免疫组化常见问题的处理
免疫组化常见问题的处理
当免疫组化染色没有出现预期结果时，应系统地查找原因，而每一次只能排除一种可能的原因。
对照/标本无染色
①确认是否忽略了应该加的某种试剂，包括一抗、二抗、三抗及底物等。
②确认所有的试剂是否按正确的顺序加入，是否孵育了足够的时间。
③对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体，以及所用的检测系统是否和一抗匹配，这一点是非常重要的。比如，如果一抗是兔来源的抗体，二抗一定要用抗兔的二抗来匹配；或一抗是小鼠的IgM一抗，二抗必须是山羊/兔抗小鼠的IgM（不是IgG）二抗。
④检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液。
⑤检查抗体的有效期和保存条件，尤其是标记了酶或荧光素的抗体，现在大多数试剂公司的抗体均要求在4~8℃条件下保存，应避免反复冻融，试剂保存时一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室，以免降低抗体的效价。
⑥检查标本的储存条件，最好用已知阳性的标本来同时做阳性对照。
⑦检查色原/底物溶液，最简单的检测方法是将一滴标记有酶的抗体加入到制备好的底物溶液中，如果底物发生预期的颜色变化，则可排除底物的因素。需要注意的是，有些底物在制成工作液后应在一定时间内用完，否则会失效。
⑧检查冲洗液是否和反应试剂匹配，溶液的pH值很重要，与过氧化物酶底物匹配的溶液中不应含有叠氮钠。
⑨检查复染剂和封片剂是否和所使用的色原匹配。
弱阳性
如果阴性对照没有染色而阳性对照标本弱阳性，除了考虑上述因素外，还应考虑：
①标本的固定方式，不当的固定方式或固定时温度过高，都会影响到所检测的抗原的数量和质量。
②不适当的抗原修复方式，由于石蜡切片在制作的过程中固定剂对抗原的封闭作用，必须用抗原热修复或酶消化或两种同时使用的抗原双暴露法，至于使用哪一种方法，应参照生产厂家的说明，同时结合标本的具体情况而定。
③抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度/时间是否正确。一般试剂生产厂家都会对试剂给出一定的使用范围，但是由于使用者的标本来自各种组织，处理过程也不尽相同，所以应参照使用范围，对所使用的一抗进行梯度测试，找出最佳的使用浓度。
④切片上遗留了过多的冲洗液，当抗体加至切片上时，等于人为地对抗体进行了进一步的稀释。
⑤孵育时切片是否放置水平，否则会导致抗体流失。
如果阴性对照没有反应，阳性对照反应良好，而标本弱阳性，则可能是由于阳性对照不是同一种组织、或固定方式不同等原因所致。
非特异性染色
①是否有效地去除了内源性酶和生物素。应注意的是，并不是每一种组织均需要进行此步骤，但对于内源性酶或生物素丰富的组织，如肝脏、肾脏等，需考虑此原因。处理的方法为：
灭活碱性磷酸酶：最常用的方法是将左旋咪唑（24mg/m1）加入底物液中，并保持pH值在7.6~8.2，即能除去大部分内源性碱性磷酸酶，对于仍能干扰染色的酸性磷酸酶，可用50mm ol/L的酒石酸抑制。
饱和处理内源性生物素：消除内源性生物素的方法是事先滴加亲和素，以饱和内源性生物素，使之不再有剩余的结合位点。具体方法是在ABC法或SP法染色前将切片浸于25ug/ml亲和素溶液中处理15分钟，PBS清洗15分钟后即可染色。
②是否选择使用了正确的封闭血清。电荷吸附所造成的非特异性背景染色消除方法是以二抗动物的非免疫血清，用PBS稀释为3%-10%溶液孵育切片，以封闭吸附位点。有时其它无关蛋白，如牛血清白蛋白也常应用。另外，取材时避开出血、坏死区亦极重要。最近有些国内的实验室应用5%脱脂奶粉替代血清进行抗原封闭，效果也不错。
③所选择的抗体是否符合试验要求。因抗原不纯、标本片中含有与靶抗原相似的抗原决定簇等原因造成的非特异性染色只能通过采用高纯度、高效价的抗体、或针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体来解决。
④一抗的使用浓度是否过高。
⑤清洗是否充分。应严格操作规程。因在缓冲液中含有一定量的盐，这亦有利于减低背景着色，通常0.05mol/l Tris—HCl，0.15mol/l NaCl已适用于多数染色方法，溶液内加入吐温2 0，效果更佳。特殊标记时，试剂公司一般都提供缓冲液的配方。
⑥ DAB的使用是否正确。DAB的孵育时间和配制方式可以产生某些背景颜色，使用浓缩型DAB试剂盒时，请严格按照说明书标明的滴加顺序操作，注意校正蒸馏水的pH值，以确保实验结果的正确性；粉剂DAB溶解时，常有一些不溶性颗粒，这些颗粒须经过滤除去，否则可能沉积于切片组织上，产生斑点状着色。另外，DAB保存不妥产生氧化物亦可沉积于切片上，因此需将DAB保存于避光干燥处，现用现配，临用前加H2O2。孵育时间过长也会造成背景染色。
⑦标本染色过程中是否曾经干涸，否则会造成边缘部的非特异性染色。
⑧检查二抗与标本的内源性组织蛋白是否有交叉反应。
免疫组织化学问题解答
免疫组织化学是一种什么方法？
免疫组织化学方法是一种把分子水平的物质准确具体表达出来的一种方法，这些分子水平的物质可能与癌细胞，细菌，病毒等等有关。自从成功地制作出这些特异性的抗体，使组织结构可以从分子水平中显示出来，这些特异性抗体可以与肿瘤细胞中特定的结构结合，这些抗体被称为单克隆抗体。把这些单克隆抗体孵育在组织切片上，与特定的靶细胞进行特异的反应。如单克隆抗体可以与癌细胞发生特异性反应，单克隆抗体可以从特定的肿瘤病人血细胞中获得。在组织切片中结合的抗体可以用棕色或红色显示出来。比如，对转移到骨组织中的肿瘤细胞进行标记实验，我们可以用前列腺特异性抗体进行标记，如显示出棕色或红色的阳性反应，我们可以明确地判断这个转移性肿瘤来自前列腺癌，有些转移的肿瘤距原发部位可能更远。免疫组织化学不仅能帮助准确地诊断出肿瘤的性质，还可以预测肿瘤预后的生物学
行为。例如，我们可以知道所有组织细胞的增殖活性。这不是更有意义的实验吗？我们能够判定在一种肿瘤组织中，80%的细胞增殖抑制了其他10%的肿瘤细胞的增殖，我们可以判定出这种肿瘤细胞增殖率高，要比其他肿瘤生长迅速，进展快。
在其他方面，免疫组织化学染色可以指导某些肿瘤的化疗，如：可以测定女性乳腺癌细胞中携带雌激素受体的含量。如果癌细胞中雌激素表达阳性，病人可以进行三苯氧胺的治疗，雌激素能够促进乳腺癌细胞的生长，三苯氧胺有封闭癌细胞中雌激素受体的功能。在此过程中，携带雌激素受体的癌细胞是通过激素促进它生长的，而且，癌细胞增生可以通过三苯氧胺治疗来阻止其生长的。因此，免疫组织化学测定雌激素受体的表达情况，可以预测三苯氧胺治疗的意义。这仅仅是免疫组织化学应用中的一个小例子。免疫组织化学在确定组织起源中的应用前景是无限的。免疫组化技术是一个复杂的生物技术，对每一个抗体标记物都有独自特定的染色方法，目的是能够明确各种组织起源，判定组织中是否存在特异抗原。
病理医生是如何对癌症做出诊断的?
