第八章荧光免疫技术

第八章荧光免疫技术

FluoreSCenCe ImmunoaSsay

第一部分目的要求和教学内容

一、目的要求

掌握：荧光免疫技术原理、类型及临床应用，常用的荧光物质；熟悉：荧光免疫技术

的技术要点；了解：荧光标记物的制备与保存，镧系稀土元素标记物的制备，荧光免疫技术主要类型的技术要点。

二、教学内容

1．荧光标记物的制备：荧光和荧光物质，荧光标记物的制备。

2．荧光免疫显微技术：基本原理，技术类型，技术要点，方法评价，临床应用。 3．荧光免疫测定技术：时间分辨荧光免疫测定(基本原理，技术类型，技术要点，方法评价和临床应用)；荧光偏振免疫测定(基本原理，技术类型，技术要点，方法评价和临床应用)。

第二部分测试题

一、选择题

(一)单项选择题(A型题)

1.如下有关荧光免疫技术正确的提法

A．直观性检测抗原和抗体

B．直观性检测抗原

C．直观性检测抗体

D．间接检测抗原或抗体

E．间接检测抗原和抗体

2．荧光素易受温度影响，操作时通常选择较佳的温度

A．10～15℃

B．15～20℃

C．20～25℃

D．25～30℃

E．30～35℃

3．荧光抗体保存3～4年，应选择

A．小量分装、4℃

B．瓶分装、4℃

C．瓶分装、-10℃

D．瓶分装,-20℃

E．小量分装、-20℃

4．下列组成荧光显微镜的结构中，与普通光学显微镜相同的是

A．光源

B．聚光器

C．目镜

D．物镜

E．滤光片

5．下列哪项方法不属于荧光免疫显微技术类型

A．直接法

B．夹心法

C．间接法

D．补体法

E．双标记法

6．荧光抗体染色标本的观察时间

A．当天

B.第二天

C．第三天

D．1周内

E．5天

7．荧光抗体闭接法应标记

A．抗原

B．抗体

C．补体

D．抗抗体

E．抗体及补体

8．荧光显微技术常用于检验血清中各种自身抗体和多种病原体抗体的方法是

A．直接法

B．间接法

C．双抗体夹心法

D．补体法

E．双标记法

9．荧光抗体间接法可检测

A．抗原

B．抗体

C.补体

D．蛋白质

E．抗原和抗体

lO．在荧光显微镜检查中直接影响检测结果的是

A．抗原荧光染色

B．抗体荧光染色

C．补体荧光染色

D．特异性荧光染色

E．非特异性荧光染色

11．主要用于测定各种激素、蛋白质、酶、药物及病毒抗原的技术

A．荧光偏振免疫测定

B．荧光免疫显微技术

C．时间分辨荧光免疫测定

D．底物标记荧光免疫测定

E．流式荧光免疫技术

12．临床药物浓度检测的首选方法

A．时间分辨荧光免疫测定

B．荧光偏振免疫测定

C．荧光免疫显微技术

D．流式荧光免疫技术

E．底物标记荧光免疫测定

13．最适合于时间分辨荧光免疫测定的荧光物质

A．异硫氰酸荧光素

B．四乙基罗丹明

C．四甲基异硫氰酸罗丹明

D．藻红蛋白

E．镧系稀土元素(Eu)

14．去除过度标记的荧光抗体最好用

A.搅拌法

B.透析法

C.盐析法

D.凝胶过滤法

E.离子交换层析法

15．目前使用最广泛的荧光色素为

A.FITC

B.RB200

C.TRITC

D.R-RE

E.Eu3+

16．免疫标记技术中发展最早的技术是

A.酶免疫技术

B.同位素标记的免疫技术

C.化学发光免疫技术

D.荧光免疫技术

E.免疫金银技术

17．作为荧光抗体标记的荧光物质必须具备的条件中，与提高观察效果有关的是

A.必须有活性化学基团

B.性质稳定

C.荧光效率高

D.不影响蛋白质的活性

E.标记方法简便快速

18．决定荧光效率的因素主要是

A.物质本身的物理特性

B.激发光的波长

C.激发光的强度

D.溶剂pH

E.溶剂极性

19．荧光显微镜光路形式为

A 衍射光、落射光

B.折射光、透射光

C. 透射光、落射光

D.折射光、衍射光

E .散射光、衍射光

20．RB200产生的荧光色泽为

A.橘红色

B.黄绿色

C.蓝紫色

D.天青色

E.褐黑色

21．落射式荧光显微镜的吸收滤片应安装在

A.激发滤片与分色镜之间

B.分色镜与目镜之间

C.物镜与分色镜之间

D.物镜与载玻片之间

E.光源与激发滤片之间

22．能用于抗原定位检测的实验为

A.直接法荧光抗体染色

B.TRFIA

C.荧光偏振免疫分析

D.ELISA

E.免疫比浊分析

23．间接法荧光抗体染色与直接法相比,优点为

A.非特异性荧光染色少

B.操作更简便

C.可用于抗原的定位检测

D.可用于抗原定性检测

E.检测不同的抗原,只需制备一种荧光抗体24．荧光免疫技术中,应用最广泛的金属元素为

A.Tb

B.Ce

C.Eu

D.Au

E.Zn

25．关于直接法荧光抗体染色的特点,错误的是

A.简单易行,特异性高

B.敏感度偏低

C.非特异性荧光染色因素少

D.可检测抗原及抗体

E.每检测一种抗原需制备一种相应的荧光抗体26．临床常用的荧光猝灭剂不包括

A.亚甲蓝

B.甲基红

C.碱性复红

D.伊文思蓝

E.碘溶液

27．荧光显微镜观察时的注意事项错误的是

A.暗室内观察

B.染色后标本立即观察

C.37℃观察,效果最好

D.不宜长时间观察一个视野

E.宜用无荧光镜油

28．荧光显微镜与普通光学显微镜的不同之处错误的是

A.光源

B.滤片

C.聚光镜

D.电源

E.镜头

29.不宜用于荧光抗体染色的标本是

A.血涂片

B.肝印片

C.肿瘤切除物切片

D.细菌涂片

E.尿液

30.下述物质不是荧光色素的是

A.异硫氰酸荧光素

B.四乙基罗丹明

C.四甲基异硫氰酸罗丹明

D.四甲基伞酮-β-D半乳糖苷

E.藻红蛋白

(二)多项选择题(x型题)

