苏云金芽孢杆菌的分离及鉴定

苏云金芽孢杆菌的分离及鉴定

09级园林工程系生物技术及应用班级

(制作人—王珏指导教师—韩磊)

内容提要

本论文描述了苏云金芽孢杆菌的选择性培养、分离以及鉴定的过程,从而熟悉了灭菌、接种等无菌操作技术，掌握了鉴定菌种的不同方法以及了解到了苏云金芽孢杆菌在生产上的应用和发展前景前景。

关键词

苏云金芽孢杆菌;选择性培养;生化鉴定；明胶酶；明胶的液化；精氨酸脱羧酶；尿素酶1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1玻璃器皿

烧杯；三角瓶；量筒；玻璃棒；培养皿；试管；移液管；涂布棒；酒精灯；胶头滴管等

1.1.2实验仪器

超净工作台；光照培养箱；水浴锅；摇床；电子天平等

1.1.3其他用具

研钵；纱布；吸耳球；八层纱布；剪刀；棉塞；pH试纸；胶头滴管；牛皮纸；麻线；喷壶等

1.1.4实验材料

土壤表层土样；叶片；苏云金芽孢杆菌菌粉

1.2方法与步骤

1.2.1选择性培养及扩大培养

1.2.1.1灭菌前准备

1)PBA培养基的制备

PBA培养基配方（1L）

配置750mL的PBA搖瓶培养基后分装于三个大三角瓶内，随后用棉塞及牛皮纸封口包扎；以备灭菌（121℃,20min）。

注（制备的培养基中有500mL中不含有醋酸钠）

2）灭菌器材的准备

将需要灭菌的三角瓶、纱布、搁置架分别包扎后同培养基利用手提式高压灭菌器进行灭菌（121℃,20min）。

1.2.1.2灭菌

1、注水：往灭菌锅内注入适量的蒸馏水；

2、预热：放入需灭菌的器材和培养基之前先预热十分钟；

3、加热升温过程：将需要灭菌器的材放入灭菌锅内→盖

好灭菌锅的顶盖→打开放气阀→接通电源进行升温、升压→

待到有大量热气从放气阀冒出时关掉放气阀；此后是升压的

过程；

4、升压、降压过程：开始升温后压强随之升高，待到压

强为0.05mpa时关掉电源；此后为降压过程，当压强降到

0mpa时打开放气阀放气。放完气后关掉放气阀接通电源，再

次升温、降温后打开放气阀放气，放完气之后关掉放气阀接

通电源；此后为升压保压的过程；

5、升压保压过程：当压强从0mpa升到1.1mpa时开始计时；当压强升到1.13mpa时关掉电源，待压强降到约1.1mpa时再接通电源；再次升压至1.13mpa时关掉电源开始降压，当降到1.1mpa时再接通电源然后开始升压。重复上一步操作，使此过程保持20分钟。此后为降压出锅过程；

6、降压出锅过程：保压20分钟后关掉电源等待降压至0mpa时打开放气阀放气；用抹布打开灭菌锅的锅盖，然后将灭完菌的器具和培养基取出；

1.2.1.3样品的预处理

三个小组分别取土壤表层土样和植物叶片共5份→土壤研磨、叶片剪碎→每份样品称取5g→溶于适量的自来水中→摇匀→置于75℃的水浴锅中保温10min→静置

1.2.1.4超净工作台的准备

接通电源后打开紫外灯，30分钟后关掉紫外灯打开风机约20分钟；然后用肥皂洗手后进行无菌操作。

1.2.1.5无菌操作

1）培养基的完善及分装（对照试验）

分装到无菌的小三角瓶内。

注（待无菌的培养基稍冷后进行操作；在无菌操作前要对超净工作台的台面和手用75%酒精进行表面灭菌。）2）接种

各组将适量的样液过滤液过滤到搖瓶培养基内，然后在搖瓶外壁上标明样品名称、接种时间及小组序号；最后将所有的搖瓶包扎好进行培养。

1.2.1.6培养

在所有搖瓶的外壁上标明样品名称、接种时间及小组

号，随后将搖瓶置于200r、min的摇床上进行培养。培养

24h后下摇床并置于冰箱内保存，等待菌种分离

1.2.2菌种分离及纯化

1.2.2.1灭菌前准备

1)BP培养基的制备

BP培养基配方（1L）

配置900mL的BP固体培养基后分装于三个大三角瓶内，随后用棉塞及牛皮纸封口包扎；以备灭菌（121℃,20min）。

注（制备的培养基中有600mL不含氯化钠）

2）灭菌器材的准备

将需要灭菌的培养皿、涂布棒、移液管、纱布、搁置架分别包扎后同培养基利用手提式高压灭菌器进行灭菌（121℃,20min）。

1.2.2.2灭菌

准备就绪后利用手提式灭菌锅进行灭菌（121℃,20min）。

1.2.2.3超净工作台的准备

接通电源后打开紫外灯，30分钟后关掉紫外灯打开风机约20分钟；然后用肥皂洗手后进行无菌操作。

1.2.2.4无菌操作

1）培养基的完善及分装（对照试验）

倾注到无菌的培养皿内。

注（待无菌的培养基稍冷后进行操作；在无菌操作前要对超净工作台的台面和手用75%酒精进行表面灭菌。）

2）涂布接种

平板培养基的凝固→用无菌的移液管从搖瓶内吸取

1-2mL的菌液→涂布平板

1.2.2.5培养

在所有平板的外壁上标明样品名称、接种时间及小

组号，随后将搖瓶置于30℃的光照培养基内进行培养，

三天后观察并记录结果。

1.2.2.6菌种的分离及纯化

观察菌种在不同平板培养基中的长势并对其进行分

析，然后挑选出长势较好的平板菌种进行纯化，对个别菌种进行分离。

1）BP固体培养基的制备

制备400mL的BP固体培养基→分装出十三只试管（每管大约10mL培养基，用于菌种分离）→将所剩的培养基装于三角瓶内→分别对试管、三角瓶封口并包扎→灭菌（121℃,20min）