癌症病人就诊时，外科医生会在肿瘤部位取一小块组织，送给病理科医生。在病理科，送检的组织经过石蜡包埋，制作成非常薄的组织切片，切片再进行HE染色，然后病理科医生将切片放在显微镜下观察，观察送检的标本中有没有肿瘤细胞，并做出诊断是患何种肿瘤。不幸的是，许多肿瘤组织细胞在显微镜下看起来非常相似，以致于病理医生难以完全准确地判断出肿瘤的性质。在许多肿瘤病例中，鉴别诊断是非常困难的，因为只有明确了肿瘤的性质，医生才能针对每种肿瘤制定出最有效的治疗方案，目前已经从分子水平研究出肿瘤细胞的表面和细胞内有特异性的物质表达。过去在传统的光学显微镜下及电镜下所看到的组织切片中的结构，曾经幻想的分子水平的结构，已经有现代免疫组织化学技术证明，这个技术的整个过程就叫做免疫组织化学方法。
CD抗原
CD，即分化丛（clusters of differentiation）。第Ⅳ届国际免疫学会议命名委员会（1983，京都），根据T细胞表面的分化抗原存在丛集现象，将这种抗原命名为CD抗原。CD抗原不仅存在于T细胞，也存在于B细胞，巨噬细胞等。
交叉反应
指抗体除与其相应的抗原发生特异性反应外还与其它抗原发生反应。产生的原因有以下几个方面：
1．抗原特异性。指用于免疫动物的抗原性物质中含有多种抗原分子，它引起动物产生针对多种抗原分子特异性的相应抗体。任何其它物质只要含有一种或多种与上述物质相同的抗原分子，必将与上述多特异性的抗血清发生交叉反应。
2．共同决定簇。即两种抗原分子中都含有相同的抗原决定簇。
3．决定簇相似，两种不同的抗原决定簇，如果结构大致相同，由于空间构象关系，某一决定簇的相应抗体可以与大致相同的决定簇发生交叉反应。当然抗原一抗体之间构象相似时的结合力小于吻合时的结合力。
? 抗原决定簇。它是指在抗原分子上为免疫系统识别和作用的基团，是抗原的关键结构。抗原决定簇的种类有1016?/FONT>1018种之多。决定簇的数目称为决定簇的价数，较大的分
子决定簇较多，如红细胞上的A或B血型抗原，其决定簇数目可能超过100万。
? 多抗和单抗特性比较
1. 均一性。一种单抗中，每个抗体的化学结构和氨基酸顺序都相同，只有一种Ig亚类。即单抗是一种纯度很高的均一抗体。而从不同动物，不同时期所得到的多抗，各有不同的化学组成。多抗是多种种类和亚类Ig的混合物。
2. 稳定性。单抗的稳定较差，对PH变化敏感，对热不稳定，提纯过程中易变性，而多抗的稳定性则较好。
3. 特异性。单抗是单一地针对抗原的某一决定簇，所以用它进行血清学反应时，特异性强，敏感性高，一般不发生交叉反应。而多抗能与抗原上的多种抗原决定簇结合，所以特异性较差，较易引起交叉反应。
4. 重复性。单抗的重复性好，而多抗每批都不一样。
沉淀反应
多抗由于与抗原多价结合容易形成网络样沉淀，而单抗只与抗原结合产生二聚体，不能直接形成抗原抗体沉淀物。
抗体的保存
抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。如储存的抗体中蛋白浓度很低（10-100Mg/L），就应另加隔离蛋白以减少容器对抗体蛋白的吸附，隔离蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。
绝大多数已稀释的抗体应存在4℃-8℃条件下，以免冻融对抗体蛋白产生有害效应。抗体原液和已分离的免疫球蛋白组分应保存于-20℃条件下，并避免反复冻融。冷冻的抗体溶液应置于室温中缓慢地解冻，应绝对避免用高温快速解冻。
被细菌污染的抗体常会出现假阳性结果，应将污染的抗体溶液及其他试剂弃之。为防止细菌污染，可于抗体溶液中加入0.01%叠氮钠。抗体经真空冷冻干燥后置-20℃以下可保存3-5年。
保存稀释后的单抗应加入0.1%叠氮钠浓度。大多数稀释抗体可进行冷冻保存，少数抗体可能会丢失抗原活性。大多数单抗，只要蛋白浓度适当，可在4℃下保存数月。
病理科成立免疫组化室需要哪些小设备（仪器）
1．冰箱（4℃、-18℃）：贮存免疫试剂用。
2． 18cm不锈钢高压锅+电炉或家用微波炉。（抗原修复用）
3．孵育盒（有机材料）；不锈钢或塑料耐高温切片架。
4．冲洗瓶两个，定时器一个，10ml玻璃试管五个，塑料试管架。
5． 1000ul国产移液器两支，200ul进口移液器一支，20ul进口移液器一支，相应吸嘴。6．磨砂玻片。
7. PAP油笔。
如何应用免疫组化进行病理科研设计？
科研课题的基本要求至少有四个，即创新性、科学性、可行性和推广应用性。关于创新性的重要性很好理解，谁喜欢东施效颦、拾人牙慧、人云亦云的文章？谁不想标新立异，“国内外尚无类似报道”？可对于病理科医生尤其是基层病理科医生，采用免疫组化技术进行创新
性的科研，似乎免为其难。其实如果调整一下思维角度，难者也就不难了。我们在这里甘冒才疏学浅之嫌，介绍几种简单可行的创新性方法，以请教于病理界同仁。
方法之一，采用新抗体，这是最简单的办法。如金属蛋白酶MMP-9抗体是一种新抗体，其抗原MMP-9与肿瘤侵袭和转移有密切关系，但采用此抗体和免疫组化研究肿瘤侵袭、转移的文章国外少见，国内尚无，读者不妨一试。
方法之二，旧抗体新用途。比如关于凋亡及其相关因子表达与肿瘤发生发展的关系的研究，国内外有大量报道，而关于其非肿瘤疾病的关系的研究，却报道很少，有的甚至迄今未见报道。如果你将P53、bcl-2、c-myc、Bax、ICE等凋亡相关基因蛋白抗体用于非肿瘤性疾病研究，一定会获得新发现。再比如，P-糖蛋白抗体绝大多数用于肿瘤耐药性研究，却极少用于非肿瘤性疾病的研究。正常肝、肠道、肾等均表达P-糖蛋白，在非肿瘤性疾病时这种表达有什么改变，这种改变又有什么意义，迄今尚未了解，读者也不妨在这方面施展你的身手。
方法之三，同时应用多种抗体进行普通免疫染色或双重免疫染色研究二种或二种以上抗原的协同表达，只要这几种抗体选用合理，也比较容易获得新发现。
评价某种免疫学试验质量的指标
1．诊断敏感性。指患者中因此试验得到阳性结果的百分率。计算方法：TP/（TP+FN）χ10 0%。理想试验的诊断敏感性为100%。
2．诊断特异性。指正常人与无关疾病的患者中因此试验得到阴性结果的百分率。非患者的阴性结果为真阴性，其阳性结果为假阳性。计算方法：TN/（TN+FP）χ100%。理想试验的诊断特异性应为100%。
3．诊断指数。为评价某种试验敏感性与特异性的综合指标。理想的指数应为200%，≤100%的试验不能成立。
4．诊断效率。某种试验能准确区分患者和非患者的能力。计算方法：（TP+TN）/（TP+F P+TN+FN）×100%。理想试验的诊断效率应为100%。
5．阳性预测值。指在所有阳性结果的人中，非患者的百分率，计算方法：TP/（TP+FP）×100%。理想试验的阳性预测值应为100%。
6．阴性预测值。指在所有阴性结果的人中，非患者的百分率，计算方法：TN/（TN+FN）×100%。理想试验的阴性预测值应为100%。
免疫组化染色过程中存在的问题