1．对荧光标记物影响的因素有

A．pH、温度

B．溴化物、碘化物等杂质

C．荧光素的浓度

D．细胞固定剂

E．化合物

2．常用的荧光素是指

A．异硫氰酸荧光素

B．四乙基罗丹明

C．四甲基异硫氰酸罗丹明

D．藻红蛋白

E．镧系稀土元素(Eu2+)

3．有关荧光显微技术中制作组织标本过程要求

A．尽量保持抗原完整性

B．切片尽量薄

C．用丙酮或乙醇固定

D．制好的标本尽快染色

E．制好的标本无法及时染色，应置-20℃下低温干燥保存

4．荧光免疫显微技术在临床可用于

A．血清中自身抗体的检测

B．各种微生物的快速检查和鉴定

C．寄生虫感染的诊断

D．白细胞分化抗原的检测

E．HLA分型检测

5．荧光显微技术在组织学检查中具有如下优点

A．抗原或抗体的定位

B．抗原或抗体的定性检查

C．抗原抗体反应的高度特异性

D．荧光标本能持久保存

E．能在荧光显微镜下清晰地显示其形态，直观性强

6．间接荧光免疫法的优点是

A．敏感性高于直接法

B．制备一种荧光抗体即可检测多种抗原或抗体

C．操作时间较短

D．不易出现非特异荧光

E．反应参与的因素多

二、填空题

1．荧光免疫技术的主要类型包括()和()。

2．荧光物质有()和()。

3．荧光抗体染色技术可分为()和()。

4．镧系稀土元素标记物制备的螯合剂有()、()、()和()

5．荧光免疫测定根据抗原抗体反应后是否需要分离结合的与游离的荧光标记物而分为()和()两种类型。

6．非均相荧光免疫测定法包括()和()。

7．均相荧光免疫测定法包括()和()。

8．荧光素标记抗体的方法有()和()。

三、名词解释

1．荧光免疫技术(f l u o r e s c e n c e i m m u n o a s s a y)

2．荧光效率(fluorescent efficiency)

3．荧光寿命(nuorescence lifetime)

4．荧光的淬灭(fluorescent dyked)

5．荧光素(fluorescein)

6．荧光抗体(fluorescent antibody)

7．非均相荧光免疫测定法(aneven phase fluoroimmunoassay)

8．均相荧光免疫测定法(even phase fluoroimmunoassay)

9．时间分辨荧光免疫测定(time resolved fluorescence immunoassay，TR-FIA)

四、问答题

1．试述用于标记的荧光素应具备什么条件?

2．试述荧光免疫显微技术基本原理。

3．试述荧光免疫显微技术的临床应用。

4．试述荧光偏振免疫测定基本原理。

5．时间分辨荧光免疫测定法具有哪些优点?

6.简述荧光显微镜的滤片系统。

7.目前临床检验中常用的荧光物质有哪些？

8.简述荧光抗体的制备及纯化方法。

六、论述题

1.荧光抗体技术有哪些优缺点，在临床上有哪些应用？

第三部分参考答案与题解

一、选择题

(一)单项选择题(A型题)

1．A 2．B 3．E 4．D 5．B 6．A 7．D 8．B 9．E 10．E 11．C 12．B 13.E 14．E 15 A 16 D 17 C 18 A 19 C 20 A

21 B 22A 23 E 24 C 25 D 26 B 27 C 28 D 29 E 30 D

(二)多项选择题(x型题)

1．ABCDE 2．ABCD、 3．ABCDE 4．ABCDE 5．ABCE 6．AB 二、填空题

1．荧光抗体染色技术荧光免疫测定技术

2．荧光素其他荧光素物质(镧系稀土元素)

3．荧光免疫显微技术流式荧光免疫技术

4．多羧基酸类螯合剂 B-二酮体类螯合剂 BCPDA，菲洛林

5．均相,非均相

6．时间分辨荧光免疫测定荧光酶免疫测定

7．荧光偏振免疫测定底物标记荧光免疫测定

8．搅拌标记法透析标记法

三、名词解释

1．荧光免疫技术：是将抗原抗体反应的特异性与荧光物质检测的敏感性和直观性结合起来的一种免疫分析技术。

2．荧光效率：是指荧光物质将吸收的光能转变成为荧光的百分率。

3．荧光寿命：指荧光物质被一瞬时光脉冲激发后产生的荧光随时间而衰减到一定程度时所用的时间。

4．荧光的淬灭：指荧光分子在某些理化因素作用下、荧光分子的辐射能力受到激发光较长时间的照射后会减弱的现象。

5．荧光素：是能产生荧光并能作为染料使用的有机化合物。

6．荧光抗体：荧光素与特异性抗体以化学共价键的方式结合而成，是免疫荧光技术的关键试剂。

7．非均相荧光免疫测定法：在抗原抗体反应后，先把Ab*Ag与Ab*分离，然后测定Ab*Ag或Ab*中的标记物的量，从而推算出标本中的Ag量，该方法称非均相荧光免疫测定法。

8．均相荧光免疫测定法：在抗原抗体反应后Ab*Ag中的标记物失去荧光特性，则不需进行Ab*Ag与Ab*的分离，可以直接测定游离的Ab*量，从而推算出标本中的Ag量，该方法称为均相荧光免疫测定法。

9．时间分辨荧光免疫测定：时间分辨荧光免疫测定是用镧系稀土元素螯合物(如螯合物)标记抗体或抗原，检测标本中的相应抗原或抗体的荧光免疫测定技术。

四、问答题

1．用于标记的荧光素应符合以下要求：①应具有能与蛋白质分子形成共价键的化学

基团，结合后不易解离，而未结合者易清除；②荧光效率高，与蛋白质结合后，仍能保持较高的荧光效率；③荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明；④与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫学性质；⑤标记方法简单、安全无毒；⑥与蛋白质的结合物稳定，易于保存。

