松乳菇组织分离菌株的rDNAITS序列分子鉴定

研究报告

松乳菇组织分离菌株的r DNA I TS序列分子鉴定3

熊　涛　肖　满33　曾哲灵　万冬满

(南昌大学生命科学学院食品科学教育部重点实验室　南昌　330047)

摘要:对松乳菇子实体和组织分离菌株r DNA I TS区域进行测序分析,通过和Gen Bank中

已知的乳菇属的种进行序列比对,构建系统发育树,通过树图分析,鉴定出分离菌株就是

松乳菇的纯菌种。

关键词:松乳菇,I TS序列,分离菌株

中图分类号:Q93 文献标识码:A 文章编号:025322654(2006)0420001204

M olecul ar I den tifica ti on of Isol a te of L acta rius deliciosus by I TS Ana lysis3

X I O NG Tao　X I A O M an33　ZENG Zhe2L ing　WAN Dong2M an

(College of L ife Science,Key Laboratory of Food Science of MO E,N anchang U niversity,N anchang330047)

Abstract:I n this study,the r DNA I TS sequence of is olate of Lactarius deliciosus(L1)Gray was se2

quenced1Molecular identificati on was accomp lished using phyl ogenetic tree analysis of22L actarius nr DNA2I TS

nucleotide sequence including the2new and20GenBank sequence1

Key words:L actarius deliciosus,I TS sequence,Is olate

松乳菇是对林木生长有重要意义的外生菌根真菌,又是有重要经济价值的食用真菌。但目前尚不能人工栽培出松乳菇子实体,无法令人信服地证明所分离到的菌株就是目标菌株且没有杂菌污染。因此,对子实体分离菌株的分子鉴定就尤为重要。

基于分子生物技术和生物信息学的快速发展,越来越多的外生菌根真菌I TS区域的序列测定结果向GenBank、E MBL、DDBJ3大数据库提交,而且通过数据库r DNA I TS 序列检索鉴定外生菌根真菌的种已成功的应用在一些研究中[1～4]。

本文对采自江西吉安的松乳菇子实体(通过形态学、解剖学和显微镜观察,初步定为松乳菇),通过对松乳菇子实体以及组织分离株的r DNA I TS区序列进行扩增、测序及分析,鉴别出组织分离株就是松乳菇的纯菌种。

1　材料与方法

111　菇体及菌株

2004年4月1日、2004年11月27日以及2005年4月10日在江西省吉安县进行调查、采集松乳菇子实体,分别对松乳菇进行组织分离得到相同形态的菌丝。待鉴定

3江西省重点科技计划项目(No1Z2100)

33通讯作者　Tel:0791********,E2mail:xiaoman20032008@yahoo1com1cn

收稿日期:2005208230,修回日期:2006202220

菌株和松乳菇子实体分别用OT U1和OT U2表示(OT U即operati onal taxonom ic unit)。112　方法

11211　菇体及菌丝体的DNA提取:取012g子实体或离心收集液体培养的新鲜菌丝体,在115mL的Eppendorf管中用研杵充分研磨后加入600μL2×CT AB提取缓冲液(EDT A20mmol/L,Tris2HCl100mmol/L,pH810,NaCl017mol/L,CT AB20g/L), 65℃水浴30m in。加等体积氯仿、异戊醇混合液(V∶V=24∶1)充分摇匀,4℃下100000r/m in离心10m in,转移上清液至新的115mL的离心管中,加入等体积的苯酚、氯仿和异戊醇(V∶V∶V=25∶24∶1)。本步骤需重复多次,直至处于中间的蛋白质相消失为止。移取上清液至一新的Eppendorf管中,加入10%体积的3mol/L Na Ac溶液(pH610)和215倍体积的冰冻乙醇,4℃下100000r/m in离心5m in,沉淀用70%的酒精洗2～3次。晾干,加TE(含10mmol/L Tris2HCl,1mmol/L E DT A pH810)缓冲液充分溶解后在220℃下保存备用。

11212　I TS区段的PCR扩增:松乳菇子实体以及组织分离株r DNA I TS区域的扩增引物为I TS12F(5’2CTTGGTCATTT AG AGG AAGT AA23’)[5],I TS4(5’2TCCT CCGCTT ATT2 G AT ATGC23’)[6]。PCR反应体系为DNA模板(50ng～1μg/μL)015μL,10×buffer 5μL,dNTP m ix4μL,Taq酶1U(015μL),ddH2O38μL,总体积50μL。PCR反应程序为:95℃预变性5m in,94℃变性1m in,55℃退火1m in,延伸72℃1m in,补平72℃5m in,共进行30个循环。

11213　扩增产物测序:PCR产物纯化后直接测序(上海基康生物技术有限公司完成)。11214　产物序列分析:将测得的I TS序列在GenBank序列库中做BLAST,找出与之最大相似性的序列,下载相似序列的I TS区域,用ClustalW(B i oEdit71010软件)进行序列比对(Multi p le alignments),并辅以人工修正。分析时所用参数均为软件默认值。11215　系统树的构建用:TREECON f orW indows(versi on113b)进行系统(phyl ogenet2 ic)分析。基于Ki m ura双参数模型,Neighbor2Joining法构建系统树,AJ534900(L ac2 ta rius s p1A54)为外类群(outgr oup)。经bootstrap法10000次循环检验系统树可靠性。

2　结果与分析

211　r D NA I TS区段PCR扩增及测序结果

r DNA I TS区段PCR扩增结果的电泳图见图1,OT U1和OT U2的长度在600bp左右。测序结果r DNA I TS区段长度分别为654bp和652bp,序列结果如下。

OT U1:

