Takara_QuickCut限制性内切酶

常用限制性内切酶酶切位点汇总

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限制性内切酶

限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（一般4-8bp），并在此处切割DNA双链的核酸内切酶。主要存在于原核生物，是原核生物自我保护的一种机制。它的作用包含两类,一种是对外的,限制作用,指一定类型的细菌可以通过限制性核酸内切酶的作用,破坏入侵的外源DNA,使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制。另一种是对内的，修饰作用，指在特定位置发生甲基化，可免遭自身限制性酶的破坏。 限制性核酸内切酶的发现是在本世纪中期，Arber等人对λ噬菌体在大肠杆菌不同菌株上的平板培养效应的研究为基础，发现了原核生物体内存在着寄主控制的限制和修饰系统。实验是：在K株或B株大肠杆菌上生长繁殖的噬菌体λ（K）或λ（B），再次感染原寄主菌体的成斑率为1，而感染新的寄主菌株的成斑率则分别为10-4和4*10-4所以说受到了限制。在 20 世纪 60 年代，噬菌体学家阐明了宿主限制和修饰现象的生化机制。该研究工作在 Me-selson 和 Yuan（1968）纯化得到了大肠杆菌 K12 的限制性内切酶时达到高峰。因为这个内切酶可以把未修饰的 DNA 切割成大的分离片段，人们认为它一定识别一个靶序列。从而提供了对 DNA 进行可控操作的前景。但不幸的是，K12 内切酶不具备人们希望的性质。虽然它确实是结合到一定的区域序列上，切割却在几千个碱基对以外“随机”发生的（Yuan 等，1980）。经过大量努力后，终于在1970 年取得了突破，人们发现了在流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）中存在一种酶，其作用更加简单（Kelly & Smith，1970；Smith & W ilcox，1970），即这个酶可以识别双链 DNA 分子中的一个特定靶序列，并在该序列之内切断多聚核苷酸链，从而产生长度和序列一定的分离片段。突破性的进展始于 Hamilton Smith 的发现，他从嗜血流感细菌（Haemophilus influenzae）菌株 Rd中找到了一种限制性内切酶（Smith & Wilcox，1970），并阐明了它在噬菌体 T7 DNA 中切割的核苷酸序列（Kelly & Smith，1970）。这个酶现在命名为 Hind Ⅱ。嗜血流感细菌还具有另一个Ⅱ型的限制酶 Hind Ⅲ，而且含量很大。幸运的是，Hind Ⅲ不切割T7 DNA，因此 Hind Ⅱ制剂中可能混有的 Hind Ⅲ将不产生任何问题（Old 等，1975）。在发现 HindⅡ后不久，又分离到其他几个Ⅱ型的限制性内切酶，并分析了它们的性质，EcoRⅠ是其中最重要的一个（Hedgepeth 等，1972）。它们随即迅速用于最初的重组 DNA 实验中。

限制性内切酶酶切位点汇总

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常用限制性内切酶酶切位点保护残基

酶切位点保护碱基-PCR引物设计用于限制性内切酶 发布: 2010-05-24 20:19| 来源:生物吧| 编辑:刘浩| 查看: 161 次 本文给出了分子克隆中常用限制性内切酶的保护碱基序列，如AccI，AflIII，AscI，AvaI，BamHI，BglII，BssHII，BstEII，BstXI，ClaI，EcoRI，HaeIII，HindIII，KpnI，MluI，NcoI，NdeI，NheI，NotI，NsiI，PacI，PmeI，PstI，PvuI，SacI，SacII，SalI，ScaI，SmaI，SpeI，SphI，StuI，XbaI，XhoI，XmaI， 为什么要添加保护碱基？ 在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。 其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。 该如何添加保护碱基？ 添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。 添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。 为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。 实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。取1μg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。反应缓冲液含70mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2, 5 mMDTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。20%的PAGE（7M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。 本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。