良好的免疫组化染色切片是正确判断染色结果的基础和前提。由于免疫组化染色过程中存在很多步骤或环节，每一个步骤或环节都可能影响到染色的最终结果，因此，要做好一张高质量的免疫组化切片并不是一件非常容易的事。需要病理技术员和病理医生密切配合、相互协调、共同努力才能保证做出合格的免疫组化切片。虽然免疫组化染色可以存在各种各样的问题，但从染色的结果看，一般可分为两类：无色片（即无阳性信号）和“杂音”染色片（有阳性信号）。 一、无色片 染色结束后，切片中见不到任何阳性信号。这是常规工作中比较常见的现象，出现这种现象，有两种可能：1、真阴性结果：整个染色过程没有出现问题，组织或细胞确实不表达与抗体相关的抗原。2、假阴性结果：即此阴性结果不是真实的反映。假阴性结果又可分为两种情况：（1）、切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞。出现这种情况，要麽是病理医生选择错了切片或抗体选错了，要麽是技术员选错了蜡块。获得正确的切片进行染色是获得正确结果的前提。由此表明：制作出合格的免疫组化切片不仅仅是技术员的事，病理医生也起着不可缺少的作用。（2）、染色过程中的某一或某些环节出了问题。比如，组织未进行抗原修复，有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达；或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体；或一抗失效，虽然抗体失效在理论上是一个逐渐的过程，但偶尔也遇到突然失效的情况，抗体长期不用和/或已超过有效期是主要的原因。也可见于染色过程中漏掉了某一环节，如忘记加二抗或三抗，或用了两次二抗而缺少了三抗，或配制DAB时少了过氧化氢。为了避免这种简单的错误，有一种简单的方法：在三抗孵育结束时，将切片上的三抗甩在一张白纸上，在将配制好的DAB滴一滴在白纸的三抗上，观察是否出现棕色。如果出现了，证明三抗和DAB的配制过程没有错误。如果这种DAB再滴到切片上没有出现任何阳性信号，问题一定是出在三抗以前。如果纸上不出现棕色反应，问题肯定在三抗DAB或DAB的配制过程。这种简单方法能迅速的帮助我们查找出现问题可能的原因。 解决阴性染色的问题非常简单，就是设立“阳性对照”。如果阳性对照有了表达，说明染色的全过程和所有试剂都没有问题。如果此时测试片仍为阴性，便是真实的阴性，说明组织或细胞没有相应的抗原表达。反之，如果阳性对照没有着色，表明染色过程中某个或某些步骤出了问题或试剂出了问题。应一一寻找原因。阳性对照包括两种，一种称为“自身对照”或“内部对照”，这是指在测试的切片中本身就存在已知的抗原，如正常淋巴结中存在T和B细胞抗原，CD20或CD3都应该有表达。自身对照是一种比较理想的对照，对照和测试组织或细胞都在同一张切片中，都处于相同的试验条件下，结果更可靠也更具有可比性。在选择自身对照片时最好选择既有病变组织同时又有正常组织的部分，这样有利于对比。另一种称为“外部对照”，有时在测试的切片中不存在已知的抗原，如在胃的标本中怀疑是恶性黑色素瘤，需要用HMB45或Mart-1来检测，在正常的胃组织中本身不存在相关的抗原，如果病变出现阳性反应结果，尚能提示是恶黑，但是如果出现阴性结果，就无法确定是本身组织中不含黑色素瘤抗原，还是技术问题。因此，应另外设立一个已知的阳性对照。这种在测试组织之外的阳性对照称为“外部对照”。在实际工作中需要设立外部对照的情况很多，如果每一种抗体都要选不同的阳性对照，工作量会很大。为了解决这个问题，目前国内外有单位将多种不同组织集成在一起，制成多组织切片、“腊肠”“春卷”切片、组织芯片等，其连续切片储备待用，需要时取出一张便可作为阳性对照。另外，比较简单的方法，是采用阑尾作为阳性对照，因为与人体其它组织器官比较阑尾包含的组织种类较多，如有上皮、淋巴组织、平滑肌、间质、神经、血管、间皮等。一张阑尾切片可以检测大多数常用的抗体。 设立阳性对照是病理医生的任务或责任，而不是技术员的责任。病理医生观察了HE切片，了解切片中是否有自身对照，如果没有，就应告诉技术员采用阳性对照。因此，病理医生在免疫组化中的作用是不可忽视的。 抗体未覆盖上测试组织：当多块散开的小组织染色时，可能漏掉某块组织染色。 二、“杂音”染色片 免疫组化除正常的真实的阳性信号外常常会遇到不正常的背景着色，这些非正常的着色称为“杂音”染色。“杂音”染色种类繁多，产生的原因也多种多样，为了便于说明，笔者将其归纳为下面几种 1、全片着色
免疫组化步骤
免疫组化实验步骤 细胞和组织的固定 （一）固定 为了更好的保持细胞和组织原有的形态结构，防止组织自溶，有必要对细胞和组织进行固定。固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，终止或抑制外源性和内源性酶活性，更重要的是最大限度的保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原弥散。不同抗原，其稳定性也不相同，因而对固定剂的耐受性差异较大 （二）固定剂 用于免疫组织化学的固定剂种类较多，性能各异，在固定半稳定性抗原时，尤其重视固定剂的选择，介绍如下。 1．醛类固定剂双功能交联剂，其作用是使组织之间相互交联，保存抗原于原位，其特点是对组织穿透性强，收缩性小。有人认为它对IgM、IgA、J链、K 链和λ链的标记效果良好，背景清晰，是常用的固定剂。 1）4%多聚甲醛为我们常用固定剂 2）Bouin’s液 该固定液为组织学、病理学常用固定剂之一，对组织穿透力较强而收缩性较小，比单独醛类固定更适合免疫组化染色。Kayhko认为用于标记B细胞的J链较好，但Bullock则认为它可导致Igg γ重链变性，故必需加大第一抗体的浓度。 2．丙酮及醇类固定剂 系最初免疫细胞化学染色的固定剂，其作用是沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性很强，保存抗原的免疫活性较好。但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，解决的办法是和其它试剂混合使用，如加冰醋酸、乙醚、氯仿、甲醛等。 丙酮的组织穿透性和脱水性更强，常用于冰冻切片及细胞涂片的后固定，保存抗原性较好，平时4。C低温保存备用，临用时，只需将涂片或冰冻切片插入冷丙酮内5-10min，取出后自然干燥，贮存于低温冰箱备用。 以上介绍了免疫组织化学中常用的固定液，用于免疫组化的固定剂种类很多，不同的抗原和标本需经过反复试验，选用最佳固定液，迄今尚无一种标准固定液可以用于各种不同的抗原固定。而且同一固定液固定的组织，免疫组化染色标记
石蜡切片免疫组化染色实验操作流程
石蜡切片免疫组化染色实验操作流程_ 1．石蜡切片脱蜡至水： （石蜡切片染色前应置60℃1小时）。 ①二甲苯I、II，各30分钟。 ②梯度酒精：100%I、II，各10分钟;95%，5分钟;80%，5分钟;70%5分钟。 ③蒸馏水洗：5分钟，2次（置于摇床）。 2抗原修复： 根据待检测的抗原，选择适当的方法。 附： 抗原修复液（10mMpH 6.0枸橼酸钠缓冲液）的配制： ①储备液的配制： A液： 枸橼酸三钠-2H2O 29.41g+蒸馏水1000ml；B液： 枸橼酸21g +蒸馏水1000ml；②工作液的配制： A液82ml+ B液18ml+蒸馏水900ml 抗原修复的方法： 高压锅处理技术： 枸橼酸钠缓冲液（10mM，PH