2．荧光免疫显微技术是以荧光显微镜为检测工具，用荧光素标记特异性抗体或抗抗体，检测固定组织细胞上的抗原或血清中的抗体，常用于定性和定位检查的一门技术。3．临床常应用于：①血清中自身抗体的检测；②各种微生物的快速检查和鉴定；⑧寄生虫感染的诊断；④白细胞分化抗原的检测。

4．荧光偏振免疫测定基本原理：荧光偏振免疫测定是利用荧光素经偏振光照射而跃入激发态，在回复至基态后可释出光子，经偏振仪形成偏振荧光，荧光偏振强度与荧光分子的大小成正比的关系而建立的免疫分析技术。

5．时间分辨荧光免疫测定法具有特异性强，灵敏度高，标准曲线范围宽，分析速度快，标记物制备较简便、有效使用期长，无放射性污染等优点，因此是很有发展前途的超微量物质免疫分析技术。

6.荧光显微镜的滤片系统有：⑴激发滤片（exciter filter）：位于光源和物镜之间，作用是使

短光波的光通过吸收长波长的光；⑵吸收滤片（barrier filter）：位于物镜和目镜之间，作用

是使荧光通过而阻断荧光以外的其它光。保护眼睛；⑶隔热滤片：位于灯室聚光器前，作用：阻拦红外线。

7.目前临床检验中常用的荧光物质有：四乙基罗丹明、异硫氰酸荧光素、四甲基异硫氰酸罗丹明、Eu3+的螯合物等。

8.荧光抗体的制备方法纯化方法有透析法、凝胶过滤法、有撑搅拌法及透析法。

六、论述题

1.荧光抗体技术有哪些优缺点，在临床上有哪些应用？

荧光抗体技术的优点：（1）能做到快速、敏感、定位。（2）Ag 和Ab 的特异性与

形态的检查结合在一起；

缺点：⑴对组织细胞进行微细结构的观察做不到；⑵标本不能永久

保存，荧光有自然消退现象，需及时观察及对照相；⑶有非特异性荧光的干扰。

荧光抗体技术的应用：⑴病毒学方面：病毒鉴定和病毒在感染cell内的定位；⑵寄生虫学方面：用于寄生虫的诊断（鉴定、分型）；⑶免疫学方面：研究、用于自身免疫病的诊断；⑷细菌学方面：菌种鉴定和Ag结构的研究。

免疫荧光操作步骤及注意事项

免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。 紫外光激发荧光物质放射荧光示意图 免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备（通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片（Slides or Coverslips）的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法（如ELISA或Western Blot）中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。 由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。 基本实验步骤：

量子点免疫层析检测技术

量子点免疫层析检测技术方兴未艾 免疫层析技术是一种快速、简便、灵敏、直观、价格低廉、可真正实现现场检测的检测方法。具有很多气相色谱、高效液相色谱、气质联用色谱、液质联用色谱、毛细管电泳等仪器检测方法以及其他传统方法无法企及的优点。在检测领域中处于特殊重要的地位，同时也是传统检测和仪器检测的良好补充。尤其在经济高速发展，生活水平提高的今天，人类重大疾病，环境污染，食品安全等问题日益受到极大的关注，让免疫层析检测技术更具有巨大的潜力和蓬勃的生命力。 目前，免疫层析产品主要为胶体金免疫层析试纸条，其最早应用于医学检验，在早孕检测中的应用取得了极大的成功，随后在各个领域迅速渗透漫延，其在毒品检测、环境检测、以及食品安全检测领域得到了迅速的发展，但是又出现新的问题，在很多方面，尤其是食品安全检测领域，有些农兽药残留限度极度苛刻，甚至要求0.1 ng/ml的检测限度，同时食品类物质如肉类、禽类、果蔬、谷物等成分复杂，前处理难度也很大，造成胶体金免疫层析检测灵敏度无法胜任。除了进一步提高前处理方法以外，寻求高灵敏度的免疫层析方法也显得尤为重要。 量子点是近20 年来发展起来的半导体纳米晶材料，因为它的优良特性，受到了很大的关注，并且已经显示出一定的潜力，近几年来从细胞标记等应用已逐渐开始向多个领域的检测与诊断方向渗透。 一、量子点特性 量子点(简称QDs,又称半导体纳米粒子)是由Ⅱ～Ⅵ族或Ⅲ～V族元素组成的，半径小于或接近于激光玻尔半径，能够接受激发光产生荧光的一类半导体纳米颗粒，其中研究较多的主要是CdX(x=S、Se、Te)，直径约为2nm-6nm。量子点由于存在显著的量子尺寸效应和表面效应，从而使它具有常规材料所不具备的光吸收特性，使其应用领域越来越广泛，特别是其在免疫生物学和临床检验学等研究中的潜在的应用价值，已引起了广大科学工作者的极大关注，发光量子点作为荧光试剂探针标记生物大分子，正是近年来迅速发展的纳米材料在生物分析领域的重要应用之一。与普通的荧光染料相比较，量子点具有以下特点： (1) 有机染料荧光分子激光谱带较窄，每一种荧光分子必须用合适能量的光来激发，而且产生的荧光峰较宽，不对称，有些拖尾。这给区分不同的探针分子带来困难，很难利用有机染料分子同时检测多种组分。量子点由于量子限域效应使其激发波长的范围很宽，可以被波长短于发射光的光(一般短10nm以上)激发，并产生窄(半波宽约13nm)而对称的发射光谱，从而避免了相邻探测通道的串扰。 (2) 量子点具有“调色”功能，不同粒径大小的量子点具有不同的颜色，激发量子点的激发波长范围很宽，且连续分布，所以可以用同一波长的光激发不同大小的量子点而获得多种颜色标记，是一类理想的荧光探针。 (3)量子点的荧光强度强，稳定性好，抗漂白能力强，Chan和Nie通过实验证明ZnS包覆的CdSe比罗丹明6G分子要亮20倍和稳定100-200倍，可以经受多次激发，且标记后对生物大分子的生理活性影响很小，因此为研究生物大分子之间的长期作用提供了可能。