2）灭菌器才的准备

将实验所需的搁置架、纱布、培养皿接种环进行分别包扎后用手提式灭菌器进行灭菌（121℃,20min）。

3）无菌操作（即：菌种的分离及纯化）

超净工作台准备就绪后事先将灭菌的培养基倒平板，然后在酒精灯火焰附近将长势较好的平板菌种进行纯化；纯化后再将挑选出的个别单菌落进行分离。

4）培养

将纯化的平板菌种和分离出的试管菌种置于36℃的光照培养箱内进行培养。

1.2.3菌种的鉴定

由于第一次进行分离时菌种长势不好所以利用的是补救实验中再次分离出的四种不同的菌种以及从菌粉中分离出的六个菌种进行了鉴定。

1.2.3.1菌种的分离

1）BP固体培养基的制备

制备500mL的BP固体培养基后用棉塞、牛皮纸、麻线对试管进行封口、包扎，等待灭菌（121℃,20min）。

2）灭菌器才的准备

将实验所需的搁置架、纱布、培养皿、接种环进行分别包扎后进行灭菌（121℃,20min）。

3）灭菌

准备就绪后利用手提式灭菌器进行灭菌（121℃,20min）。

4）菌种的分离

超净工作台准备就绪后在酒精灯火焰附近将挑选出的四种平板菌种分离到试管斜面上。

5）培养

标记好分离菌种的形态及代号后将菌种置于36℃的光照培养箱内进行培养，三天后观察结果。

另外从购买的苏云金芽孢杆菌纯菌粉中分离出菌种

1）BP固体培养基的制备

制备500mL的BP固体培养基后事先分装出200mL试管培养基；随后将剩余的培养基置于大三角瓶内，随后用棉塞、牛皮纸、麻线对试管和三角瓶进行封口、包扎，等待灭菌（121℃,20min）。

2）无菌水的制备

分别向五个小三角瓶内加放10mL、9mL、9 mL 、9 mL 、9 mL 的蒸馏水；随后用棉塞和牛皮纸进行包扎，以备灭菌（121℃,20min）。

3）其他灭菌器才的准备

将实验所需的搁置架、纱布、培养皿、接种环、涂布棒进行分别包扎后进行灭菌（121℃,20min）。

4）灭菌

准备就绪后利用手提式灭菌器进行灭菌（121℃,20min）。

5）菌种的分离

超净工作台准备就绪后在酒精灯火焰附近进行无菌操作。操作流程如下：

倒平板→平板培养基的凝固→菌悬液的制备（称取0.0001g菌粉溶于10mL的无菌水中）→摇匀→菌悬液的梯度稀释（利用其他四瓶无菌水完成负一至负四梯度的稀释，）→摇匀稀释液→徒步接种（每梯度的稀释液重复两个平板）→培养→适时转接试管斜面→培养

注（每次在用移液管和涂布棒的前后务在酒精灯火焰处进行灭菌，且在其温度降下后再使用为的是其避免烫死菌体）

1.2.3.2菌种的鉴定

一、明胶液化实验

1)实验原理：

有些细菌能产生分泌于细胞外的明胶酶（即：类蛋白水解酶）。明胶酶能将明胶水解为多肽，进一步水解为氨基酸，使得明胶失去凝胶性质而液化。

又明胶在20℃的温度下开始液化且培养温度却高于20℃，所以让培养后的平板和试管菌种经过低温处理或者利用倾注酸性升汞法来验证该菌是否产生明胶酶即：是否为阳性，从而排除温度对明胶液化的因素。

2）操作步骤：

明胶培养基配方（1L）

按照培养基配方配置1400固体培养基

↓

分装试管（800mL）

（每支斜面培养基高度约为试管的1/2）

↓

灭菌器才的封口及包扎

↓

灭菌（121℃,20min）

↓

超净工作台的准备及表面消毒

↓

平板培养基的分装及冷凝

↓

穿刺接种及点植

（对4-10号菌种进行穿刺及点植）

↓

标记

↓

培养

（将平板、试管菌种置于36℃的光照培养箱昂内进行培养，三天后观察结果）

3）鉴定过程

挑选出每种菌体经点植后长势较好的平板菌种→40ml酸性升汞的配置→滴加升汞→静置→与没有滴加升汞的菌种进行对比，观察现象。

滴加升汞的过程

按照上述配方配置500mL的培养基

↓

倒平板

↓

培养基的凝固

↓

滴加升汞

↓

静置

↓

与空白最对照，观察现象

二、精氨酸脱羧酶试验

1）实验原理：

有的菌体能产生脱羧酶，令氨基酸发生脱羧反应生成胺和二氧化碳，从而使得培养基的PH发生变化。利用该原理使分离出的菌落在加放精氨酸的培养基上进行生长，让溴甲酚紫作指示剂，来验证菌体的特性。

补充：溴甲酚紫显色原理

其变色范围为pH（5.2-6.8）；当pH为5.2时显黄色，当pH为6.8时显紫红色。

2）方法与步骤

（1）培养基的制备

精氨酸培养基配方

制备500mL的精氨酸液体培养基（不含DL-精氨酸）后分装至31个试管内，随后往21个试管内滴加适量的石蜡封口；最后用牛皮纸和麻线对试管进行封口、包扎，等待灭菌（121℃,20min）。