常用限制性内切酶酶切位点

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限制性内切酶考点小结

限制性内切酶考点盘查 限制性内切酶是基因工程中最难把握的知识点，高考中对这种酶的考察特别重视，我们有必要对相关的知识先进行归纳，才有利于解答试题。 1 限制性核酸内切酶的基本知识 ①来源及化学本质:主要是从原核生物中分离纯化出来的。化学本质为蛋白质。 ②作用：催化作用，可用于DNA的切割获取目的基因和载体的切割，切割的化学键为磷酸二酯键。 ③作用特点：特异性,即限制酶可识别特定的脱氧核苷酸序列,切割特定位点。 ④切割方式：错位切--产生两个相同的黏性末端，平切--形成平末端。如果是错位切则将一个基因从DNA分子上切割下来,需要破坏4个磷酸二酯键,同时产生4个黏性末端，增加4个游离的磷酸基团。 2 限制性核酸内切酶的难点解析 2.1 目的基因切割要点归纳 ①要把目的基因切割下来需要在目的基因的两边都进行切割，但绝对不可以破坏目的基因的结构。 ②切割目的基因的酶可以用同一种限制酶，也可以用两种不同的限制酶。 ③切割产生的末端有三种情况：都是平末端、都是粘性末端、一

边是粘性末端，一边是平末端。 2.2 质粒切割要点归纳 ①质粒的切割可以切一个切口，也可以切两个切口。如果是一个切口，则连接时可能会产生一些我们不需要的连接物(如自身环化等)；如果是两个切口则质粒会丢失一段DNA片段，但可以控制连接物就是我们需要的目的基因和质粒的连接。切割时注意不要破坏了载体上的标记基因（至少保留有一个标记基因）、终止子、启动子、复制原点等。 ②切割质粒的酶可以用同一种限制酶，也可以用两种不同的限制酶。 ③切割产生的末端有三种情况：都是平末端，都是粘性末端，一边是粘性末端，一边是平末端。 2.3 限制性核酸内切酶的说明 不同的酶识别序列一般不同，但也有识别序列相同的。如果识别序列相同，切割点也相同则切割产生的粘性末端一样。一种酶的识别序列中可能包含另外一种酶的识别序列，切割时可以产生相同的粘性末端。不同的酶识别的序列一般不同，但有时也可能相同，这时切割产生的粘性末端也相同。 2.4 酶切割后的DNA片段的连接 如果是用一种限制性内切酶切割质粒表达载体和目的基因,不可以防止载体和目的基因的自身环化,两个DNA片段连接产物有：目的基因—目的基因；目的基因—载体；载体—载体。这些

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【推荐】限制性内切酶的特点有哪些-范文word版 本文部分内容来自网络整理，本司不为其真实性负责，如有异议或侵权请及时联系，本司将立即删除！ == 本文为word格式，下载后可方便编辑和修改！ == 限制性内切酶的特点有哪些 限制性核酸内切酶是可以识别特定的核苷酸序列，并在每条链中特定部位 的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。下面是小编 给大家整理的限制性内切酶的特点，希望能帮到大家! 限制性内切酶的特点 1、识别位点的DNA序列呈二重旋转对称(即具有迥文结构); 2、切割DNA均产生含5’-磷酸和3’-羟基的末端; 3、错位切割产生具有5’-或3’-突出的粘性末端;而沿对称轴切割双链DNA产生平头末端，也称钝性末端。 4、少数不同的限制酶可识别和切割相同的位点，这些酶称为同切酶，如MboI Ⅰ和 Sau3A。 限制性内切酶的分类性质 根据酶的功能特性、大小及反应时所需的辅助因子，限制性内切酶可分为 两大类，即I类酶和Ⅱ酶。最早从大肠杆菌中发现的EcoK、EcoB就属于I类酶。其分子量较大;反应过程中除需Mg2+外，还需要S-腺苷-L甲硫氨酸、ATP;在DNA分子上没有特异性的酶解片断，这是I、Ⅱ类酶之间最明显的差异。因此， I类酶作为DNA的分析工具价值不大。Ⅱ类酶有EcoR I、BamH I、Hind Ⅱ、Hind Ⅲ等。其分子量小于105道尔顿;反应只需Mg2+;最重要的是在所识别的 特定碱基顺序上有特异性的切点，因而DNA分子经过Ⅱ类酶作用后，可产生特 异性的酶解片断，这些片断可用凝胶电泳法进行分离、鉴别。 限制性内切酶识别DNA序列中的回文序列。有些酶的切割位点在回文的一 侧(如EcoR I、BamH I、Hind等)，因而可形成粘性末端，另一些Ⅱ类酶如Alu I、BsuR I、Bal I、Hal Ⅲ、HPa I、Sma I等，切割位点在回文序列中间，形 成平整末端。Alu I的切割位点如下： 5'-A G^C T-3' 3'-T C^G A-5'

