酵母转化--to 杜

-80℃保存的菌液要先划线活化，挑取单菌在YPD液体培养基培养。

主要试剂配制：

10×YNB：134g溶解于1L去离子水，过滤灭菌4°保存。

500×B（20%Biotin）：20g Biotin溶解于100ml去离子水中，过滤灭菌后4°保存。

10×D（20%dextrose）：200gD型葡萄糖溶解于1L去离子水，121℃、15min高温灭菌，4℃保存。

10×M（10%Methanol）:10ml纯甲醇与去离子水混合，定容至100ml，过滤灭菌后4℃保存。

10×GY（10%Glycerol）:100ml纯甘油与去离子水混合，定容至1L，121℃、15min高温灭菌，室温保存。1M potassium phosphate buffer,pH6.0:132ml1M K2HPO4与868ml1M KH2PO4混匀，以磷酸和KOH调节pH至6.0，121℃、15min高温灭菌，室温保存。

YPD培养基：10g酵母提取物，20g蛋白胨，定容至900ml，121℃、15min高温灭菌，冷却至60℃在超净台上加入100ml10×D，轻微摇匀，常温保存（固体另加琼脂粉15g/L）。

MD培养基：80ml离子水加1.5g琼脂粉，121℃、15min高温灭菌，冷却至60℃在超净台上加入10ml10×D、10ml10×YNB和200微升500×B，迅速摇匀后倒平板，4℃保存。

BMGY培养基：10g酵母提取物，20g蛋白胨溶解于水，定容至700ml,121℃、15min高温灭菌，冷却至60℃在超净台上加入100ml10×YNB、100ml的1M potassium phosphate buffer，100ml10×GY和2ml500×B，轻微摇匀，4℃保存。

BMMY培养基：10g酵母提取物，20g蛋白胨溶解于水，定容至700ml,121℃、15min高温灭菌，冷却至60℃在超净台上加入100ml10×YNB、100ml的1M potassium phosphate buffer，100ml10×M和2ml500×B，轻微摇匀，4℃保存。

100mg/mlG418：用无菌水配，过滤除菌，-20℃保存。

一、载体构建：

pPIC9k用于分泌表达，具有氨苄青霉素抗性（50微克/ml），利用启动子AOX1来诱导高水平表达:

1.载体构建方法同pBI121方法，设计引物时加上的尾巴不是pBI121的换为pPIC9k的。

2.步骤1也可以采用SnaBI和NotI双酶切方法，回收载体大片段和目的基因小片段，然后用T4连接酶连接。

3.gene-pPIC9k质粒提取后，用Sal I酶切,37℃过夜，体系如下：

质粒：70微升（约25微克），内切酶：2微升（20U），10×buffer：8微升。

4.酶切产物用5’突出去磷酸化酶处理，方法按说明书即可。

5.去磷酸化产物纯化，200微升去磷酸化产物中加入2倍体积的无水乙醇，-80℃沉淀2h，13000rpm离心10min，弃上清，用75%酒精洗2次，在通风橱吹干，加入10微升去离子水溶解后-20℃保存。