6.0），淹没切片，盖上锅盖，高压锅内煮沸，上汽3分钟后缓慢冷却（可用自来水在高压锅外冲，以助冷却）。晾至室温抗原修复的注意事项： ①组织不能干。②选择抗原修复方法要因抗体而异。③该方法主要用于10%福尔马林固定、石蜡包埋组织。④抗原修复后至DAB显色的过程中，均需用PBS缓冲液。 3．PBS：5分钟，2次（置于摇床） 4．过氧化氢封闭内源性过氧化物酶：3%H2O2，室温20分钟（避光）。 5．PBS水洗：5分钟，2次。 6．正常血清封闭： 从染片缸中取出切片，擦净切片背面水分及切片 正面组织周围的水分（保持组织呈湿润状态,）滴加正常山羊或兔血清（与第二抗体同源动物血清）处理，37℃，15分钟。 附： 正常血清配制(或按试剂盒规定的浓度配制)： 按1:10比例，用PBS配制，每张切片需要量按50μ+5μl (10%抛洒量)计算。 7．滴加第一抗体： 用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加第一抗体50μ，（也可置于4℃冰箱过夜）。 第二天片子晾至室温 8．PBS：5分钟，2次。 9.滴加聚合物增强剂（试剂A），37℃孵育30分钟， 0.01 M PBS洗涤三次，5分钟/次，振洗。
免疫组化染色操作步骤
免疫组化染色操作步骤 Document serial number【UU89WT-UU98YT-UU8CB-UUUT-UUT108】
免疫组织化学染色原理和操作步骤一、免疫组织化学原理 免疫组织化学（IHC）又称免疫细胞化学，是根据抗原—抗体特异性结合的原理，应用带有可见标记的特异性抗体作为探针，检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。免疫组化技术主要有直接法和间接法：直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分；间接法则先后加入一抗和二抗，形成抗原—一抗—二抗复合体以达到检测该抗原的目的，该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。间接法常用的有过氧化物酶—抗过氧化物酶（PAP）法、亲和素—生物素—过氧化物酶（ABC）法和链霉亲和素—过氧化物酶（SP）法。 PAP法一抗和二抗均不标记，避免了标记过程对抗体活性的影响，但需要制备过氧化物酶的抗体，与适量过氧化物酶混合形成PAP复合物（含3个酶分子和 2个抗体分子），染色时依次加入一抗、二抗、PAP复合物孵育标本，最后用H 2O 2 和二氨基联苯（DAB）为底物显示过氧化物酶，即可检测标本中的抗原成分。 生物素为含硫的杂环单羧酸，可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合，从而标记抗体和酶。亲合素又称抗生物素蛋白，与生物素有很高的亲合力，1分子亲合素可结合4分子生物素，ABC法即在此基础上建立。ABC法与PAP法相似，一抗不标记，二抗用生物素标记，染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC复合物，并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。在标本孵育过一抗和二抗后，再加入ABC复合物使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB进行显色。ABC法的敏感性较PAP法更高。 图1. 免疫组织化学基本原理示意图（引自八年制《组织学与胚胎学》）
免疫组化超详细步骤
免疫组化超详细步骤 Prepared on 22 November 2020
免疫组化 一实验目的：分别用KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体检测肺癌组织中KRAS、NRAS、HRAS蛋白的表达情况 二实验原理:应用基本原理——抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使的（、酶、、）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和），对其进行定位、定性及定量的研究，称为或. 三实验试剂及耗材:经病理医生确认的肺癌组织切片、KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体、DAB显色试剂盒、抗原修复液、PBS、苏木素染料、1%盐酸酒精溶液、%氨水、二甲苯、等 四实验设备：切片机、4℃冰箱、显微镜、烤片机 五主要试剂配置: 缓冲液 应用液配成1000毫升溶液 应用液BNa2HPO4·配成1000毫升溶液 配制1000毫升PBS需要14毫升应用A液，36毫升应用B液，加。 枸橼酸钠抗原修复液 应用液A枸橼酸配成1000毫升溶液 应用液B柠檬酸三钠（三水合柠檬酸三钠）配成1000毫升溶液 配制500毫升抗原修复液需要9毫升应用A液，41毫升应用B液。 苏木素染液配方：苏木素2g,无水乙醇250毫升，硫酸铝蒸馏水750毫升，碘酸钠，冰醋酸20毫升。先将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝溶于蒸馏水水中。两液溶解后将其混合，加入碘酸钠，最后加入冰醋酸。 抗体说明书建议的抗体稀释度 N-Ras1:50-1:500 H-Ras1:50-1:500 K-Ras1:20-1:200 六实验步骤： 1组织常规石蜡切片厚度3-5um，防脱片捞片后晾干，放入72℃烤箱烤片2小时。 2切片脱蜡水化程序 ⑴二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各12分钟； ⑵无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各3分钟；（洗二甲苯） ⑶95%乙醇3分钟； ⑷85%乙醇3分钟； 3自来水漂洗3分钟，洗涤一定要充分。 4组织修复采用高温高压法：压力锅中加入，抗原修复液约1000ml，切片插入塑料架上，放入压力锅，盖上锅盖（此时不扣上压力阀）1600W预热至沸腾，扣上压力阀1300W，待高压锅阀门喷气开始计时，修复时间为2分钟。 5停止加热并用流水冲洗高压锅以降温，室温冷却。 6将抗原修复后切片置自来水中，浸泡2分钟。将样本置于内源性过氧化物酶阻断剂 3%H2O2，室温放置4分钟。（需要盖盖子）自来水洗2分钟，PBS缓冲液洗涤2分钟。
免疫组化操作步骤
免疫组化操作步骤集团标准化工作小组 #Q8QGGQT-GX8G08Q8-GNQGJ8-MHHGN#
免疫组化操作流程 试剂准备 1. PBS缓冲液（～）： NaCl 137mmol/L，KCl L，Na2HPO4 L， KH2PO4 L。 2. L柠檬酸盐缓冲液（CB，，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸。即抗原修复液 : PBS+吐温-20（1000:1）洗液可全部运用PBST 4. 3% 甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。 5. 封片剂：中性树脂+二甲苯。 操作流程 免疫组织化学染色 SP法： 1. 脱蜡、水化： 脱蜡前，应将切片在60℃恒温箱中烘烤60~120分钟，观察石蜡应溶解。 从烤箱拿出切片后尽快置于二甲苯中浸泡30分钟，更换二甲苯后再浸泡30分钟； 无水乙醇中浸泡3分钟； 95%乙醇中浸泡3分钟； 70%乙醇中浸泡3分钟（我用80%）； 50%乙醇中浸泡3分钟； 自来水中浸泡3分钟；