高中生物论文解读限制性核酸内切酶应用的考点例析人教版

解读《限制性核酸内切酶应用的考点例析》 我们知道限制性核酸内切酶（限制酶）是指能识别DNA中特定碱基顺序，并在特定位点切割双链DNA的核酸内切酶。它在生物学中应用相当广泛，是基因工程中的工具酶，用来构建重组DNA分子，对于遗传性疾病的基因定位和基因诊断的研究也具有重要的应用价值。下面我们以问题的形式简要地了解它在这些方面的应用。 1。限制酶的特点 例1．下面哪项不具有限制酶识别序列的特征（） A．GAATTC B．GGGGCCCC C．CTGCAG D．CTAAATC CTTAAG CCCCGGGG GACGTC GATTTAG 解析：限制酶识别的各种序具有回文对称的特点。所谓回文对称序列就是当以不同的方向分别阅读DNA的两条互补链时，DNA的两条链上的碱基序列相同。如A中的DNA分子，其中一条链从左向右阅读碱基序列是GAA TTC，另一条互补链从右向左阅读碱基序列也是GAATTC。 答案：D 例2．限制酶HindⅢ酶切DNA的识别序列是AAGCTT，限制酶HpaⅡ酶切DNA的识别序列是CCGG。假定DNA分子中A、T、G、C所含的比例相等，那么，限制酶HindⅢ酶切割双链DNA的概率是，酶切位点间的平均距离约kb（千碱基）；限制酶HpaⅡ酶切割双链DNA的概率是，酶切位点间的平均距离约kb。 解析：因为限制酶识别序列具有回文对称序列的特点，这两个序列在相应的互补链上又会呈现，因此我们只需考虑DNA的一条链即可。六碱基长HindⅢ识别序列AAGCTT出现的概率是（1/4）6或1/4096，因此HindⅢ酶切位点之间的平均距离大约为4 kb。同样的道理，4碱基长的HpaⅡ酶识别序列CCGG出现的概率是（1/4）4或1/256，因此HpaⅡ酶切位点的平均距离大约为0.25 kb。 2．黏性末端与限制酶类型的关系 例3．用同一种限制酶处理会产生相同的黏性末端，但用不同的限制酶处理也可能产生相同的黏性末端。下列所示的四个黏性末端是由（）种限制酶作用产生的。 解析：不同的限制酶的识别序列和切割位点不同。要判断题中的4个黏性末端是由几种限制酶作用下产生的，不光要看共有几种黏性末端，更重要的是要看作用产生这些黏性末端的限制酶的识别序列和切割位点是否相同。经过分析，题中4幅图所示的黏性末端应该分别是由4种限制酶作用产生的，这4种酶的识别序列及切割位点依次是：G↓AATTC，C↓AA TTG，G↓TTAAC，C↓TTAAG。 答案：4 3．限制酶图谱分析 例4．一线性DNA分子分别用限制酶HindⅢ和SmaⅠ消化，然后用这两种酶混合消化，得到如下片段： HindⅢ 2.5 kb，5.0 kb SmaⅠ 2.0 kb，5.5 kb HindⅢ和SmaⅠ 2.5 kb，3.0 kb，2.0 kb （1）画出此丝性DNA分子的限制酶图谱。 （2）两酶混合消化的片段再用限制酶EcoRⅠ消化，结果导致凝胶上3.0 kb的片段消失，产

限制性内切酶的一般原则和建议!