注（因DL-精氨酸不能高温加热，所以在培养基灭菌之后再向各个管中滴加DL-精氨酸；）

（2）灭菌器才的准备

将实验所需的搁置架、纱布、培养皿、接种针、镊子、棉花以及盛有20mL蒸馏水的三角瓶进行分别包扎后进行灭菌（121℃,20min）。

（3）灭菌

准备就绪后利用手提式灭菌器进行灭菌（121℃,20min）。

（4）培养基的完善

称取0.5g精氨酸→溶于无菌水中→摇匀→置于无菌的培养皿内→无菌针头内无菌棉的加放→药品的吸取→加放精氨酸（每支管加放0.4mL）→摇匀培养基→接种（每个菌种取三次样分别置于两个滴加精氨酸的培养内和一个不加精氨酸的培养基内）→摇匀→标记→培养→观察管内变化

注（在使用接种针的前后都要对其进行灼烧即：灭菌，且灭菌之后必须将其降温再使用，避免烫死菌落）

对照试验

接种之前事先留出一只不加精氨酸和一只加放精氨酸的培养基，随后不加放菌落随同接种的菌管进行培养。

（5）培养

标记好分离菌种的代码后将菌种置于36℃的光照培养箱内进行培养，三天后观察结果并得出结论。

保种

菌种进行保存；转接前剔去不知菌种来源以及不能

再使用的试管菌种。操作过程：

200mLBP培养基的制备→分装试管→接种环

及灭菌器材的包扎→灭菌（121℃，20min）→超净

工作台的准备→转接→培养（将菌种置于36℃的

光照培养箱内进行培养）

三、尿素酶试验

1）实验原理：

有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解成二分子的氨，使得培养基呈碱性；再利用酚红作为指示剂，来鉴定菌种的阴阳性，即：当培养基呈粉红色时证明菌种为阳性。

又尿素酶不是诱导酶，即无论底物是否有尿素的存在，细菌均能产生尿素酶；所以在培养菌体前后加放尿素都不会影响试验结果。

补充：酚红的显色原理

酚红的显示为范围为5.8-6.4。当PH为5.8时为酸性呈黄色，当PH为6.4时为碱呈粉红色。

2）方法步骤

尿素酶培养基配方

按照培养基配方配置500mL的平板培养基

↓

培养皿、接种器具及其他灭菌器材的包扎

↓

灭菌（121℃，20min）

↓

超净工作台的准备

↓

倒平板及培养基的冷凝

↓

三点式点植

（每菌种重复两个平板）

↓

标明菌种代码及接种日期

↓

培养

（将平板菌种置于试验台上进行培养，三天后观察结果并鉴定）

3）鉴定过程

配置300mL，20%的尿素→挑选出每个菌种的平板平放于试验台面上→均匀的往每个平板内加放尿素→静置30min→观察结果，得出结论

平放

↓

滴加尿素

↓

静置

2实验结果及讨论

2.1试验结果

2.1.1菌种的分离

1）从搖瓶中分离的菌种长势：

菌种在加放醋酸钠的BP平板培养基中生长状况明显比加放青霉素和庆大霉素的平板好，菌体长满整个平板且没有沾染杂菌。

平板菌种的形态

在加放醋酸钠的平板内又由于样品不同菌种的长势也显然不同。从土壤中提取的菌数要比从叶片上提取的多。

2）平板培养菌种时出现的其他现象：

少数培养基表面颜色不一；有一个平板沾染了真菌。

菌体在分离平板内的长势长有杂菌的平板

2.1.2菌种的纯化

纯化后的菌种长势较好且平板内没有沾染杂菌，只是平板内非划线的部位也长有菌体。

纯化后的平板

2.1.3菌种的鉴定

1）菌种的分离

从补救实验的补救实验中和菌粉中分离出的共10种菌种的代码及形态如下表所示。

注：（6号菌种是从加放青霉素的BP平板中分离出的特定菌种。前1-6号共4个菌种是从补救实验中分离出的菌体；而7、8、9、10四种菌体则是从菌粉中分离出来的。

从补救实验中分离出的菌体在平板内的长势不好，平板内有数条蠕动的蛆；且部分平板沾染里杂菌；只有一个平板内长有少数菌体。

分离得到的菌落

生有蛆的平板

从菌粉中分离出的菌体在梯度平板内长势不好，出现了以下情况：只在负二梯度的培养基上长有少许菌落；在其他平板上没有菌体生长；有一个平板上长有杂菌-放线菌；还有一个平板培养基浑浊。

从菌粉中长势较好的三个平板

异常的蛋黄平板

随后分离出的试管菌种没有出现异常现象；培养出的1-6号试管菌种表面水分较多、干裂，7-10号菌种表面则没有上述现象。

2）生化实验一

明胶液化实验

菌种经过穿刺接种后在试管内生长的现象为：2号菌管（三只菌管中有一只管的底部培养基中出现了气泡；其他两管没有异常现象）4号菌管（三只菌管中有两只管内菌体表面有水分且第三只没长菌；长菌的菌管内有两种形态的菌体）5号菌管（三只试管菌种的菌体表面有水分；其中两只菌管内斜面体与高层之间出现朱砂色的朱砂环；这位三只试管内也长有两种不同的菌体）六管（三只菌管内菌体表面有水分；其中有一只管出现了朱砂圈）

出现朱砂环及2号菌管中的气泡

点植到平板培养基内的菌种长势：2号平板（三个平板菌种长势很好，三点式菌落且没有沾染任何杂菌；其中在平板壁的外围也长有一圈菌落）4号平板（三个平板内出现了多个菌落，没有沾染杂菌）5号平板（三个平板中有一个平板内在点植的位置没有长菌但在其他位置长有一个单菌落；第二个平板内在点植位置长有三个菌落且菌体形态有两种；第三个板内没有出现异常现象）六号平板（三个平板中有一个平板沾染了霉菌；其他两个平板内生长了多个菌落）

