细胞培养
细胞培养标准操作程序（SOP）
1．目的：
为了保证培养细胞的正常生长，实验技术人员必须明确并正确执行细胞培养的基本操作步骤，特制订实验室细胞培养操作流程。
2．适用范围：
适用于来我院细胞室进行细胞培养工作的人员。
3．操作规程：
3.1 培养液、PBS、胰蛋白酶的配制
3.1.1 1000ml培养液的配制
1、准备用品：培养粉、1000ml烧杯、玻棒、量筒、电子分析天平、PH仪、2～3天内的新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）、NaHCO3粉、1000ml无菌玻璃瓶（100ml ×10个玻璃瓶）、青霉素、链霉素、2～3个过滤器、注射器。紫外线照台30min。
2、将培养粉用900ml新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）溶解，并冲洗袋内残留粉末。
3、充分搅拌，按说明添加成分（如Invitrogen公司的RPMI-1640配制1000ml 需加NaHCO3粉2.0g，Invitrogen 公司的DMEM需加NaHCO3粉3.7g等），再充分搅拌。无需加谷氨酰胺，因该培养基里已含有。
4、用1M（1mol/L）HCl 调PH至7.0左右（细胞适宜在PH7.2～7.4生长，配制好后PH值会升高0.2～0.3，故配时调PH至7.0左右）。
5、用新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）定容到1000ml。
6、配青霉素 80万/瓶 + 4ml 蒸馏水溶解
配链霉素100万/瓶 + 4ml 蒸馏水溶解
取0.5ml青霉素和0.4ml链霉素加入到1000ml培养液中，使其终浓度均为100U/ml，充分搅拌混匀。
7、在无菌操作台里用0.22um的除菌滤膜过滤配制好的培养液，并分装到到100ml玻璃瓶中，玻璃瓶口用薄膜封口，盖上橡皮塞，放-20℃保存备用。
注意：
（1）配制培养液及调节培养液PH值所使用的HCl和（或）NaOH均需新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）配制。
一般于配制当天制备，以保证水的纯度和质量。
（2）准备的100ml×10个玻璃瓶必须事先高压灭菌！烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水（或新鲜反渗
水）的容器均不需高压灭菌，干净即可。
3.1.2 PBS（平衡盐溶液）的配制
NaCl 8g
KCl 0.2g ＋新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）至1000ml
O 1.56g
Na2HPO4*H
2
KH2PO4 0.2g
（1）无需调PH值，其成分溶解后PH为7.4，不需除菌滤膜过滤除菌，放于4℃保存，用前直接高压灭菌（高压时，装PBS的瓶子的瓶盖要插针头!）
（2） Na2HPO4*H2O 1.56g 则Na2HPO4*12 H2O需3.4888g
（3）如欲配制500ml，以上成分减半即可
3.1.3 0.25%胰蛋白酶的配制
胰蛋白酶粉 2.5g
EDTA（乙二胺四乙酸二钠） 0.3g
NaCl 8.0g
KCl 0.4g +新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）至1000ML
NaHCO3 0.5g
Glucose(葡萄糖) 1.0g
酚红 0.06g
（1）配出来的PH值为7.6，在PH值7.6～7.8范围内，故不需调PH值。
（2）用0.22um的除菌滤膜过滤分装，瓶口用薄膜封口，放-20℃保存备用。4℃可连续使用1月左右。
（3）用于分装的玻璃瓶必须事先高压灭菌！而烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）的容器均不需高压灭菌，干净即可。
（4）如欲配制500ml，以上成分减半即可
3.2 细胞复苏
1、准备：紫外线照台30min，准备好装有高压灭菌好的吸管、试管的饭盒、
废液缸；培养基临用前放水浴箱里温育20分钟。在操作台上摆放好物品，左边为饭盒、培养液等，中间为酒精灯、试管架等，右边放滴管架、镊子，右上角放废液缸。
2、灼烧培养瓶口及瓶盖，用滴管取培养基5ml加入试管中（一滴约为50ul）。
3、戴手套，从-196℃液氮罐中取出冻存管，立即放入37℃水浴箱中快速解
冻，同时不断轻轻摇动冻存管，保证冻存管内细胞1min内融化。以70%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。（慢冻快融）
4、用吸细胞液的滴管从冻存管中完全吸出细胞悬液，加入到已装有培养基
的试管中，塞子塞试管，800rpm离心2min（用培养基且离心的目的:去除细胞冷冻保护剂DMSO，因常温下其对细胞毒性大），弃上清，试管底部的白色物质为细胞，轻弹混匀。往试管中加培养基、FBS（胎牛血清）各80滴和20滴（使FBS 浓度为20％）。用吸细胞液的滴管轻轻吹打，使细胞混匀，以免在培养瓶里成团，影响细胞生长。
5、将试管中的细胞悬液用吸细胞液的滴管全部吸出，加到培养瓶中，标记
日期、细胞名称，再把培养瓶放入CO2培养箱。（注意：加入到培养瓶后，培养瓶轻轻平放，用手拿培养瓶侧壁，左右上下轻轻摇晃几次，使细胞均匀贴壁在培养瓶底。）
6、收拾所用物品、用75%酒精喷洒操作台，擦台，保持台面整洁。
注意：
（1）入细胞室前观察CO2%压力，5-7.5mPa左右，减压器表压力不低于
0.1mPa！
（2）刚复苏的细胞需要的营养成分更多些，让FBS浓度达到20％。
（3）离心时间为1～2min，速度为800转，不要离心太久，避免对细胞伤害较大。
（4）滴管使用注意事项：
a.吸细胞液专用一个滴管，各株细胞的滴管一定要严格分开，不能混用，防止细胞间污染。
b.培养基和FBS（胎牛血清）可以用一个滴管，但分开用更好！
c. FBS（胎牛血清）不能和胰酶用一根滴管,因为血清对胰酶活性有抑制作用。
d．胰酶和PBS（平衡盐溶液）可以用一根滴管，不过最好分开
（5）不是所有的细胞复苏后都能活。死亡原因：冻存时间太长（如2年以上），技术不过关（如吹打太激烈）、细胞传代数太多等。
（6）关于PBS（平衡盐溶液）:
a. PBS溶液配好后要高压灭菌后才能用；PBS高压时其瓶塞一定要插针头。
b. PBS和培养基都可以冲洗培养瓶里细胞中的杂质，但需用温过的PBS 冲洗细胞中的杂质。PBS虽然冲洗杂质效果较好，但它有使细胞易脱壁的倾向，故不可经常冲洗细胞。
c．不温的PBS用来做难消化细胞消化前冲洗一遍的准备，使细胞加入胰酶后易消化。
d．消化后暂时不养细胞的培养瓶，可以往其中加入2～3ml PBS（防止培养瓶干燥），培养瓶放CO2培养箱里短时间保存。下次用该培养瓶再养同种细胞时，把PBS吸出弃去，再用培养基冲洗一遍即可再用。
（7）DMSO（二甲基亚砜）在常温下对细胞毒性较大，而在4℃时，其毒性大大减弱，故冻存的细胞复苏后应及时洗涤冷冻保护剂DMSO（离心后弃去上清），防止DMSO在常温下对细胞产生较大毒性！
3.3 细胞换液
1、倒置显微镜下观察细胞生长状态：
a.移动细胞培养瓶时，观察到呈漂浮状态的细胞为死细胞；
b.生长状态良好的细胞：透明度大、折光性强、轮廓不清；能看清部分细胞细微结构，细胞处于对数生长期时可以见到很多分裂期细胞。
c.生长状态不良的细胞: 细胞折光性变弱，轮廓增强，胞质中常出现空泡、脂滴、颗粒样物质，细胞间空隙加大，细胞变得不规则，失去原有特点。
d.只有生长状态良好的细胞才适合进一步传代和实验。