限制性内切酶的一般原则和建议! 1．如何做酶切反应？ 该问题看似什么简单： DNA中加上酶，然后保温一段时间就可以了。但是在实际操作过程中，我们不断听到：切不动，装不上。问题在什么地方？能系列生产限制性内切酶的公司国际上，就那么几个，位列前 3 的是NEB, Fermentas, SibEnzyme。这些公司提供酶的品质一般都能得到保证。您可以怀疑酶的质量问题，但是更多的问题来源于模板是否合适酶切要求。下面几点对你的酶切是有帮助的。 1) 成功酶切的关键是准备好模板DNA。DNA样品中不能含有有机溶剂（会使酶变性或产生星号货性），不能含有干扰酶活性的污染物质，不能含有高浓度的EDTA (TE中的EDTA浓度较低，对Mg的浓度影响较小)；同时要对DNA甲基化程度及其对酶切效率的影响要做到心中有数。 2) 选用合适的酶。根据酶切序列选用，特别注意选用甲基化对酶活性的干扰。 3) 正确使用和保存酶。酶需要保存在-20度的低温环境中，只是在需要用酶才从冰箱中取出来。运输和临时存放时需要将酶至于冰上。手拿酶管时不要接触酶管下步含酶的部分，移酶时尽可能用长TIP, 避免污染。用完后需要及时送回原处。注意：酶通常是最后加。所有4) 反应体积需要根据实验目的定，常规的酶切一般要维持在10-50ul，酶切鉴定10-20ul就可以了。 5) 模板浓度问题：浓度过高，溶液黏度过大，酶不能有效扩散，酶切效果不会好。浓度过低，也会影响酶活性。 6) 注意模板用量和反应体积的关系。对酶用量，模板用量，反应体积等要素的确定需要的是时间和经验的积累。 7) 酶切反应的各个组分加完后，需要用TIP小心混匀几次，short spin 一下就可以保温了。一般不能使用振荡器混匀。 8) 反应温度的选择。一般反应都用37度，但是 Sma I 的最适合温度是25度，37度时酶仍表现出活性，但是效率下降50%。部分从耐热菌制备的酶需要在37度以上的温度反应，如Taq I的最适温度为65度，37度保温，效率仅为前者的1/10。 9) 反应时间的选择。一般酶切鉴定30分钟就可以了。要完全酶切可以采用少量的酶长时间反应，或较高的酶量短时间处理都可以达到。在使用高酶量的时候需要注意甘油的最终浓度不要超过5%，也就是说10ul的体系，酶的用量不要超过1ul。 10) 是否和如何终止反应？酶切鉴定之类的实验不需要特殊处理。灭活的手段：加入高浓度的EDTA；65度或80度热处理20-30分钟；部分从高温菌纯化出来的内切酶由于最适的反应温度比较高，热处理灭活不一定完全，需要用苯酚/氯仿/乙醇方法纯化；电泳回收也是实验室常用除酶的手段。 2．如果遇到酶切不动或切不完全，该怎么办？ 要回答这么问题常常需要了解酶活性单位是如何确定，我们多次接到这样的问题：1个单位的酶能在60分钟内切1ug的DNA,为什么我们的DNA那么少切那么长时间也不能切开或切完全？从下面几个因素去考虑： 1) 酶是否有活性：酶的活性单位通常是在60分钟酶切1ug lambda DNA或特定线状DNA所需要的酶量。鉴定酶的活性高低不是用您待切的DNA模板，也不是别的公司的酶来判定。因为不同公司酶可能是从不同系统中纯化的，虽然识别位点相同，但是酶的特性可能是有差异的。鉴定酶必须使用使用说明书上认定的酶活确定的方式，通常需要用lambda DAN做模板来判定。同时如果酶对甲基化敏感，还需要用Dcm-, Dam-的DNA.不排除由于运输或分装不当导致酶活性下降，这种情况是很少发生。我们公