二、酵母GS115感受态制备方法：

1.在YPD平板上划线培养酵母菌，30℃培养2d

2.从平板上挑取单克隆于10mlYPD中，30℃震荡过夜。

3.早上，在100mlYPD培养基中接种1ml过夜培养物，在30℃生长至OD=1.3~1.5。

4.4℃6000rpm离心5min收集细胞，用50ml buffer A洗一次。

5.用4ml buffer A重悬细胞，分成0.2ml等份分装至1.5ml离心管，立即使用，也可加入11微升DMSO于

各管中，混合，液氮速冻保存。

三、PEG1000转化方法：

溶液准备：

Buffer A:1M山梨醇，10mM bicine（N-二（羟乙基）甘氨酸）pH8.35,3%(v/v)乙二醇。

Buffer B：40%（w/v)聚乙二醇1000，0.2M N-二（羟乙基）甘氨酸pH8.35

Buffer C：0.15M NaCl，10mM N-二（羟乙基）甘氨酸pH8.35

过滤除菌，存于-20℃。

转化步骤如下：

1.将50微克线性化DNA+20微升水+40微克鲑鱼精DNA，直接加入酵母感受态中。

2.在37℃水浴中孵育5min，期间混匀1-2次

3.取出各管，加入1.5mlbufferB，混匀

4.在30℃水浴1h

5.室温，2000g离心10min，去除上清，用1.5ml Buffer C重悬细胞

6.再次离心，用0.2ml Buffer C重悬细胞

7.涂板到筛选培养基MD培养基，30℃培养3-4天。

也可以采用LiCl方法：

溶液：

1MLiCl：无菌水配制，过滤除菌。

50%PEG(3350):过滤除菌。

2mg/ml单体DNA:煮沸鲑鱼精DNA5min，快速放到冰水中使变冷（无需每次都煮，用3-4次后再煮，最好小管分装每次用完）。

感受态制备：

1.在50mlYPD培养基中培养酵母至OD600=1.0(约108个/ml)。

2.收集细胞，用25ml灭菌水洗涤2次。

3.1ml100mM的LiCl重悬细胞。

4.将重悬液转至1.5ml离心管中，13000rpm离心30s，吸去LiCl，用400微升的100mM LiCl重悬细胞。

5.50微升每管分装，现做现用，不要放到冰上或冰箱。所以要同时准备好转化要用的东西。

转化步骤如下：

1.上面5的感受态离心去掉上清LiCl。

2.按下面顺序加入试剂，240微升50%PEG，36微升1M LiCl，25微升2mg/ml单链DNA，溶解于50

微升灭菌水的质粒DNA（5-10微克）。

3.剧烈漩涡至完全混匀。

4.42℃热激20-25min。

5.6000-8000rpm离心1-2min，用1ml灭菌水重悬细胞。

6.在MD平板上涂板培养。

四、筛选：超净台操作

1．挑取单克隆到YPD培养基中培养，具体为：96孔细胞培养板每孔加YPD200微升，挑96个单菌培养48h。

2．在另一96孔培养板上每孔加入190微升YPD，对应着从8中每孔吸取10微升继续培养24h。

3．筛选遗传霉素高抗克隆（G418：Geneticin遗传霉素），96个单菌各吸取1微升菌液点样到2M G418的YPD板上，培养48h。

4．挑取96个孔中长势最强的，接种到含10ml BMGY的250ml摇瓶中，28-30℃，250-300rpm培养至OD600=2 ~6(16-18h)。

5．室温6000g离心5min收集细胞，15mlBMMY培养基重悬至100ml摇瓶中，继续培养。

6．每24小时加甲醇150微升即浓度为0.5%，每天取1-2ml培养物，离心后取上清共检测7天作用，确定最佳诱导时间。保证无菌操作，防止污染。

7.上清保存，检测蛋白，浓度低时要进行浓缩，纯化，保存备用。

五、产物检测，常规SDS-PAGE检测手段：

分离胶（10%）浓缩胶

Acr+Bis（30.8%） 3.4ml0.7ml

Buffer 2.5ml pH=8.9 1.25ml pH=6.8

ddH2O 3.9ml 3.1ml

TEMED6微升4微升

10%AP100微升50微升

10%SDS100微升50微升

1.20微升与20微升上样缓冲液混匀，100℃沸水浴5min。

2.8000rpm离心5min后取上清上样，电泳。

3.考马斯亮蓝R250染色30min。

4.脱色液脱色至带型清晰，扫描分析目标蛋白。

六、花粉萌发实验

以香水柠檬和白花柠檬的花粉为材料，把酵母表达的蛋白S1,S2,F-box分别稀释成不同浓度梯度，如：0.4、0.8、1.6、3.2、6.4微克/微升，添加在固体培养基上，播种花粉观察在含有不同蛋白上的花粉萌发率，生长状态，并确定最佳实验浓度。

以确定的最佳浓度进行后续实验，培养后不同时间花粉管的显微结构，超微结构观察，主要通过荧光显微镜和透射电镜观察，拍照后进行分析。

毕赤酵母化学转化

（化学转化） 如果没有电转仪，LiCl转化是一种可供选择的方法，转化率是102到103cfu/ug。 主要过程为： 取过夜活化培养的菌液按1：1000接种于15ml新鲜的YPD液体培养基，30℃培养至OD600达到0.8-1.0；4℃，4500rpm离心5分钟，用8ml冰预冷的无菌水洗涤菌体，倾除洗涤液，用1mL ，4℃，4500rpm离心5分钟，沉淀用50μl冰预冷的100mmol/L LiCl悬浮，最后定容至80-90ml。 LiCl转化取适量单链鲑精DNA（2mg/mL）煮沸5min，立即置于冰上备用，取上述制备好的感受态细胞12 000rpm，离心15s，吸弃LiCl溶液，按顺序依次加入 50%PEG 240ml 1mmol/L LiCl 36 ml 单链鲑精DNA 25ml 线性化质粒DNA 10 ml (约10mg) 用吸头反复吹打，使细胞沉淀与加入的溶液混匀，30℃静置温育30min，42℃热击20-25min，4500rpm离心10min，吸弃转化液，细胞沉淀加1ml YPD培养基于30℃200 rpm培养2-4hr，取转化混合液100ml涂布含100μg/mL ZeocinTM 的YPDS平板，30℃培养2-3天。 LiCl 转化方法 作为电转化的替代方法，在线性化DNA条件下，转化效率介于102~103cfu/ug 之间 溶液： 1M LiCl 用无离子水溶解，过滤除菌。（稀释使用无菌水。） 50% PEG 3350 无离子水溶解，过滤除菌，密封保存 2mg/ml变性的鲑精DNA片段（10mM Tris-HCl，pH 8.0,10mM EDTA）-20℃保存。 准备感受态细胞： 1.在50ml YPD中，培养至OD600 在0.8~1.0之间（大约108个/ml）。 2.收集细胞，用25ml无菌水洗涤，1500g室温离心10min。 3.重悬细胞于1ml 体积的100mMLiCl中，将悬液转移至1.5ml离心管中。 4.使用最大转速离心15s，吸去LiCl上清。 5.重悬细胞于400ul体积的100mMLiCl中。 6.每个转化组取50ul细胞悬液置于1.5ml离心管中，立即使用。勿要存于冰上或冻存于 -20℃。 转化： 1.取1ml单链DNA鲑鱼精标准煮沸5min，后快速于冰上降温并存于冰上。注意：不需要 也不推荐在每次使用前煮沸载体DNA。分装冻存于-20℃，并且每使用3-4次后再次煮沸更加适宜。 2.离心上面步骤6的细胞，吸去残留的LiCl。 3.每次转化都要向细胞中顺次加入下列试剂。PEG可以保护细胞不会因高浓度的LiCl而受 到损伤。 I.240 ul50% PEG 3350 II.36 ul 1M LiCl III.25 ul 2mg/ml 单链鲑鱼精DNA IV.质粒DNA（5~10ul）溶于50ul无菌水中。

!!酵母双杂交操作步骤(中文翻译)

