地高辛DNA标记试剂盒II

质粒DNA的提取及检测实验报告

题目：质粒DNA的提取及检测 一．实验目的: 1.学习碱裂解法提取质粒的原理和方法； 2.学习DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。 二．实验原理 1. 质粒 (Plasmid)： 一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性，产生抗生素、限制酶、修饰酶等。 2.载体(Vector)： 要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，转化到细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体。目前除了大肠杆菌中的质粒、λ噬菌体、M13噬菌体、噬菌粒外，还有酵母人工染色体载体以及动、植物病毒载体等。 3.分离质粒DNA： （1）培养细菌使质粒扩增； （2）收集和碱裂解细菌； （3）分离和纯化质粒DNA。 4.碱裂解法 （1）溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，10mmol/EDTA-Na，25mmol/LTris-HCl 作用：分散细胞，螯合金属离子使酶失活，防止DNA的降解

（2）溶液Ⅱ：L NaOH，2% SDS，临用前1：1配制 作用：细胞在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与染色体DNA发生变性 （3）溶液Ⅲ：5mol/L 醋酸钾60ml，冰醋酸，双蒸水 作用：酸性条件上质粒DNA复性，留在上清液。大肠杆菌DNA和蛋白质-SDS复合物等发生沉淀。 5.电泳 带电荷的物质，在电场中的趋向运动称为电泳。DNA的琼脂糖凝胶电泳可以分离长度为200bp至近50kb的DNA分子。DNA的迁移率（U）的对数与凝胶浓度（T）之间存在反平行线 性关系。因此，要有效地分离不同大小的DNA片段，选用适当的琼脂糖凝胶浓度是非常重要的。 6.提取质粒 在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性DNA、开环DNA 、 闭环超螺旋DNA 。当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒 DNA泳动速度：闭环超螺旋〉线状〉 开环。但有时也有也会出现相反情况，因为与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度及核酸染料 含量有关。 三．实验材料及设备 1.实验材料： （1）含质粒pUC18大肠杆菌，塑料离心管，EP管架，微量取液器和取液器吸头，常用玻璃器皿（如三角瓶、量筒、试剂瓶等）； （2）提取的pUC18，琼脂糖，锥形瓶，一次性手套，胶铲，封口膜，剪刀，取液器吸头。实验设备：

地高辛标记与检测DNA试剂盒说明书

地高辛标记与检测DNA试剂盒DIG DNA Labeling and Detection Kit 采用地高辛-dUTP进行随机引物DNA标记，碱性标记，利用NBT/BCIP 酶联免疫，随时即用。 此试剂盒可对10ng-3μgDNA进行25次标记反应， 可检测10×10cm2面积的杂交膜50张 指导手册 1 前言 1.1 内容表 1 前言 1.1 内容表 1.2 试剂盒成分 2.介绍 2.1 产品简介 3. 操作步骤和所需材料 3.1 在你开始前 3.2 流程图 3.3 地高辛标记DNA 3.4 标记效率的确定 3.5 DNA的转移和固定 3.6 杂交 3.7 免疫检测

3.8 DNA印记的洗脱和再杂交1.2 试剂盒的成分 瓶号标记 内容包括功能 1 无标记对照DNA1 2 无标记对照DNA2 3 DNA稀释缓冲液2管1mL 50μg/mL鱼精DNA,10mM Tris-HCl,1mM EDTA, pH8.0 在25℃ 澄清溶液 4 DIG标记的对照 DNA 20μL 5μg/mL 质粒pBR328 DNA （用Bam HI线性 化） 澄清溶液 用于确定标记效率 5 六聚核苷酸混合物 6 标记用混合物 7 DNA聚合酶1大片 段 标记级 8 抗地高辛的碱性磷 酸酶结合物 200μL 750U/mL 从羊中获取的，Fab段，结合碱性磷酸酶 澄清溶液 9 NBT/BCIP 10 封阻试剂附加仪器与所需试剂

除了上表中列出的试剂外，你必须准备一些溶液。在下表中，你可以找到不同操作程序需要准备的设备概要。 在每个操作程序的前面提供了详细的信息。 操作程序仪器设备试剂 3.3 DIG-DNA标记水浴灭菌的双蒸水 0.2M pH8.0 灭菌的 EDTA 3.4 标记效率的半定量带正电荷的尼龙膜* 地高辛洗涤和封阻缓冲 组合* TE缓冲液 或者 洗涤缓冲液 马来酸缓冲液 检测缓冲液 3.5 DNA转移和固定紫外光盒或者商业化可用 于紫外交联的其他设备2×SSC 或者10×SSC 3.6 杂交尼龙膜，带正电荷* 杂交袋*，或者耐热的塑料 袋或者滚筒瓶（分子杂交 炉） 注意：当用地高辛杂交缓冲 液工作时，不要用开口的托 盘。DIG Easy Hyb （杂交缓冲液，需单独购买） 3.7 免疫检测耐热的塑料袋或者滚筒瓶 杂交袋* 地高辛洗涤和封阻缓冲组合* TE缓冲液 或者 洗涤缓冲液 马来酸缓冲液 检测缓冲液 3.8 DNA 斑点的脱色和大的托盘DMF

