高效液相色谱应用中的若干问题与解决方法1
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高效液相色谱应用中的若干问题与解决方法Ξ
李海生,白海娇
(天津市药品检验所,天津 300070)
摘 要 本文针对高效液相色谱应用中存在的13个共性问题予以分析,并提出了相应的解决方法。关键词 高效液相色谱法,流动相,异常峰,梯度洗脱条件
中图分类号:R917 文献标识码:A 文章编号:100625687(2006)022*******
高效液相色谱法(HP LC)作为一种成熟的方法被广泛应用,特别在医药、食品、环保、化工等领域更是不可缺少的分析手段。在应用中,随着具体分析对象的不同而出现各种各样的实际问题,这些问题直接影响分析工作的继续进行。为此,笔者归纳了在工作中遇到的一些带有共性的问题与解决方法。实践证明,这些解决方法是可行的。
1 梯度洗脱条件的设计
同样的梯度洗脱条件(即比例),如洗脱方式不同,可能得到不同的结果。例如,某个标准中规定人参皂苷的梯度洗脱条件如下:
时间(min)乙腈(%)水(%)
01684
201882
554060
654060
759010
801684
若采用流动相A为乙腈,流动相B为水直接混合的方式,用两个泵的高压梯度装置还能满足要求,如果采用电磁阀混合的低压梯度装置,两种溶剂先抽滤脱气,由于两种溶剂中空气溶解度的不同,再混合时也非常容易出现气泡,导致泵压力的不稳定及异常峰的出现,另外也容易导致基线的漂移,从而影响峰的积分值。因此,建议改为如下的洗脱方式:流动相A为乙腈-水(16∶84),流动相B为乙腈-水(90∶10),则梯度洗脱可改为以下条件:
时间(min)流动相A(%)流动相B(%)
01000
2097.5 2.5
5567.532.5
6567.532.5
750100
801000
由于乙腈与水经过预混合后再减压抽滤,因此基本上可以避免梯度中气泡的产生,以第三步梯度洗脱条件为例,可用下列公式计算出流动相(A)的比例,其他以此类推。
16%X+(100-X)
100
=
40
100X
=67.5
2 负峰的消除
理论上当样品池的吸收值低于参比池时可产生负
5
天津药学 T ianjin Pharmacy 2006年4月 第18卷第2期Ξ收稿日期:2005207204
峰现象,因此要求用流动相溶解或稀释样品,但也有个别样品即使采用流动相溶解样品,仍然出现较大的负峰,如盐酸氨基葡萄糖的进口标准中流动相为0.05%磷酸溶液-乙腈(300∶200),当用流动相配制的对照品或样品溶液(2mg/ml)进样时,在主峰后产生一较大负峰而影响积分,注入相同体积的流动相则无负峰出现。据此分析认为,盐酸氨基葡萄糖为一两性化合物,极性较大,特别是由于结构中含有氨基,极可能与检测池壁产生相互作用,伴随吸附与解吸附的进程,影响到光路而产生了负峰等现象。倘若在流动相中加入NH4+应能解决这个问题。为此在流动相中加入0.03m ol/L的硫酸铵,其他条件不变,使负峰消失。
3 进样量对重复性的影响问题
采用自动进样器一般不存在该问题,当用进样阀手动进样时应注意进样量的问题。例如在做体内药物分析时,定量盘管体积为20μl,由于样品体积有限并需多次测定,导致进样量不够,其结果是样品溶液未能完全取代定量盘管中的流动相,导致重现性不好。因此建议样品体积至少应该是定量盘管体积的2倍以上。此外,当定量盘管的体积>50μl时,应注意进样速度对重复性的影响。
4 进样量对分离效果的影响问题
这是一个容易被忽视的问题。特别是由于样品性质的特殊性导致溶解样品的溶剂与流动相组成不同时,更应注意该问题。例如在做靛蓝、靛玉红分析时,对照品及样品溶液为氯仿溶液,流动相为甲醇-水(70∶30),当进样量为20μl时,由于色谱系统不能平衡而出现异常峰,如将进样量改为10μl,则出峰正常。