免疫荧光操作步骤及注意事项

免疫荧光操作步骤及注意事项 免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术(比如流式细胞仪)测定含量。 紫外光激发荧光物质放射荧光示意图 免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透(或称为透化)、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备(通俗的说法是细胞爬片)是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片(Slides or Coverslips)的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法(如ELISA或Western Blot)中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4?或-20?避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。

由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。 基本实验步骤: (1) 细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次;对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤(1000rpm,5min)2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。 (2) 固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4?保存3个月。PBS洗涤3×5 min. (3) 通透。使用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min. (4) 封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min. (5) 一抗结合。室温孵育1h或者4?过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min. (6) 二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。 (7) 封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。 (一)细胞准备 用于免疫荧光实验的细胞可以是直接生长在盖玻片上的贴壁细胞，也可以是经过离心后涂片的悬浮细胞或者是将取自体内的组织细胞悬液离心后涂片。贴壁良好

免疫标记技术讲解

课程名称：临床免疫学检验技术课题名称：免疫标记技术 组员：朱恩鹏拉巴卓嘎 张燕培汪婷婷

免疫标记技术 免疫标记技术指用荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金及化学（或生物）发光剂等作为追踪物，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。藉助于荧光显微镜、射线测量仪、酶标检测仪、和发光免疫测定仪等精密仪器，对实验结果直接镜检观察或进行自动化测定，可以在细胞、亚细胞、超微结构及分子水平上，对抗原抗体反应进行定性和定位研究；或应用各种液相和固相免疫分析方法，对体液中的半抗原、抗原或抗体进行定性和定量测定。因此，免疫标记技术在敏感性、特异性、精确性及应用范围等方面远远超过一般免疫血清学方法。近年来，随着分子生物学、细胞生物学、基础免疫学和免疫化学等学科的发展以及现代高新技术建立的仪器分析的应用，免疫标记技术也不断完善和更新。各种新技术和新方法不断涌现，至今已成为一类检测微量和超微量生物活性物质的免疫生物化学分析技术，在医学和其他生物学科的研究领域及临床检验中应用十分广泛。 根据试验中所用标记物的种类和检测方法不同，免疫标记技术分为免疫荧光技术、放射免疫技术、免疫酶技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术和发光免疫测定等。 第一节放射免疫技术 放射免疫标记技术是将同位素分析的高灵敏度与抗原抗体反应的特异性相结合，以放射性同位素作为示踪物的标记免疫测定方法，由于此项技术具有灵敏度高（可检测出毫微克（ng）至微微克（pg），甚至毫微微克（fg）的超微量物质，特异性强（可分辨结构类似的抗原）、重复性强、样品及试剂用量少、测定方法易规范化和自动化等多个优点。因此，在医学及其他生物学科的研究领域和临床实验诊断中广泛应用于各种微量蛋白质、激素、小分子药物及肿瘤标志物等的分析与定量测定。 （一）放射免疫测定（RIA） 放射免疫测定（Radio immunoassay , RIA）是1959 年Yalow 和Berson 首先创建的经典放射免疫分析技术，用于血清中胰岛素含量的测定。30 多年来，由于此项技术灵敏、特异、并已制成多种标准试剂盒，使用方便，应用范围十分广泛。目前国外已成功地应用RIA检测的物质多达300余种，国内研究的被测物质也达百余种，试制的RIA试剂盒已有60余种，是测定各种微量物质不可缺少的手段。 （二）免疫放射测定（IRMA）

直接免疫荧光法测抗原

直接免疫荧光法测抗原 基本原理 将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。 试剂与仪器 l 磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4 l 荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释 l 缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制 l 搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml） l 有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫） l 荧光显微镜 l 玻片架 l 滤纸 l 37℃温箱等。 实验步骤 1. 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。 2. 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间（参考：30min）。 3. 取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗后，再按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。 4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。 5. 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示： （-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+++

--++++）荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。 注意事项 1. 对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释度不应超过1：20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。 2. 染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30 min已足够。染色温度多采用室温（25℃左右），高于37℃可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0-2℃的低温，延长染色时间。低温染色过夜较37℃30 min效果好的多。 3. 为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。 （1）标本自发荧光对照：标本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。 （2）特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。 （3）阳性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。 如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。 4. 一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象，经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。

细胞免疫荧光实验步骤

细胞免疫荧光实验步骤 细胞免疫荧光实验步骤 简单实验步骤如下: 1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时. 2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟 3.PBS洗净:3min＊3 4.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS 5.PBS洗净:2＊5min 6.羊血清封闭：３７度，２０分钟 ７.一抗，４度过夜，一般要大于１８小时或者３７度１－２小时 ８.４度PBS洗净，３min＊５次 ９.二抗３７度小于一小时 １０.３７度PBS洗净，３＊５min 凉干封片（封闭液ＰＨ８.５） 活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备 （一）制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、 胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法) ↓ 用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为 5×10６～１×10７／ml ↓ 取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl) 的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS 稀释)灭活正常兔血清 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右 1000rpm×5min

↓ 弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠 (或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右 1000rpm×5min ↓ 加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入 1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察， 视细胞浓度加入100～500μl固定液) ↓ FCM检测或制片后荧光显微镜下观察 (标本在试管中可保存5～7天) （二）试剂和器材 1. 各种特异性单克隆抗体。 2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。 3. 10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。 4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。 （三）注意事项 1. 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN ３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。 2. 洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。 3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。 4. 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。 附: 1. DPBS (×10, 贮存液)