2、紫外线照台30min，准备好吸管、试管饭盒，温育培养基，FBS（胎牛血清）可不温。实验开始时打开照明灯和抽风机，用75%酒精喷双手。酒精灯点燃放中间。滴管放滴管架上，从左到右顺序为：吸细胞液的滴管、吸培养基的滴管、吸FBS（胎牛血清）的滴管。从水浴箱中取出培养基，擦干水放入操作台的左边。
3、从CO2培养箱中取出细胞培养瓶，在酒精灯外焰上旋转灼烧其瓶口、盖子处（注意不要把胶盖烧焦），滴管（前端90%部位）灼烧。细胞培养瓶倾斜，用吸细胞液的滴管吸出旧液弃到废液碗中，尽量吸干净。注意：滴管的胶头应在瓶外压紧再伸进培养瓶内，避免产生气泡，且不要伸入瓶内太多，防止造成污染；滴管尖端悬空弃液，不要触到废液碗（要亲眼看到弃液，防止滴管尖端触到废液碗）！
4、用吸培养基的滴管吸取培养基90滴加入到培养瓶（25c㎡）中，再用吸FBS（胎牛血清）的滴管吸取FBS 10滴加入到培养瓶中。（使FBS浓度为10％）
5、旋紧细胞培养瓶盖后，再旋回半圈，以利于空气流通。平放回CO2培养箱中。
6、收拾所用物品、用75%酒精喷洒操作台，擦台，保持台面整洁。
注意:
（1）在打开培养基、FBS（胎牛血清）、培养瓶前后均需旋转灼烧其瓶口和瓶盖，严格注意无菌操作。灭菌饭盒只能在无菌操作台里打开。
（2）镊子每次使用前均需灼烧。装FBS的瓶子瓶盖小，用镊子夹住盖子灼烧后，再用其夹住瓶盖盖上；取其瓶盖时也是用镊子夹住瓶盖取下盖子。
（3）滴管在第一次使用前也需灼烧。注意：除吸取细胞液的滴管外，其他滴管滴加液体时都要悬空滴加。已吸过液体的滴管在再次使用前决不能再灼烧！滴管千万不能混用！
（4）培养瓶口不要对着自己，不加试剂时要平放。
（5）培养液以没过细胞为宜。
（6）细胞液颜色变黄，死细胞多时换液。不要求每天换液，容易增加污染机会。
3.4 细胞计数
1、原理：
（1）计算细胞数目用血球计数盘计数。
（2）血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。当chamber 上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目。
细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×104
注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。
2、计数方法：
(1) 75%酒精棉签清洁盖玻片及计数板，再用干纱布或棉签再擦一遍，放好盖玻片。
(2) 用滴管从已经吹打混匀的细胞悬液中取一滴滴在计数板周边，再用加样枪吹打混匀该滴液体，从中吸取13ul至盖玻片边缘（注意不要溢出，不要有气泡）。
(3) 观察计数：压线的记左不记右，记上不记下；成团的细胞只记为1个；先用低倍镜（红色，4×）找出大位置，再用中倍镜（黄色，10×）进行计数。
细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×104
(4) 计数完毕用75%酒精棉签擦盖玻片及计数板，再用干纱布（或干棉签）擦一遍。
3.5 细胞传代
1、紫外线照台30min，准备好细胞培养所需物品。
2、取灭菌试管1支，配完全培养基（含10%FBS）3ml（培养基:FBS=54滴：6滴）。
3、用吸细胞液的滴管吸弃旧液。
4、胰酶消化：加入约1ml（20滴）胰酶到培养瓶里消化。胰酶铺平培养瓶底为佳。倒置显微镜下观察培养瓶内细胞，一旦发现大量细胞胞质回缩，细胞间隙增大，但未脱离培养瓶底，立刻用吸细胞液的滴管吸出胰酶弃去，把细胞培养瓶放入CO2培养箱让残存的胰酶继续消化，（在37℃胰酶消化效果最佳）。
5、每1min把培养瓶拿到倒置显微镜下观察，当观察到细胞变圆，透亮，细胞间隙明显增大时,用吸细胞液的滴管从试管中吸取事先配好的完全培养基3ml加入到培养瓶中终止消化。
6、用吸细胞液的滴管轻柔吹打，保证培养瓶底的每个角落都吹打到，斜坡处不能忽略（可以把滴管卡在瓶口处吹打斜坡处。吹打时尽量避免产生气泡，因其对细胞有伤害；需轻柔吹打，用力吹打对细胞也有伤害。新学者可固定每个角落包括斜坡处吹打5次，靠近瓶口端处的角落也要吹到），把培养瓶中所有细胞悬液用吸细胞液的滴管移入试管中，再用滴管吹打混匀细胞悬液。
7、取一滴细胞悬液进行计数（此步骤是为了积累培养细胞的经验，观察多少密度的细胞具体几天可以长满,待有经验后此步骤可以省略。如需进一步进行铺板则一定要计数！）
8、传代：不同细胞根据细胞数量、生长快慢、难易等，一般按照1：5比例进行传代。先用滴管吹打混匀3ml（60滴）细胞悬液，取12滴细胞悬液到培养瓶中，补足完全培养基（培养基:FBS=9:1）使液体总体积达到4ml，平放到CO2培养箱中继续培养。
9、收拾所用物品、用75%酒精喷洒操作台，擦台，保持台面整洁。
注意：
（1）对于难消化的细胞（如Bxpc-3胰腺癌细胞）在用胰酶消化前，先用1～2ml（即20～40滴，或1～2滴管）4 ℃PBS冲洗一遍，较易消化的细胞不需要此步骤。
（2）一定要防止细胞过消化！因过消化，使细胞成团，不均匀，且对细胞伤害很大，影响细胞贴壁和导致生长状态差等。
* 过消化特征：
a.在没有加入完全培养基终止消化前就有成团细胞从培养瓶壁上脱落，胰酶里
出现很多悬浮物，为掉下来的细胞。
b.培养瓶底板上本身为白茫茫（细胞贴壁生长），而过消化后细胞脱壁掉下来，
则可见培养瓶底板有一片片空隙。
（3）过消化的处理：不吸出胰酶，立刻加入3ml完全培养基终止消化后一并收集入试管中，经过800 rpm 离心3min，弃去上清（失活的胰酶、培养基、FBS）。细胞沉淀（白色沉淀物）在试管底，用手指轻弹打散细胞，重新加入适量完全培养基，混匀后放入培养瓶中继续培养。
（4）在加入未经37℃温育的胰酶（指仅为室温）消化细胞时，即使细胞已经变圆，且透亮，用完全培养基终止消化后仍很难吹打下来。那是因为胰酶的温度不适宜；而应该把残留有胰酶作用的培养瓶放到CO2培养箱中，放置5min,让胰酶在其最佳温度(37℃)下消化细胞。
（5）把试管中细胞悬液转移到培养瓶中时，每次滴管在试管中取液时都要轻柔吹打液体，以防止细胞成团不均，影响在培养瓶中生长。
（6）用力吹打和气泡产生对细胞都有伤害，故应轻柔吹打并尽量减少气泡产生。
（7）吹打结束使细胞尽量分离成单个细胞为宜。
（8）完全培养基为含有10％FBS（胎牛血清）的培养液（基）。
（9）小牛血清使用范围：5～20%，10%最常用。血清可控制细胞生长速度，若想减慢细胞生长速度可减少血清浓度，反之亦然。对于刚复苏的细胞需要的营养成分更多些，则血清用20%。
（10）一般25c㎡培养瓶需培养液5ml，通常需90滴培养基+10滴胎牛血清（FBS），一滴液体体积为50ul,即20滴为1ml。
（11）一般细胞生长铺至瓶底约80%，则可传代或用来做实验，否则细胞进入生长平台期进而缺少营养而状态老化，不易用于后续实验。
3.6 细胞铺板（如12孔板）
1、紫外线照台30min，准备好细胞培养所需物品。
2、在灭菌试管1中配完全培养基3ml（培养基:FBS=54滴：6滴）
3、消化同前，注意防止过消化。吹打混匀计数，如为：8.0×10 5个/ml
4、稀释细胞悬液：根据经验，细胞密度0.8×10 5个/ml较合理，因每孔需加培养液1ml，共需12ml,分2次，每次6ml（因试管体积有限，6ml即120滴），则配制细胞悬液： 8.0×10 5个/ml ×x ml = 0.8×10 5个/ml × 6ml，x=0.6ml 即细胞原液： 0.6ml×20滴/ml=12滴
完全培养基： 6ml-0.6ml=5.4ml （5.4×20滴=108滴）
97滴培养基+ 11滴FBS