生长正常的平板

经点植后四号平板内菌体的形态

长有霉菌的平板

滴加升汞后平板内出现的现象为：2号平板（培养基变为亮白色，菌体周围无明显变化）4号平板（培养基变为亮白色，菌体周围有明显的透明圈）5号平板（培养基变为亮白色，菌体四周有较大的透明圈）六号平板（整个平板变为透明色，明胶酶吸取了大部分的明胶）

四号及六号平板内出现的透明圈

结论：

有晕圈的出现从而说明菌种产生了能使明胶液化的明胶酶，因此证明了1-6号菌种皆为明胶阳性。

4）保种

经过筛选保留了11个菌种，并对2号和3号菌种进行了转接、保存。

5）生化实验二

精氨酸脱羧酶试验

培养三天的试管里只有6号管培养基呈黄色，其他无明显变化仍然呈紫红色。

阴阳性菌管的对比

试管内培养基颜色的变化

结论：

根据溴甲酚紫的显色范围可知，当PH为5.2时呈黄色、PH为6.8时呈紫红色得知六号管菌管培养基的PH值已大于6.8；因此六号菌种产生了精氨酸脱羧酶，为阳性。

再次加放菌落培养后三号、四号菌管虽有颜色的变化，但由于三号、四号菌管在培养前后加放的菌种不一致所以试验结果作废。其他菌管没有明显变化。

作废的三号机四号菌管

结论：

再次接种培养后唯一变色的两个菌种因为前后培养的菌种不同，因此无法证明任何一个菌种的阴阳性。

6）生化实验三

尿素酶试验

1号、4号和7号平板沾染了杂菌，其他平板菌种生长良好。

生长正常的平板

长有霉菌的平板

滴加尿素后平板内的变化如图所示：

滴加尿素后平板内的变化

苏云金芽孢杆菌

本文对农业上研究最多、用量最大的两类微生物杀虫剂苏云金芽孢杆菌 （Bacillus thuringiensis, Bt）和昆虫杆状病毒（baculovirus）进行了综述，分别论述了它们的杀虫优势、杀虫的分子机理、目前的研究状况，并对它们的基因工程技术改良路线以及在农业上的应用，提出了一些建议。 由病虫害引起的农作物的减产减收已成为制约农业生产进一步发展的限制因素，全球每年农作物因虫害造成的损失约占总产量的13％，而目前对农作物害虫的防治主要依赖于化学农药。完全依赖化学杀虫剂存在许多弊端，其中最主要的问题是，一种化学物质的广泛使用会使害虫的后代产生选择性进化优势，从而对该化学物质产生抗性。例如，世界各地的家蝇品系对杀灭它们的每种杀虫剂都产生了抗性。第二个问题是，有的杀虫剂影响非靶目标品种，产生灾难性后果，某些益虫被无意中消灭，导致其次要害虫急剧增长。第三问题是在于环境的耐受性和许多杀虫剂的毒性，不仅造成了严重的环境污染，而且给人类的健康带来巨大的威胁。上述不利因素促使人们急欲寻求控制害虫的替代方案。 在对农业害虫进行的长期防治实践中，人们逐渐认识到必须采取综合治理的措施，才能有效的控制害虫的危害。基因工程技术的发展，为防治农林害虫提供了一种有效、减污的新技术手段，微生物农药也因此在世界范围内受到广泛重视。微生物农药是指非化学合成、具有杀虫防病作用的微生物制剂，如微生物杀虫剂、杀菌剂、农用抗生素，等等。这一类微生物包括杀虫防病的细菌、真菌和病毒。 杀虫微生物是指其代谢产物或微生物本身对宿主昆虫有致死效应或致病的微生物类群，通常也称为昆虫病原微生物。目前已知的杀虫防病微生物主要有芽孢杆菌科、假单胞菌科、肠杆菌科、链球菌科和杆状病毒科等类群。尽管不同杀虫微生物引起昆虫致病的症状不尽相同，但杀虫微生物对害虫的作用方式主要是通过产生特异性的杀虫毒素来破坏害虫的代谢平衡，或者是通过营养体在虫体内的繁殖复制而引起昆虫死亡和发生流行病。 除了这一独特的杀虫机制外，微生物杀虫剂还具有以下一些特点：对人畜安全无毒，不污染环境；杀虫作用具有一定特异性和选择性，不会使天敌和非目标昆虫致死；易于和其他生物学手段结合进行害虫综合治理，维持生态平衡；由于杀虫活性蛋白的多样性，昆虫产生抗性较缓慢或不易产生抗性；可以通过发酵法生产，具有较低的生产成本；可以通过基因工程技术途径筛选或构建优良性能的菌株来满足生产与应用所需等。所以微生物杀虫剂自问世以来发展很快，据报道，全世界已商品化的微生物农药约30种，微生物杀虫剂占其中的90％。 苏云金芽孢杆菌 杀虫微生物中研究最多，用量最大的是苏云金芽孢杆菌。苏云金芽孢杆菌从上世纪20年代起就用于害虫的防治，它的生物学特性决定了它的微生物杀虫剂功能。 苏云金芽孢杆菌菌株在生长代谢过程中会形成芽胞，在芽胞形成过程中产生一个芽胞及一个或多个较大的蛋白质性质的晶体内含体。这种蛋白质性质的晶体被敏感昆虫摄食后会导致昆虫死亡，蛋白质晶体含有不具活性的原毒素分子——δ－内毒素，当昆虫幼虫吞食了这种内毒素，晶体就会被幼虫的碱性肠液溶解，随后被肠道蛋白酶降解，形成有活性的蛋白质毒素，最终导致昆虫死亡。苏云金芽孢杆菌菌株在营养体生长旺盛期，某些菌株还会产生一些其它的外毒素，如α－外毒素、β－外毒素、γ－外毒素，等等。除上述毒素外，近年来从