人类K-ras基因突变检测试剂盒说明书

人类K-ras基因突变检测试剂盒（PCR-熔解曲线法）说明书 【产品名称】 通用名：人类K-ras基因突变检测试剂盒（PCR-熔解曲线法） 英文名：Diagnostic kit for Mutations of Human K-ras Gene (PCR-Melting Curve Analysis) 【包装规格】 20测试/盒 【预期用途】 K-ras基因位于12号染色体短臂上，是重要的癌基因之一，编码一种21kD 的kras蛋白，参与细胞内的信号传递，主要包括PI3K/PTEN/AKT 和 RAF/MEK/ERK信号转导途径，这些转导途径是当前肿瘤靶向药物研究的热点，靶向药物通过抑制这些途径发生药理作用。K-ras基因第12和13密码子发生突变，将导致kras蛋白变异并处于持续激活状态，使药物失效。。据中国2010版《肿瘤学临床实践指南》，在一项包含101例肺腺癌亚型细支气管肺泡癌患者的回顾性研究中，所有患者均接受厄洛替尼单药一线治疗。K-ras突变者无一例缓解（0/18），而无K-ras突变者则有20例缓解（20/62，32%），差别有统计学意义（P <0.01）。因此，指南建议，非小细胞肺癌和结直肠癌患者使用靶向药物前应进行K-ras基因突变状态的检测。 本试剂盒以人非小细胞肺癌、结直肠癌肿瘤组织切片提取的基因组DNA为检测样本，用于检测肿瘤组织K-ras基因第12，13密码子的12种体细胞突变（表1），提供突变状态的定性结果。为临床肿瘤靶向药物的个体化用药提供辅助诊断依据，本品适用于进入个体化靶向治疗疗程前的患者使用。 【检验原理】 本试剂盒基于实时PCR平台，结合了特异引物、荧光探针和熔解曲线技术，定性检测DNA样品中K-ras基因12，13密码子是否存在突变。用一对K-ras基因特异引物，该引物可

地高辛标记探针在Southern杂交分析中的技术要点

地高辛标记探针在Sou thern杂交分析中的技术要点陆小平　周文军(苏州大学生命科学学院江苏苏州215006) 小岛峰雄(日本信州大学纤维学部) 外源基因是否成功导入受体材料的基因组中,必须从转化植株中找到分子生物学的检测证据。目前,PCR、Southern杂交等作为常用检测手段而被广泛采用。虽然PCR技术可以快速得到结果,但是,以农杆菌介导的材料必须慎重这一结论,以免由于农杆菌污染造成假阳性。而Southern分析由于操作程序繁琐,对植物基因组DNA的提取、纯化、酶切等技术要求较高,有时使杂交结果不甚理想。我们在植物基因转化的研究中,对荞麦,桑树,紫景天,洋麻等基因组DNA的提取、纯化、酶切进行了探讨,对流程中的有关步骤进行技术改良,使酶切后的PNA在凝胶板上是涂布状完全达到了Southern杂交的技术要求,并用地高辛(D ig)标记探针对外源DNA进行分析,取到了较好的效果。现简述如下∶ 1　植物基因组D NA的提取及纯化 1)提取高纯度的DNA是Southern杂交的关键, DNA的粗提物中,往往含有大量的蛋白质、多糖、单宁、色素等大分子杂质。这些杂质通常与DNA共同沉淀或与DNA聚合成大分子复合物。一旦复合物形成,即便在以后的操作中用酚、氯仿多次纯化,也很难将其除去。我们的经验是:当用液氮破碎新鲜样品的细胞壁后,先用蒸馏水洗脱两次(洗脱温度为42℃),每次5m in。以达到洗脱多糖的目的。每次洗脱后离心5m in(13000 r m in),弃去上层液。该上层液中含有粘度较高的胶状体,其主要成分可能是粘性多糖。在提取桑树基因组DNA时,最好用叶柄或幼茎、幼叶作提取材料。在样品有限时,也可用成熟叶甚至老叶代替。据C lark M S (1998)介绍,取样前对材料进行除淀粉处理(减少光照、黑暗处理24h),可以抑制多糖的污染。但我们采用除淀粉处理后的实验结果并不理想,其效果远不及用蒸馏水洗脱。另外,该方法不仅可以用于桑树DNA提取,而且也适用于其他植物材料(果树、花卉)。 2)由于桑叶中也含有酚类、色素,提取DNA时,常有茶褐色物质混入DNA中,由此而影响DNA的纯度。为了防止DNA的褐变,我们在液氮磨碎后,立即置冰箱下层或4℃条件下任其自然解冻,待粉末完全解冻后再加入DNA提取液。 3)做一次Southern杂交所需10Λg纯DNA,一般取0.2g新鲜样品即可得到10Λg以上纯DNA。因此,用该方法提取DNA无论是产量还是质量都能满足一定要求。为了保证DNA的纯度,每管加样量不要太多,以0.2～0.25g新鲜样品为宜,用30mL液氮研磨成粉末,置4℃条件下解冻后分别加600ΛL提取液 和200ΛL提取液 ,再稍稍研磨后全部转入2mL的离心管中,其余步骤仍按试剂盒要求操作。 4)在去除蛋白质的干扰时,我们仍用蛋白酶K,但其中添加了80ΛL酶解缓冲液(60mmo l T h is2HC l、60mmo l ED TA、3%SD S、pH7.8),置55℃条件下酶切过夜。结束后再用苯酚、氯仿处理。 5)纯化后的DNA可以通过测定波长为230、260、280的紫外吸收光谱来确定其浓度,但这些数据只能作为参考,因即便有较高的OD值,仍会存有影响酶切的干扰物质,我们建议最好采用凝胶电泳检测。 2　酶切 DNA的酶切时间一般是1～3h,但结束前最好取10ΛL(总量为200ΛL)酶切产物在小孔胶上检测是否完全酶切,即DNA片段弥散于各泳道中,若加样孔下方仍有亮度较强的条带出现(重复序列例外),这表明DNA尚未完全酶切,需继续延长酶切时间。 3　Southern印迹 将完全酶切的DNA上大孔胶电泳,若DNA在胶板上呈涂布状,便可进行Southern印迹。若近加样孔一侧的泳带,其前沿参差不齐;加样孔变形;孔内残留物较多;泳道中DNA分布不匀等,这些均为干扰物存在所致。在条件许可时应重新酶切。Southern印迹可按常规方法操作,将胶板分别用0.25mo l HC l、变性液、中和液浸泡15～30m in后,用20XSSC溶液将变性DNA全部转移至尼龙膜(H ybo rdN+m em bane)上。但印迹操作时,须戴手套作业,以免污染尼龙膜而影响DNA的固定。吸水纸上的重量要逐次添加,以防泳道变形和凝胶毛细管过早堵塞。 4　杂交 1)固定　印迹结束后,取下尼龙膜,置室温中自然干燥1h,用紫外仪[FUNA2UV L IKER(FS21500)]将DNA固定到尼龙膜上(约30s)。 2)预杂交　将尼龙膜装入小塑料袋中,加入10mL 预杂交液后,驱尽袋中的气泡,封口后置65℃杂交炉(EYELA H YBR I D Z A T I ON OV EN M H S2301)中孵育1h。 3)杂交　剪开小塑料袋的一角,直接加入10ΛL变性D ig探针,赶尽气泡后重新封口,继续置65℃杂交炉中慢速振摇过夜。 该步骤的关键是小塑料袋中不能留有气泡,否则,