故取12滴细胞悬液、108滴完全培养液加入试管中。用吸细胞液的滴管吹打混匀细胞悬液。
5、在超净工作台里打开细胞板，铺板，注意无菌操作。每孔1ml(20滴)，分4次滴加，每次5滴，按顺序依次滴入。注意：每次从试管中吸细胞悬液时都应吹打以使细胞均匀！
6、继续稀释细胞悬液6ml，操作同前。
7、加完之后，小心平稳地将培养板放入培养箱内，静置5min后，在显微镜下观察细胞是否铺均匀，如不均匀，将影响后续实验，则需在细胞板内吹打混匀细胞：因孔内细胞悬液1ml，采用700ul枪吹打（不能用滴管，会刮花底面），可以轻轻抵着底面往各个方向吹打。
注意：小心吹打，最好不要起气泡，否则会导致细胞不均，且影响观察。吹打后放倒置显微镜下观察，若不够均匀，继续吹打。将细胞板拿出操作台时需盖板盖，避免污染。
8、吹打完毕后，小心将细胞板放CO2培养箱培养。（注意：拿细胞板避免晃动，最好直拿直放，不要推动移动，否则细胞容易成团。）
9、清洁操作台面，用75%酒精喷洒操作台，擦台。
注意：（1）若铺96孔板，则需在96孔板周围一圈孔中加入PBS，防止干燥。
（2）各种不同规格板的铺板细胞数量：
板型细胞密度（孔）体积/孔
需细
胞数
吹打加
样枪头
6孔板 0.6～0.8× 2ml 4×1ml
10 5个/ml10 4
12孔板
0.6～0.8×
10 5个/ml
1ml
6～8
×10 4
700ul
24孔板
0.8～1.0×
10 5个/ml
0.5ml
4～5
×10 4
300ul
96孔板 1.0×10 5个
/ml
0.1ml
1
×10 4
50ul
3.7 细胞冻存
1、冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。欲冷冻保存之细胞应在生长良好（log phase）且存活率高之状态，约为80–90％致密度。
2、依细胞传代培养之操作，收集培养之细胞于试管中，取少量细胞悬浮液，计数细胞浓度，一般冻存细胞浓度约1～5×106 cells/ml，依细胞种类而异。
3、用试管塞塞住试管，配平，800 rpm 离心3min，去除上清液，加入适量完全培养液，使细胞浓度为1～5×106cells/ml，混合均匀。
4、吸取16滴细胞悬液到冻存管中，再加入2滴FBS，2滴DMSO（二甲基亚砜，为细胞冻存保护剂），使FBS浓度为20%，DMSO浓度为10%。盖紧冻存管盖，在壁上标记好冻存细胞名称、冻存年月日。
5、把冻存管放到-70℃冰箱程序降温盒中24小时（勿超过1周），然后转移到-196℃液氮罐中长期保存。
注意：
（1）注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色（以
0.22micron FGLP Telflon过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650），以5～10ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。
（2）冷冻保存之细胞浓度：
①normal human fibroblast:1～3×106cells/ml
②hybridoma：1～3×106cells/ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma会
因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。
③adherent tumor lines：5～7×106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma
解冻后须较高之浓度，而HeLa只需1～3×106cells/ml
④other suspensions：5～10×106cells/ml，human lymphocyte须至少5×106cells/ml。
（3）冷冻保护剂浓度为5或10％DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。
（4）DMSO（二甲基亚砜）在常温下对细胞毒性较大，而在4℃时，其毒性大大减弱，且能以较快的速度渗透到细胞内，故冻存细胞时使用室温下的DMSO，在冻存的细胞复温后，应及时洗涤冷冻保护剂DMSO（离心后弃去上清），防止DMSO对细胞产生毒性。
细胞培养的方法与步骤
细胞培养的方法与步骤 1．开紫外灯前先擦超净台，台内紫外30分钟，室内紫外10分钟。同时将放在4℃内的培养液提前放置到室温。（可放在抽屉中，防止紫外照射） 换液 2．先将培养液打开（开一层烧一层），放置在酒精灯旁。 3．将细胞从培养箱中拿出，进超净台前先要喷酒精。 4．打开培养瓶，烧瓶口，而后弯脖朝后，倒液，注意瓶口不要残留液体，若有残液要用纱布擦净。 5．倒培养液（之前要烧瓶口），注意量（5ml）不要再瓶口有残留液体是烧瓶口，否则碳化的培养液会对细胞的生长有毒害作用。 6．倒一瓶封一瓶，迅速放平，培养瓶口拧紧后再松一下，放入培养箱中。 传代 2．拿出细胞，开口，烧，倒液。 3．（5ml大枪加3ml）用PBS洗2~3遍（洗净血清，放置血清钝化胰酶）。 4．胰酶消化，37℃5分钟（时间可自控）。消化程度是细胞不能滑落，要吹落。500微升胰酶（4×，1%）+1.5mlPBS→工作浓度0.25%（此时要用大枪）。 5．（大枪）加入3mlDMEM完全培养液终止消化，用吸管缓慢吹打壁上的细胞（不要让吸管的嘴端接触到瓶壁） 6．将混合物吸入离心管，加封口膜，离心500g 5分钟（此时洗去胰酶）在此期间PBS 洗培养瓶3遍，PBS一定要吸净，否则加入培养液后会产生沉淀（培养瓶要重复使用，至少100次） 7．倒掉上清，此时动作要轻或用大枪吸，加入3mlDMEM完全培养液重悬细胞，用吸管吹掉（再洗，清除胰酶）。 8．离心完毕，加入3ml新鲜培养液，再次吹打（约50~100下，视细胞情况而定），防止起泡沫，至细胞单个，圆球状为宜。 9．在培养瓶中加入新鲜培养液4ml，将吹打起来的细胞分配至各培养瓶中（量依需要而定）。80微升，100微升都可以。 冻存 8．在冻存管中加入200微升冻存液，在离心管中加入1000微升冻存液，吹打（防止起泡），移入冻存管中，此段时间不宜过久（DMSO对细胞伤害很大）。 9．封口膜封紧冻存管，可多封几层，用胶布缠紧，只缠一层就行，然后写字。 10．放在4℃30分钟。 11．放在冰水混合物中10分钟。 12．-20℃中放置1~2小时（经验值是不超过1.5小时） 13．-70℃中过夜，（最多可存放7~8个月） 14．放入液氮。 注意：传代前一天换液（可换可不换） 冻存前一天换液（必换） 血清灭活: 56℃30分钟水浴。
细胞传代培养的原理及操作步骤,细胞冻存,细胞复苏