常用限制性内切酶酶切位点汇总

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限制性内切酶

第二章限制性内切核酸酶 一、填空题 1．严格地说限制性内切核酸酶(restriction endonuclease)是指已被证明是的酶。基因工程中把那些具有识别的内切核酸酶统称为限制性内切核酸酶。2．年Luria和Human在T偶数噬菌体对大肠杆菌感染实验中首次发现了细菌的现象。 3．1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离到一种限制酶，能够特异性的切割DNA，这个酶后来被命名为，这是第一个分离到的Ⅱ类限制性内切核酸酶。 4．通过比较用不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小的片段，可以构建显示该区域各限制性内切核酸酶切点相互位置的。5．Ⅱ类限制性内切核酸酶分子量较小．一般在20~40kDa，通常由亚基所组成。它们的作用底物为双链DNA，极少数Ⅱ类酶也可作用于单链DNA，或DNA／RNA杂合双链。这类酶的专一性强，它不仅对酶切点邻近的两个碱基有严格要求，而且对更远的碱基也有要求，因此，Ⅱ类酶既具有专一性，也具有专一性，一般在识别序列内切割。切割的方式有，产生末端的DNA片段或的DNA 片段。作用时需要作辅助因子，但不需要和。6．完全的回文序列具有两个基本的特点，就是：(1) (2) 。 7．Ⅱ类限制性内切核酸酶一般识别个碱基，也有识别多序列的限制性内切核酸酶。根据对限制性内切核酸酶识别序列的分析，限制性内切核酸酶识别序列具有倾向，即它们在识别序列中含量较高。 8．EcoK是I类限制性内切核酸酶，分子组成是α2β2 γ，分子量300kDa。在这些亚基中，o亚基具有作用；β亚基具有的活性；γ亚基的作用则是。 9．个体之间DNA限制性片段长度的差异叫。10．限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的，第一个大写字母取自，第二、第三两个字母取自，第四个字母则用表示。11．限制性内切核酸酶Acy I识别的序列是5’—GRCGYG-3’，其中R ，Y 。12．在酶切反应管加完各种反应物后，需要离心2秒钟，其目的是和。13．部分酶切可采取的措施有：(1) (2) (3) 等。14．第一个分离的限制性内切核酸酶是；而第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是。 15．限制性内切核酸酶BsuRI和HaeⅢ的来源不同，但识别的序列都是，它们属于。 16．由于DNA是由4种碱基组成的，所以任何限制性内切核酸酶的切割频率的理论值应该是。 17．Sal I和Not I都是哺乳动物中识别序列稀有的酶，在哺乳动物基因组的5kb片段中，找到NotI切点的概率是。 18．部分酶切是指控制反应条件，使得酶在DNA序列上的识别位点只有部分得到切割，它的理论依据是。 19．I类限制酶识别DNA的位点和切割的DNA位点是不同的，切割位点的识别结合有两种模型，一种是，另一种是。20．限制性内切核酸酶通常保存在浓度的甘油溶液中。

AgeI限制性内切酶使用说明书

H om e ?P roducts ?AgeI AgeI Product Information FAQs Protocols Other Tools & Resources Related Products Description Properties and Usage Quality Control This enzyme has transitioned to an improved new buffer system. Visit https://www.wendangku.net/doc/3414014172.html, for further details. The new and current Double Digest Finder and current Activity/Performance Chart for the CutSmart buffer system are available. The previous version of the Double Digest Finder , as well as the previous Version of Activity/Performance Chart that use the former buffer system, are still available for your convenience. AgeI has High Fidelity (HF) and RE-Mix Master Mix versions available. Isoschizomers Catalog # Size Concentration Price Qty R0552S 300 units 5,000 units/ml $67.001R0552L 1,500 units 5,000 units/ml $268.001 Categories: Restriction Endonucleases: A Applications: Restriction Enzyme Digestion Description AgeI has a High Fidelity v ersion AgeI-HF? (NEB #R3552). High Fidelity (HF ?) Restriction Enzymes hav e 100% activ ity in CutSmart ? Buffer; single-buffer simplicity means more straightforward and streamlined sample processing. HF enzymes also exhibit dramatically reduced star activ ity. HF enzymes are all Time-Sav er qualified and can therefore cut substrate DNA in 5-15 minutes with the flexibility to digest ov ernight without degradation to DNA. Engineered with performance in mind, HF restriction enzymes are fully activ e under a broader range of conditions, minimizing off-target products, while offering flexibility in experimental design. Product Source An E. coli strain that carries the AgeI gene from Ruegeria gelatinovora (ATCC 25655). Reagents Supplied The following reagents are supplied with this product: Properties and Usage Unit Definition One unit is defined as the amount of enzyme required to digest 1 μg of λ DNA in 1 hour at 37°C in a total reaction of 50 μl. NEBuffer 1.110X