质粒DNA的提取

质粒DNA的提取 一、原理 采用碱变性发抽提取质粒DNA。该法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性预复性的差异而达到分离目的的。在PH大于12的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当以pH5.2的乙酸钠高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，保存在溶液中。而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 二、方法 1.挑取一环在LB固体培养基平板上生长的含PUC57质粒的大肠杆菌，接在含有100μ g/ml氨苄青霉素（Amp）的LB液体培养基（5ml/15ml试管）中，37℃震摇培养过夜。 2.将1.5ml菌液加入微离心管中，14000r/min，离心10秒，其取上清液。反复数次，收 集全部菌体。 3.倾去上清，滤纸吸干。 4.加30μlTE缓冲液（10mmol/L Tris—HCl,1mmol/L EDTA,pH8.0）,振荡起菌体。 5.加30μlTENS溶液（10mmol/L Tris—HCl, pH8.0，1mmol/L EDTA,0.1mol/L NaOH,0.5%SDS）,震荡10秒至溶液变粘稠。 6.加150μl 3.0mol/LnaAC,震荡3—5S，14000r/min，离心3分钟，沉淀细胞碎片及染 色体DNA。 7.上清液转移至另一微离心管中，甲等体积胞和酚，混匀，12000r/min,离心2分钟。 8.上层水相转移至另一位离心管，加2倍量冷水乙醇，14000r/min，离心20分钟。9．倾去乙醇，加入7o％冷乙醇淋洗。 10．倾去乙醇，滤纸吸于，真空抽吸2～3分钟。 lI．加人50μlTE缓冲液，溶解DNA。 12，加入1μl核糖核酸酶(10mg／m1)，14000r/min,离心2s，使核糖核酸酶与管底液体混匀。 13．37℃水浴30min。 14．样品放一20℃冰箱保存备用。 三、试剂 1．TE缓冲液(10mmol/L Tris—HCl,1mmol/L EDTA,pH8.0) 配制方法： Tris 1.211g EDTA.Na 0.037g 用800ml重蒸水溶解，用分析纯盐酸调整pH至8.0，加重蒸水定容至1000ml。2．TENS溶液：(10mmol/L Tris—HCl, pH8.0，1mmol/L EDTA,0.1mol/L NaOH,0.5%SDS)

罗氏地高辛说明书

DIG DNA Labeling and Detection Kit 采用地高辛-dUTP进行随机引物DNA标记，碱性标记，利用NBT/BCIP 酶联免疫，随时即用。 此试剂盒可对10ng-3μgDNA进行25次标记反应， 可检测10×10cm2面积的杂交膜50张 指导手册 1 前言 1.1 内容表 1 前言 1.1 内容表 1.2 试剂盒成分 2.介绍 2.1 产品简介 3. 操作步骤和所需材料 3.1 在你开始前 3.2 流程图 3.3 地高辛标记DNA 3.4 标记效率的确定 3.5 DNA的转移和固定 3.6 杂交 3.7 免疫检测 3.8 DNA印记的洗脱和再杂交

除了上表中列出的试剂外，你必须准备一些溶液。在下表中，你可以找到不同操作程序需要准备的设备概要。

2.介绍 2.1 产品概况 实验原则 此试剂盒采用DIG(地高辛)，一种甾类半抗原，steroid hapten去标记DNA 应用 地高辛标记DNA探针可以用于：所有类型的滤膜杂交 样品材料 至少100bp的DNA片段 线性的质粒，cos质粒或者DNA 超螺旋的DNA 实验时间

检测数量 一个试剂盒足够用于: 25个标准的标记反应，每个反应的膜板DNA不超过3μg； 并可以检测50张10×10cm2的杂交膜。 质量控制 根据操作步骤中的说明对未标记的对照DNA 【pBR328】进行标记，并按 照下面的标准检测操作方法在点杂交中用0.1pg 同源DNA点在膜上16h后成色 显影检测。 试剂盒的储存和稳定性 未开封的试剂盒在保质期内可以稳定的存放在-15℃到-25℃（保质期印在标签上）。在干冰中运输。 一旦开封，请根据下表选择适宜的储存条件。 采用southern杂交从1μg人胎盘DNA（经BglⅡ或EcoRⅠ酶切）中检测到单拷贝基因。