梯度脱蜡 2. 抗原修复：（用于福尔马林固定的石蜡包埋组织切片） 高压热修复高压锅里放少许水，用一量杯或容器（大小能容纳玻片架为宜）装抗原修复液放入高压锅里一起煮沸，再放入玻片架，盖上不锈钢高压锅的盖子，将排气阀门套上，待听到阀门冒气时，即可倒计时2min，之后将玻片杯一起放入凉水中，静置15min，平衡至室温。电磁炉1000W 2min。 3.丢弃抗原修复液，将玻片浸泡在去离子水中（时间不限）可省略 4.用组织笔沿组织边缘画线（可与组织边缘留适当间隙），画完立即放入PBST溶液中浸泡3遍X3min（三个容器，每个容器3min，时间不限制）。 5. 3%H2O2滴加在切片上，室温静置15分钟(3%的H2O2用30%的 H2O2加双蒸水稀释10倍，现配现用。目的为阻断内源性过氧化物酶)； 6. PBST洗3次各3分钟(过三缸) 7. 滴加正常山羊血清封闭液,室温30分钟。用与一抗不同源的血清即可，本人用Western-blotting的含胎牛血清封闭液。 8. 甩去封闭液（注：不要冲洗），滴加一抗50ul（至少50ul否则易干片），4℃孵育过夜。4℃过夜后需在37℃复温45分钟（未验证：室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。）。 9. PBST洗3次各3分钟；
免疫组化操作方法原理步骤以及常见问题处理大总结
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结 1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。就拿温度来说，可以有4度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。 2、免疫组化最大的优势是定位和定性。相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。尤其对于有些因子的转位研究十分有用。 3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。 4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。 5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。当然也不能做假阳性或假阴性结果。 6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。失败往往促进你去思考试验原理和过程，成功有时也加快你自傲。 7、实验方法需要动手+动脑。如今我还不敢说我在免疫组化什么都知道。我只所以今天敢在这里说这说那，这是因为我经过了反复的动手+动脑，把理论原理运用于实践，在把实践中发现的问题带到理论知识中去解决，最终把理论与实践融会贯通。 一、概念和常用方法介绍 1、定义用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。 2、原理根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。 3、分类 1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是比较
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总 结 1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。就拿温度来说，可以有4度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。 2、免疫组化最大的优势是定位和定性。相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。尤其对于有些因子的转位研究十分有用。 3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。 4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS 或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。
5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。当然也不能做假阳性或假阴性结果。 6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。失败往往促进你去思考试验原理和过程，成功有时也加快你自傲。 7、实验方法需要动手+动脑。如今我还不敢说我在免疫组化什么都知道。我只所以今天敢在这里说这说那，这是因为我经过了反复的动手+动脑，把理论原理运用于实践，在把实践中发现的问题带到理论知识中去解决，最终把理论与实践融会贯通。 一、概念和常用方法介绍 1、定义用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。 2、原理根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等
免疫组化步骤
免疫组化：链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法 1)将石蜡切片置于烤片机烘烤２－３h,{因为做石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，所以应烤片2-3h,除非组织的抗原性较稳定，则时间可长一点}后可把烤好的组织切片，放在60℃烤箱中过夜，最佳时间控制在14-18h{乳腺病理处省略此步骤}。取组织切片于切片架，用吹风机吹至产生蜡液，不可靠太近，以免使组织切片局部温度过高，破坏组织切片。 2）常规脱蜡 ({二甲苯脱蜡，在夏天，室温较高，脱蜡试剂也新鲜，则脱蜡时间不需很多，3-5分钟就已足够。如果在冬天，室温较低，脱蜡试剂也较陈旧，则脱蜡时间需要延长，10-20分钟或更长}二甲苯I 20min →二甲苯II 20min→二甲苯Ⅲ20min →无水乙醇10min（清洗二甲苯）→无水乙醇10min→95%乙醇5min→80%乙醇5min) {梯度酒精用无水酒精与蒸馏水配置} 目的：把水渗入组织切片中，给细胞创造一个水溶性环境 <以下步骤是为细胞染色做准备> 3）捞出，放入铁缸内，用凉清水冲洗3次{如果组织容易脱片，就尽量泡一下，这样脱片可以减少很多}； 4）将配好的柠檬酸盐抗原修复液（抗原修复液的量为稍高于横向放倒的切片架的高度）{EDTA配制方法：EDTA修复液使用比例：EDTA:蒸馏水=1:49,每次最好配制1000ml。