各种SD培养基： 1)SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（？ “四缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的） ; 葡萄糖20g (即2%) 2)SD/-leu/-trp/-his (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g. (即2%) 3)SD/-leu/-trp (1000 ml) （？“二缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）; 葡萄糖 20g (即2%) 4)SD/-leu (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g (即2%) 5)SD/-trp (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g (即2%) 注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。我们这用的是含硫酸铵的。（买来就加进去了的）。如果不含硫酸铵，那么要在终浓度0.17%的YNB中再加入0.5%的硫酸铵，即最终在1000 ml溶液中加入总量为6.7g的YNB与硫酸铵。 实际配制的方法是： 1.配制40%的葡萄糖贮存液（贮存在4℃），过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55℃ 以下时，再将50ml葡萄糖贮存液加入。（李博士经验这一步不高压，过滤即可使用）2.酵母氮源6.7g，加DO supplement 在920ml水中溶解，调PH至5.8（李博士的经验大 约加10M NaOH 200ul即可），之后补水至950 ml。 3.高压完后待温度降至55℃以下，加入50 ml40%葡萄糖。

酵母转化问题参考

5 Ways to Destroy Your Yeast Transformation by Emily Crow on 27th of July, 2011 in Cell / Tissue Culture Transforming yeast with DNA is a very similar process to transforming E. coli, but with just enough differences to trip you up if you let your attention slip. Whether you’re doing a yeast two-hybrid screen, or using yeast as a model system, here are a some mistakes to to avoid… 1. Forgetting to add single stranded DNA While E. coli readily takes up double-stranded DNA, yeast requires the addition of single-stranded “carrier DNA” to enhance uptake of your plasmid or fragment. If you only add your plasmid to the transformation mix, chances are you’ll be confronted with a pristinely sterile plate after three days of incubation. 2. Using old PEG PEG (polyethylene glycol) is a crucial ingredient in the yeast transformation buffer. Unfortunately, it’s annoying to make and goes bad quickly. The percentage of PEG will make or break the success of your transformation; an old PEG solution has had a chance to evaporate, so that the water to PEG ratio is off. If you can stand it, make new PEG for every transformation. Otherwise, make it in small batches, and seal tightly with parafilm between uses to minimize evaporation. 3. Using cells in stationary phase Cells in log phase, or exponential growth, take up DNA with much better efficiency. This is not to say that cells from a stationary culture can’t be transformed –only that your successful transformation rate will be much lower. Your best bet is to use cells that are growing rapidly at the time of transformation. 4. Using the wrong selective marker A stupid mistake, but one that I’ve made more times than I’d like to admit. Double check to save yourself some tears! 5. Cutting corners when heat-shocking This is a major difference between E. coli and yeast transformations: while E. coli is relatively delicate, and requires a heat-shock of less than a minute to take up DNA, the cell wall makes yeast more hardy and resistant to shock. Thus, for efficient transformation, yeast are generally heat-shocked for up to 45 minutes. I’ve gotten away with as little as 15 minutes, but any shorter and the transformation efficiency is drastically reduced. If you’re not in a hurry, let it go the whole 45 minut es, or you’ll get to experience the joy of doing it all over again.

酵母双杂交操作步骤(中文翻译)

（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中） 概念： 1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。 2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。优点：比次序转化更容易操作。 pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）？ pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林) ？ 各种SD培养基： 1) SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（？“四缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的）; 葡萄糖 20g (即2%) 2) SD/-leu/-trp/-his (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g. (即2%) 3) SD/-leu/-trp (1000 ml) （？“二缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）; 葡萄糖 20g (即2%) 4) SD/-leu (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）

酵母转化

酵母转化（By HMM） 1.取50mL YPD液体培养基于100mL已灭菌的三角锥形瓶中，从中吸取1mL培养基于已灭菌的管，挑单克隆接种于1mL YPD培养基中，吹吸混匀（可再vortex继续混匀）后转移至50mL 的YPD液体培养基中，过夜培养约11h45min； PS: 晚上21:15开始准备，21:30接种完毕开始摇菌。（30℃ 250rpm）。 2.第二天早上9:15开始准备，取出1mL菌液用于测OD600，用1mL YPD培养基作为Blank. 9:30测完。 PS: a.要求OD600在至之间。 b.测完OD后打冰盒，将ssDNA置于冰上融化。 3.将菌液分装在2支50mL离心管（蓝色，无菌）中（锥形瓶留用），2500Xg常温离心5min.弃上清于之前的锥形瓶中，各用1mL灭菌ddH2O重悬转移至管中，共水洗两次，再各用1mL 灭菌ddH2O重悬后转移至同一个5mL无菌EP管中，吹吸混匀置于冰上。 PS：a.离心期间将灭菌水置于65℃烘箱中预热，将所需平板置于30℃培养箱中预热。 b.为避免菌液浓度差异，故将重悬后的菌液混匀，因重悬后体积大于2mL，因此转移至5mLEP管中，也可在2mL EP管中混匀后分装出一部分在一个管中。 4.待ssDNA溶化后根据所需量在无菌管中分装几管，各100uL（有助于煮沸后迅速冷却）。 PS: a. ssDNA要尽量多出一些，煮沸和转移过程中均有损失。 b.看ssDNA快融化时即可打开水浴锅，中频煮沸（800即可），煮沸ssDNA时用最低频120. 5.将ssDNA沸水浴5min, 然后迅速冰浴5min; PS：a.重复沸水浴5min与冰浴5min可提高转化效率。 b.冰浴ssDNA时将50％PEG与1M LiOAc也置于冰上。 6.在超净台中配制mix，vortex混匀。

酵母感受态的制备(化学法)