地高辛使用注意事项

xx合理使用与注意事项 地高辛为强心类药物，主要用于治疗各类急、慢性心功能不全及室上性心动过速、心房颤动或扑动等，由于其治疗指数低、安全范围小、毒副作用大、药动学及药效学个体差异大，常规剂量亦可导致中毒或达不到疗效，治疗浓度与中毒浓度问又存在重叠现象，使其有效治疗剂量难以掌握。进行地高辛血药浓度监测是临床上调整给药方案、维持有效血药浓度、预防药物中毒的主要方法，下面对地高辛的主要特点及注意事项做一简要介绍。 [xx血药浓度范围] xx的治疗药物浓度参考范围为 0."8- 2."0ng/ml，当浓度超过 2."0ng/ml后，病人易出现心律紊乱等毒性反应，取血时间一般在达到稳态后取血，成人为7-11天，儿童为2-10天，于服药后8-24hr取血。 由于老年人对本品耐受低，血药浓度最好调至正常范围的下限，但波动不宜太大，故以少量多次的用药方案为安全且有效。 [xx的适应症] 1．用于高血压、瓣膜性心脏病、先天性心脏病等急性和慢性心功能不全。尤其适用于伴有快速心室率的心房颤动的心功能不全；对于肺源性心脏病、心肌严重缺血、活动性心肌炎及心外因素如严重贫血、甲状腺功能低下及维生素B1缺乏症的心功能不全疗效差； 2．用于控制伴有快速心室率的心房颤动、心房扑动患者的心室率及室上性心动过速。 [xx的用法用量] 成人常用量。常用 0."125～

0."5㎎，每日一次，7天可达稳态血药浓度；若达快速负荷量，可每6～8小时给药 0.25㎎，总剂量 0."75～ 1."25㎎/日；维持量，每日一次 0."125～ 0."5㎎。 [xx的不良反应] 1.常见的不良反应包括： 促心律失常作用、胃纳不佳或恶心、呕吐(刺激延髓中枢)、下腹痛、异常的无力、软弱。 2.少见的反应包括： 视力模糊或"色视"，如黄视、绿视、腹泻、中枢神经系统反应如精神抑郁或错乱。 3.罕见的反应包括： 嗜睡、头痛及皮疹、寻麻疹(过敏反应)。 [xx药动学过程] 本品吸收不完全，也不规则，片剂生物利用度为60%～80%，口服起效时间 0."5～2小时，血浆浓度达峰时间2～3小时，获最大效应时间为4～6小时。地高辛消除半衰期平均为36小时。血浆蛋白结合率低，为20%～25%，表观分布容积为6～10L/㎏。地高辛在体内转化代谢很少，主要以原形由肾排除，尿中排出量为用量的50%～70%。 [影响xx血药浓度的生理因素]

大肠杆菌质粒转染实验-QIAGEN大提试剂盒

质粒抽提 一、溶液及培养基配制： 1、LB液体培养基 （1）配方: 酵母提取物（Yeast extract）5g/L 胰蛋白胨（Tryptone）10g/L （2）配制： A、称量：称取培养基各成分所需量，置于烧杯中。 B、溶化：加入所需水量2/3的蒸馏水于锥形瓶中，搅拌使药品全部溶化。 C、定容。 D、加塞、包扎。 F、高压灭菌121 C, 30min ,灭菌后室温保存备用。若要分装需要在超净台内。 G、培养基完全溶解，降至室温后，加氨苄霉素（AMP ）。先将AMP用三蒸水配制为 100mg/ml母液，而后每1ml母液加至1000ml培养基。（可以多配制一些，分装为1ml/管）2、LB固体培养基 （1）配方: 酵母提取物(Yeast extract)5g/L 氯化钠（NaCl）5g/L 胰蛋白胨（Tryptone）10g/L 氨苄青霉素溶液100^g/ml （终浓度）（即100mg溶于1ml超纯水或生理 盐水或PBS，再加入1000ml培养基） 琼脂粉15g/L （2）配制： A、称量：称取培养基各成分所需量，置于烧杯中。 B、溶化：加入所需水量2/3的蒸馏水于烧杯中，搅拌使药品全部溶化。 C、5mol/L NaOH 溶液调pH 到7.4。 D、定容。 E、分装、加塞、包扎。 F、高压灭菌121 C, 30min。 G、火菌后，将融化的LB固体培养基置与55 C的水浴中（或室温），待培养基温度降到55 C时（手可触摸）加入抗生素，（免温度过高导致抗生素失效），并充分摇匀。 （3）倒板： 一般20ml倒1块板，培养基倒入培养皿后，打开盖子，水分晾干后盖上盖子并用封口膜封口，4 C保存备用，使用前提前拿出，防止水蒸气滴入板中。 首要检查是否有足够的固体和液体LB培养基，基本上每个质粒需要一块固体培养基，小摇 的2ml和大摇的250ml LB培养基。小摇的可以在一个50ml离心管中预备着，每次直接取 用。转化所需L形玻璃棒需确认已灭菌摇菌器申请，张评浒老师，王雪师姐； 注意：考虑到多种东西需要灭菌，可以在转化之前或者小摇大摇那天一起灭菌。所有需要提前灭菌的东西有：足量液体LB培养基灭菌后加入AMP蓝黄白枪头至少个一盒，备用； 1.5ml doff 管；Beckman离心机专用离心管；锡箔纸；250ml锥形瓶，500或者1000ml锥形瓶；电动移液器所用移液管（可以考虑用5ml移液枪，则先灭菌5ml枪头）；超纯水和TE

