4 ℃12000rpm离心10 min;

4、弃掉液体,保留沉淀,加入1.5 mL的PBS缓冲液,涡旋震荡使沉淀悬浮起来,冰上温

和摇动15 min;

(2、将1 mL全血转入一个无菌的2 mL离心管中;

3、加入等体积(1 mL)的PBS缓冲液,温和摇动15 min;)

5、4 ℃12000rpm(3500 g)离心10 min,弃掉液体,保留沉淀;

6、重复步骤4、5一次;至上清液透明,沉淀无色;

6、用蓝枪头将沉淀捣碎,呈絮状(关键步骤,越碎越好);

7、离心管中加DNA提取液500μL-1 mL, 37 ℃水浴1 h,加蛋白酶K 3 μL -6 μL;(终浓度为60 μg/mL),混匀;

8、在恒温水浴箱中37 ℃(55 ℃)温育过夜(16 h左右),至细胞沉淀物被完全消化,溶液澄清;

10、反应液冷却至室温,加入1 mL的Tris饱和酚,放置冰上温和摇动20 min;

11、4 ℃,12000 rpm离心10 min;

12、将上层水相用移液器移到另一2.0mL灭菌离心管中;

13、加入0.5 mL的饱和酚和0.5 mL的氯仿,放置冰上温和摇动20 min;

14、4 ℃,12000 rpm离心10 min;

15、将上层水相用移液器移到另一2.0mL灭菌离心管中;

16、加入1 mL的氯仿,放置冰上温和摇动20 min;

17、4 ℃,12000 rpm离心10 min;

18、将上层水相用移液器移到1.5mL离心管中;

19、加入1mL预冷无水乙醇(?20 ℃),轻轻口底摇晃多次至DNA析出,然后?20 ℃放置

30 min(-20或-40均可);

20、用玻璃钩将DNA团钩出转入一新的灭菌离心管中,或4 ℃,12000 g离心10 min,弃

去乙醇;或者4 ℃,12000 rpm离心10 min,弃去乙醇;

21、加入70% 乙醇1 mL,温和摇动10 min;

22、4 ℃,12000 rpm离心10 min,弃乙醇,重复漂洗一次(用移液枪将管底剩余酒精吸出);

23、真空干燥或室温下使乙醇挥发干净;或者,室温放置30min,60℃烘箱30s,使乙醇挥发干净;

24、根据DNA的量,加入超纯水50-300 μL,4 ℃保存至DNA完全溶解,分光光度计测定浓度后,-80 ℃保存。