限制性核酸内切酶相关知识归纳

名师精编优秀资料 限制性核酸内切酶相关知识归纳 编制：军长 2013.12.10 限制性核酸内切酶是基因工程中最难把握的知识点，高考中对这种酶的考察特别重视，我们有必要对其相关的知识进行归纳，才有利于解答试题。 1 限制性核酸内切酶的基本知识 ①来源及化学本质:主要是从原核生物中分离纯化出来的。化学本质为蛋白质。 ②作用：催化作用，可用于DNA的切割获取目的基因和载体的切割，切割的化学键为磷酸二酯键。 ③作用特点：特异性,即限制酶可识别特定的脱氧核苷酸序列,切割特定位点。 ④切割方式：错位切--产生两个相同的黏性末端，平切--形成平末端。如果是错位切则将一个基因从DNA分子上切割下来,需要破坏4个磷酸二酯键,同时产生4个黏性末端，增加4个游离的磷酸基团。 2 限制性核酸内切酶的难点解析 2.1 目的基因切割要点归纳 ①要把目的基因切割下来需要在目的基因的两边都进行切割，但绝对不可以破坏目的基因的结构。 ②切割目的基因的酶可以用同一种限制酶，也可以用两种不同的限制酶。 ③切割产生的末端有三种情况：都是平末端、都是粘性末端、一边是粘性末端，一边是平末端。 2.2 质粒切割要点归纳 ①质粒的切割可以切一个切口，也可以切两个切口。如果是一个切口，则连接时可能会产生一些我们不需要的连接物(如自身环化等)；如果是两个切口则质粒会丢失一段DNA片段，但可以控制连接物就是我们需要的目的基因和质粒的连接。切割时注意不要破坏了载体上的标记基因（至少保留有一个标记基因）、终止子、启动子、复制原点等。 ②切割质粒的酶可以用同一种限制酶，也可以用两种不同的限制酶。 ③切割产生的末端有三种情况：都是平末端，都是粘性末端，一边是粘性末端，一边是平末端。 2.3 限制性核酸内切酶的说明 不同的酶识别序列一般不同，但也有识别序列相同的。如果识别序列相同，切割点也相同则切割产生的粘性末端一样。一种酶的识别序列中可能包含另外一种酶的识别序列，切割时可以产生相同的粘性末端。不同的酶识别的序列一般不同，但有时也可能相同，这时切割产生的粘性末端也相同。 2.4 酶切割后的DNA片段的连接 如果是用一种限制性内切酶切割质粒表达载体和目的基因, 不可以防止载体和目的基因的自身环化,两个DNA片段连接产物有：目的基因—目的基因；目的基因—载体；载体—载体。这些连接物可以环化。如果是用两种不同的限制性内切酶切割载体和目的基因, 可以防止载体和目的基因的自身环化, 同时可以防止目的基因和质粒表达载体在酶切后不发生任意连接。两个DNA片段连接产物也有：目的基因—目的基因；目的基因—载体；载体—载体。这些连接物也可以环化。

常见限制性内切酶识别序列(酶切位点)

The Type II restriction systems typically contain individual restriction enzymes and modification enzymes encoded by separate genes. The Type II restriction enzymes typically recognize specific DNA sequences and cleave at constant positions at or close to that sequence to produce 5-phosphates and 3-hydroxyls. Usually they require Mg 2+ ions as a cofactor, although some have more exotic requirements. The methyltransferases usually recognize the same sequence although some are more promiscuous. Three types of DNA methyltransferases have been found as part of Type II R-M systems forming either C5-methylcytosine, N4-methylcytosine or N6-methyladenine. ApaI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5'GGGCC^C 3' BamHI（类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' G^GATCC 3' BglII （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' A^GATCT 3' EcoRI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' G^AATTC 3' HindIII （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' A^AGCTT 3' KpnI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' GGTAC^C 3' NcoI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' C^CATGG 3' NdeI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' CA^TATG 3' NheI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' G^CTAGC 3' NotI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' GC^GGCCGC 3' SacI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' GAGCT^C 3' SalI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' G^TCGAC 3' SphI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' GCATG^C 3' XbaI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' T^CTAGA 3' XhoI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' C^TCGAG 3' 当然，上面总结的这些肯定不全，要查找更多内切酶的识别序列，你还可以选择下面几种方法： 1. 查你所使用的内切酶的公司的目录或者网站；NEB网站上提供的识别序列图表下载 2. 用软件如：Primer Premier5.0或Bioedit等，这些软件均提供了内切酶识别序列的信息；