细胞传代培养的原理及操作步骤 （一）原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，须进行传代再培养。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 （二）细胞传代培养具体操作 1、细胞：贴壁细胞株 2、操作步骤 1）将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 2)加入0.5-1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。 3)瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml培养液终止消化。 观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1-3分钟。 4)用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。 细胞冻存 1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射15min；培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水 浴箱37℃预热备用；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液 2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入适量胰蛋白酶消化。 3. 适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的 细胞悬液。 4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心(1000r/min，10分钟)。 5. 去上清液，加入与细胞悬液等量的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀 6. 冷存管置于4℃10分钟----20℃30分钟----80℃16～18小时(或隔夜)---液氮槽vaporphase长期储 存。-20℃不可超过1h，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 7．记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。 细胞复苏 1.室内紫外消毒；培养基、PBS于37℃恒温水浴预热备用。 2.自液氮罐中取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，离心。 3.去上清，加入培养基，吹打，然后移入培养瓶中，用培养基清洗冻存管，清洗液也移入培养瓶中。 4.于培养瓶中加入适量培养基，放入CO2培养箱中培养 5.记录复苏日期；次日换液。
人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析
人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析 The final edition was revised on December 14th, 2020.
西南大学《细胞生物学自主实验》课程论文论文题目：人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分 析 学院：生命科学学院 专业：生物科学 年级班级：2010级5班 校区编码：北区 姓名：陈建坤 二零一二年十二月四日 人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析 【摘要】：染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。本文着重介绍通过对人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析，初步了解到对人体外周血淋巴细胞培养方法与人类体细胞染色体核型分析的方法。该实验采用人工离体培养的方法，采集人体外周血淋巴细胞，在加有植物血球凝集素（PHA，刺激小淋巴细胞转化为淋巴母细胞而进行有丝分裂）的培养基中培养。经过（72±2）恒温培养，秋水仙素处理、低渗和固定，获得大量有丝分裂中期细胞。最后经过空气干燥法制片，对人体外周血淋巴细胞进行染色体核型分析。 【关键字】：人体外周血淋巴细胞染色体核型人工离体培养 一．引言: 染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。人类染色体核型分析是将人的一个体细胞有丝分裂中期的染色体，在技术的基础上，按照染色体的大小和形态特征（主要根据着丝点位置），对染色体进行分组、排队和配对。这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。直到上世纪50年代，科学家对染色体本身的细致深入研究才成为可能。染色体组型分析是细胞遗传学研究的基本方法，是研究物种演化、分类以及染色体结构、形态与功能之间，人类G显带核型图谱关系所不可缺少的重要手段。1952年徐道觉用低渗法使细胞膨胀，使染色体充分分散开来。1956年，Tjio等用秋水仙素使细胞分裂固定在分裂中期，增加了细胞分裂相。之后，有科
细胞培养室管理方法
细胞培养室管理的研究与探索 文章来源：中国实用医药作者：徐家英秦立强等 【摘要】本文从培养室的服务职能，培养室的技术交流，细胞培养室的建设，实验室管理制度建立的重要性等几个方面进行了研究与探索，充分发挥细胞培养室的潜能，从而达到有效提高研究质量的目的。 【关键词】细胞培养室；技术服务与交流；培养室建设与管理 实验室是高等学校从事科研的重要基地，营造一个好的实验研究环境对实验室管理和建设起着至关重要的作用。实验室管理质量的好坏，直接关系到实验研究是否进展顺利。良好的实验室建设，能给研究者带来愉快的心情，同时也能有效的提高研究质量。 细胞培养室是综合实验室的一个重要组成部分, 细胞培养技术是生命科学各研究领域的一种最基本、最重要、也是应用最广泛的研究技术之一。对于高等医学院校来说,各生物医学相关学科均建有细胞培养实验室，其规模、档次、技术水平、使用效率、管理模式、服务保障等方面都缺乏统一的标准，普遍存在着小而全、投资分散、资金浪费、缺乏有效管理、无法提供服务保障、不利于技术交流和创新等诸多问题。本文总结了笔者在细胞实验室管理与建设方面的一些经验，并与广大同行进行探讨。 1 细胞培养室的服务职能 细胞培养除了需要娴熟的操作技术外，更多的体现在培养技术的过程复杂，无菌要求严格。研究人员掌握该门技术的时间周期较长。如果成天陷入清洗，包装和消毒等简单繁琐的劳动中，就会影响研究人员专心致志地从事研究活动中更重要的环节。建立大型细胞培养室，由专人进行工作流程服务，实验室按研究人员的要求提供标准化、规范化的实验用品和材料，可以极大地提高细胞培养实验室的成功率，确保实验器材符合细胞培养的要求，减少研究人员的无谓劳动。因此可以将研究人员从烦琐的劳动中解放出来，安心从事更重要的研究活动。 2 细胞培养实验室的技术交流 细胞培养是一项通用的技术平台。但针对各个研究课题而言，每个研究人员进行细胞培养的目的和要求又各不相同，即既有共性，又有特殊性。一个学科自建的细胞培养室，一般仅局限于本学科领域内有限的研究方向所必需的细胞培养方法和技术，对其它的特殊方法了解不多，因此不利于技术创新。即便是某个研究生掌握的新方法，常常由于毕业分配等原因离开科室，而使新的特殊技术不复存在，不利于特殊技术的建立和完善。 如果大型细胞培养室面向全校开放，自学科的研究人员中具有丰富科研经验的研究人员、博士、硕士等不同层次、不同研究目的和不同要求，他们相互之间不存在利害关系，容易交流，毫无技术保留。每个人的经验和教训很快为大家所用，可极大缩短技术学习的周期和提高新技术的交流。同时，实验室建立了技术档案制度，不同学科的研究人员探索的新技术不会因走人而流失，可以极大地丰富和积累特殊技术，提高技术水平，为后来者提供更多的方便。 3 细胞培养室的建设 3．1 细胞培养室面积和房间安排实验室的面积应由实验台的长度、净化工作台的大小等仪器设备情况决定，同时还应考虑科研及实验人员有足够的空间，
细胞培养方法