EDTA修复液重复使用最好不要超过5次，并且3次之后要测PH值，测PH是否为9.0，如偏离太大则弃用。枸橼酸修复液只能用一次。修复的原因：因为常规的石蜡切片标本均用甲醛固定，结果使得抗原性物质形成醛键，羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇。另外，蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。在染色时，要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态}{用EDTA修复比柠檬酸容易脱片，但是你要用到EDTA的时候也可，因其抗原修复效果比柠檬酸盐的好，可从另外的问题上着手}灌入高压锅中，不旋紧，盖上即可，210℃烧至沸腾后，把切片架放入横向放倒，旋紧锅盖，待喷气时，开始计时2min-2min30s,如果组织不易染色，可延长修复时间，但一般不超过3min，否则容易掉片。 5）到时间后，把高压锅放入水池中用凉水冲至气体放出完，旋下锅盖，自然冷却至室温，大于30min。 6）冷却后取出切片架用凉清水冲洗3次，放入3% H2O2 罐中10min，目的：封闭过氧化物酶。【每天用前新放入10ml H2O2 】【配制方法：1000ml 3%的过氧化氢=100ml 30%过氧化氢+900ml蒸馏水，（H2O2保存需避光）】 7）捞出后用凉清水冲洗多次，应注意H2O2 有腐蚀性，最后一次用PBS（磷酸盐缓冲液），PBS
免疫组化超详细步骤
免疫组化 一实验目的：分别用KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体检测肺癌组织中KRAS、NRAS、HRAS蛋白的表达情况 二实验原理: 应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术. 三实验试剂及耗材:经病理医生确认的肺癌组织切片、KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体、DAB 显色试剂盒、抗原修复液、PBS、苏木素染料、1%盐酸酒精溶液、0.05%氨水、二甲苯、等 四实验设备：切片机、4℃冰箱、显微镜、烤片机 五主要试剂配置: 缓冲液 应用液A NaH2PO4 38.4g配成1000毫升溶液 应用液B Na2HPO4·12H2O 114.8g配成1000毫升溶液 配制1000毫升PBS需要14毫升应用A液，36毫升应用B液，加8.5gNaCl。 枸橼酸钠抗原修复液 应用液A 枸橼酸 10.55g配成1000毫升溶液 应用液B 柠檬酸三钠（三水合柠檬酸三钠） 29.01g 配成1000毫升溶液 配制500毫升抗原修复液需要9毫升应用A液，41毫升应用B液。 苏木素染液配方：苏木素2g,无水乙醇250毫升，硫酸铝17.6g蒸馏水750毫升，碘酸钠0.2g，冰醋酸20毫升。先将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝溶于蒸馏水水中。两液溶解后将其混合，加入碘酸钠，最后加入冰醋酸。 抗体说明书建议的抗体稀释度 N-Ras 1:50-1:500 H-Ras 1:50-1:500 K-Ras 1:20-1:200 六实验步骤： 1组织常规石蜡切片厚度3-5um，防脱片捞片后晾干，放入72℃烤箱烤片2小时。 2 切片脱蜡水化程序
免疫组化入门实验操作
免疫组化入门实验操作 一、实验目的： 1.了解免疫组化基本原理。 2.了解免疫组化实验操作及注意事项。 3.免疫组化结果判定。 通过实验，让学生熟悉免疫组化操作流程及注意事项，对抗原抗体结合、抗原修复和酶催化底物显色进行研究。要求学生通过查阅文献，在归纳、对比、总结的基础上对免疫组化有进一步的了解。 二、实验原理： 三、实验材料： 一抗：CD5、CK8、Ki67 二抗：MaxVision3 其它：柠檬酸抗原修复液、过氧化物酶阻断剂、PBS缓冲液、DAB、孵育盒、染色架、苏木素、盖玻片、冲洗瓶、中性树胶，孵育盒。 四、实验步骤：
1.脱蜡水化 二甲苯5min，二甲苯5min，二甲苯5min，无水乙醇2min，无水乙醇2min，95%酒精2min，85%酒精2min，自来水冲洗。 2.抗原修复 高压锅中加入1200mL柠檬酸修复液，电磁炉煮沸后放入切片，扣紧锅盖，功率调至800W，至压力阀均匀喷气后计时 1.5min，移开高压锅室温冷却10min，自来水冷却。 3.过氧化物酶阻断 修复结束后，流水冲洗干净，除去自来水，在离组织3mm处用免疫组化油笔画圈或用纸巾擦干组织外残留的液体，滴加50 μL（一滴）过氧化物酶阻断剂，室温孵育10min，PBS冲洗3×3min。 4.一抗 甩去PBS，纸巾擦干组织3mm外的残留液体，每张切片加50 μL（一滴）相应一抗，室温下孵育60分钟，PBS冲洗3×3min。 5.二抗 甩去PBS，纸巾擦干组织3mm外的残留液体，每张切片加50 μL（一滴）MaxVisionTM试剂，室温下孵育30分钟，PBS冲洗3×3min。 6.DAB 甩去PBS液，纸巾擦干组织3mm外的残留液体，每张切片加50 μL（一滴）新鲜配制的DAB，显色5分钟，自来水冲洗。 7.苏木素复染 每张切片滴加50 μL（一滴）苏木素，20-30秒后自来水冲洗30s以上，或浸泡于PBS中30s以上再自来水冲洗。 8.封片 梯度酒精脱水干燥（85%酒精2min，95%酒精2min，无水乙醇2min，无水乙醇2min，二甲苯1min），或直接电吹风吹干，中性树胶封固。
免疫组化组织细胞地取材、固定、切片操作方法及要点
从大体标本上切除适量的组织材料进行研究就是取材。取材不仅在免疫组化而且在常规病理检查中也十分重要。用于免疫组化的组织一般取材大小为1．OcmXl．OcmX0．2cra。取材时应剔除脂肪和钙化，否则会影响切片，出现假阳性或假阴性结果。 组织标本包括动物标本、手术活检标本、尸体解剖标本及细胞标本等，有关各种标本的取材方法分述如下。 一、动物的致死法及取材 (一)致死法 (1)空气栓塞法向动物静脉注入一定量的空气，使动物很快死亡。一般适用大动物，例如兔、犬、猫等动物。 (2)麻醉法可将浸有乙醚或氯仿(三氯甲烷)的棉球连同动物一起放人密闭容器进行麻醉，也可用4％戊巴比妥作静脉注射，或用20％氨基甲酸乙酯做腹腔注射。适用于鼠等小动物。 (3)断头法用剪刀剪去动物的头部，待血液流出后立即取材。适用于小动物。 (4)去头法用重物猛击头后部或将动物头后部猛撞桌沿。 (5)股动脉放血法动物麻醉后，切开股动脉放血致死。 (二)取材注意事项 (1)最好在动物心脏还在跳动时立即取材，并迅速投入环保组织固定液。脏器的上皮组织易变质，争取在死后半小时取材完毕，否则免疫组化染色时会产生背景染色。 (2)切取组织使用的刀、剪要求锋利，避免来回挫动组织。因动物组织质脆，因此夹取组织时切勿用力过重，以免挤压损伤组织。 二、尸体解剖的取材 尸体解剖的取材应根据实际需要进行，一般取材部位和数量如下。 (1)心和大血管右心室一块，左心室一块，主动脉一块，取材部位可在距主动脉瓣5cm处。 (2)肺右下叶一块，切成正方形；左下叶一块，可切成长方形。 (3)肝右叶一块，切成正方形；左叶一块，切成长方形。 (3)脾一块。 (4)胰一块。 (6)肾两肾各一块，包括皮质、髓质和肾盂。右肾一块切成正方形，左肾一块切成长 (7)膀胱一块。 (8)肾上腺左、右各取一块。 (9)消化道食管一块，胃窦部一块，小肠一块，淋巴结一块，直肠一块。 (10)骨脊椎骨一块。 (11)胸腺一块。 (12)子宫宫颈和宫体数块。 (13)睾丸或卵巢各一块。 (14)脑左侧运动区一块，左侧豆状核一块，小脑一块。 (15)脑下垂体一块，前叶或包括前后叶。 如有较严重或复杂病变时应适当增加取材数量，以便彻底检查而作出正确诊断。 三、活检标本的取材 (一)常规活检标本的取材 应注意病变的部位、形状、大小、颜色以及与周围组织的界限，有无完整的包膜。取材时应取病变部位、病变的切缘、病变与正常组织交界处以及远离病灶的正常组织。取材用的刀剪