B-raf基因突变检测试剂盒(PCR-毛细管电泳法)标准化操作流程

B-raf基因突变检测试剂盒(荧光PCR-毛细管电泳法) 标准化操作流程 1、预期用途 该产品用于定性检测确诊的结直肠癌患者石蜡包埋病理组织切片DNA的B-rafV600E 基因突变。B-raf 基因是一种癌基因，编码一种丝/ 苏氨酸特异性激酶，是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK 通路重要的转导因子，参与调控细胞内多种生物学事件，如细胞生长、分化和凋亡等。B-raf 基因位于7p34，长约190kb，转录mRNA 长2.5kb，编码783 氨基酸的蛋白，相对分子质量为94000-95000 Da。 研究表明，在多种人类恶性肿瘤中，如恶性黑色素瘤、结直肠癌、肺癌、甲状腺癌、肝癌及胰腺癌等均存在不同比例的B-raf 突变，B-raf 突变主要发生在Exon15 上的激活区的第1799 氨基酸上(T 突变为A)，导致编码的氨基酸由谷氨酸变成缬氨酸(V600E)，该突变能使B-raf 激酶活性提高，V600E 突变能模拟T598 和S601 两个位点磷酸化作用，使BRAF 蛋白激活。近来研究表明，对于野生型Kras、但存在B-raf 基因V600E 突变患者，抗EGFR 单抗治疗无效。2010 年版《NCCN 结直肠癌临床实践指南》中已明确指出“如K-ras 基因无突变时，需检测B-raf 基因突变，如果后者存在V600E突变，则不应该给予抗EGFR 单抗治疗。” 2、仪器配置要求 移液器，振荡器，微型离心机，生物安全柜，高速冷冻离心机，定性PCR仪，荧光定量PCR仪（ABI7500，LightCycler? 480，MX3000P，CFX-96等），微量紫外分光光度计，基因分析仪（ABI3130，ABI3500DX）。 3、耗材要求 无菌带滤芯吸头、吸水纸，离心管（1.5ml，0.5ml，0.2ml）、PCR反应管（配套荧光定量PCR仪型号）及无粉一次性乳胶手套，基因分析板。 4、责任人 基因扩增实验室室长负责技术指导和质量监督。 5、执行人 操作人员应经过专业培训，具有合格的操作技能的检验专业技术人员。 6、检测原理 本产品选取人类基因组B-raf 基因Exon 15 上设计特异性引物和探针，对扩增后的PCR 产物片段进行测序分析。使用尿苷酶(UNG)防污染体系，经加热可以选择性地降解U-DNA，以防止先前PCR 扩增产物的污染。 7、试剂来源 北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司 8、样本要求 8.1用量：每例标本切5张(10μm)白片，连续切片，不漂洗脱蜡，直接封存于1.5ml EP管中； 8.2质量：为确保DNA提取成功率，必须选择2年以内的石蜡标本； 8.3标本收集方法：石蜡包埋病理切片样品应确定含有肿瘤病变细胞，为了保证切片组织中

原位杂交-经典方法-地高辛标记探针

原位杂交 (In situ hybridization) 一、目的 掌握核酸探针原位杂交操作技术，并利用该技术对单细胞的靶目标进行定位，用于细胞生物学基础研究。 二、原理 原位杂交技术（in situ hybridization）是分子生物学和组织化学成功结合的产物，是特定标记的已知序列核酸作为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交并对其实行检测的方法。其基本原理是含互补序列的标记DNA或RNA片段，即探针，在适宜的条件下与细胞内特定的DNA或RNA形成稳定的杂交体。 原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其它成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便；由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。 三、仪器设备 烘箱，切片机，展片机，染色缸，湿盒，原位PCR仪，显微镜、镊子、量筒、烧杯、吸水纸、枪与枪头、载玻片、盖玻片、冰盒等。 四、材料和试剂 1．材料：带有病原体的水生动物，如感染WSSV病毒的对虾、感染虹彩病毒的水生动物等。 2．试剂： Davidson’s AFA固定液: 330 ml 95％乙醇 220 ml 福尔马林（37～39％甲醛水溶液） 115 ml 冰醋酸 335 ml H2O 混匀后封口，室温放置； DIG标记与检测试剂盒（Roche公司）； TNE：50 mmol/L Tris-HCl 6.57 g Tris Base 10 mmol/L NaCl 0.58 g NaCl 1 mmol/L EDTA 0.37 g EDTA ddH2O 900 ml （定容至1L） 用HCl调pH至7.4，高压灭菌，4℃保存；