1、毕氏酵母氯化锂转化法 （1）试剂 1M LiCl（用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌；必要时用消毒去离子水稀释） 50% PEG3350（Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装） 2mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存 注：醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效；PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用； （2）感受态毕氏酵母的制备 接种Pachia pastoris到50ml YPD培养基中，30℃摇菌过夜（约24～28h）培养到OD值为0.8～1.0（约108 Cells/ml）； 收获细胞，用25ml无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10min； 重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液中，将悬液转入1.5ml离心管； 离心机最大速度离心15秒沉淀菌体，重悬菌体于400ul 100mM LiCl溶液中； 按50ul/管分装，立即进行转化； 注：不要将感受态酵母菌冰浴； （3）毕氏酵母的转化 煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA； 将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液； 对于每一个转化，按以下顺序加入： 50% PEG3350 240ul

1M LiCl 36ul 2mg/ml 单链Salmon sperm DNA 25ul 5～10ug/50ul H2O 质粒DNA 50ul 剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）； 30℃水浴孵育30min； 42℃水浴热休克20～25min; 6000～8000rpm离心收集酵母菌体； 重悬酵母于1ml YPD培养基，30℃摇床孵育； 1～4h后，取25～100ul菌液铺选择性培养基平板，于30℃培养2～3天鉴定； 2、毕氏酵母PEG1000转化法 （1）试剂 缓冲液A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35（sigma）,3%（v/v）ethylene gl ycol 缓冲液B：40%（w/v）PEG1000（sigma），0.2M Bicine，pH8.35 缓冲液C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35 未污染的新鲜、试剂级DMSO，-70℃保存 注： 缓冲液A、B、C均用滤膜过滤，-20℃保存; 将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处（即使在冰上解冻的待转化细胞，其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降；如进行多样品的转化，建议按6样品/组进行）; （2）待转化毕氏酵母的制备

酵母重新转化及对照制备

酵母重新转化及对照制备(20181213) 背景： 前面酵母转化非常不顺，对照制备失败。这次置换Y2HGold菌株（from陆勇军老师实验室），重新转化相关质粒以及制备酵母筛库的对照。 实验设计： 实验流程： 1.复苏及培养酵母 1)提前三天划板(YPDA无筛选板)复苏酵母细胞Y2HGold、Y187，至30℃恒温培养箱生长3 天 2)将复苏的菌落挑单克隆至3ml YPDA液体培养基(15ml摇菌管) ，至30℃恒温摇床200rpm 摇8h 3)将5ul/10l培养物分别转入2个50mlYPDA液体培养基（250ml锥形瓶） 至30℃恒温摇床200rpm摇16-20h，至OD600=0.15-0.3 4)将培养物转至50ml离心管，室温离心700g 5min 5)弃上清，将沉淀的酵母细胞重悬，转至100mlYPDA液体培养基（250/500锥形瓶） 至30℃恒温摇床200rpm摇3-5h，至OD600=0.4 -0.5 2.制备酵母感受态 6)将上述培养物转至2个50ml离心管，室温离心700g 5min 7)弃上清，悬浮于30ml去离子水中（50ml离心管），室温离心700g 5min 8)弃上清，悬浮于3ml 1.1XTE/LIAC中，分装于两个1.5mlEP管中，每管高速离心15s 9)吸弃上清，把沉淀悬浮于600ul 1.1XTE/LIAC中 3.转化 10)在1.5mlEP管中加入相应质粒1000ng 10)加入5ul Carrier DNA（提前变性处理：95~100℃ 5min，冰上冷却） 11)加入50ul 酵母感受态细胞，温和混匀 12)加入500ul PEG/LIAC，温和混匀 13)放入30℃水浴锅30min 每15min摇一次 14)加入20ul DMSO，温和混匀 15)放入42℃水浴锅30min 每10min摇一次

酵母菌感受态制作及转化

Y187 酵母感受态制作及转化 1）挑新鲜单菌落Y187 于8 ml YPDA 培养液，30℃，250 rpm 培养16-18h；2）至OD600＞1.5，1：10 转接，此时OD600≈0.3； 3）30℃，250 rpm，4-7 h，每2 h 检测一次，直到OD600=0.4-0.6； 4）转入2 个50 ml 离心管，5100 rpm,5 min,弃上清； 5）加入1/2 V ddH2O,洗涤细胞，5100 rpm,5min,弃上清； 6）每管中分别加1 ml 1×TE/LiAc，冰上混匀，10000 rpm，15 s，去上清； 7）每管中分别加0.5 ml 1×TE/LiAc，冰上混匀，10000 rpm，15 s，去上清；8）每管中分别加0.5 ml 1×TE/LiAc，冰上混匀，10000 rpm，15 s，去上清；9）每管中分别加0.4 ml 1×TE/LiAc，每管100 ul 分装； 10）分别加入100 ng 左右DNA（plasmid）和0.1 mg 鲑鱼DNA（10 mg/ml,10 ul）,移液器抽吸混匀溶液； 11）分别加入600 ul LiAc/PEG，高速混匀（10 s-1 min 内）； 12）30℃摇床恢复30 min； 13）超净台（无菌条件下）加入70 ul DMSO,轻轻颠倒混匀； 14）42℃热激15 min； 15）冰上放置1-2 min； 16）14 000 rpm,15 s,去上清； 17）300 ul TE 重悬细胞； 18）100 ul/1 ul 分别涂布于YPDA 平板； 100 ul/1 ul 分别涂布于SD/-Trp 单缺陷平板； 100 ul/1 ul 分别涂布于SD/ -Trp/ -His 双缺陷平板上，30℃倒置培养48-72 h 可见转化菌落。

