cDNA文库的构建方法与原理

c D N A文库的构建方法与原理

蛋白质是细胞的功能分子：它们构成结构和调控分子，动力和泵蛋白，酶和受体。然而，如果仅用传统的生化方法确定某一特异蛋白的全序列，或制备足够量的蛋白进行操作和鉴定都是使人厌烦且昂贵的步骤。基因克隆和遗传工程对生化领域有很大贡献。如果只限于将基因组DNA作为材料来源，由于其中仅2%被认为可能编码蛋白质，那么确定蛋白质序列仍然是令人生畏的工作。其他部分包括结构和调节因子、内含子、非编译外显子和重复及功能未知的非编码序列。如果分析仅局限在编码序列，那么确定基因产物序列所需的努力就会大大的降低。因此分子生物学主要原则之一是mRNA作为蛋白质合成的模板，所以mRNA是确定蛋白质序列的理想底物。不幸的是，现有通用的克隆载体没有一个能容纳mRNA分子作为插入片段。因此，产生表达序列文库的一个基本步骤是将mRNA分子转变成双链DNA。来自mRNA分子的DNA拷贝称cDNA，由来自细胞或组织mRNA种类的DNA拷贝组成的文库称为cDNA文库。

1．基本原理

cDNA（Complementary DNA）是以mRNA为模板，在反转录酶作用下合成的互补DNA，它的顺序可代表mRNA序列。cDNA文库的构建是指将cDNA与克隆载体DNA体外重组，然后去转化克隆载体DNA 的宿主细胞，从而得到一群含重组DNA的细菌或噬菌体克隆的过程。这些序列来自并代表一定组织或细胞类型特定发育或分化阶段的整个mRNA群体。其过程可概括为：（1）通过反转录酶将各种mRNA转变在cDNA；（2）cDNA与合适的载体重组并导入到宿主中。

cDNA基因文库具有许多优点和特殊用途：

首先，cDNA克隆以mRNA为起始材料，这对于有些RNA病毒来说非常适用，因为它们的增殖并不经过DNA中间体，研究这样的生物有机体，cDNA克隆是唯一可行的方法。

第二，cDNA基因文库的筛选简单易行，恰当选择mRNA的来源，使所构建的cDNA基因文库中，某一特定序列的克隆达到很高的比例，简化了筛选特定基因序列克隆的工作量。

第三，每一个cDNA克隆都含有一种mRNA序列，在选择中出现假阳性几率比较低，从阳性杂交信号选择出来的阳性克隆一般含有目的基因序列。

第四，cDNA克隆的另一用途是用于基因序列的测定，读码框（ORF）的界定，只有通过对mRNA5’核苷酸序列才能获得。

2．基本方法

2．1 mRNA纯化

构建一个cDNA文库的第一步是分离在某一给定的组织或细胞类型表达的mRNA。mRNA仅占细胞总RNA的1%～5%，因而需要另外的纯化技术来富集mRNA。从细胞总RNA中分离mRNA是根据实际上所有真核细胞mRNA 3’端有一长的伸展的腺嘌呤核苷，这个序列被称为poly(A)尾巴，是mRNA分子特有的而其他主要RNA没有，poly(A)尾通常有足够的长度因而能与人工合成的互补的寡脱氧胸苷酸（oligo(dT)）杂交。正是这种特性使得mRNA从RNA分子的混合物中分离出来。方法有三种：

·寡脱氧胸苷酸亲和层析：即分离mRNA的标准方法，将一个寡脱氧胸苷酸（12~18碱基）连接到纤维素的亲和层析柱法，总RNA混合物上样后，mRNA与寡脱氧胸苷酸退火。非poly(A)RNA不结合并很容易从柱子洗去。用低盐缓冲液洗柱，己结合的mRNA很快洗脱出来。

·溶液杂交：本方案也用寡脱氧胸苷酸－纤维素，但不用层析柱，而是将基质直接加到总RNA溶液中。退火和洗涤步骤通过离心含有RNA沉淀的基质在溶液中完成。

·生物素标记寡脱氧胸苷酸和链霉亲和素包被磁性球珠：本方案中，一个生物素标记的寡脱氧胸苷酸酸引物在溶液中与总RNA退火，然后加入以链霉亲和素包被的磁性球珠，用磁分离器从大量溶液中分离球珠－mRNA复全体。移去磁分离器，加入洗脱缓冲液，并重复磁性分离步骤。在无盐的状态下，寡脱氧胸苷酸引物从mRNA上解离。