地高辛合理使用与注意事项

地高辛合理使用与注意事项 地高辛为强心类药物，主要用于治疗各类急、慢性心功能不全及室上性心动过速、心房颤动或扑动等，由于其治疗指数低、安全范围小、毒副作用大、药动学及药效学个体差异大，常规剂量亦可导致中毒或达不到疗效，治疗浓度与中毒浓度问又存在重叠现象，使其有效治疗剂量难以掌握。进行地高辛血药浓度监测是临床上调整给药方案、维持有效血药浓度、预防药物中毒的主要方法，下面对地高辛的主要特点及注意事项做一简要介绍。 [地高辛血药浓度范围] 地高辛的治疗药物浓度参考范围为，当浓度超过ml后，病人易出现心律紊乱等毒性反应，取血时间一般在达到稳态后取血，成人为7-11天，儿童为2-10天，于服药后8-24hr取血。由于老年人对本品耐受低，血药浓度最好调至正常范围的下限，但波动不宜太大，故以少量多次的用药方案为安全且有效。 [地高辛的适应症] 1．用于高血压、瓣膜性心脏病、先天性心脏病等急性和慢性心功能不全。尤其适用于伴有快速心室率的心房颤动的心功能不全；对于肺源性心脏病、心肌严重缺血、活动性心肌炎及心外因素如严重贫血、甲状腺功能低下及维生素B1缺乏症的心功能不全疗效差； 2．用于控制伴有快速心室率的心房纤颤、心房扑动患者的心室率及阵发性室上性心动过速。 [地高辛的用法用量] 成人常用量。常用～㎎，每日一次，7天可达稳态血药浓度；若达快速负荷量，可每6～8小时给药㎎，总剂量～㎎/日；维持量，每日一次～㎎。 [地高辛的不良反应] 1. 常见的不良反应包括：促心律失常作用、胃纳不佳或恶心、呕吐(刺激延髓中枢)、下腹痛、异常的无力、软弱。 2. 少见的反应包括：视力模糊或"色视"，如黄视、绿视、腹泻、中枢神经系统反应如精神抑郁或错乱。 3. 罕见的反应包括：嗜睡、头痛及皮疹、寻麻疹(过敏反应)。 [地高辛药动学过程]

Braf基因突变检测试剂盒说明书

人类B-raf基因V600E突变检测试剂盒（荧光PCR法）说明书 【产品名称】 通用名：人类B-raf基因V600E突变检测试剂盒（荧光PCR法） 英文名：Diagnostic kit for V600E Mutation of Human B-raf Gene(Fluorescence PCR Analysis) 【包装规格】 20测试/盒 【预期用途】 B-raf基因位于7号染色体长臂上，是一种癌基因，属RAF基因家族，有18个外显子，编码一种含783个氨基酸的B-raf蛋白，是EGFR通路RAS/RAF/MEK/MRK/MAPK中重要的转导因子，参与调控细胞生长、分化和凋亡等多种生理过程。 针对EGFR的肿瘤靶向药物通过抑制该途径发生药理作用。研究表明在非小细胞肺癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤中存在B-raf基因突变，其中第15外显子上V600E点突变最常见，约占所有突变的90%以上，该突变导致B-raf蛋白被异常激活，从而使患者接受EGFR-TKI药物和EGFR单抗类药物治疗失效。据中国2010版《肿瘤学临床实践指南》建议，对K-raf基因检测正常的非小细胞肺癌和结直肠癌患者，应进一步检查B-raf基因的突变状态，以指导靶向药物治疗方案。 本试剂盒以人非小细胞肺癌、结直肠癌肿瘤组织切片提取的基因组DNA为检测样本，用于肿瘤组织B-raf 基因V600E点突变的定性检测，为临床肿瘤靶向药物的个体化用药提供依据。本公司尚无临床实例证实B-raf 基因突变与靶向药物的相关性，其相关性主要来自文献报道，因此本试剂盒检测结果仅用于辅助临床医生对肿瘤患者制定用药方案。 【检验原理】 本试剂盒基于实时荧光PCR平台，结合等位基因特异性扩增（ARMS）技术、野生型基因扩增抑制技术和多重PCR技术检测B-raf基因V600E突变。ARMS技术是指PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增，通过设计特异性ARMS引物，对存在V600E突变的B-raf基因靶序列进行PCR扩增放大，并利用FAM基团标记的Taqman 探针对扩增产物进行检测。因为采用了野生型基因扩增抑制剂，使ARMS体系能够耐受更高浓度的背景野生型B-raf基因，降低了试剂盒对基因组样本的DNA浓度要求，提高了检测灵敏度。 为质控扩增体系的有效性，试剂盒设置了内质控和外质控，内质控基因是人类基因组的一个保守片段，长

探针标记

核酸探针已被广泛用于筛选重组克隆、基因多样性的种性检测和真菌种群内及种群之间的系统发育关系评价。最早使用的放射性同位素标记核酸探针具有敏感性高、特异性好、分辨力强的特点，但放射性同位素标记也存在着一系列令人困扰的问题,如成本高、探针半衰期短、放射性物质危害人体健康等。而且在进行放射性同位素标记实验时,需要有专门的实验室及相应的实验保护设施，还需要由经过培训的专业人员来操作,因而限制了在普通实验室进行分子生物学实验。 近几年发展起来的非放射性核酸探针大多通过酶促、光化学和化学手段掺入一种报道基团,这种报道基团可通过高灵敏度的冷光、荧光或金属沉淀等检测系统检测。另外,应用pH电极或感应器技术的电化学检测系统也有报道。在这些检测系统中,灵敏度最高的是生物素- 亲合素检测系统和半抗原-抗半抗原地高辛检测系统。由于生物样品中常含有内源性生物素及生物结合蛋白，生物素标记的核酸探针会发生一些非特异性结合，从而影响实验效果。与生物素-亲合素系统同样具有高灵敏度，却减少了非特异性结合的地高辛检测系统，已为人们所接受,并得到广泛的应用。 地高辛(Digoxigenin ,DIG) 又称异羟基洋地黄毒甙元，是一种类固醇半抗原分子。 第四节非放射性标记的核酸探针 放射性标记核酸探针在使用中的限制，促使非放射性标记核酸探针的研制迅速发展，在许多方面已代替放射性标记，推动分子杂交技