酵母转化

酵母转化方法步骤 1.YPD固体培养基 Yeast Extract：10 g；Peptone：20 g；葡萄糖：20 g；Agar：20 g 2.1M LiAc LiAc：10.2 g；加水到100 ml 高压蒸汽灭菌，4℃保存。100 mM的LiAc只需将1M LiAc稀释10倍即可。 3.50% PEG3350（50% W/V） 4.鲑鱼精DNA（2 mg/ml） i.鲑鱼精DNA：2 mg；加TE缓冲液至10 ml ii.振荡溶解后用注射器剧烈抽吸30-40次，沸水浴20分钟后马上置于冰上降温，分装100 μl到1.5ml离心管中-80℃保存。 5.SD-Trp培养基（1L, pH 6.8） 无氨基氮源（含硫胺酸）：6.7g；葡萄糖：20g；-Trp DO supplement：0.74g。调节pH，121℃高压灭菌20分钟。 酵母热激转化 1.将酵母XK1-35在YPD固体培养基划线活化，3-4天菌落长到直径大约2-3 mm 待用（菌落平板可放在4℃冰箱保存2至3周）。 2.将单菌落挑到含有50 ml YPD的100 ml三角瓶中，30℃, 220 rpm摇12 h。 3.用分光光度计测量OD值到1.0（即5×107个/ml）,吸取5ml培养液加入到含有 45 ml YPD的100 ml三角瓶中，终浓度约为5×106个/ml。 4.置于30℃摇床中，200rpm摇至OD值为0.4-0.6（即2-3×107个/ml），约用时3小 时（2.5小时测一次OD值防止浓度摇过）。 5.将OD值为0.4-0.6的培养物转移到预冷的50ml的离心管中，置于冰上冷却15 分钟，3000g离心5分钟。后面用到的试剂和仪器都要预冷，所有操作都要在冰上或者4℃。 6.倒掉上清液，加入30 ml预冷的无菌水并将酵母悬浮，同上步离心。

酵母转化PEG LiAC法

酵母转化 (一)原理： 我们采用的是PEG/LiAc法转化酵母。 PEG是一种高分子聚合物,只有分子量达到3000左右的PEG才会发挥最大的转化促进作用。本文使用的PEG分子量为3350,实验结果表明促转化效果可以达 到103～105cfu/μg。PEG在酵母转化中起到在高浓度醋酸锂环境中保护细胞膜, 减少醋酸锂对细胞膜结构的过渡损伤,同时促进质粒与细胞膜接触更紧密。PEG的 浓度是务必适宜,这一点很重要。 LiAc可使酵母细胞产生一种短暂的感受性状态,此时它们能够摄取外源性DNA。 鲑鱼精担体DNA为短的线形单链DNA,在转化实验中主要是保护质粒免于被DNA酶降解;另外还可能在酵母细胞摄取外源性环形质粒DNA中发挥协助作用。 在每次使用前务必进行热变性,使可能结合的双链DNA打开,保证鲑鱼精担体DNA 在转化实验体系中以单链形式存在 (二)材料、仪器设备及试剂： 1.SD培养基： z YNB： 1.6g/L z硫酸铵：5g/L z氨基酸：根据质粒的筛选压力选择性添加 z调节pH=5.8，121°灭菌15min 2.YPDA培养基 z胰蛋白胨20g/L z酵母浸膏10g/L z琼脂20g/L(固体) z腺嘌呤15ml0.2%腺嘌呤/L z调节pH=7.5，121°灭菌15min 3.0.9%NaCl（w/v） z NaCl:0.9g z milipore水定容到100ml z灭菌121°，20min 4.100%DMSO 从试剂瓶中分装到ep管中，500ul每管，室温保存 5.10×TE（pH=7.5）：（0.1M Tris-HCl，10mM EDTA） z Tris-HCl 1.211g/100ml z EDTA0.37g/100ml z调节pH=7.5,121°，20min 6.10×LiAc（pH= 7.5）

酵母电转化参数

Protocol 0342 ElectroSquarePorator PROTOCOL T820 ELECTROPORATION Cells: E. coli XL1-Blue or DH5a Plasmid: pBluescriptKS (Stratagene) Cell Preparation: Growth medium: Grow cells in SOC to OD600=0.6 Washing procedure: Wash the cells with 200ml SOC in a 2L flask. Spin the cells @ 3000 rpm for 5-10 min. each time. Resuspend in 10 ml of ice cold ddH2O (must use ice cold ddH2O, or 1 mM HEPES @ pH 7.0. The efficiencies are comparable.). Aliquot into 50-200 μl samples. Note: It’s very important to prepare competent cells carefully to not lose their competency. Both aeration and temperature control are critical. The higher quality water you use for preparing the SOC and for rinsing, the better the efficiency will be. Try to use ddH2O for everything if possible. The author suggests that the cells be thawed out immediately prior to electroporation. He also recommends that the DNA be diluted in H2O just before use. He uses 0.1ng of DNA in 0.1 μl of H2O to keep the DNA concentration @ 1 μg/ml. This is a critical point. (If SOC is not available, it can be substituted with LB plus Mg++.) Electroporation Settings: Mode: LV Choose V 500 Set Voltage: Set Pulse Length: 8 msec Set Number of Pulses: 1 pulse Chamber: BTX Disposable Cuvette 1 mm gap, P/N 610 Desired Field Strength: 5 kV/cm Electroporation Procedure: Sample Volume: 50 μl ng 1 DNA Amount: Temperature: Prechill the cuvette on ice for 1 min. Pulse: Press the Start button to activate the Automatic Charge & Pulse sequence Plate: After electroporation, immediately (< 5 sec) add 1 ml of warm SOC (37o C) to the cuvette. Transfer the sample into tubes and incubate for 45 min. @ 37o C on a shaker. Results: 2.5 x 109 cfu/μg DNA Reference: Personal communication, Dr. Masaya Yamamoto and Ha Do, University of Texas SW Medical Center, Dallas, TX ?2000, BTX Division of Genetronics, PR0342