TT ATCGT ACAACGTGCGTGG AGGGCGTGCG AGGGCTGTCGCTG ACTTTTTGTTG ACGCA AAA GTCGTGCACGCCGG A GCACGTCCTCTCGCAT AAAA TCCA TCTCACCCTTTTGTGCA CCACCGCGTGGGCACCTTTTGGG ATCG AACCG A TCCTGG AGGGGGCTTGCGTTTTCACA CAAACCCCTTTT AAAAAAGTGT AG AA TG ACCCCATTTTGCG A TG ACACGCAA TCAA T AC AACTTTCAACAACGG ATCTCTTGGCTCTCGCA TCG ATG AAG AACGCAGCG AAA TGCG A T ACGT AA TGTG AATTGCAG AATTCAGTG AA TCA TCG AA TCTTTG AACGCACCTTGCGCCC CTTGGT ATTCCG AGGGGCACACCCGTTTG AGTGTCGTG AAA TTCTCAACCTTCTCGGTTT

TCTTCTGG ACACCG AA GG AGGCTTGG ACA TTGG A GGCCTTTGCTGGCGTCTCTT A G ACC CAGCTCCTCTT AAATG AA TT AGCGGGGTCCTCTTTGCCG A TCCTTG ACA TGTG AT AA G A T GTTTCCATG ACTTGGTTTCTGGCTCTGTTGCA TTTGGG ACCTGCTTCT AACCGTCTCGAC G A G ACAACGTTTGGGCGTGTCTCCCTTCTCGGG A G ACTCTCTCAACCCCACG AACCCTT G A

OT U2:

AT ATCGT ACAACGTGCGTGG AGGGCGTGCG AGGGCTGTCGCTG ACTTTTTGTTG ACGCA AAA GTCGTGCACGCCGG A GCACGTCCTCTCGCAT AAAA TCCA TCTCACCCTTTTGTGCA CCACCGCGTGGGCACCTTTTGGG ATCG AACCG A TCCTGG AGGGGGCTTGCGTTTTCACA CAAACCCCCTTT AAAAAAGTGT AG AA TG ACCCCATTTTGCG ATG ACACGCAA TCAA T AC AACTTTCAACAACGG ATCTCTTGGCTCTCGCA TCG ATG AAG AACGCAGCG AAA TGCG A T ACGT AA TGTG AATTGCAG AATTCAGTG AA TCA TCG AA TCTTTG AACGCACCTTGCGCCC CTTGGT ATTCCG AGGGGCACACCCGTTTG AGTGTCGTG AAA TTCTCAACCTTCTCGGTTT TCTTCTGG ACACCG AA GG AGGCTTGG ACA TTGG A GGCCTTTGCTGGCGTCTCTT A G ACC CAGCTCCTCTT AAATG AA TT AGCGGGGTCCTCTTTGCCG A TCCTTG ACA TGTG AT AA G A T GTTTCCATG ACTTGGTTTCTGGCTCTGTTGCA TTTGGG ACCTGCTTCT AACCGTCTCGAC G A G ACAACGTTTGGGCGTGTCTCCCTTCTCGGG AG ACTCTCTCAACCCCACGAACCCCT 图1　OT U1和OT U2r DNA I TS 区域

的PCR 产物M Marker Ⅶ,1～2OT U1和OT U2

212　r D NA I TS 区段同源性检索

在Gen Bank 核酸序列数据库中,进行blastn 搜

索,得到的同源序列全部是乳菇属不同的物种。下

载上述相似物种中有代表性的I TS 序列,用Clustal

W (B i 1010软件)进行序列比对,并辅以人工

修正后。

基于松乳菇子实体、分离株以及来自GenBank

的最相似乳菇属22个种的I TS 序列,用T REECON

forW indows (versi on 113b )软件构建无根NJ 系统

树。分析序列采用Ki m ura 双参数模型。AJ534900(L actarius s p 1A54)为外类群(outgr oup ),从中间生

根(The tree is m idpoint r ooted )。图中只显示用百分

数表示的大于70%的Bootstrap 值。系统树见图2。

从系统树可看出,乳菇属的不同种,种间、种内距离在宽度和重叠排列(wide and overlapp ing range )上都不同。OT U1和OT U2与乳菇属中的松乳菇聚为一支。基于系统树其它部分的分支上物种(如L actarius sal m onicolor 、L actarius deterri m us 等)种内距离,可以推断OT U1与乳菇属中的松乳菇为相同种,而且这种根据系统树规律鉴定种的方法也很好的符合一种标准。即Tayl or 等概述的用PSR (Phyl ogenetic Species Recogniti on )

来作为鉴定进化种(phyl ogenetic s pecies )的标准之一[7]。

图2　基于子实体、分离菌株及来自GenBank的最相似物质的

I TS序列构建的NJ系统发育树3　讨论

尽管r DNA I TS区已被国际上公认是生物各类群属下种间、种内水平比较研究的一个很好的分子指标,并且已在动物[8]、被子植物[9]、真菌[10]等都已得到广泛的应用,但是,作为种的界定标准,目前尚未有一致的标准。Renske Lande weert等认为通过I TS区域比对,序列相似性≥99%,鉴别为相同种;序列相似性大于95%且小于99%,鉴别为相同属;序列相似性≤95%,鉴别为相同科[3]。另外通过构建系统树也是一种很好的鉴定种的方法。Tayl or 等提出的GCPS(Geneal ogical Concordance Phyl ogenetic Species Recogniti on)方法对鉴定进化种更具有科学严谨性[7]。已有成功应用的报道[11]。当然也可以用其它一些分子生物技术如PCR/RF LP[12、13、14]、PCR/ RAP D[15]等对种群关系进行鉴定,作出更全面、更准确的判断。

参考文献

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