免疫荧光检测

免疫荧光技术（检测抗核抗体（ANA）的实验方案） 荧光免疫技术是以荧光物质标记的特异性抗体或抗原作为标准试剂，用于相应抗原或抗体的分析鉴定和定量测定。荧光免疫技术包括荧光抗体染色技术和荧光免疫测定两大类。荧光抗体染色技术是用荧光抗体对细胞、组织切片或其他标本中的抗原或抗体进行鉴定和定位检测，可在荧光显微镜下直接观察结果，称为荧光免疫显微技术，或是应用流式细胞仪进行自动分析检测，称为流式荧光免疫技术。荧光免疫测定主要有时间分辨荧光免疫测定和荧光偏振免疫测定等。本次实验以荧光免疫显微技术检测抗核抗体(ANA)为例进行实习。 抗核抗体(antinuclear antibody，ANA)又称抗核酸抗原抗体，是一组将自身真核细胞的各种成分脱氧核糖核蛋白(DNP)、DNA、可提取的核抗原(ENA)和RNA等作为靶抗原的自身抗体的总称，能与所有动物的细胞核发生反应，主要存在于血清中，也可存在于胸水、关节滑膜液和尿液中。 抗核抗体实验原理 以小鼠肝细胞或某些培养细胞(如Hep-2)作抗原片，将病人血清加到抗原片上。如果血清中含有ANA，就会与细胞核成分特异性结合。加入荧光素标记的抗人IgG抗体又可与ANA结合，在荧光显微镜下可见细胞核部位呈现荧光。 试剂与器材 1．抗原片现多用商品试剂。如需自行制备，方法如下： (1)肝印片制备：取4-8周龄小鼠，断颈杀死后，剖腹取肝。将肝脏剪成平面块，用生理盐水洗去血细胞，用滤纸吸干渗出的浆液。将切面轻压于载玻片上，使其在载玻片上留下薄层肝细胞。冷风吹干，乙醇固定，冰箱可保存1周。

(2)Hep-2细胞抗原片制备：Hep-2细胞是建株的人喉癌上皮细胞。经适宜培养在载玻片上形成单层细胞抗原片，用洗涤洗去培养基。干燥后，用无水乙醇固定。 (3)肝切片制备：取小鼠肝组织作冰冻切片，厚4μl。-30℃保存备用。 2．异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗人IgG抗体(FITC-抗人IgG抗体)有商品供应，临用时按效价稀释。 3．L PBS 4．缓冲甘油取甘油9份加PBS 1份。 5.待测血清、阳性和阴性对照血清临床标本筛选获得。 6．器材荧光显微镜、孵箱、有盖湿盒、染色缸、吸管、试管等 操作方法 1．准备：检查加样板，生物载片恢复室温，标记。 2．稀释：PBS-Tween缓冲液稀释血清，设阴阳性对照。 3．加样：加样板放于泡沫塑料板上，加25μl稀释后血清，至加样板的每一反应区，避免气泡。加完所有标本后开始温育。 4．温育：将生物薄片盖于加样板的凹槽里，反应开始，室温温育30分钟。 5．冲洗：用烧杯盛PBS-Tween缓冲液流水冲洗生物薄片，然后立即将其浸入盛有PBS-Tween缓冲液的小杯中至少1分钟。不必混摇。 6．加样：滴加20μl荧光素标记的抗人球蛋白（结合物）至一洁净加样板的反应区，完全加完方可继续温育。荧光素标记的抗人球蛋白用前需混匀并以PBS-Tween缓冲液稀释。

免疫组化与免疫荧光的区别

免疫组化与免疫荧光 一、两者都是蛋白定位的检测（也就是确定蛋白是表达在细胞核/浆/膜）。 二、区别是： 1、概念和基本原理 免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜的现像和放大作用，在细胞，亚细胞水平检测各种抗原物质，并可在原位显示相应的基因和基因表达产物。免疫组织化学技术现已有：免疫荧光组织（细胞）化学技术、免疫酶组织（细胞）化学技术、亲和组织化学技术、免疫金银及铁标记免疫组织化学技术等。 免疫荧光组织（细胞）化学技术是采用荧光素标记的已知抗体（或抗原）作为探针，检测待测组织、细胞标本中的靶抗原（或抗体），形成的抗原抗体复合物上带有荧光素，在荧光显微镜下，由于受高压汞灯光源的紫外光照射，荧光素发出明亮的荧光，这样就可以分辨出抗原（或抗体）的所在位置及其性质，并可利用荧光定量技术计算抗原的含量。以达到对抗原物质定位、定性、定量测定的目的。 2、标本制作： 免疫荧光一般用冰冻切片，减少杂质干扰；而酶免疫组化一般用石蜡切片或冰冻切片均可以。 3、实验步骤：免疫荧光染色步骤简单，而酶免疫组化方法较为复杂，多了DAB显色过程。 4、染色后的标本保存：免疫荧光染色后的标本一般短时间拍照，时间长了荧光衰退；而酶免疫组化染色标本可以长期保存。 5、免疫组化结果除了知道蛋白是在细胞浆还是细胞膜表达高些，还可以用软件做相对定量分析。 6、免疫荧光得到的图片是彩色的，漂亮些，可以发高档次文章。 免疫学三大工具：免疫组化、Western、ELISA，分别用于定位，定性和定量。

细胞免疫荧光步骤(仅供参照)

方法一： 1.首先需要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片） 2.然后在4％PFA里面室温下固定30分钟，PBS洗两次，0.1% TX-100室温下作用1－2分 钟使细胞膜通透。 3.接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器（面积大，扁平状的，比如大的培养皿）里面， 放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。 4.剪一片合适大小的parafilm，在上面滴上稀释在1％BSA/TBS中的一抗（稀释倍数依具体 抗体而定），每个玻璃片30ul足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育30分钟，然后在PBS里洗三次。 5.接下来二抗孵育步骤同上。 6.最后，在载玻片加上mounting medium（大约每个玻璃片加10ul），把玻璃片放上去（细 胞面朝下），37度30分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。 7.抗体很重要，不能有非特异性结合。你可以先做WB检测一下你的抗体，看看有没有杂带。 8.双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看看那种方法合适）。 如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。 方法二： 1.选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，二抗则是不 同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。 2.我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔细摸索， 我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。 3.我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对 照是PBS+荧光标记物。 4.封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10%的正常donkey血清。 5.其余步骤同一般免疫荧光单标操作。 方法三： 1.片子的制作：可以做细胞爬片，细胞甩片，还有直接在24well/12well/96well中直接染色 2.细胞爬片的制作：直接购买公司的已经处理过的细胞爬片，要是自己制作的话，就用无菌 的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片 3.细胞甩片：需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。