毕赤酵母LiCl 转化方法

实验概要 本文介绍了毕赤酵母LiCl 转化方法。该程序是电转化的替代方法。转化效率为102-103cfu/ug线性化DNA。 实验原理 主要试剂 溶液准备：不能用醋酸锂，一定要用氯化锂 1. 用无菌去离子蒸馏水配制1M LiCl，过滤除菌，用无菌水稀释 2. 用无菌去离子蒸馏水配制50%PEG(3350)，过滤除菌，存于盖紧的瓶中 3. 用TE(10mM Tris-HCl pH8.0，1.0mM EDTA)溶解2mg/ml 变性断裂鲑鱼精DNA，存于-20度 主要设备 实验材料 实验步骤 1. 细胞准备： 1) 在50mlYPD 中培养毕赤酵母至OD600＝0.8-1.0(约108个/ml)。 2) 收集细胞，用25ml灭菌水洗涤，室温1500g离心10min。 3) 去除水，用1ml 100mM LiCl 重悬细胞。 4) 将细胞悬液转至1.5ml 离心管中。 5) 最大转速沉淀细胞15s，用吸头吸去LiCl。 6) 在400ul 100mM LiCl中悬浮细胞。 7) 将50ul细胞悬浮液移到1.5ml离心管中，每次用一管，现做现用，不要置于冰上或-20度保存。 2. 转化： 1) 煮沸单链DNA 5min，快速放于冰水中使变冷，后置于冰上。 注意：载体DNA不需要在每次用之前都煮，在-20 度保存等份少量样品，每次解冻一管，用3-4 次后再煮。 2) 取上面第7步中细胞，离心去除LiCl。 3) 每个转化样品，按顺序加入下列试剂，PEG 可保护细胞免受高浓度LiCl的有害作用240ul 50%PEG，36ul 1M LiCl，25ul 2mg/ml 单链DNA，溶解于50ul灭菌水中的质粒DNA(5-10ug)。 4) 剧烈涡旋细胞沉淀至完全混匀(1min)。 5) 在30 度孵育30min(不要摇动)。 6) 在42 度水浴热击20-25min。 7) 6000-8000rpm离心，将转化溶液转移走。 8) 用1ml 灭菌水重悬细胞沉淀。

酵母转化常用培养基及程序

酵母实验操作方案 一．质粒酶切及线性化 1）用维特洁日常型小量DNA纯化试剂盒抽提9KSF2，可得到较纯的质粒10μg/3ml菌液，终体积80ul。 2）线性化质粒 使用80μl酶切体系 9KSF2质粒70μl 内切酶（SacI，SalI，BglⅡ）2μl 10 x buffer 8μl 3）酶切3－16小时，一般3小时即可； 二．乙醇回收酶切质粒 1）2倍体积无水乙醇和0.1倍体积的3M NaAC（PH 5.2），混匀，沉淀DNA； 2）－200C数个小时（>2小时），13,200rpm离心10～20分钟，吸弃上清； 3）300ul 70％乙醇洗一次，13,200rpm离心10分钟，吸弃上清（注意离心管位置，从含有DNA的离心管另一侧吸取）； 4）37℃烘干水分和残留乙醇； 5）用20μl ddH2O重溶； 6）1ul样品电泳检测DNA量，计算DNA总量； 三．电转化 1．准备感受态细胞 1）5ml YPD 接种GS115单菌落，250rpm，300C，摇菌24 hours； 2）100ml YPD，接种百分之一，同时留1ml空白YPD，300C ，250rpm，7～8hours，直到OD600＝1.3～1.5； 3）菌液转入500ml离心管，JA14，1500g，40C离心5 min，弃上清； 4）100ml冰水重悬，同上离心，弃上清； 5）80～90ml冰水重悬【50ml】，同上离心，弃上清； 6）20ml冰1M sorbitol 重悬【5ml】，然后转移到50ml 离心管中，同上离心，弃上清； 7）约150μl 1M sorbitol重悬【250ul】，40C备用，剩下的感受态细胞可以保存在－700C冰箱大约3周。 2．转化 1)100μl GS115感受态细胞加入＋20μl 线性化质粒，用枪打匀； 2)冰浴5min，加入0.2cm转化杯中，轻轻将液体震到杯底，立即冰浴； 3) 电转化，参数设定：电压1500V 电容25μF电阻200欧姆，放电时间4～5ms 4)立即加650μl 冰1M sorbitol 入转化杯，打匀； 5) 迅速涂板，250μl/块MD板，共3块； 6) 涂好的板放在300C培养箱中培养4～5天，至菌落直径1mm即可。 注： a）【】内为手册推荐量，相关文献报道，转化效率一般为103～104 / ugDNA，所需质粒量0.3－10ug不等； b）放电是可好出现电击穿现象，原因有：酵母浓度不够；DNA溶液离子浓度过大；混合液体积不够； c）MD板加入1M sorbitol ，转化时第2）步冰浴时间延长至1－2小时，均有利于提高转化效率 四．G418筛选多拷贝基因 1）取出长有克隆的3块板，可考虑先挑10－20个菌落先表达； 2）第一块加入2ml 灭菌的ddH2o，用涂布棒打匀，洗后，菌液吸入第二块； 3）第二块加入1ml，洗之，吸入第三块； 4）菌液吸入EP管，可适量补充ddH2o；