2.2 cDNA的合成与克隆

2.2.1 cDNA第一条链的合成

所有合成cDNA第一条链的方法都要用依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）来催化反应，有两个关键的因素，一个是mRNA模板，另一个反转录酶。

目前商业化的反转录酶主要有两种：一种是禽源反转录酶(reverse transcriptase)，另一种是鼠源反转录酶。两种酶都无3’－5’外切酶活性，但禽源反转录酶有很强的RNAase H酶活性，鼠源的具有相对较弱的RNAase H酶活性。RNAase H酶活性在反应中起负作用，可降解mRNA分子末端的poly(A)序列和cDNA-RNA杂交分子中的RNA。因此一般反转录过程都是采用鼠源反转录酶。GIBCO-BRL公司出品一种鼠源反转录酶，称为SUPERSCRIPT反转录酶，缺少C-末端180个氨基酸，完全去除了其RNAase H酶活性，保持完整的DNA聚合酶活性。

2.2.2 cDNA第二条链的合成

合成cDNA第二条链的传统方法是“自身引导法”，即将第一条链合成过种中形成的cDNA/RNA杂交分子变性，降解RNA，则单链cDNA分子的3’末端自身环化，形成发卡结构。以此为引物，在DNA聚合酶作用下合成第二条链。所得到的产物是双链cDNA，在其相当于mRNA5’端的地方有一发卡闭环结构。然后用单链特异性的SI核酸酶消化该环，得到可供克隆的双链cDNA分子。由于SI酶的消化反应难以控制，不可避免地导致对应于mRNA5’的序列出现缺失和重排，并造成克隆效率偏低，故该法基本上己被一些改进的方法所代替。主要的改进之处是在合成第一条链的反应体系中加入4mmol/L的焦磷酸钠，以抑制发卡结构的形成，这样便避免了使用SI核酸酶。然后再用其他方法合成第二条链的引物。例如置换合成法：在4mmol/L焦磷酸钠存在的条件下合成cDNA的第一条链。用RNAase H酶降解，使cDNA/RNA杂交分子中的RNA链上出现切口，产生一系列带3’-OH的RNA引物，它们可被大肠杆菌DNA聚合酶用以合成cDNA的第二条链。若在合成第二条链的反应体系中加入大肠杆菌DNA连接酶，可避免异常结构的产生，并得到相对完整的cDNA链。最后在T4DNA聚合酶的作用下，使双链cDNA成为平头末端，然后再与接头或连接子相连并用限制性内切酶切割使cDNA具有粘性末端而增加克隆效率。该方法有三个主要优点：（1）非常有效；（2）直接利用第一条链反应产物，无需进一步处理和纯化；（3）不必用SI酶切割单链发卡环，避免了cDNa的大量损失。

2.2.3 cDNA的克隆

dscDNA（双链cDNA）合成后，将此DNA与载体（质粒或噬菌体）组成重组分子，然后转化到受体菌中进行扩增。CDNA文库可用质粒载体或噬菌体载体构建。质粒文库具有易于操作的优点，但质粒文库适于筛选10000到50000个重组子。噬菌体文库更适合于筛选较大数量（>100000）的重组子。载体的选择还必须考虑一种mRNA在细胞内的含量，即mRNA的丰度。如果要筛选的目的cDNA的mRNA是低丰度mRNA，要用噬菌体载体构建文库；如果是高丰度mRNA，则可用质粒载体。

2.2.4 重组子的筛选与鉴定

基因克隆的最后一道式序是从转化细菌菌落中筛选含有阳性重组子的菌落并鉴定重组子的正确性，能过细菌培养以及重组子的扩增，从而获得所需基因片段的大量拷贝，进一步研究该基因的结构，功能或表达该基因的产物。

重组子转化宿主细胞后，载体上的一些筛选标志基因的表达失活，会导致细菌的某些表型改变，通过琼脂平板中添加一些相应筛选物质，可以直接筛选鉴别含重组子的菌落。例如将cDNA克隆到多数载体是通过插入到载体分子上的β－半乳糖苷酶基因（lacZ）内完成的。在简便的噬菌斑测试中，插入的DNA 破坏了lacZ基因的编码序列从而导致载体的表现型从蓝色（亲本）变成无色（重组子）。以这种方式可以很容易地确定出现在文库中的重组子。