细胞株(系)细胞复苏 (1)戴手套，从液氮罐中取出冷冻管。 (2)迅速放入38℃水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化。 (3) 紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。然后在无菌下取出细胞。冻存管用75%酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液注入离心管中，再滴加10ml培养液。 (4)在1000r/min速度下离心5～10分钟，弃去上层液，加入适量培养液后接种于培养瓶中，接种浓度1×109/L，置37℃温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养，观察生长情况。若细胞密度较高，及时传代。或无需离心直接将细胞加入瓶中，并加入培养基贴壁培养12～24小时后，充去上清，换入新鲜培养基继续培养。加入的培养液的量依冻存的细胞数量，如果冻存数量为106，则稀释10倍使细胞达到105即可。 注意事项 在细胞复苏操作时，应注意融化冻存细胞速度要快，可不时摇动安瓿或冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段(-5～0℃)。这样复苏的冻存细胞存活率高，生长及形态良好。然而，由于冻存的细胞还受其他因素的影响，有时也会有部分细胞死亡。此时，可将不贴壁、飘浮在培养液上(已死亡)的细胞轻轻倒掉，再补以适量的新培养液，也会获得较为满意的结果。 细胞换液 （1）贴壁细胞（包括半贴壁细胞的换液） 紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。
常规细胞培养方法
常规细胞培养方法（原代培养和传代培养）初代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s 液，碘酒 初代消化培养法
1.准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2.布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3.处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中3 0~60分钟。 4.剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5.消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6.分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500 ~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。
7.计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7. 4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHC O3调整。 8.培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1.剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm 3块为止。 2.摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一2 5ml培养瓶底可摆布20~30块。 3.轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4.培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液
人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析完整版
人体外周血淋巴细胞培 养与染色体核型分析 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】
西南大学《细胞生物学自主实验》课程论文论文题目：人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分 析 学院：生命科学学院 专业：生物科学 年级班级：2010级5班 校区编码：北区 姓名：陈建坤 二零一二年十二月四日 人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析 【摘要】：染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。本文着重介绍通过对人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析，初步了解到对人体外周血淋巴细胞培养方法与人类体细胞染色体核型分析的方法。该实验采用人工离体培养的方法，采集人体外周血淋巴细胞，在加有植物血球凝集素（PHA，刺激小淋巴细胞转化为淋巴母细胞而进行有丝分裂）的培养基中培养。经过（72±2）恒温培养，秋水仙素处理、低渗和固定，获得大量有丝分裂中期细胞。最后经过空气干燥法制片，对人体外周血淋巴细胞进行染色体核型分析。 【关键字】：人体外周血淋巴细胞染色体核型人工离体培养 一．引言: 染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。人类染色体核型分析是将人的一个体细胞有丝分裂中期的染色体，在技术的基础上，按照染色体的大小和形态特征（主要根据着丝点位置），对染色体进行分组、排队和配对。这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。直到上世纪50年代，科学家对染色体本身的细致深入研究才成为可能。染色体组型分析是细胞遗传学研究的基本方法，是研究物种演化、分类以及染色体结构、形态与功能之间，人类G显带核型图谱关系所不可缺少的重要手段。1952年徐道觉用低渗法使细胞膨胀，使染色体充分分散开来。1956年，Tjio等用秋水仙素使细胞分裂固定在分裂中期，增加了细胞分裂相。之后，有科
细胞培养操作步骤
培养基的配置：基础培养基500ml+胎牛血清50ml+双抗5ml 冻存液的配置：DMSO18ml+胎牛血清2ml。 依次比例酌量配置。 超净工作台常规配置 移液器1套（2.5μl、20μl、200μl、1ml），酒精灯1盏，液器1台，斜架1台，酒精喷壶1个，酒精棉球缸1个，污缸1个， 常规耗材：培养瓶（50㎝2），定量移液管（5ml、10ml），枪头（1ml、200μl、10μl），培养皿，6/24/48/96孔板，医用脱脂棉球，保种管 所需试剂：gibco高糖培养基，胎牛血清，双抗，DMSO，胰酶，苯扎溴氨，75%酒精…… 实验前准备： 所需的各项高压后的耗材放于超净工作台内，用酒精喷壶喷洒实验台面，并关闭工作台打开紫外灯照射30min后开始实验操作。 首次传代前细胞的复苏，首先用一大烧杯盛满37℃的温水放于液氮罐旁边，待细胞株取出后留上端1/3于37℃水面上尽最大速摇动管使其在2min内迅速融化。若种管顶部含有冻存的细胞液在摇动期间用力甩动使其降于管底后再摇动。这一过程可在超净工作台外操作。 实验步骤 一、原代细胞的培养 1.紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作 者的双手。 2.