DNA限制性内切酶——酶切Buffer组分及其活性

DNA限制性内切酶——酶切Buffer组分及其活性 TaKaRa公司，为了方便限制酶的统一使用，采用了通用缓冲液(Universal Buffer) 测定限制酶活性的体系(5种通用缓冲液中，用标注的)，以此时的活性值作为100%。并把在其它通用缓冲液中的相对活性表示如下表。有( ) 标记的是易受Star活性影响的缓冲液，为了避免Star活性的影响，希望尽量使用或标注的缓冲液。每种限制酶都有其自身的基本缓冲液(Basal Buffer)，其中AccⅢ、BalⅠ、BcnⅠ、BglⅠ、Bpu1102Ⅰ、Cfr10Ⅰ、Eam1105Ⅰ、Eco52Ⅰ、NruⅠ、Psh BⅠ、Sna BⅠ、SspⅠ、TaqⅠ、VpaK11B Ⅰ(共14种)由于没有十分合适的通用缓冲液，只能使用基本缓冲液(Basal Buffer)。各种限制酶的基本缓冲液组成不同，相互之间不能通用。各种限制酶在基本缓冲液中的相对活性也被列于下表，供参考。 限制酶在各种缓冲液中的相对活性 附带·活性测定用Buffer 推荐使用的Buffer

*1+0.01%BSA→100%:Afl II, Aor13H I, Eco O65 I, Fok I, Hin1 I, Mun I, Nco I, Pvu I, Sse8387 I, Xba I *2 +0.01%BSA+0.01%Triton X-100→100%:Not I *3不加BSA

按Universal Buffer分类的限制酶

各Universal Buffer的组成 ■ 使用注意事项 10×Buffer都为10倍浓度的缓冲液。此外，10×T溶液中不含BSA，在使用时将BSA添加进去，使最终浓度为0.01%，有些限制酶(带有*1或*2标记)的反应体系中需加BSA或Triton X-100，添附的溶液是10倍浓度(0.1%) 的液体，使用时，请在反应体系中添加1/10量进行反应。 ■ 保存 -20℃ 反应停止液组份表 (10 × Loading Buffer) 1%SDS 60%Glycerol 0.05%Bromophenol Blue ■ 使用方法 本公司的酶包装中全部附带有反应停止液。使用时请添加反应液量的1/10，即可停止反应，进行电泳。-20℃保存时，会出现SDS 沉淀，请于温水浴中溶解后使用。在室温下保存时，SDS有时也会出现沉淀，此时同样请于温水浴中将其溶解后使用。 ■ 保存 开封后室温保存。

常用限制性内切酶酶切位点总结

常用限制性内切酶酶切位点总结

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Acc65I识别位点 AccI识别位点 AciI识别位点 AclI识别位点 AcuI识别位点 AfeI识别位点 AflII识别位点 AflIII识别位点 AgeI识别位点 AhdI识别位点 AleI识别位点 AluI识别位点 AlwI识别位点 AlwNI识别位点 ApaI识别位点 ApaLI识别位点 ApeKI识别位点 ApoI识别位点 AscI识别位点 AseI识别位点 AsiSI识别位点 AvaI识别位点 AvaII识别位点 AvrII识别位点 BaeI识别位点 BamHI识别位点 BanI识别位点 BanII识别位点