苏云金芽孢杆菌的分离及鉴定

苏云金芽孢杆菌的分离及鉴定 09级园林工程系生物技术及应用班级 (制作人—王珏指导教师—韩磊) 内容提要 本论文描述了苏云金芽孢杆菌的选择性培养、分离以及鉴定的过程,从而熟悉了灭菌、接种等无菌操作技术，掌握了鉴定菌种的不同方法以及了解到了苏云金芽孢杆菌在生产上的应用和发展前景前景。 关键词 苏云金芽孢杆菌;选择性培养;生化鉴定；明胶酶；明胶的液化；精氨酸脱羧酶；尿素酶1材料与方法 1.1实验材料 1.1.1玻璃器皿 烧杯；三角瓶；量筒；玻璃棒；培养皿；试管；移液管；涂布棒；酒精灯；胶头滴管等 1.1.2实验仪器 超净工作台；光照培养箱；水浴锅；摇床；电子天平等 1.1.3其他用具 研钵；纱布；吸耳球；八层纱布；剪刀；棉塞；pH试纸；胶头滴管；牛皮纸；麻线；喷壶等 1.1.4实验材料 土壤表层土样；叶片；苏云金芽孢杆菌菌粉 1.2方法与步骤 1.2.1选择性培养及扩大培养 1.2.1.1灭菌前准备 1)PBA培养基的制备 PBA培养基配方（1L） 配置750mL的PBA搖瓶培养基后分装于三个大三角瓶内，随后用棉塞及牛皮纸封口包扎；以备灭菌（121℃,20min）。

注（制备的培养基中有500mL中不含有醋酸钠） 2）灭菌器材的准备 将需要灭菌的三角瓶、纱布、搁置架分别包扎后同培养基利用手提式高压灭菌器进行灭菌（121℃,20min）。 1.2.1.2灭菌 1、注水：往灭菌锅内注入适量的蒸馏水； 2、预热：放入需灭菌的器材和培养基之前先预热十分钟； 3、加热升温过程：将需要灭菌器的材放入灭菌锅内→盖 好灭菌锅的顶盖→打开放气阀→接通电源进行升温、升压→ 待到有大量热气从放气阀冒出时关掉放气阀；此后是升压的 过程； 4、升压、降压过程：开始升温后压强随之升高，待到压 强为0.05mpa时关掉电源；此后为降压过程，当压强降到 0mpa时打开放气阀放气。放完气后关掉放气阀接通电源，再 次升温、降温后打开放气阀放气，放完气之后关掉放气阀接 通电源；此后为升压保压的过程； 5、升压保压过程：当压强从0mpa升到1.1mpa时开始计时；当压强升到1.13mpa时关掉电源，待压强降到约1.1mpa时再接通电源；再次升压至1.13mpa时关掉电源开始降压，当降到1.1mpa时再接通电源然后开始升压。重复上一步操作，使此过程保持20分钟。此后为降压出锅过程； 6、降压出锅过程：保压20分钟后关掉电源等待降压至0mpa时打开放气阀放气；用抹布打开灭菌锅的锅盖，然后将灭完菌的器具和培养基取出； 1.2.1.3样品的预处理 三个小组分别取土壤表层土样和植物叶片共5份→土壤研磨、叶片剪碎→每份样品称取5g→溶于适量的自来水中→摇匀→置于75℃的水浴锅中保温10min→静置 1.2.1.4超净工作台的准备 接通电源后打开紫外灯，30分钟后关掉紫外灯打开风机约20分钟；然后用肥皂洗手后进行无菌操作。 1.2.1.5无菌操作 1）培养基的完善及分装（对照试验）

苏云金芽孢杆菌生物农药的制备伴胞晶体的分离纯化及杀虫活性

苏云金芽孢杆菌生物农药的制备伴胞晶体的分离纯化及杀虫活性 集团文件发布号：（9816-UATWW-MWUB-WUNN-INNUL-DQQTY-

JIUJIANG UNIVERSITY 实验论文 题目苏云金芽孢杆菌生物农药(Bt制剂)的制备、伴 孢晶体的分离纯化及杀虫活性 院系生命科学学院 专业生物技术 姓名樊晓乐、严学芬、王伟、 周明宣、邹红虹 班级 B0933 指导教师张炳火 二零一一年十一月

摘要：苏云金芽孢杆菌是目前世界上研究最多、产量最大、应用范围最广的微生物杀虫剂，具有专一性强、对人畜无害、防治效果好、易生物降解及无残毒等优点。本试验采用固体培养，对一株苏云金芽孢杆菌进行了发酵，制备了Bt制剂，对伴孢晶体进行了分离纯化，采用菜地试验，检测了Bt制剂和伴孢晶体对白菜虫害的防治效果。 关键词：苏云金芽孢杆菌（Bt）；伴孢晶体；杀虫活性 前言 苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）是一种革兰氏阳性细菌，其菌体为短杆状，生鞭毛，单生或形成短链。它在芽孢形成过程中产生称为δ-内毒素的杀虫伴胞晶体蛋白(控制合成这种蛋白质的基因在质粒上），这些蛋白具有很高的杀虫活性。Bt由于具有专一性强、对人畜无害、防治效果好、生物降解无残毒、所用原料简单等优点，在虫害防治中发挥着越来越重要的作用，随着对Bt研究的深入，Bt 的基因改造、毒理学研究、杀虫机理、对人类的安全性等方面的研究都对高纯度的Bt伴胞晶体提出了极大的需求。 因此，Bt伴胞晶体的分离纯化方法逐步得到了发展，如等密度梯度离心法、液体双相分离法、等电点沉淀法、离子交换分离法、碱裂解法、高速离心法和生物物理法等。 本实验采用2种液体培养基、2种培养条件对苏云金芽孢杆菌进行培养。镜检观察当90％以上的芽孢脱落时处理菌体，经碱液裂解后比较等电点沉淀和液体双相分层法提取Bt蛋白的收率和纯度。 1 材料与方法