做好免疫组化染色必须注意的问题
做好免疫组化染色必须注意的问题 一、为达到免疫组织化学技术的要求，组织固定越新鲜越好。 在免疫组化最后结果的判断时，常可见到均匀一片的似非特异性染色的现象，经多方研究认为，它是一种假性非特异性的染色。因为肿瘤组织中含有的抗原较易发生扩散弥散，肿瘤细胞无限制的生长和生长过速，导致肿瘤中间部分组织血液供给困难，造成缺血坏死，坏死细胞中的抗原由于机体的作用，可以被均匀地散布于细胞与细胞间的间质，这是抗原发生弥散的一种方式。另一种抗原弥散的方式就是，由于组织没有及时的固定所引起的。离体的组织不及时固定，组织就会自溶，抗原就会扩散，这是一非常普通的常识，但要做好却是极不容易。标本从外科切除到浸入固定液需要经过一段时间，在这段时间里，有的抗原就可以发生扩散。虽然已浸入了固定液，但标本较大，固定液的量又不足，当然由于固定液的渗透需要时间，当渗入到组织之中时，中间的细胞已发生了变化，抗原也随着发生扩散，这种现象在产酶多的器官是比较明显的，如胃癌，当切除后标本较大，虽然在手术室期间已放入了固定液，但固定液要透过肌层达到胃粘膜面起码需要几个小时的时间，当固定液发挥作用时，组织已经发生变化。因此，这了达到免疫组织化学染色的要求，对于离体的组织尽量快的进行固定，有条件的应将其剖开，早取材，早固定。 二、组织脱水必须彻底干净 组织块取材不能太大过厚，才能较好地完成脱水的过程。如果取材太厚，在较短的时间内脱水不完全，将可引起一系列的问题，比如浸蜡不彻底，切片不好完成，切不完整。由于先天不足，导致后来切片染色的脱落，造成染色的失败，或者由此反复操作，造成年人力物力的浪费，造成病理报告的延期发出等。因此，对取材的要求是除了要求要有艺术性外，即平整、外观好看，还要求适中。 三、切片必须完整、均匀、平展、无邹折 应用于免疫组织化学染色的切片，对切片的质量要求较高，切片必须完整，平展、无汽泡，无邹折，这样有利在染色时的冲洗，有利于切片的牢固附贴。如果切片不平展，免疫组化染色后，可出现染色不均匀的现象，颜色深浅不一，不平。如果切片有汽泡切片在烘烤时，由于汽泡的破裂影响了汽泡周围的组织，在其周围可观察到深浅不一的染色。如果切片有邹折，免疫组化染色后，在邹折的地方有深浅不一的颜色，这是一种假阳性，容易引走混淆。 四、切片的附贴必须牢固，必须使用合适的粘贴剂。 免疫组织化学染色前的前期准备工作，就是必须对新的载玻片进行处理，新的载玻片表面看起来很干净，有人认为不需要进行任何的处理，都能够适合使用，这是一种错误的想法。新出厂的载玻片，表面复盖着开一层油脂样的物质，如果不加以处理，对切片的附贴是极为不利的。我们的做法是：新的载玻片，放于玻璃清洗液中浸泡4小时甚至过夜，然后取出，经自来水彻底冲洗后，浸入酒精中达2小时以上，取出擦干备用或烘干也可。然后再将载玻片浸入了－氨基－三乙氧基－硅烷（3－Aminopropyl triethoxy-silane）的稀释液（1：50用丙酮或无水乙醇稀释都可以）中硅化10分钟，后经无水乙醇洗2次，烘干即可使用。 五、切片必须烘烤附贴牢固，既要经得起抗原修复时高温的作用而不使轻易脱片，又不至于破坏抗原。 应用于免疫组化染色的切片。由于整个过程需经几个阶段的处理，如抗原修复时抗原修复液的沸腾且需持续十几分钟，PBS的反复冲洗，有的甚至于4℃冰箱中孵育达十几小时。因此，
免疫组化原理、步骤及要注意的事项
免疫组化 一，免疫组织化学简介 免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应炕原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。 二，免疫组化技术的基本原理 免疫组化技术是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解疾病的发病机理和病理过程。 免疫酶组化技术是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，根据酶标记的部位可将其分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等，用于标记的抗体可以是用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性单克隆抗体，最好是特异性强的高效价的单克隆抗体。直接法是将酶直接标记在第一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。目前通常选用免疫酶组化间接染色法。 三，免疫组化步骤 1，切片，烤片60℃，1h； 2，脱蜡及复水 二甲苯10min，100％乙醇5min，95％乙醇5min，90％乙醇5min，85％乙醇5min，80％乙醇5min， 75％乙醇5min，60％乙醇5min，50％乙醇5min，30％乙醇5min，自来水1min，双氧水1min； 3，1份30％H2O2加10份蒸馏水，室温10min，蒸馏水洗3次，每次3min； 4，微波修复 将切片浸入0.01M枸橼酸缓冲液，微波中最大火力（98℃-100℃）加热至沸腾，冷却（约5-10min），反复两次； 5，将切片自然冷却至室温，PBS洗涤3次，每次5min；
免疫组化常见问题