将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶 口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。 3.取1个高压后的新培养瓶，瓶口在酒精灯上消毒2-3次，旋开后分别再次消 毒瓶口和瓶盖2-3次分别放于酒精灯两侧，把保种管在超净台外用酒精棉球擦拭下2/3后拿进超净台内在酒精灯上消毒保种管口2-3次放于台面左手边，取1ml移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次，然后再装上枪头吸取保种管内的细胞液，悬空移入培养瓶内。 4.拿出1支高压后的5ml定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于电动移液器 上，再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3次，悬空进入培养基瓶内吸取4ml培养基再悬空移入培养瓶内，将培养瓶瓶口和瓶盖在酒精灯上消毒2-3次后拧紧平放，在瓶身做好实验标记。 5.将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出 实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。 6.将培养瓶放于28℃,5%CO2的培养箱内培养，旋开瓶口少许。注意整个培养箱 底托盘内一定要放高压后的水，且定期更换确保无菌。 在CO2培养箱内培养10-12h，瓶盖拧紧后拿出培养箱，置于荧光倒置显微镜下观察细胞贴壁情况，及细胞形态。最后更换培养液。 二、培养液的更换
动物细胞培养常用方法
一.细胞增殖周期（cell proliferatinal cycle）概念 细胞周期是描述细胞增殖和分化交替发生变化的概念。而细胞增殖周期主要是从细胞增殖角度赋予细胞活动的概念，两者不应混为一谈。细胞增殖周期是指细胞从一次分裂结束开始生长，到下一次分裂结束所经历的过程。根据细胞增殖周期不同时期的生化特点，划分为四个连续的时期，即G 1 期（DNA合成前期），S 期（DNA合成期），G 2期（DNA合成后期），M期（有丝分裂期）。如以G 1 期为起点， 那么细胞增殖周期的各时期应循着G 1-S-G 2 -M的顺序进行，G 1 、S、G 2 三期合称为 细胞间期，此期完成细胞生长过程。M期完成遗传物质的分配。 因此，细胞增殖周期=间期（G 1期+S期+G 2 期）+分裂期（M期）。 二.培养细胞生命期（life span of culture cells） 很多细胞特别是正常细胞，在体外的生存不是无限的，而是具有一个生命期。索维培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。培养细胞的生命期与细胞的种类、性状和原供体的年龄、健康等情况有关。人胚二倍体成纤维细胞，在不冻存和反复传代条件下，科传30~50代，相当于150~300个细胞增殖周期，能维持1年左右的生存时间，最后衰老凋亡。如供体为成体或衰老个体，则生存时间较短；其他细胞如肝细胞或肾细胞，生存时间更短，仅能传几代或十几代。只有当细胞发生遗传性改变，如获永生性或恶性转化时，细胞的生存期才可能发生改变。正常细胞培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞生命的全过程中，大致都经历以下三个阶段：原代培养期、传代期、衰退期。 三.培养细胞一代生存期 培养细胞的生存空间和营养是有限的，当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代（Passage或Subculture）。每次传代以后，细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞的数量和细胞增殖的速度
人体外周血淋巴细胞培养及染色体制片实验原理
实验原理 人体的1ml 外周血中一般含有约1-3×106个小淋巴细胞，通常它们都处于间期的GO和G1期。在培养条件下给予药物刺激时，经过53-72小时可在培养物中获得大量的有丝分裂细胞，供染色体标本制备和分析之用。这种外周血培养方法是在1960年由Moorhead等所建立的。 人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板，其中红细胞和血小板不能离体培养。血细胞中的小淋巴细胞处于间期的GO和G1期。在培养时给予药物刺激，可转变为淋巴细胞，随后进行有丝分裂。这样经过66-72小时短期培养、秋水仙素处理，低渗和固定，就可获得大量有丝分裂的细胞。这种微量全血培养技术已得到了广泛的应用。 1912年，Warfter 最先研究人类染色体。1923年，报道人类染色体的二倍体为48条。 细胞遗传学、组织培养技术为 人类染色体的研究提供了条件。 技术突破主要在于： （1）人体外周血淋巴细胞培养和PHA的应用：PHA 是从菜豆种子中提取出来的，大量的PHA具有凝血作用。如果适合，可刺激细胞转为母细胞，从而进行有丝分裂。 （2）秋水仙素的应用：秋水仙素可阻断纺缍体截止于中期，使染色体个体大，结构清晰，缩短适度，细胞质粘度降低。 （3）低渗处理（水或0.075mlKcl）使红细胞胀破，白细胞胀大，染色体空间变大，易伸展，便于观察。 1956年，J.H.Tjio A.Levan 培养人胚胎组织细胞，计数人体细胞染色体数为46条。1960年，Moorhead建立人体外周血培养技术，使染色体的研究跃进一步。1968年，T.U. Casperssan 提出染色体显带技术。 实验试剂 RPMI1640培养基，植物血凝素（PHA），小牛血清，肝素，双抗，秋水仙素，低渗液：0.075Mol/L Kcl，卡诺氏固定液，Giemsa染色液，0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6)等。 磷酸缓冲液的配制 0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6): A:Na2HPO4?12H2O 28.8克B:Na2HPO4?7H2O 2.164克 KH2PO4 2.67克NaH2PO4?2H2O 0.3克 溶解于1000 ml双蒸水中溶解于1000 ml双蒸水中 实验设备 2ml灭菌注射器，离心机，电子天平，恒温培养箱，除菌滤器，显微镜，酒精灯，载玻片等。实验材料 人的外周血淋巴细胞
细胞培养实验室的设置及设备
一、细胞培养实验室的设置及设备 （一）细胞培养实验室的设置 组织细胞培养技术与其他一般实验室工作的主要区别在于要求保持无菌操作，避免微生物及其他有害因素的影响。目前，超净工作台的广泛使用，很大程度上方便了组织细胞培养工作，并使一些常规实验室有可能用于进行细胞培养。 细胞培养实验室应能进行六方面的工作：无菌操作、孵育、制备、清洗、消毒灭菌处理、储藏。 1．无菌操作区 （1）无菌操作室：无菌操作区只限于细胞培养及其他无菌操作的区域，最好能与外界隔离，不能穿行或受其他干扰。 理想的无菌操作室应划为三部分： a) 更衣室—―供更换衣服、鞋子及穿戴帽子和口罩。 b) 缓冲间—―位于更衣间与操作间之间，目的是为了保证操作间的无菌环境，同时可放置恒温培养箱及某些必需的小型仪器。 c) 无菌操作间—―专用于无菌操作、细胞培养。其大小要适当，且其顶部不宜过高（不超过2.5m）以保证紫外线的有效灭菌效果；墙壁光滑无死角以便清洁和消毒。工作台安置不应靠墙壁，台面要光滑压塑作表面，漆成白色或灰色以利于解剖组织及酚红显示pH的观察。