苏云金芽孢杆菌基因组研究概况

基因组学与应用生物学，2009年，第28卷，第1期，第202－208页Genomics and Applied Biology,2009,Vol.28,No.1,202－208 专题介绍Review 苏云金芽孢杆菌基因组研究概况 谭寿湖1,3张文飞1,3叶大维2* 1广西大学生命科学与技术学院,南宁,530005;2南开大学生命科学院,天津,300071;3海南海德热带农业资源研究所,三亚,572025*通讯作者,yehtawei@https://www.wendangku.net/doc/355508740.html, 摘 要 迄今为止，全球已有2个Bt 株菌株完成了全基因组测序，1个Bt 菌株正在拼接中，15个Bt 菌株正在 进行测序中。已有22个Bt 质粒完成了全序列测定。Bt 是作为生物农药使用最广泛的微生物菌株，也是最为成功地将其杀虫晶体蛋白基因应用于植物转基因的微生物。在基因组进化、新基因发现、基因表达调控等方面一 直是科学家研究的热点，并取得了相当多的成果。本文概述了苏云金芽孢杆菌基因组测序现状、基因组特征及比较基因学等方面的研究进展。 关键词苏云金芽孢杆菌,Bt 基因组,质粒基因组,比较基因组 Summary of Research Progress in the Genomics of Bacillus thuringiensis Tan Shouhu 1,3 Zhang Wenfei 1,3Ye Dawei 2* 1College of Life and Technology Science,Guangxi University,Nanning,530005;2College of Life Sciences,Nankai University,Tianjin,300071;3Haide Institute of Tropical Agricultural Resources,Sanya,572025*Corresponding author,yehtawei@https://www.wendangku.net/doc/355508740.html, Abstract Presently,there are two Bt strains that have completed whole genomic sequencing,while one Bt strain is being assembled,and 15Bt strains are in progress.Furthermore,22Bt plasmids have completed sequencing.Bt is the most widely used microbial strains as a biological pesticide and also have the most successful application in genetically modified plant with the use of its insecticidal protein gene.Scientists have been looking at the genomic evolution,new gene discovery,gene expression and regulation with considerable achievements.This article pro-vides an overview on the latest research development of Bt genome sequencing,genome characteristics and com-parative genomics studies.Keywords Bacillus thuringiensis ,Bt Genome,Plasmid genome,Comparative genome 基金项目：本研究由国家863项目(2006AA022189)资助 随着基因组测序技术的快速发展，测序成本的降低，对任何生物的基因组进行测序变得现实和可能(Marguerat et al.,2008)。自1995年首次完成流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae )的全基因组序列以来，已有大量的微生物菌株基因组全序列测定完成。截止到2009年2月3日，全球已经完成基因组测序的微生物菌株有834株，有643株微生物菌株的基因组正处在拼接阶段，此外，有797株微生物菌株的基因组由于各种原因只完成了基因组草图。在已经完成测序的微生物中，有779株为真细菌，55株为古生菌(https://www.wendangku.net/doc/355508740.html,/genomes/lproks.cgi)。 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis ,简称Bt )在《伯杰氏系统细菌学手册》(第九版)中被列为第2类 第18群中的芽孢杆菌属。与蜡状芽孢杆菌(B.cereus )，炭疽芽孢杆菌(B.anthracis )同属于蜡状芽孢杆菌群细菌(Rasko et al.,2005)。 Bt 广泛存在于土壤、 虫尸、污水、淤泥、尘埃以及叶面等介质中，是一种广泛存在于自然界的革兰氏阳性细菌。苏云金芽孢杆菌也是一种典型的昆虫病 原菌，对鳞翅目(Lepidoptera )、 双翅目(Diptera )、鞘翅目(Coleoplera )、膜翅目(Hymenoptera )、同翅目(Ho － moptera )、 直翅目(Orthoplera )、食毛目(Mallophaga )等多种昆虫，以及线虫、 螨类和原生动物等具有特异的毒性活性，由此成为目前世界上研究最深入，应用最广泛的农业害虫生物防治细菌(Crickmore et al.,1998;喻子牛等,1996)。

苏云金芽孢杆菌作业

发酵工艺学作业 题目苏云金芽孢杆菌生物农药发酵工艺研究进展 学院 班级学号 姓名

苏云金芽孢杆菌生物农药发酵工艺研究进展 摘要：苏云金芽孢杆菌（Bt）是一种开发和利用较为成功的微生物生物农药，但也存在着生产成本高、发酵条件难控制等缺点。本文主要综述了Bt生物农药的发酵工艺研究进展，主要包括BT发酵中的培养基、温度、PH值、通氧量以及发酵时间等方面。并对Bt生物农药的发展前景作出了展望。 关键词：苏云金芽孢杆菌；生物农药；发酵工艺；展望 Review on fermentation of Bacillus thuringiensis Abstract:Bacillus thuringiensis (Bt) is a microbial pesticides,Which has been successful developed and used.The fermentation technology of Bacillus thuringiensis (Bt) in recent years were summarized, including raw material, temperature, pH value, oxygen, fermentation time.In this aricle,the development prospct of Bt microbial pesticides is also put forward. Key words: Bt;microbial pesticides; fermentation technology;forward 前言 生物农药又可称为绿色农药、生态农药，是20世纪70年代提出的，是指可以用来防治病、虫、草、鼠等有害生物及调节植物生长的生物体或源于生物体的各种生理活性物质。生物农药不仅具有常规农药的高活性，能大规模工业化生产，而且专一性强，一般不伤害虫的天敌和有益生物，对人畜无毒，不污染环境，可在田间大规模应用。 微生物生物农药是生物农药中的主要类型之一[1]。而在微生物生物农药方面又以苏云金芽孢杆菌（Bt）为目前产量最大，应用最为广泛的一类细菌杀虫剂[2,3]，占到生物农药的90%左右[4]。Bt的发酵方式可分为液体发酵和固体发酵两种类