术的广泛应用。目前已形成两大类非放射标记核酸技术，即酶促反应标记法和化学修饰标记法。 酶促反应标记探针是用缺口平移法，随机引物法或末端加尾法等把修饰的核苷酸如生物素-11-dUTP掺入到探针DNA中，制成标记探针，敏感度高于化学修饰法，但操作程序复杂，产量低，成本高。 化学修饰法是将不同标记物用化学方法连接到DNA分子上，方法简单，成本低，适用于大量制备（>50μg）如光敏生物素标记核酸方法，不需昂贵的酶，只在光照10～20min，生物素就结合在DNA 或RNA分子上。 非放射性标记核酸探针方法很多，现介绍常用的几种方法如下： 一、生物素标记核酸探针方法 生物素标记的核苷酸是最广泛使用的一种，如生物素-11-dUTP，可用缺口平移或末端加尾标记法。实验发现生物素可共价连接在嘧啶环的5位上，合成TTP或UTP的类似物。在离体条件下，这种生物素化dUTP可作为大肠杆菌多聚酶I（DNA酶I）的底物掺入带有缺口的DNA或RNA，得到生物素标记的核酸探针。这种标记方法称为缺口平移法。用标记在DNA上的生物素与链霉亲合素-酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）标记物进行检测。

地高辛标记及检测试剂盒说明书讲述

仅仅研究于生命科学，不适合在诊断过程使用 只能在体外使用 地高辛DNA标记和检测试剂盒1 和NBT/BCIP一起用于颜色检测 通过酶联免疫法采用地高辛-dUTP进行随机引物DNA标记，碱性标记和检测货号：11 745 832 910 此试剂盒储存条件-15o C—-25o C 此试剂盒可对10ng-3ugDNA进行12次标记反应 可检测100cm2面积的杂交膜24张 指导手册 2009.11版

1前言 1.1内容表 1前言 (2) 1.1内容表 (2) 1.2试剂盒内容 (3) 2简介 (5) 2.1产品概述 (5) 3步骤和所需材料 (8) 3.1开始之前 (8) 3.2地高辛DNA标记 (9) 3.3 标记效率的测定 (11) 3.4 DNA 的转移和固定 (14) 3.5杂交 (16) 3.6免疫检测 (18) 3.7 DNA印记的洗脱和再杂交 (20) 4结果 (21) 4.1典型的结果 (21) 5附录 (23) 5.1故障排除 (23) 5.2引用 (24) 5.3订购信息 (25)

1.2 试剂盒内容

附加仪器与所需试剂 除了上表中列出的试剂外，你必须准备一些溶液。在下表中，你可以找到不同操作程序需要准备的设备概要。 *标记的产品可以从Roche Applied Science 获得

2 介绍 2.1 产品概况 实验原则 此试剂盒采用地高辛（DIG），一种甾类半抗原，去标记DNA探针从而通过酶免疫分析

应用 地高辛标记DNA探针可以用于： 所有类型的滤膜杂交 总基因组DNA中单拷贝基因的检测，甚至对于高度复杂的生物也可以进行 检测，如人，大麦和小麦。 样品材料 至少100bp的DNA片段 线性的质粒，cos质粒或者λDNA 超螺旋的DNA 实验时间 此表格列出了每一步实验所需的反应时间 检测数量 一个试剂盒足够用于： 不超过3ug的模板DNA的12个标准的标记反应 和100cm2有24个斑点的检测 质量控制 根据操作步骤中的描述，对未标记的对照品DNA（PBR328）进行标记，0.1pg同源DNA 在点杂交中通过16h的显色来检测（1pg同源DNA可以通过1小时的显色进行检测）。

质粒抽提原理和详细操作步骤

质粒抽提,实验室必备技能之一 质粒 质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA 分子。 质粒抽提 从细菌中分离质粒DNA的方法包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用强碱液、加热或溶菌酶（主要针对革兰氏阳性细菌）可以破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（SDS）和 TritonX-100（一般很少使用）可使细胞膜裂解。经溶菌酶和SDS或 Triton X-100处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性，而共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA，简称cccDNA）的两条链不会相互分开。当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。 质粒抽提最常用的方法是碱裂解法，它具有得率高、适用面广、快速和纯度高等特点。当然，碱裂解法也有缺陷：容易导致不可逆的变性。要降低不可逆的变性，就要控制好碱裂解的时间。 碱裂解法抽提质粒需要用到以下三种溶液 溶液Ⅰ 50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0），10 mmol/L EDTA（pH 8.0），在15 psi 压力下蒸汽灭菌15 min，4℃保存。 溶液Ⅱ 0.2 mmol/L NaOH（从10 mmol/L 贮存液中现用现稀释），10 g/L SDS（室温保存）。 溶液Ⅲ

地高辛标记探针的Southern 杂交

地高辛标记探针的Southern杂交 1.探针标记(20μL体系)： 1)将10ng-1μg模板DNA用无菌去离子水补足至16μl。 2)沸水浴或干浴锅98o C10分钟，使DNA变性成单链并迅速冰浴冷却。 3)充分混匀DIG-high Primer（1#管），并取4μl至变性DNA管，混匀并离 心； 4)37o C温育1小时或过夜（最大到不超过20小时）； 5)停止反应，加2μL0.2M EDTA（pH8.0）或65o C加热10分钟。若不用 将于-20o C冰箱保存。 2.探针标记效率检测： 将地高辛标记好的探针作一系列的稀释，点到一条尼龙膜上，同时用地高辛标记的control DNA作对照标准，120℃固定30分钟；然后用地高辛抗体免疫检测，按BNT/BCIP显色步骤显色；比较显色结果，选择带有可以接受的背景的最高探针浓度做正式的杂交。操作步骤如下： 1)根据表1DIG-High Prime DNA标记及检测试剂盒理想条件下探针的标记 产量将标记的探针稀释到1ng/μl，将试剂盒提供的control DNA稀释到1ng/μl(原始浓度是5ng/μl)，然后按照表2作一系列的稀释探针及control DNA稀释 表1DIG-High Prime DNA标记及检测试剂盒理想条件下探针标记产量 Template DNA1h20h 10ng45ng600ng 30ng130ng1050ng 100ng270ng1500ng 300ng450ng2000ng 1000ng850ng2300ng 3000ng1350ng2650ng