再如乳果糖口服液的分析,样品与对照品均用水溶解与稀释,流动相为乙腈-水(80∶20),色谱柱为氨丙基键合硅胶柱,由于该系统属正相色谱系统,水的量对峰的分离与保留行为影响明显,当进样量为20μl 时,峰形对称性不好,且乳果糖与乳糖峰几乎重叠,若将进样量改为10μl,则不存在上述问题。
5 具有-NH2结构药物的峰托尾问题
具有-NH2结构的物质多呈碱性,特别在酸性条件下可形成-NH3+,若用硅胶为基质的键合填料,如C18、C8等,由于硅胶填料含有硅羟基(-Si-OH),二者相互作用而导致托尾现象,并影响方法的重现性。解决的方法是向流动相中加入0.05～0.1m ol/L的硫酸铵。由于硫酸铵为中性盐,加入后不会明显影响流动相pH值。笔者以上述方法很好地解决了依达拉奉、地斯氯雷他定、甲磺酸罗哌卡因和复方阿米三嗪与萝巴新(四氢蛇根碱)的峰对称问题。
6 用于流动相的甲醇与乙腈的特点分析
甲醇与乙腈各有其选择性和特点,在实际工作中可参考以下具体情况予以选择。在适用性基本相同情况下应选择乙腈,原因有以下几个方面:①毒性:乙腈中含有异腈,具有神经毒,但其残存量甚微,加之沸点相对较高(82℃),故毒性作用低于甲醇,甲醇的沸点较低(65℃)并对视神经有很强的毒害作用(必须用甲醇时,一定要注意通风);②黏度:乙腈的黏度为0.38,甲醇的粘度为0.55,一般而言,由乙腈组成的流动相其压力较甲醇系统低10～20kg/cm2;③吸收度方面以210nm处的吸收值为例,色谱纯乙腈一般吸收值为0104,而色谱纯甲醇的吸收值为0.60,二者相差15倍,因此当用低波长时(≤230nm)应尽量选择乙腈,以降低本底吸收而提高检测灵敏度。
但有些分析,甲醇不可取代,例如用一根反相色谱柱和甲醇-磷酸盐缓冲液系统,可同时基线分离测定注射用水溶性维生素中10种成分,其中包括维生素C、盐酸硫胺、盐酸吡哆醇,烟酰胺、泛酸钠、叶酸、生物素、维生素B12、核黄素磷酸钠和对羟基苯甲酸甲酯,如改用乙腈,则分离效果很差。
7 由过滤引起的异常峰问题
在做进口药品米索前列醇片的有关物质检验时,在三种异物杂质-8-差向米索前列醇、A型和B型米索前列醇峰后,还出现一个较大的未知峰,若将该峰计算在内,则有关物质超出限度规定而不合格。经多方位查找原因,最后锁定在过滤环节上,由于米索前列醇的检测采用紫外末端的200nm,因此滤材上洗脱下来的成分形成了未知峰,出现这种情况以滤纸过滤为最严重,滤膜次之。将滤液经6000r/min离心15min,取上清液再进行检测予以解决。
8 积分仪或工作站中Drift功能的使用
在做皮质激素或氨苄青霉素的有关物质检查时,采用梯度洗脱,随着有机溶媒量的增加,基线不可避免地有所增高或漂移,此时有必要设定Drift值(一般与Slope值相同即可),使位于漂移基线上的有关物质以拐点至拐点方式积分并扣除漂移点至原基线部分,这样保证了测定结果的准确性,否则测定值偏高。
9 流动相的pH
流动相的pH值对有些样品分析起着关键性的作用,例如鹅去氧胆酸(C DC A)、熊去氧胆酸(UDC A)、胆酸(C A)、去氧胆酸(DC A)、猪去氧胆酸(H DC A)的分析,流动相为甲醇-水系统(75∶25)并用10%的高氯酸调节pH值至3.0。如果pH值在3.0以上,由于胆酸类成分存在未解离与解离两种状态而出现异常峰。再如测定18种氨基酸注射液,流动相(A)的pH要求为6150±0.5,超过该范围则可引起组氨酸峰与甘氨酸峰
6天津药学 T ianjin Pharmacy 2006年4月 第18卷第2期
的重叠,因此要求酸度计的性能应符合要求,并在调节中严格按照S OP操作。另外,还应注意,调节pH值后的流动相在放置过程中可能发生变化。