免疫荧光技术

免疫荧光技术（Immunofluorescence technique）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位。 一、基本原理： 免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光（黄绿色或橘红色），可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。 二、应用范围： 其应用范围极其广泛，可以测定内分泌激素、蛋白质、多肽、核酸、神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、肿瘤标志物、血药浓度等各种生物活性物质。根据诊断类别，又可分为传染性疾病、内分泌、肿瘤、药物检测、免疫学、血型鉴定等。 三、基本实验步骤：

1、细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm,5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。 2、固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。PBS洗涤3×5min. 3、通透。使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5min. 4、封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min. 5、一抗结合。室温孵育1h或者4℃过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min. 6、二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。 7、封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。 四、注意事项： 1、染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会崔灭的。 2、荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。

免疫荧光技术的实验方法及其分类

免疫荧光技术的实验方法及其分类 一、免疫标记法及其分类 1.荧光免疫法 原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。底物用磷酸-4-甲基伞形酮，检测产物发出的荧光，荧光强度与Mb浓度呈正比，可在8min 内得出结果。结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。该法重复性好，线性范围宽，具有快速、敏感、准确的特点。 以双抗夹心法为例，首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。除去未结合抗体，然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。洗涤除去未结合物，接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体—抗原—抗体复合物。最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。 传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大，时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕，作为标记物，加入正常液后激发测定，能有效去除短寿命本底荧光的干扰。

2.放射免疫法 放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原，竞争性地与抗体结合，形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物，并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。然后通过离心沉淀等方法，将抗原—抗体复合物与游离抗原分离，分别测定其放射性强度与标准曲线比较，即可对未标记的待测抗原进行定量。 RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强，可准确定量到ng/ml 水平。但早期的方法操作麻烦，耗时长，且有放射性污染。近年来，随着单克隆抗体的应用，RIA的灵敏度又有了较大提高，且操作大为简化，并已有商品试剂盒供应，使用方便。 3.酶联免疫法(ELISA) ELISA法有竞争法和夹心法两种。竞争法是基于标准或血清Mb 和微孑L板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立，该法的最低检测限为10μg/L，线性范围达1 000ug/L。夹心ELISA 法与EIA具有良好的相关性(r=0.92)。ELISA法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，操作简单，适用于多份标本的检测，不需特殊仪器设备等优点，易于推广普及。但不适合急诊的快速检测。

第八章荧光免疫技术

第八章荧光免疫技术 FluoreSCenCe ImmunoaSsay 第一部分目的要求和教学内容 一、目的要求 掌握：荧光免疫技术原理、类型及临床应用，常用的荧光物质；熟悉：荧光免疫技术 的技术要点；了解：荧光标记物的制备与保存，镧系稀土元素标记物的制备，荧光免疫技术主要类型的技术要点。 二、教学内容 1．荧光标记物的制备：荧光和荧光物质，荧光标记物的制备。 2．荧光免疫显微技术：基本原理，技术类型，技术要点，方法评价，临床应用。 3．荧光免疫测定技术：时间分辨荧光免疫测定(基本原理，技术类型，技术要点，方法评价和临床应用)；荧光偏振免疫测定(基本原理，技术类型，技术要点，方法评价和临床应用)。 第二部分测试题 一、选择题 (一)单项选择题(A型题) 1.如下有关荧光免疫技术正确的提法 A．直观性检测抗原和抗体 B．直观性检测抗原 C．直观性检测抗体 D．间接检测抗原或抗体 E．间接检测抗原和抗体 2．荧光素易受温度影响，操作时通常选择较佳的温度 A．10～15℃ B．15～20℃ C．20～25℃ D．25～30℃ E．30～35℃ 3．荧光抗体保存3～4年，应选择 A．小量分装、4℃ B．瓶分装、4℃ C．瓶分装、-10℃ D．瓶分装,-20℃ E．小量分装、-20℃ 4．下列组成荧光显微镜的结构中，与普通光学显微镜相同的是 A．光源 B．聚光器 C．目镜 D．物镜 E．滤光片

5．下列哪项方法不属于荧光免疫显微技术类型 A．直接法 B．夹心法 C．间接法 D．补体法 E．双标记法 6．荧光抗体染色标本的观察时间 A．当天 B.第二天 C．第三天 D．1周内 E．5天 7．荧光抗体闭接法应标记 A．抗原 B．抗体 C．补体 D．抗抗体 E．抗体及补体 8．荧光显微技术常用于检验血清中各种自身抗体和多种病原体抗体的方法是 A．直接法 B．间接法 C．双抗体夹心法 D．补体法 E．双标记法 9．荧光抗体间接法可检测 A．抗原 B．抗体 C.补体 D．蛋白质 E．抗原和抗体 lO．在荧光显微镜检查中直接影响检测结果的是 A．抗原荧光染色 B．抗体荧光染色 C．补体荧光染色 D．特异性荧光染色 E．非特异性荧光染色 11．主要用于测定各种激素、蛋白质、酶、药物及病毒抗原的技术 A．荧光偏振免疫测定 B．荧光免疫显微技术 C．时间分辨荧光免疫测定 D．底物标记荧光免疫测定 E．流式荧光免疫技术 12．临床药物浓度检测的首选方法

免疫荧光双标操作方法及注意事项

在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。 (1)直接法双重免疫荧光标记：将标记有两种不同荧光素的抗体(如抗A 和抗B)以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合的荧光抗体，在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，即可对两种抗原进行定位和定量。直接法简便可靠，但灵敏度较低。 (2)间接法双重免疫荧光标记：用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，从而对两种抗原进行定位和定量。使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属，且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。 免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项 一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下： 1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。 2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。 3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。 4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS (1：1)。条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。