无菌操作间的空气消毒： 紫外线灯—－产生臭氧，并且室温度及湿度均较高，不利于工作人员健康。 空气过滤的恒温恒湿装置—－最好。 表1 洁净室（区）空气洁净度级别表 洁净度级别尘粒最大允许数／立方米微生物最大允许数浮游菌／立方米沉降菌／皿 100级3,500 0 5 1 10000级350,000 2,000 100 3 100000级3,500,000 20,000 500 10 300000级10,350,000 60,000 - 15 无臭氧紫外线消毒器 电子消毒灭菌器—－在高压电场作用下，电子管的外电极发生强烈电子轰击，使空气电离而将空气中的氧转换成臭氧。臭氧是一种强氧化剂，能同细菌的胞膜及酶蛋白氢硫基进行氧化分解反应，从而靠臭氧气体弥漫性扩散达到杀菌之目的，消毒时没有死角。消毒后空间的残留臭氧只需30～40min即能自行还原成氧气，空气不留异味，消毒物体表面不留残毒。
体外细胞培养
第一讲体外细胞培养的基本技术 ●体外细胞培养条件和基本技术 ●体外细胞培养 ●体外培养物的生长生物学 ●细胞系和细胞株 ●培养物的冷冻与复苏 ●培养物的污染、检测和排除 ●一、体外细胞培养条件和基本技术 体外细胞培养的优缺点 优点：简化细胞的生长环境，方便施加实验因素，便于观测实验结果，便于获得均一细胞群，能够进行大规模生物制品的生产。 体外细胞培养不足之处：培养对象脱离了机体的整体支配和调控，细胞间在一定程度上失去组织联系及相互作用。体外培养条件下的生长发育情况与在体时的情况存在一定差异，分析实验结果时必须考虑这种差异。 一、体外细胞培养条件 （一）、体外培养实验室 1. 准备室 2. 培养室：基本条件要求：清洁、无菌、干燥、不通风，并具有适宜的光线。空气调节用中央空调或分体式空调机。室顶安装紫外灯等消毒装置。 3. 缓冲室 4. 其他实验室 （二）、体外培养的设备和器具 设备：1. 超静工作台，生物安全柜，净化室 2. 培养箱：温度，湿度，pH值 3. 倒置显微镜 4. 水净化装置：去离子水净化装置，石英玻璃蒸馏器， 超纯水装置 5. 冰箱 6. 离心机7. 冷冻保存装置 8. 高压蒸汽消毒装置：电热干燥箱，pH计，天平 培养器具：1. 过滤除菌装置：Zeiss 滤器，抽滤式玻璃简易型滤器， 针头式加压塑料小滤器 2. 培养器皿：（1）溶液瓶（2）培养瓶（3）培养皿 （4）多孔培养板（5）离心管 3. 移液器 4.筛网：金属筛网（不锈钢网、铜网），尼龙筛网 （三）培养用液 ?水和平衡盐溶液（balanced salt solution, BSS) 水：离子交换水，蒸馏水 平衡盐溶液：主要成分：无机盐和葡萄糖 常用BSS: PBS ，Ringer Earle ，D-Hanks，Hanks ?培养液：1.天然培养液：1）血清：小牛血清,胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）,马血清，2）水解乳蛋白，3）胚胎渗出液 2.合成培养液：合成培养基的种类MEM，RPMI 1640，McCoy 5A，HAM F12等
实验七+人体外周血淋巴细胞培养
实验五人的外周血淋巴细胞培养 一、实验原理 外周血液中的小淋巴细胞，几乎都处在G1期(或Go期)，一般情况下是不再分裂的，在培养液中加入植物凝血素(PAH) 时，这种小淋巴细胞受刺激转化成为淋巴母细胞，随后进入有丝分裂。这样经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂细胞。本方法已为临床医学、病毒学，药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。 二、实验目的 掌握人体微量血液体外培养、制备染色体标本的方法。 三、实验材料 人的外周血。 四、实验器具和药品 1．用具: 2毫升灭菌注射器，离心管，吸管，试管架，量筒，培养瓶，试剂瓶，酒精灯，烧杯，载玻片，切片盒，天平，离心机，恒温培养箱，显微镜。 2．器皿的清洗和消毒 玻璃器皿在使用前，均应用肥皂水洗刷，清水冲净，烘干后浸泡在洗液中至少2h，再用流水冲洗，烘干待消毒。 将已洗净、烘干的玻璃器皿装入铝盒或用纸包装，放入干燥消毒箱内；150℃1h。 隔离衣、口罩。橡皮塞，注射用针筒等则用高温高压消毒(15磅15min)。 3．药品 (1) RPMI“1640”培养基：称取“1640”粉末10.5克，用1000ml的双蒸水溶解，如溶液出现混浊或难以溶解时，可用干冰或CO2气体处理，如pH值降至6.0时，则可溶解而透明。每1000ml溶液加NaHCO， 1.0－1.2g，以干冰或CO2气体校正pH至7.0－7.2。立即以5号或6号细菌漏斗过滤灭菌，分装待用。 (2) 肝素：作为抗凝剂使用。称取该粉末160mg(每mg含126U)，用40ml的生理盐水溶解，此溶液的浓度为每ml 500U。高压消毒8磅15min。 (3) 秋水仙素：作为有丝分裂的阻止剂，它能改变细胞质的粘度；抑制细胞分裂时纺锤体形成，使细胞分裂停留在中期。称取秋水仙素4mg，用100ml生理盐水溶解，用6号细菌漏斗过滤，然后放入冰箱4℃保存。使用时用1ml注射器吸取该溶液0。05－0.1ml加入5ml的培养物中，其最终浓度为0.4—0.8ug／ml。 (4) 植物凝血素(PHA)：是淋巴细胞有丝分裂刺激剂。提取PHA的方法有两种。一种比较简单，直接用四季豆的浸出液；另一种较复杂，最后制品为粉末。如用之得当，二种方法均可获得良好的效果。 盐水浸取法：最好用皮色四季豆，但其它颜色如红斑色、黑色.黄色，白色的四季豆亦可。取豆子20g，用水洗净可能粘附在种子外面的化学药物。先在水中浸过夜(4℃)，次日倒去水分，将豆子放入组织搅碎器内，加30ml生理盐水，开动搅碎器使之成为粘糊状，向搅碎器再加70ml生理盐水，混合均匀。置冰箱24h。然后以3000转／min离心15min，取上清液，用生理盐水稀释10倍，5号除菌滤斗过滤，分装小瓶，冰冻保存。
细胞培养实验室操作准则.10版
细胞培养实验室操作准则 任何首次准备开展细胞实验的人员必须首先认真阅读以下准则，然后在已经熟练掌握细胞培养操作技术人员的指导下开始进行细胞实验，并在以后的实验过 程中严格遵守各项准则。 一、细胞实验准备 1.进入细胞房前要换鞋，穿无菌服（干净实验工作服），戴手套，接触细胞前喷75%酒精消毒手套。 2.将所需实验用品：培养基（完全培养基、空白培养基）、胰酶（含ETTA）、枪头（1ml、200ul、10ul)、离心管，预先放置到超净工作台，打开紫外照射30min后开始细胞实验。 3.观察细胞前，用75%酒精纱布擦拭显微镜镜头及台面，进行消毒后方可开始观察细胞。 4.观察细胞主要包括：细胞数量（汇合度）、形态、分布情况（是否均匀）、有无漂浮的死细胞和污染等，观察完及时放回培养箱。（如图，汇合度约90%，分布均匀） 5.每次开始细胞实验前，需关闭紫外照射，打开超净台风机及灯。用含75%酒精的纱布擦拭超净工作台。超净台内物品放置情况：左侧（各式枪头，及可常温放置的试剂如PBS等），右侧（5ml枪头及镊子），废弃瓶位于右上角，尽可能远离操作区域，正前方为枪和酒精灯，培