苏云金芽孢杆菌的研究——综述

苏云金芽孢杆菌的研究 摘要苏云金芽孢杆菌是目前应用最广泛、研究最深入、生产量最大的微生物杀虫剂。目前已发现多种Bt亚种或血清型对害虫具有杀虫活性,同时也发现了一些新的杀虫晶体蛋白，通过纯化得到高效的杀虫晶体蛋白也是目前研究热点之一。本文简要介绍了Bt的发展历史、晶体蛋白的纯化及在杀虫方面的一些应用。 关键词苏云金芽孢杆菌、历史、伴孢晶体、杀虫 苏云金杆菌(Bacillu .thuringiensis，简称Bt)是一种革兰氏阳性芽孢杆菌，为昆虫病原细菌，其菌体为短杆状、有鞭毛，一般单生或形成短链。在芽孢形成期可产生具有杀虫活性的伴孢晶体,且伴孢晶体(原毒素)对鳞翅目或双翅目等多种昆虫具有毒杀活性[15]。苏云金杆菌是一种应用广泛的绿色环保型微生物杀虫剂，全世界年产值已突破1亿美元[1]。自20世纪60年代实现工业化生产以来,已成为世界上用途最广、商业开发最成功、产量最大的微生物杀虫剂,每年以20%的速度增长[2,3]。苏云金杆菌杀虫剂的稳定性较差、残效期短、杀虫速度慢等问题都待解决，关于苏云金芽孢杆菌的研究都将继续进行。 1Bt的发展历史 1901年，日本学者石渡繁胤(Ishiwata)从虫尸体液中分离出苏云金杆菌猝倒变种(Bacillus.thuringiensis var.sott) 成为苏云金杆菌研究的起点[4]。1911年，Berliner 发现一杆菌，并详细描述了该菌的形态和培养特征，定名为苏云金杆菌(Bacil-lus.thuringiensis)，指明苏云金杆菌含伴孢晶体(Paraspora crystl) 。 1938年，苏云金杆菌商品化，用于防治地中海粉螟。20世纪50年代许多国家进行了商业性生产。从发现该菌至今已有整整105年历史,世界上有超过万篇的研究报道,涉及生物学、分类命名、有效成分、杀虫机理、分子生物学、遗传学、产品化和安全性,包括近年来的转基因植物等诸多方面[5]。 1953年，Hannay第一次发现苏云金杆菌的杀虫活性与伴孢晶体有关，并和Fitz-James于1955年证实，伴孢晶体是一种蛋白质。1981年，Schnept和Whiteley 首次将HD21菌株伴孢晶体的基因克隆到大肠杆菌中，并得到表达。用血清学技术进行Bt的鉴定和分类始于20世纪60年代。 我国对苏云金芽孢杆菌的研究和应用起步较晚，但发展迅速，据统计，在在70年代，我国苏云金杆菌制剂年产量大1000吨以上，并且部分产品用于出口。 1992年联合国“世界环境和发展大会”在巴西的召开促进了全球生物防治的发展，推进了苏云金杆菌制剂产业化进程。世界上许多科学家致力于Bt的研究，并作出卓越贡献，时至今日，Bt在农药上所占的比例仍处于劣势，许多问题依然有待解决。 2 苏云金芽胞杆菌的伴孢晶体的纯化方法 2.1等密度梯度离心法 等密度梯度离心法是利用密度的差异将伴孢晶体与杂质分离,获得纯品的方

苏云金芽孢杆菌杀虫方面的研究及运用进展

苏云金芽胞杆菌杀虫方面的研究 及运用进展 摘要：人类对苏云金芽胞杆菌（Bt）的研究至今已有100多年的历史，因其具有特殊的生理特性，在微生物防治害虫方面具有重要的作用。利用微生物能直接杀死害虫却又不伤害控制害虫的天敌，最重要的是它不污染环境，害虫也更难以产生抗药性，还能通过遗传操纵改造某些性状，以便对其更好的利用。同时，随着转基因技术的兴起和发展，Bt成为转基因过程中的重要材料，在应用实践中起着巨大的作用，如今成功的转Bt产物已有：转Bt抗虫棉花、转Bt玉米以及备受争议的转基因水稻等等。本文主要叙述Bt的某些重要特征和当前的研究进展，旨在达到一种科普宣传让人们更加了解有关转Bt产物方面的知识。 关键词：苏云金芽孢杆菌、微生物防治、转基因、农业生产应用 苏云金芽胞杆菌( Bacillus thuringiensis，简称Bt )是一种杆状、革兰氏染色阳性反应、能形成内生芽胞的细菌，广泛存在于各种生态环境中。其营养体具有周生鞭毛或无鞭毛。在其芽胞期能形成对特定昆虫具有毒性的由杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins, ICPs)组成的伴胞晶体，此特点成为苏云金芽胞杆菌区别于分泌肠毒素的蜡状芽胞杆菌(Bacillus cereus)和引起炭疽病的炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)的主要特征(喻子牛等，1990)。由于其独特的杀虫特性，自从1901年日本学者Ishiwata首次分离到苏云金芽胞杆菌以来，苏云金芽胞杆菌得到了广泛的关注和研究，在世界范围内已分离得到超过