5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。 6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。 二、注意事项 1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。 2、每次试验均需设置以下三种对照： (1) 阳性对照：阳性血清+荧光标记物; (2) 阴性对照：阴性血清+荧光标记物; (3) 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。 三、免疫荧光双标的经验之谈 1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。 2、我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要自我摸索，我感觉一抗4℃孵育过夜比较好，背景比较清晰。 3、我的阳性对照采用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。 4、封闭血清是二抗来源动物的正常血清，我用的是10%正常donkey 血清。 5、其余事项同免疫荧光单标操作。 免疫组化双重染色方法和步骤 在生物医学和临床研究实践中，经常需要检测两种不同物质是否在同一

免疫荧光实验步骤大全(精华版)

免疫荧光染色大全（精华版） 组织免疫荧光法 （1）将待染组织切片置于65摄氏度恒温箱烤片1h，脱蜡 （2）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （3）0.5%Triton X-100（PBS 配制）室温通透 10min （4）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 注意：步骤（3）和（4）用于检测细胞核抗原，细胞膜抗原直接跳过此步骤（5）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火3min，后转成低火 15min。 （6）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （7）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。 （8）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （9）使用1% BSA进行室温封闭 30min，用于封闭非特异性抗原表位。 （10）按抗体推荐使用说明书孵育特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜。（11）次日取出切片，室温下复温 30min。 （12）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （13）选取相应的免疫荧光二抗滴加于血管组织上，37°C避光孵育30min。（14）1×PBS洗涤 3 次，每次 5min。 （15）避光条件下，DAPI 染液染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用（16）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （17）在血管组织上滴加抗荧光淬灭剂进行封片。 （18）使用荧光显微镜进行观察拍照。 贴壁细胞免疫荧光法 （1）在培养板中接种的带染色的细胞爬片用PBS泡洗3次×3min （2）4%多聚甲醛固定细胞爬片15min （3）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （4）0.5%Triton X-100（PBS配制）室温通透10min （5）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （6）1%BSA室温封闭30min （7）弃掉封闭液，细胞爬片滴加适量稀释至适当比例的一抗，4℃孵育过夜（8）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （9）细胞爬片滴加稀释至适当比例的荧光二抗 （10）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （11）DAPI染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用 （12）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （13）用抗荧光淬灭剂封片 （14）荧光显微镜下观察采集图像 细胞免疫荧光（悬浮细胞方法一） （1）收集悬浮细胞，细胞在冰浴中冷却，然后用台式离心机于4℃以800 g 离心5 min，吸去培养液并以4℃ 1×PBS重悬细胞。

免疫荧光步骤(精)

胞免疫荧光步骤： 1.细胞爬片；首先是玻片的处理，普通的盖玻片用砂轮划成自己要的大小的小方块，先用洗衣粉洗干净，用水冲静烤干，然后泡酸过夜，捞酸后流水洗净，烤干，置于器皿中高压灭菌，然后再烤箱中大约8小时烤干备用。 爬片可以在培养皿六孔板或24孔板中都可，我选择在培养皿中爬。一为节约经费（培养皿可以重复利用）二来觉得培养皿口大，操作比较方便。培养皿消毒同上，消毒时记得消两把镊子 具体操作是：用胰酶消化好细胞，充分吹打，使之成单细胞悬液（注意：这一点很重要，关系到将来爬出来片子的质量） 取出消毒的培养皿，可以先加少量培养基（以使玻片与培养皿紧密接触），将玻片小心放入摆放其中，然后将单细胞悬液一滴一滴的滴到玻片上。最后盖上培养皿置于37度5％CO2的暖箱中培养，根据细胞生长状况，24小时或更长时间适时取出爬片。 爬片置于37度PBS中洗三次，每次3到5秒钟，然后在4％多聚甲醛中固定15分钟，然后再用37度去离子水将甲醛冲干净，注意手法轻柔，要不然掉片很厉害。同时操作过程中注意玻片的正反面，要不然真的是前功尽弃。 将做好的爬片置于滤纸上晾干，然后用中性树胶粘在载玻片上。注意一定要等中性树胶彻底干了之后才能做后续实验，要不然玻片会掉下来的，就又是前功尽弃了做好的细胞爬片可以放在－20保存备用，具体能保存多长时间不太清楚，当然尽量早用。 2.4%多聚甲醛固定10min(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮)； 3.PBS漂洗5min； 4.0.5% Triton 穿孔15min(丙酮固定法不用透化处理)； 5.PBS漂洗2次，每次5min； 6.1%BSA封闭30min； 7.加入1%BSA稀释的一抗，于37℃杂交2h； 8.PBS漂洗2次，每次5min； 9.加入1%BSA稀释的二抗，于37℃杂交1h； 10.PBS漂洗2次，每次5min； 11.5ug/ml DAPI染色2min； 12.抗淬灭封片剂封片。