管理学院本科交换生成绩认定、转换程序及转换对照表

管理学院本科交换生 成绩认定、转换程序及转换对照表一、成绩认定及转换程序

二、课程属性、学分和成绩认定有关规定 （一）课程属性认定： 1、所修对方学校课程与我院专业必修课相同或相近的，可以申请转为教学计划中对应的专业必修课程。 2、所修对方学校课程与我院专业性质接近的，可以申请转为专业选修课程。 3、所修对方学校课程与我院已修读课程相同的，原则上不能申请转换学分。 4、其它课程可向学校申请转为公共选修课程，学校文件规定“对公共选修课程的认定需严格审核控制，一般每位交换生认定的公共选修课学分数不得超过4。其余多修课程只予备案或作放弃处理。” （二）学分认定 1、一般参照我校学时与学分的对应关系，即一般课程18学时计1个学分，实验课36学时计1个学分。 2、若对方学校采用小时登记的，按授课时间12小时计1学分来折算。 3、专业必修课按我校学分认定；专业选修课最高只能认定3学分；公共选修课最高只能认定2学分。 （三）成绩认定 1、对方学校采用百分制的，按对方学校给出的成绩认定。 2、对方学校按A（优）、B（良）、C（中）、D（及格）记录成绩的，对应百分制92、82、72、62，如有+或-档的，可上下浮动3分。 3、对方学校采用“优（秀）、良（好）、中（等）、及格、不及格”的，则分别认定为“92、82、72、62、55”。 4、对方学校采用“合格、不合格”的，则分别认定为“70、55”。 5、各合作学校的成绩转换标准可参考附表，在具体实施过程中，学院将根据学校建议及学生历年交换生修读成绩情况，对其中的执行标准进行微调。 三、其它注意事项： 1、交换生在交换期间，应随时查看学院网站上的通知，并保持与班委的联系；若EMAIL发生变化，必须及时通知学院各部门老师及班委。 2、已获选派到国外或国内的交换生，需认真阅读《中山大学本科生交流生学籍管理办法》。 3、交换生在交流学习期间至少要修读与本专业教学计划相对等的学分，学校鼓励学生选读尽可能多的课程。

实验总结的几种高效酿酒酵母转化方法

电转法 设计方案一： 感受态制备： 1.挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养过夜； 2.取1mL一级种子分别接种于两瓶50mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm 培养约16-18h(OD:1.3-1.5)； 3.于4℃离心收集菌体，用25mL冰无菌水洗涤一次后，细胞用10ml冰无菌水 重悬，可换成较小的离心管； 4.加入1ml，pH7.5，10×TE缓冲液，摇晃均匀，再加入1ml 10×LiAc，旋转摇 匀，于30度轻轻摇动45min； 5.再加入0.4ml 1 mol/L DTT，并同时旋转摇动，于30度轻轻摇动15min； 6.于4℃离心，弃上清（用枪吸），再用25mL冰无菌水洗涤； 7. 2.5ml冰冷的1mol/L山梨醇洗涤，离心收集菌体，弃上清（用枪吸）； 8.每管用100ul山梨醇溶解，分装于EP管中（80ul/管），于-70℃冰箱保存。 电转化： 1．向感受态细胞中加入约5～10ug（体积小于10 ul）的DNA，用枪吹吸均匀，转移至预冷的电转杯中，静置5min； 2．擦干电转杯，电击，电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆； 3．立即加入1ml 预冷的山梨醇，转移至EP管中，于30℃静置1h； 4．离心，弃上清，加入1mL YEPD后，于30℃、200rpm培养2h； 5．离心得菌体后，吸除550 ul上清液，然后按150 ul/板进行涂板。 说明：该方法可直接采用50或100mL体系的一步法，即直接挑单菌落于YEPD中培养至预定菌浓，也可采用试管摇菌收集菌体制备感受态。 设计方案二： 感受态制备： 1.挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养过夜； 2.取1mL一级种子分别接种于两瓶50mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm 培养约16-18h(OD:1.3-1.5)； 3.于4℃，5000rpm，5min离心收集菌体，用25mL冰无菌水洗涤后，细胞重悬 于8ml处理液中（处理液配方：100 mM LiAc，10 mM DTT，0.6 M山梨醇， 10 mM Tris-HCl，pH 7.5），室温静置30min； 4.4℃，5000rpm，5min离心收集菌体，用1.5mL 1mol/L预冷的山梨醇洗涤三 次，离心条件一样； 5.每管用100ul山梨醇溶解（以黄枪头能吸取为宜，菌浓低时可适量少加入山 梨醇），最后以80 ul的终体积转移至EP管中（菌体太多可适当放弃部分），置于-70℃冰箱保存。 电转化： 1.向感受态细胞中加入约3ug（体积小于10ul）的DNA，用枪吹吸均匀，转移 至预冷的电转杯中，静置5min； 2.擦干电转杯，电击，电击参数：2.0KV，25uF，200欧姆； 3.立即加入1ml 预冷的山梨醇，转移至EP管中，于30℃静置1h；

毕赤酵母的电转化方法

Transformation of Pichia pastoris GS115 毕赤酵母电转化方法 电穿孔法简便、快速、高效，是理想的转化方法。 线性化质粒DNA对Pichia pastoris GS115的转化 一、菌体的准备： （1）挑取酵母单菌落，接种至含有5ml YPD培养基的50ml三角瓶中，30℃、250~300r/min培养过夜； YPD培养基配方：注意高温灭菌的温度 1 L培养基：900 mL水中加入10 g Yeast extract, 20 g peptone，20 g葡萄糖； 定容至1L，在115o C条件下灭菌25 min； （2）取100~500μl的培养物接种至含有100ml新鲜培养基的250 mL三角摇瓶中，28~30℃、180 rpm培养过夜，至OD600达到1.3~1.5； （3）将细胞培养物于4℃，1500g离心5min，用20 mL的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬； （4）按步骤3离心，用20 ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬； （5）按步骤3离心，用20 ml的冰预冷的1 M的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；（6）按步骤3离心，用1ml的冰预冷的1M的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为1.5ml； （7）备注：可将其分装为80μl一份的包装冷冻起来，但会影响其转化效率（2周之内）。 二、电击转化： （8）将5~20μg的线性化DNA溶解在5~10 μl TE溶液(或灭菌ddH2O)中，加入5μl ssDNA (ssDNA需要在沸水中煮5 min变性，然后迅速转移到冰上，放置5 min 使之成为单链状态)，与80 μl的上述步骤6所得的感受态菌体混匀(轻弹混匀)，尽数吸出转移到0.2cm型的电穿孔转化杯中；