免疫组化常见问题与回答集锦 一、石蜡切片和冰冻切片的比较？ 1.要求做冰冻切片的不一定能做石蜡切片，这是我向一老师请教得出的结论。因为作石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，如果组织的抗原性较稳定，则可作石蜡切片；但是要求做石蜡切片的，可作冰冻切片。 2.冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这一步。缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散；切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮。当你买一抗时，目录上都写着做什么样的切片，如果它写着只能做冰冻，就不能做石蜡，如写着两者都可，那就都能做。 3.石蜡切片的优点是可以保持组织细胞的形态结构，且容易存放在室温，而冰冻切片比较麻烦，一定要存在 -80oC 的低温冰箱中，尤其是用来做原位杂交的切片，为了防止 RNA 降解，保存一贯很重要。由于石蜡切片可以切到 4 μm 左右，所以原位杂交探针容易渗透到组织中去，容易成功，而且得到的颜色/形态都较冰冻切片好。 二、一抗的选择要点和技巧是什么？ 1.单克隆和多克隆抗体的选择。由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。单克隆抗体能目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合，就像导弹精确地命中目标一样。另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色（可以通过封闭等避免）。 2.应用范围的选择。有的一抗只能用于 WB ( Western blotting）或免疫组化、免疫荧光、免疫沉淀等；甚至表明石蜡切片或冰冻切片。 3.种属反应性的选择。这一点很重要，表明这种抗体可能存在种属差异，且这种抗体适合检测哪种种属动物体内的抗原。 4.种属来源，一般兔来源的多是多克隆；而小鼠来源的多是单克隆，但也有另外。根据此来源来选择相应的二抗。 5.生产厂家的选择。如 santa Cruz 公司抗体一般 1 ml，价格 2100 元左右； 而 chemicon 公司一抗一般 100 μl，价格 2800 元左右。这两个厂家的同一种抗体，它的实际效价稳定是不同的，我一般用后者抗体做免疫组化效果较好，而前者做 WB 效果还可以。
免疫组化实验步骤
免疫组化实验步骤 Revised final draft November 26, 2020
石蜡切片免疫组化实验步骤 石蜡切片步骤按照晓峰整理的步骤进行（From徐晓峰、朱老师的“石蜡切片”方案）： 1）材料的准备 在本实验室条件下推荐使用FAA（50%ethanol,5%aceticacid,3.7%甲醛）固定材料。 FAA固定液（100ml），室温保存： 无水乙醇50ml 冰醋酸5ml 37%甲醛10ml 水35ml 第一天：组织固定 用FAA固定，详见“石蜡切片”protocol。 第二天：脱水 以上所有步骤中每换好一步乙醇均置于4℃冰箱等待，并不时轻摇。 *组织可在70%ethanol4℃可存放几个月 第三天：进一步脱水和浸蜡 以下所有步骤在4℃进行并不时轻摇
以下所有步骤在室温进行并不时轻摇 准备工作：60℃预热plus蜡片（ParaplastPlus）石蜡可反复融凝而去气泡 第四天：浸蜡2 将材料置于42℃直至蜡块完全熔化。再加1/4体积的蜡块至完全熔化后移至60℃。几个小时后换上新鲜熔好的蜡液，过夜。 第五天：浸蜡3 换蜡两次（ParaplastPlus） 第六天：浸蜡4 换蜡两次（ParaplastPlus） 第七天：浸蜡5 换蜡两次（ParaplastPlus） 准备工作：60℃预热Regular蜡片（ParaplastRegular）
第八天：包埋（包埋块可长久保存） 第九天及之后： 开始切片，切片应包括自己的片子及正负对照等。事先打开烘片机至37度，在涂有多聚赖氨酸的玻片上加1~2ml的蒸馏水。切好的片子轻至于加水的玻片上。待所有片子准备完之后盖上盖子，烘片过夜。 用自来水及双蒸水清洗免疫组化专用塑料，放在烘箱烘干待用。 第二天：开始脱蜡（From徐晓峰、朱老师整理的“石蜡切片”protocol） （用新买来的免疫组化塑料小盒，每一步只需加入试剂220~250毫升） 抗原修复： 在切片还浸入酒精时，可以事先将煮锅清洗干净，用蒸馏水洗1~2遍，最后加入0.01M柠檬酸钠缓冲液(PH=6.0)，煮沸(保持在95度左右)，将过完PBS的片子让入煮沸的锅中，煮片10~15min。然后将电磁炉关闭，自然冷却锅中切片（千万不要把片子拿出来，放在缓冲液中一起自然冷却至室温！！！） 将片子浸入PBS（PH=7.4）5min。
免疫组化染色操作步骤
免疫组织化学染色原理和操作步骤 一、免疫组织化学原理 免疫组织化学（IHC）又称免疫细胞化学，是根据抗原—抗体特异性结合的原理，应用带有可见标记的特异性抗体作为探针，检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。免疫组化技术主要有直接法和间接法：直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分；间接法则先后加入一抗和二抗，形成抗原—一抗—二抗复合体以达到检测该抗原的目的，该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。间接法常用的有过氧化物酶—抗过氧化物酶（PAP）法、亲和素—生物素—过氧化物酶（ABC）法和链霉亲和素—过氧化物酶（SP）法。 PAP法一抗和二抗均不标记，避免了标记过程对抗体活性的影响，但需要制备过氧化物酶的抗体，与适量过氧化物酶混合形成PAP复合物（含3个酶分子和2个抗体分子），染色时依次加入一抗、二抗、PAP 复合物孵育标本，最后用H2O2和二氨基联苯（DAB）为底物显示过氧化物酶，即可检测标本中的抗原成分。 生物素为含硫的杂环单羧酸，可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合，从而标记抗体和酶。亲合素又称抗生物素蛋白，与生物素有很高的亲合力，1分子亲合素可结合4分子生物素，ABC法即在此基础上建立。ABC法与PAP法相似，一抗不标记，二抗用生物素标记，染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC复合物，并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。在标本孵育过一抗和二抗后，再加入ABC复合物使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB 进行显色。ABC法的敏感性较PAP法更高。
图1. 免疫组织化学基本原理示意图（引自八年制《组织学与胚胎学》） SP 法与ABC 法相似，其不同于ABC 法之处在于用 生物学特性与亲和素相似的链亲和素标记过氧化物酶。 在标本孵育过一抗和二抗后，加入链亲和素标记的过氧 化物酶使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB 进行 显色。与亲和素相比，链酶亲和素的结合力与亲和素相 似而非特异性结合较亲和素低。SP 法简化了操作步骤， 同时也减少了非特异性背景，是目前应用最为广泛的免 疫绥化染色技术。 二、实验准备： 1. 标本准备 ①石蜡包埋组织切片：由病理室常规处理 ②冰冻组织切片：由病理室常规处理 ③细胞爬片：将无菌盖玻片置于六孔板中，接种细胞，待细胞生长达到60％以上后取出玻片，4%多聚甲醛固定2 h 。 2. 试剂准备 ①抗体选择 单克隆抗体针对单一表位，具有较高的特异性，但在该表位破坏后将得不到阳性结果；多克隆抗体表位针对多个表位， 可避免单克隆抗体图2. SP 法原理示意图