３．构建cDNA文库的新方法

自上世纪70年代初首例首例cDNA克隆问世以来，已用构建和筛选cDNA文库的方法克隆了很多基因。最初的cDNA克隆技术主要适合于获得高丰度ｍＲＮＡ的拷贝，即通过使用相应的核酸或抗体探针来筛选富含该mRNA的组织cDNA文库来克隆目的cDNA，但对于那些低丰度mRNA的拷贝，通常需要筛选文库有大量克隆，才能获得相应的cDNA，有时即使筛选的克隆量很大也不能奏效。为了更有效地克隆

到未知的低丰度mRNA的cDNA，近年来已发展了一些cDNA文库构建的新方法和新技术，主要有：减数cDNA文库、标准化cDNA文库，这2种特殊的cDNA文库构建方法用不同的策略和方法富集特定的cDNA 给克隆新基因提供了有力的工具。

3．1减数cDNA文库

减数cDNA文库(subtracted cDNA library ) 常用于克隆两种组织或同一组织在不同生理或病理状态下表达有差异的基因。由于减数文库富集了仅在一种组织中或一种状态下表达的cDNA克隆，使筛选克隆的总数减少数十倍。最初构建cDNA文库是通过羟基磷灰石柱层析或生物素卵清蛋白体系去除两种组织或状态下共有的mRNA，,以此来富集表达有差异的cDNA，但普遍的问题是回收的cDNA量少，易丢失一些mRNA以及mRNA的降解使合成的cDNA过短。近年来，在方法学上进行了改进，常用的有：使用磁珠的减数技术、Oligo(dT) 3 0乳胶和PCR结合的方法、代表性差别筛选法和酶降解减数法现1．使用磁珠的减数技术(magnet assisted subtractive technique, MAST)

待去除的一种组织或状况下的mRNA称为“驱动mRNA（Driver mRNA）”，以此为模板，以oligo(dT)25－流动磁珠为引物合成驱动cDNA单链；另一种组织或状况下所含有需要保留的mRNA称为“目的mRNA （Tester mRNA）”，以此为模板合成目的cDNA双链，并用填充法使其形成平头末端。将目的cDNA双链加到过量驱动cDNA单链－流动磁珠中进行分子杂交，能与驱动cDNA分子杂交的目的cDNA通过磁珠吸引去除，构成减数cDNA文库。

2．Oligo(dT)30乳胶和PCR结合的方法

以Ａ组织的ｍＲＮＡ为模板，与乳胶颗粒共价结合的Oligo(dT)30为引物合成cDNA链，直接用过量的A细胞cDNA与B细胞的mRNA分子杂交，沉淀乳胶去除可与cDNA结合的mRNA，上清则为B细胞特异性mRNA，以此为模板，用RT-PCR合成B细胞特异性cDNA。

3．酶降解减数法（enzymatic degrading subtraction, EDS）

分别以驱动mRNA和目的mRNA为模板合成cDNA，将所合成的cDNA用一种限制性内切酶降解成小于1kb的片段，用末端转移酶加尾，PCR扩增小片段，将目的cDNA片段的扩增产物用少量Klenow酶部分降解，即利用其3’-5’外切酶活性降解片段的3’端，并利用其5’-3’聚合酶活性在相应的位置止补上硫代核苷酸。将修饰过的目的cDNA片段与过量的未修饰驱动cDNA片段做减数杂交，杂交后先用核酸外切酶III从3’端降解驱动cDNa，而目的cDNA因掺有硫代核苷酸而被保护；再用外切酶VII降解单链核酸。未降解的双链目的cDNA再经PCR扩增，即得到富集的差示表达cDNA。

3.2标准化cDNA文库

构建标准化cDNA文库即构建一个在某一特定组织或细胞中表达的各个基因均含有等量cDNA的文库，故又称为等量化cDNA（equalized cDNA library）。该文库主要有3个优点：（1）增加克隆极低丰度mRNA的可能，尤其是那些经过减数杂交和选择杂交仍难以克隆的转录本。（2）等量化的cDNA可作探针来发现基因组序列中的转录区，尤其是普通cDNA探针难以发现的稀有转录区。（3）与原始丰度的mRNA 拷贝数相对应的cDNA探针与标准化cDNA文库做杂交，可估计出大多数基因的表达水平及发现一些组织特异性基因。

标准化文库的构建方法通常是根据cDNA退火的二级动力学特征，即稀有拷贝的cDNA比丰富拷贝的cDNA复性或杂交更慢的特性建立起来的。