LUMINEX技术原理及应用

Luminex的基本原理及应用 传统的蛋白质分析主要采用双抗体夹心ELISA法。此法长期以来被视为蛋白质定量分析的“标准方法”。ELISA可以用来准确测定大批量生物样品，但每次实验只能分析一个目标分子，而不具备同时分析多种目标分子的能力。在ELISA基础上发展出的 luminex技术，不仅同样通过双抗体选择而具有高特异性，同时也具有ELISA的高通量、操作简便、测量准确等优点，而且可以在一次实验中完成对多种目标分子的分析，从而改变了过去的分析模式，建立了更加高效快速的分析平台。Luminex技术原理，在近年发表的文章中已有过详细的介绍和说明。Luminex 技术应用微球和流式细胞仪的原理。微球内部含有三种荧光免疫荧光，通过荧光不同的比例可以区分500种不同的微球。每种微球可以用来检测一种不同的蛋白或基因。因此，利用微球技术，可以同时检测高达500个蛋白或基因。该技术利用荧光编码的微球共价交联单克隆抗体，与被测定的目标分子结合后，加入荧光素标记的检测抗体，再通过激光扫描荧光编码来识别单个微球和测量“检测荧光”强度来确定被测分子的浓度。在使用相同抗体对的条件下，luminex技术的测量结果在准确度、精确度、灵敏度方面与ELISA均可达到相似的水平。Luminex应用的荧光编码微球带有针对不同目标分子的特异性抗体，不同的微球在一定程度上可以自由组合，这样在一次实验中可以同时完成多个目标分子的分析。多目标分子的同时测定可以大大减少生物样品的消耗量，节省成本和测定时间，并且使多种目标分子之间相关性的分析更加准确。很多公司已经开始提供Luminex试剂盒，用于基础和临床医学研究以及临床检测。目前，Luminex 试剂盒已经可以检测500多种蛋白质分子，包括细胞因子、激素、自身抗体、肿瘤标志物等。 Luminex常见问题及解答 LUMINEX应用于哪些领域? 生物医学研究，生物标记物开发，临床检测等领域。Luminex技术主要用于蛋白和核酸检测分析。 LUMINEX敏感性如何？ 灵敏度取决于开头的质量。对于同样的抗体对，Luminex检测的灵敏度高于ELISA技术。一般检测灵敏度在pg级。 对不同类型的样品制备和样品量的要求是怎样的？ 血清、血浆是常用的样本，每次检测需要10ul，每次可以检测多个蛋白。 从各种细胞或组织中提取的蛋白也可以用Luminex技术检测，制备方法与ELISA、Western Blot完全一样。 一般可以检测到多少基因或蛋白的表达信息？ 检测蛋白和基因的数目主要取决于试剂盒。蛋白质检测目前最高可以达到50个左右，基因检测最高达500个。 如何保证检测结果的特异性？ 检测的特异性取决于抗体高特异性。试剂几乎全部来源于美国大公司，产品经过了严格的质量控制。同时，我们检测公司也有近15年的经验、严格的操作程序和质量控制体系。 客户自己提供抗体，是否可以进行LUMINEX检测？ Luminex和ELISA检测试剂都需要两个配套的特异性抗体。我们公司具有开发Luminex试剂盒的经验。但是，需要一系列的开发工作才能保证结果的特异性、重复性和可靠性。 除了蛋白，LUMINEX技术是否还可以用于其它指标的检测？ 可以用于基因表达，基因多态性和HLA配型分析。

免疫荧光抗体检测技术

实验七免疫荧光抗体检测技术 一、目的要求 通过本实验，了解和掌握直接免疫荧光和间接免疫荧光染色的原理和方法，并能应用于疾病的诊断和抗原抗体的分析。 二、实验原理 用化学或物理的方法将荧光素标记到抗体或抗原上，这种标记荧光素的抗体或抗原仍然能与相应抗原或抗体发生特异性结合。通过已知的荧光抗体或抗原，检测样本中相应的抗原或抗体，从而进行疾病的诊断和对抗原抗体的分析。 间接免疫荧光试验 三、实验材料 感染鸡马立克病病毒（MDV）的细胞培养物，抗MDV特异性单克隆抗体BA4;丙酮-乙醇（6:4，V/V）固定液，盖玻片，FITC标记的抗小鼠IgG荧光抗体，0.01mol/L PBS(pH 7.2)，蒸馏水，载玻片（洁净无油）；1000ml 烧杯，磁棒，磁力搅拌器，200μL移液器，吸水纸，镊子等。 四、实验方法 1.细胞片的制备与固定将消毒并处理过的盖玻片放于细胞培养瓶（皿）中，按常规操作，制备鸡胚成纤维细胞，并培养于细胞培养瓶（皿）中，待细胞生长成单层后，接种CVI988/Rispens疫苗株。48—72h后，直接收获盖片，用PBS洗涤1次，再以-20℃预冷的丙酮-乙醇（6:4，V/V）固定液固定5min，空气干燥，置密封容器于-20℃保存备用。如用96孔或24孔细胞培养板培养的细胞，可弃去培养液，用PBS洗涤1次，然后固定，固定方法同上。 2.抗体染色 ⑴将接种并固定的MDV病毒的盖玻片，用PBS洗涤1次，置架上。取未接种MD病毒的盖玻片，同上用PBS洗涤1次，置架上，作为阴性对照。盖玻片上滴加10μL—20μL工作浓度的单克隆抗体，96孔细胞培养板加入50μL/孔工作浓度的单克隆抗体。37℃水浴孵育30—45min。 ⑵盖玻片在PBS（Ph7.4,0.01mol/L）中用磁力搅拌器洗涤5—10min，如用96孔细胞培养板检测，则加入PBS 200μL/孔，洗涤3—4次。 ⑶取出盖片置架上，滴加工作浓度的荧光抗体（FITC标记的抗小鼠IgG的抗体）。37℃孵

细胞免疫荧光实验步骤

细胞爬片免疫荧光实验步骤 第一天： 1. 在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min； 2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15min， PBS浸洗玻片3次，每次3min； 3. 0.5%Triton X-100( PBS配制 )室温通透20min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）； 4. PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30min； 5. 吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜； 第二天： 6. 加荧光二抗： PBST 浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min；注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。 7. 复染核：滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI；8. 用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。 细胞免疫荧光步骤 1.在24孔板里加500微升培养基，放爬片，接种细胞（做实验以30-50%汇合度较好。10000-30000左右 2.给药处理24h。 3.PBS洗三遍。 4. 4％冷的多聚甲醛固定15分钟，PBS洗三遍，每次5min，摇床。（避光） 5.0.5％Triton X－100（PBS配）破膜15min，PBS洗三遍，每次5min，摇床。 6.5%BSA（牛血清白蛋白，PBS配）封闭60分钟,不用洗。 7.加一抗孵育（5%BSA配），4℃摇床过夜。 8. 收集一抗，PBS洗三遍，每次5min，摇床。孵育二抗Alexa Fluor 488（1:1000 ）,室温60min（避光） 9. 回收二抗，PBS洗三遍，摇床，每次5min。 10. 0.5ug/mLDAPI（5%BSA配，2滴/ml）染核15min。（避光） 11. PBS洗三遍，每次5min，摇床。 12.取载玻片，滴加10uL抗荧光衰减封片剂，将爬片有细胞面盖在封片剂上，指甲油封片子的对角线。 All steps for IF