BbvCI识别位点 BbvI识别位点 BccI识别位点 BceAI识别位点 BcgI识别位点 BciVI识别位点 BclI识别位点 BfaI识别位点 BfuAI识别位点 BglI识别位点 BglII识别位点 BlpI识别位点 Bme1580I识别位点 BmgBI识别位点 BmrI识别位点 BmtI识别位点 BpmI识别位点 Bpu10I识别位点 BpuEI识别位点 BsaAI识别位点 BsaBI识别位点 BsaHI识别位点 BsaI识别位点 BsaJI识别位点 BsaWI识别位点 BsaXI识别位点 BseRI识别位点 BseYI识别位点

BsiEI识别位点 BsiHKAI识别位点 BsiWI识别位点 BslI识别位点 BsmAI识别位点 BsmBI识别位点 BsmFI识别位点 BsmI识别位点 BsoBI识别位点 Bsp1286I识别位点 BspCNI识别位点BspDI识别位点 BspEI识别位点 BspHI识别位点 BspMI识别位点 BspQI识别位点 BsrBI识别位点 BsrDI识别位点 BsrFI识别位点 BsrGI识别位点 BsrI识别位点 BssHII识别位点 BssKI识别位点 BssSI识别位点 BstAPI识别位点 BstBI识别位点 BstEII识别位点 BstNI识别位点

限制性核酸内切酶相关知识归纳

限制性核酸内切酶相关知识归纳 编制：军长 2013.12.10 限制性核酸内切酶是基因工程中最难把握的知识点，高考中对这种酶的考察特别重视，我们有必要对其相关的知识进行归纳，才有利于解答试题。 1 限制性核酸内切酶的基本知识 ①来源及化学本质:主要是从原核生物中分离纯化出来的。化学本质为蛋白质。 ②作用：催化作用，可用于DNA的切割获取目的基因和载体的切割，切割的化学键为磷酸二酯键。 ③作用特点：特异性,即限制酶可识别特定的脱氧核苷酸序列,切割特定位点。 ④切割方式：错位切--产生两个相同的黏性末端，平切--形成平末端。如果是错位切则将一个基因从DNA分子上切割下来,需要破坏4个磷酸二酯键,同时产生4个黏性末端，增加4个游离的磷酸基团。 2 限制性核酸内切酶的难点解析 2.1 目的基因切割要点归纳 ①要把目的基因切割下来需要在目的基因的两边都进行切割，但绝对不可以破坏目的基因的结构。 ②切割目的基因的酶可以用同一种限制酶，也可以用两种不同的限制酶。 ③切割产生的末端有三种情况：都是平末端、都是粘性末端、一边是粘性末端，一边是平末端。 2.2 质粒切割要点归纳 ①质粒的切割可以切一个切口，也可以切两个切口。如果是一个切口，则连接时可能会产生一些我们不需要的连接物(如自身环化等)；如果是两个切口则质粒会丢失一段DNA片段，但可以控制连接物就是我们需要的目的基因和质粒的连接。切割时注意不要破坏了载体上的标记基因（至少保留有一个标记基因）、终止子、启动子、复制原点等。 ②切割质粒的酶可以用同一种限制酶，也可以用两种不同的限制酶。 ③切割产生的末端有三种情况：都是平末端，都是粘性末端，一边是粘性末端，一边是平末端。 2.3 限制性核酸内切酶的说明 不同的酶识别序列一般不同，但也有识别序列相同的。如果识别序列相同，切割点也相同则切割产生的粘性末端一样。一种酶的识别序列中可能包含另外一种酶的识别序列，切割时可以产生相同的粘性末端。不同的酶识别的序列一般不同，但有时也可能相同，这时切割产生的粘性末端也相同。 2.4 酶切割后的DNA片段的连接 如果是用一种限制性内切酶切割质粒表达载体和目的基因, 不可以防止载体和目的基因的自身环化,两个DNA片段连接产物有：目的基因—目的基因；目的基因—载体；载体—载体。这些连接物可以环化。如果是用两种不同的限制性内切酶切割载体和目的基因, 可以防止载体和目的基因的自身环化, 同时可以防止目的基因和质粒表达载体在酶切后不发生任意连接。两个DNA片段连接产物也有：目的基因—目的基因；目的基因—载体；载体—载体。这些连接物也可以环化。 1