10 泵压力的波动问题
该问题可以从以下两方面做重点排查。
(1)柱塞的密封圈老化。当仪器使用015年以上时,且泵压力在2～5kg/cm2范围内波动,泵头处会出现轻微漏液(或可观察到析出的白色盐类),多为密封圈失效所致,应找专业人员更换。
(2)在做脂溶性维生素分析时,流动相多为己烷,在分析过程中,有可能出现泵压力的波动,其波动的范围高达10余kg,上述问题的出现是由于己烷的黏度小(η=0.31),加之泵性能(指单向阀的性能)较差所致,可考虑在不影响分离的前提下,在流动相中加入5%～10%的乙醇(η=1.20),以增加流动相的黏度,可解决上述问题。
11 溶解与分析用流动相的一致性问题
当采用紫外末端波长为200～210nm检测时,如果配制样品所用的流动相与分析时所用流动相不是同一次配制,经常会发生在主峰前出现负峰问题,例如米索前列醇粉的含量和有关物质测定采用210nm检测,流动相为乙腈-水(50∶50),进样量为100μl,若不是同一次配制的流动相,在米索前列醇峰前就会出现一明显负峰,而这个位置恰好是有关物质之一的8-表米索前列醇的出峰位置,如改用同一次配制的流动相,则不会出现上述问题。12 同系列离子对试剂和色谱行为带来的影响理论上同系列离子会随着烷烃链的长短有规律地影响试剂峰的保留时间,多数教科书也是这样记载。笔者在做乙酰半胱酰氨酸泡腾片的基础研究工作时发现,离子对试剂还会影响到组分的色谱行为。例如使用同一根色谱柱和流动相组成,只是将流动相中庚烷磺酸钠换成相同摩尔浓度的辛烷磺酸钠,结果出峰顺序由乙酰半胱氨酸、半胱氨酸、N,N-二乙酰胱氨酸、N,S-二乙酰半胱氨酸、胱氨酸变成了乙酰半胱氨酸、N,S-二乙酰半胱氨酸、N,N-二乙酰胱氨酸、半胱氨酸、和胱氨酸。其原因只能解释为不同离子对试剂所形成的对离子的保留系数不同所致。
13 自身对照法和归一化法测定结果的差异
对有关物质检查时,以含1%有关物质计算,其主峰峰面积大约为有关物质峰面积的100倍,若用归一化法计算,很可能存在非线性的问题,而采用自身对照法测定,可以克服上述问题及积分上可能存在的误差,使结果更接近真实值。笔者用上述两种方法考查了3批氨苄西林钠中有关物质的测定结果,归一化法的结果分别为0.20%、0.20%和0.19%,而自身对照法的结果分别为0.25%、0.25%和0.26%,归一化法的测定值比自身对照法低约20%。
作为分析工作者,不仅要熟悉所使用仪器的性能,也需要掌握基本故障的判断能力和解决方法,否则一个小的故障也要等仪器供应商的维修部门来解决,往往耽误工作。
流感与人禽流感Ξ
黄淑萍
(天津市海河医院,天津 300350)
摘 要 流行性感冒(流感)是一种由流感病毒引起的感染性疾病,上世纪全球曾发生数次流感大爆发,目前防治方法日趋完善。禽流感是禽流行性感冒,自1997年首次发现人感染禽流感病毒以来,世界各地不断有散发的人感染禽流感病例。研究资料表明,禽流感病毒与人生活密不可分,应引起广泛重视。
关键词 流感,禽流感,预防治疗
中图分类号:R511.7 文献标识码:A 文章编号:100625687(2006)022*******
1 流行情况回顾
流行性感冒是历史上死亡人数最多的呼吸道传染病,简称流感。流感爆发流行一般在冬季,但爆发的强度和时间都无法预测。流感流行史可追溯到几百年以前,但未得到病原学和血清学的验证。至今共发生过有可靠证据并得到大家所公认的4次世界性流感大流行[1],分别为1918—1919年西班牙流感、1957年亚洲流感、1958年香港流感、1977年俄罗斯流感。第1次和
7
天津药学 T ianjin Pharmacy 2006年4月 第18卷第2期Ξ收稿日期:2006202227