酵母的高效转化(Clontech)

酵母的高效转化（Clontech） 1．在YPAD平板上将酵母菌种划线，30℃下培养直至单菌落出现（3天）。 2．将一个单菌落接种到5ml液体YPAD，30℃下250 rpm振荡培养过夜（8–12 hr）。 3．将 5 μl 预培养液接种到装有50 ml YPDA的250 ml 三角瓶中培养，OD600达到0.15-0.3 （16-20hr）。 4．在室温下700g离心5分钟，弃上清，再加入100ml YPDA，然后在30℃下培养直至OD600达到0.4-0.5（3-5hr）。 5．分装到2x50ml无菌离心管，在室温下700g离心5分钟，弃上清，每个离心管加入30ml无菌水悬浮细胞。 6．再离心，弃水，分别把细胞悬浮在1ml的100mmol/L醋酸锂中，并转悬浮物到一个无菌1.5ml离心管。 7．高速离心15秒钟沉淀细胞，用微量移液器吸出醋酸锂。 8．悬浮细胞到最终600μl体积其中大约含400μl的100mmol/L醋酸锂。 9．将1ml单链载体DNA样品煮沸5分钟，快速在冰水中冷却。 10．振荡细胞悬浮液，取50μl样品加到标记的离心管中，离心沉淀细胞，用微量取样器除去醋酸锂。 11．基本“转化混合液”由下列成分组成，小心按下列顺序如下： 240μl PEG（50% w/v） 36μl 1.0mol/L 醋酸锂 25μl 单链载体DNA（2.0mg/ml） 50μl 水和质粒DNA（0.1～10μg） 12．剧烈振荡每个反应管每个反应管直到细胞完全混匀，通常需要1分钟左右。 13．置30℃保温30分钟。 14．置42℃水浴中热激20～25分钟。 15．以6000～8000r/min离心15秒，用微量移液器除去转化混合液。 16．吸0.2～1.0ml无菌水加到每个反应管中，用移液器上下轻轻抽提以悬浮沉淀。 17．用等份的200μl转化混合液涂选择平板。

酵母单杂交实验方法.

酵母单杂分析 酵母单杂交技术是体外分析DNA与细胞内蛋白质相互作用的一种方法，通过对酵母细胞内报告基因表达状况的分析来鉴别DNA结合位点并发现潜在的结合蛋白基因，或对结合位点进行分析。运用此技术能筛选到与DNA结合的蛋白质，并可直接从基因文库中得到编码该蛋白质的核苷酸序列而无需复杂的蛋白质分离纯化操作，故在蛋白质研究中具有一定的优势；而且酵母属真核细胞，通过酵母系统得到的结果比其它体外技术获得的结果更能体现真核细胞内基因表达调控的情况。 【实验目的】 了解酵母单杂交的基本原理和应用，掌握酵母单杂交的主要步骤及注意事项，学会酵母感受态的制作与转化，基因文库的构建及筛选。 【实验原理】 酵母单杂交方法是根据DNA结合蛋白（即转录因子）与DNA顺式作用元件结合调控报告基因表达的原理来克隆编码目的转录因子的基因（cDNA）。该方法也是细胞内分析鉴定转录因子与顺式作用元件结合的有效方法。如图所示，将已知的特定顺式作用元件构建到最基本启动子（minimal promoter，Pmin）上游，Pmin启动子下游连接报告基因。进行cDNA融合表达文库时，编码目的转录因子的cDNA融合表达载体被转化进入酵母细胞后，其编码产物（转录因子）与顺式作用元件结合，就可以激活Pmin启动子，并促使报告基因表达。根据报告基因的表达，筛选出与已知顺式元件结合的转录因子。

“Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System”提供了一个简单高效的构建cDNA文库并进行酵母单杂交筛选的方法，它使用aureobasidin A 抗性基因作为报告基因，筛选效率高，背景低。单杂交筛选是从酵母双杂交筛选发展而来，利用单杂交筛选可以对cDNA文库进行筛选直接获得与目的顺式作用元件相结合的蛋白质。 图2 用Matchmaker Gold One-Hybrid System筛选protein-DNA相互作用的原理 The Matchmaker Gold One-Hybrid Library Screening process主要包括以下步骤： 1 将已知序列（bait）克隆到pAbAi载体。 2 pBait-AbAi质粒转化Y1HGold酵母菌株，使其与酵母基因组发生重组，生成bait/reporter酵母菌株。 3 检测Y1HGold bait菌株AbAi r基因的本底表达水平。 4 合成cDNA并通过cDNA和pGADT7-Rec载体共转化酵母进行细胞内同源重组筛选cDNA文库。 5 筛选结果的验证和分析。 【实验准备】 1 仪器设备 微量取液器（2.5 μL；20 μL；50 μL；100 μL；200 μL；1000 μL）、PCR仪、低温离心机、台式离心机、CHROMA SPIN TM+TE-400纯化柱、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像系统、恒温摇床、恒温孵箱、通风橱、制冰机、振荡器、恒温金属浴、酒精浴、无菌接种环、10 cm培养皿、15 cm培养皿等。