40000个菌株，对其生物活性谱的了解得到了极大的扩展，由最初对鳞翅目的毒性，逐渐发现对双翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目等昆虫纲10个目500多种昆虫以及原生动物、线形动物门、扁形动物门中某些有害种类也有特异的生物活性(Schnepf等，1998)。 1.苏云金芽孢杆菌的毒素 毒素是苏云金杆菌杀虫的核心，主要有三种：伴孢晶体（杀虫晶体蛋白，Insecticidal Crystal Proteins，ICPs）即σ-内毒素，苏云金素即β-外毒素，芽孢。 1.1杀虫晶体蛋白（ICPs） 杀虫晶体蛋白（Insecticidal Crystal Proteins,简称ICPs）是由Cry基因和Cyt基因编码的，自从1981年克隆了第一个ICPs基因，并于1985年发表了他的核苷酸序列起，大量的ICPs基因相继被发现和克隆。他们的分类系统也从最初的基于杀虫活性和基因的同源性的分类系统变为基因的核苷酸序列及其演化关系的分类系统，并且其基因编号也该用阿拉伯数字取代了原来的罗马数字。Cry基因广泛用于转基因作物中，目前对Cry基因及其蛋白的主要分析方法有：PCR-RFLP、核酸分子杂交鉴定等。 1.1.1 ICPs基因的命名 传统命名法，Hofte和Whiteley（1989）提出根据杀虫谱进行分类的分类系统，根据基因编码的杀虫晶体蛋白的同源性及杀虫活性，已克隆的42个基因被划分为五类。其中，cryI、cryII、cryIII、cryIV编码的杀虫晶体蛋白分别特异地对鳞翅目、鳞翅目和双翅目、鞘翅目、双翅目有毒力作用，而对双翅目有生物活性且具溶细胞的作用的杀虫晶体蛋白基因则被划入cytA类。

苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白提取和纯化

苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白提取和纯化 摘要：苏云金芽孢杆菌是目前世界上研究最多、产量最大、应用范围最广的微生物杀虫剂，具有专一性强、对人畜无害、防治效果好、易生物降解及无残毒等优点。通过对苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白提取和纯化得到伴孢晶体。经过稀释分成不同的浓度分别去检测杀虫活性。 关键词：伴孢晶体，苏云金芽孢杆菌，纯化 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 仪器设备和试剂 超净工作台，高压灭菌锅，离心机，冷冻干燥机，-80℃低温冰箱，透析袋，移液管，玻璃棒，电子秤，养虫缸。超纯水，0.5M/L的Nacl，生理盐水，5%的丙酮溶液。 1.1.2 研究菌株 本实验室分离自病蚕体内的苏云金芽孢杆菌。 1.1.3 供试昆虫 菜青虫。 1.1.3 培养基 种子培养基[1]:酵母浸膏0.5％，蛋白胨1.0％，NaC1 1.0％，pH值7.0。121℃灭菌30 min。蒸馏水1000 ml，pH值7.0（用NaOH调pH值）。 发酵培养基[2]：牛肉膏0.5％，蛋白胨1.0％，葡萄糖0.3％，NaC1 0.2％，MgS04·7H2O 0.03％，K2HPO4 0.03％，MnSO40.005％，蒸馏水1000 ml。调pH 7.5，121℃灭菌30 min，灭菌后pH 7.3。 1.2 方法 1.2.1 种子液的培养 在无菌的条件下，从保藏管中分别挑一环接种有种子夜培养基，30℃培养14 h。 1.2.2 菌株发酵 按照3％的接种量转接500ml的发酵培养基，30℃，120 r／min培养60 h，镜检观测80％以上的菌体裂解时停止培养，离心收集提取晶体蛋白。 1.2.3 伴孢晶体的分离纯化[4] 氨基酸可以3种形式存在，即带正电荷、带负电荷和两性离子，如在酸性溶

1000吨年苏云金芽孢杆菌厂生产工艺初步设计

年产1000吨苏云金芽孢杆菌的发酵车间工艺设计 包文雨 （辽宁石油化工大学，石油化工学院，生物工程1102，辽宁营口，1132050215） 摘要 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)于1901年在日本被发现，1911 年由柏林纳从地中海粉螟的患病幼虫中分离出来，并依其发现地点德国苏云金省而命名. 苏云金芽孢杆菌简称苏云金杆菌，是内生芽孢的革兰氏阳性土壤细菌，在芽孢形成初期会形成杀虫晶体蛋白对敏感昆虫有特异性的防治作用。 本设计首先初步介绍了苏云金芽孢杆菌的发展过程，然后就其产品化进行了讨论，苏云金芽孢杆菌的发酵共有两种工艺路线，即液体深层发酵和固态发酵。它们都有其优缺点，但是经过对比论证，最终选择了液体深层发酵。随后根据相关资料确定了苏云金芽孢杆菌的生产周期及期产量，依照期产量对其进行了物料衡算和热量衡算，最后对设备进行了合理的选型。 关键词：苏云金芽孢杆菌；产品化；工艺路线；设备选型

1000 tons of Bacillus thuringiensis fermentation process design workshop Bao Wenyu (Class 1102, Department of Biological Engineering, School of Environmental and Biological Engineering, Liaoning Shihua University, Liaoning Yingkou, 1132050215, China) Abstract Bacillus thuringiensis (Bacillus thuringiensis) in 1901, was discovered in Japan in 1911 by the Berliner from the Mediterranean flour moth larvae in the prevalence of isolated and found locations in Germany according to their province and named Bacillus thuringiensis. thuringiensis Called Bacillus thuringiensis, is endogenous Gram-positive Bacillus soil bacteria, initially formed in the spore formation of insecticidal crystal protein (insecticidal crystal protein), insects have specific sensitive rats. The preliminary design of the first Bacillus thuringiensis introduced the development process, and then conducted a discussion of its products, the fermentation of Bacillus thuringiensis There are two process routes, that is, submerged fermentation and solid-state fermentation. They all have their advantages and disadvantages, but after comparison argument, I finally chose the submerged fermentation. Then determined according to the relevant information of Bacillus thuringiensis and production cycle of production, production was carried out in accordance of the material balance and heat balance, the last of the equipment for a reasonable selection Key words:Bacillus thuringiensis; product of; process routes; equipment selection