表2探针DNA及Control DNA系列表 Tube DNA(μl)From Tube#DNA dilution buffer(μl) Dilution Final concentration 1Diluted orginal 1ng/μl 2211981:10010pg/μl 3152351:3.33pg/μl 452451:101pg/μl 553451:100.3pg/μl 654451:100.1pg/μl 755451:100.03pg/μl 856451:100.01pg/μl 90-50-0 1)将上述稀释的2-9号管的control DNA及探针DNA各取1μL点膜； 2)120o C固定30min或紫外交链3-5min； 3)将膜放入装有20mL Maleic acid buffer的塑料器皿中，室温振荡2min； 4)将膜放入10mL Blocking solution中室温温育30min； 5)将膜放入10mL Antibody solution中室温温育30min； 6)用10mL Washing buffer洗2次，每次15min； 7)在10mL Detection buffer平衡2-5min； 8)将膜放入2mL新配制的Color substrate solution(从试剂5#中取100ul到 5mL)中暗室条件下显色。显色过程中不要摇动或振荡! 9)当斑点或带显示出来后，用50ml灭菌的双蒸水洗膜5分钟，照相 染色至0.1pg的Control DNA出现斑点，比较标记的探针与Control DNA染色情况计算出地高辛标记的DNA的量：如果0.1pg的探针及对照稀释点都显色，则探针标记理想；如果0.1pg的对照显色，0.1pg的标记探针没显色，但0.3pg 显色，则计算探针浓度（约为理想浓度的1/3）以确定杂交时加多少探针（25ng 探针/ml杂交液）；如果0.1pg的对照显色，但标记探针0.3pg的斑点没显色，则应重新标记探针。

洋地黄、地高辛作用

医生须知 1 药理作用 具剂量依赖性的直接选择性正性肌力作用；增强迷走神经活性，抑制交感神经；减轻神经内分泌异常；纠正窦弓及心内压力感受器的敏感性；降低窦房结自律性，提高浦肯野氏纤维自律性，减慢房室结传导速度，缩短心房和浦肯野氏纤维的有效不应期等；能收缩下肢、肠系膜和冠脉血管，提高外周阻力，使平均动脉压升高；轻度利尿作用。 2 分类 （1）快速作用类：适用于急性心衰或慢性心衰急性加重时，如西地兰、毒毛花甙K； （2）中速或缓慢作用类：适用于轻、中度心衰或维持治疗，如地高辛、洋地黄毒甙。 3 适应证 （1）心力衰竭：心衰病人应用洋地黄类药后，症状可明显改善。长期使用，尚无明确临床试验证实对心衰的病死率、发病率和生活质量有益。对肺心病、严重心肌损伤、急性重症心肌炎、风湿活动期心衰，疗效差；对严重单纯二尖瓣狭窄和缩窄性心包炎，疗效很差或无效。 （2）心律失常：洋地黄治疗房颤的目的是减慢心室率，目前仍是改善快室率房颤的首选药物之一。 4 用法 （1）维持量法：逐日地高辛～，6～7天即可达稳态有效浓度。负荷量加维持量法：首次地高辛～，后每6～8小时给，至总量～，2～3天后地高辛维持量～。 （2）西地兰快速饱和量首次～，后每2～4h给～，总量1～。 5 毒副作用及防治 （1）毒副作用：

·胃肠道反应：厌食、恶心、呕吐、腹泻等。应注意洋地黄用量不足、心衰未控制时常因胃肠道瘀血也可出现上述反应。 ·中枢神经系统反应：眩晕、头痛、疲乏、失眠、谵妄等。 ·视力障碍：黄视、绿视、视力模糊等。 ·心脏毒性反应：最早、最常见为室早（33％）；Ⅱ、Ⅲ度房室传导阻滞（1 8％）；交界性心动过速（17％）；交界性逸搏（12％）；房性心动过速（10％）；室性心动过速（8％）；窦性停搏（2％）。 （2）防治原则（早期诊断、及时停药）： ·注意诱发因素：低钾、高钙、低镁血症、心肌缺血、缺氧等； ·警惕中毒先兆：室早出现或增多、窦缓（＜50～60次/min）、色视障碍等； ·测定血药浓度（地高辛＞3ng/ml或洋地黄毒甙＞45ng/ml，即可确诊中毒）； ·一旦确诊即停药； ·补充K+、Mg++； ·苯妥英钠能与洋地黄竞争膜Na+-K+ ATP酶，具解毒效应。 ·利多卡因也可用于治疗洋地黄中毒所致的室速和室颤，1～3mg/kg静推后以 1～4mg/min维持； ·阿托品用于治疗中毒时的心动过缓及Ⅱ、Ⅲ度房室传导阻滞，1～2 mg静推； ·静推地高辛抗体Fab片段，每80mg能拮抗1mg 地高辛； ·电复律属禁忌，若以上方法无效，可用小能量直流电复律。 ·必要时人工心脏起搏。 6 药物间相互作用 （1）能提高地高辛浓度、增强疗效的药物： ·奎尼丁能使90％患者的地高辛浓度提高1倍，二药合用时，酌减地高辛用量1/2～1/3。