养基及胰酶放置左侧便于取用。 6.超净台在使用前后，都需用含75%酒精的纱布擦拭台面至纱布上看不到明显脏物为止，每天操作后废液缸需清洗用紫外照射，此外，从外面拿进超净台的东西都要喷75%酒精消毒。 7、每周四需更换培养箱中高压过的超纯水，每周五对超净台（包括风机）、细胞培养房卫生进行打扫，每月对培养箱进行消毒清洗，确保细胞不受污染。 8、检查培养箱的CO2含量是否正常，如出现异常及时联系细胞平台相关负责人。 9、5mL枪头清洗高压的流程:(1)用洗洁精将枪头超声一遍（2）更换干净的自来水超声清洗3遍（3）用超纯水超声清洗1遍（4）将枪头捞出后再用超纯水荡洗3遍（5）放入烘干箱烘干（6）装在铁盒中，注意枪头放置顺序一致，放入高压锅，选择橡胶类（7）高压后放入烘干箱烘干后方可拿入细胞房使用 1ml、200ul、10ul装入枪盒后放入高压锅高压烘干后方可拿入细胞房使用 二、细胞传代 1.细胞传代前要观察细胞，细胞汇合度达到80%-90%时可以进行传代。图片 2.以25cm2培养瓶为例：打开培养瓶瓶盖，将盖子地面朝下放在超净台台面上，然后将培养瓶倾斜，用量程5ml的枪将旧培养基吸走，然后用量程1ml枪加1ml 空白培养基轻轻摇匀清洗，用5ml枪将清洗的培养基吸走。注：75cm2加3ml空白培养基清洗 3.加入胰酶（含EDTA）500ul；然后轻轻摇晃培养瓶，注意让所有细胞都要接触到胰酶，放入37度培养箱消化。注：75㎡大瓶加1500ul胰酶、6孔板加300ul 胰酶、12孔板加200ul胰酶 4.消化时间长短根据不同细胞有不同选择，镜下观察大部分细胞变圆，见大部分细胞脱落即可终止消化。 5.25cm2培养瓶加入2ml完全培养基终止消化。注：75cm2培养瓶加5ml完全培养基终止消化、6孔板加1.5ml完全培养基终止消化、12孔板加1ml完全培养基终止消化。 6.用5ml枪头轻轻吹打细胞后，观察底部大部分细胞已脱落，然后倾斜培养瓶，将细胞混悬液转移到15ml离心管，800r/min条件下离心3min。 7.离心时，准备新的培养瓶，标记好细胞的名称、日期、代数。
H9c2细胞培养方法
大鼠心肌细胞H9C2 细胞描述： 大鼠心肌细胞H9C2是来源于胚胎期BD1X大鼠心脏组织的亚克隆细胞系，表现很多骨骼肌细胞的特性。当H9c2细胞汇合时，细胞就会融合成多核的肌管并对乙酰胆碱刺激有反应，但该细胞缺少像心肌细胞一样的节律性搏动。此外，多项生化、电生理指标的检测也表明其具有骨骼肌的很多特点。由于来源于心脏，H9C2细胞作为心脏成肌细胞也用于心肌疾病的研究。 大鼠心肌细胞H9C2增殖能力取决于细胞取材、培养技术、培养条件等综合因素。请按照正确的培养方法来解冻、传代，以此保证细胞具备良好的增殖能力，方便您的后继研究顺利进行。 货号规格培养基运输保存 C0048 1×106个/管DMEM+10% FBS 干冰运输液氮保存 质量控制： 本细胞经过了检测，不含有细菌、真菌、病毒（HIV、HBV、HCV）、支原体。 培养条件： 37℃，5% CO2，PH值7.2~7.4，无菌恒温培养。 用途： 本产品只提供给进一步的科研使用，不可应用于治疗等其他方面。 细胞相关操作（注意：细胞操作都需严格按照无菌操作） 收到复苏好的贴壁细胞的处理方法： 1. 先从外包装盒拿出细胞瓶，在细胞瓶表面喷一层酒精，并小心去掉封口膜； 2. 在显微镜下观察细胞状态，并确定是否染菌，如有染菌，请立即拍照，并将细胞丢掉； 3. 将培养瓶置于37°C，5% CO2的无菌培养箱中培养4-6小时； 4. 倒掉多余的培养基，留正常体积的培养基； 5. 重新将培养瓶置于37°C，5% CO2的无菌培养箱中培养过夜； 6. 第二天传代。 收到冻存细胞的处理方法： 1.37°C水浴预热培养基； 2.从液氮中取出细胞迅速放入37°C水浴快速解冻（解冻后不要继续暖细胞）； 3.在超净台中加入5ml培养基重悬细胞，1000rpm离心5min； 4.弃上清，加入5ml培养基重悬细胞后转入T25培养瓶中，轻轻晃匀； 5.置于37°C，5% CO2培养箱中培养(培养瓶盖没有透气孔的话,瓶盖不要拧太紧)； 6.第二天，用新鲜的培养基给细胞换液后继续培养。 细胞传代 1.当细胞融合度达到90%以上时，给细胞传代； 2.37°C水浴预热培养基； 3.在超净台中，弃培养基，加入2-5mlPBS清洗细胞后，再加入1ml胰酶消化细胞； 4.显微镜下观察到细胞变圆，有细胞开始脱离瓶壁时，加入5ml培养基终止消化； 5.用移液器轻轻吹下瓶壁上剩余的细胞，并轻轻吹打将细胞吹散； 6.将细胞移入离心管中，1000rpm离心5min；
细胞培养2_人体间期细胞X—小体的制备
人体间期细胞X—小体的制备 一、原理 1949年Barr等发现，在雌性体细胞中的两条X染色体有一条（或这条的大部分）处于凝集不活动状态，从而形成X-小体（或称X-染色质、性染色质、Barr 小体）。进而发现，所有哺乳类雌体细胞中都有一条这种表现的X染色体，当在个用雌或雄体中，有多于2条X染色体时，在间期细胞内除一条外，其余均形成X-小体。 人类正常的男女体细胞中，22对常染色体并无区别，但其性染色体分别为XY 和XX。女性的两条X染色体中，有一条在间期呈现浓缩状态，可由适当的染料显示。正常女性间期细胞中X小体阳性率约为30—50%。 二、仪器、用品及试剂 光学显微镜，恒温水浴箱； 牙签、载玻片、染色缸； Carnoy固定液（甲醇∶冰乙酸＝3∶l）70%乙醇，硫堇染液； 5N HCl，0.2%甲苯胺兰染液。 三、操作步骤 （一）方法一 l．取材、涂片：取女性口腔上皮细胞均匀涂布在洁净载玻片上。 2．固定：涂片后立即95％乙醇中固定30分钟（不可干燥）。气干。 3．染色：玻片在蒸馏水中冲洗几次后5N HCl（22℃）水解10分钟，蒸馏水洗去多余HCl，硫堇染色30分钟。水洗。 4．镜检、气干后即可镜检。若背景颜色过深可在75%乙醇、95%乙醇中分色后再镜检。 （二）方法二 l．取女性口腔上皮细胞涂片。待干燥。 2．Carnoy固定液中固定15分钟。干燥。 3．5N HCl中10分钟。水洗。干燥。 4．0.2%甲苯胺兰染色2—5分钟。水洗。气干。 5．镜检。 四、注意事项 l．涂片时应均匀涂成单层，取材细胞要多些。取材前应漱口。 2．镜检应选择完整、核质中颗粒均匀的细胞观察，X-小体大小约为1μm，多位于细胞核边缘。 3．统计X-小体阳性率，计数应选300—500个细胞。 五、试剂 1．硫堇染液配方： ①4%硫堇原液：4g硫堇粉末置研钵中以50%乙醇100ml研磨溶解。过滤。 ②Michaelies缓冲液：醋酸钠9.714g，巴比妥钠14.714g加双蒸水至500ml。 ③硫堇工作液（PH5.7）：0.1N HCl 32ml Michaelies缓冲液28 ml 4%硫堇原液400ml 2．甲苯胺兰染液配方： 0.2g甲苯胺兰粉末溶于100ml双蒸水中即可。
细胞培养实验室构建方案-new
细胞培养实验室构建方案 （一）细胞培养实验室的设置 细胞培养实验室与其他一般实验室的主要区别在于要求保持无菌操作，避免微生物及其他有害因素的影响。 细胞培养实验室应分为以下几个区：无菌操作、孵育、制备、清洗、消毒灭菌处理、储藏。 1．无菌操作区 （1）无菌操作室：无菌操作区只限于细胞培养及其他无菌操作的区域，最好能与外界隔离，不能穿行或受其他干扰，一般地理位置在最后部分。 理想的无菌操作室应划为三部分： a) 更衣室—―供更换衣服、鞋子及穿戴帽子和口罩。 b) 缓冲间—―位于更衣间与操作间之间，目的是为了保证操作间的无菌环境，同时可放置恒温培养箱及某些必需的小型仪器。 c) 无菌操作间—―专用于无菌操作、细胞培养。其大小要适当，且其顶部不宜过高（不超过2.5m）以保证紫外线的有效灭菌效果；墙壁光滑无死角以便清洁和消毒。工作台安置不应靠墙壁，台面要光滑压塑作表面，漆成白色或灰色以利于解剖组织及酚红显示pH的观察。 （2）净化工作台：操作简单，安装方便，占用空间小且净化效果很好。一般细菌培养室使用的净化工作台主要有两种：a)侧流式或称垂直式b)外流式或称水平层流式。 净化工作台工作原理（大致相同）――通常是将室内空气经粗过滤器初滤，由离心风机压入静压箱，再经高效空气过滤器精滤，由此送出的洁净气流以一定的均匀的断面风速通过无菌区，从而形成无尘无菌的高洁净度工作环境。 净化工作台应用注意： （1）净化工作台应安装在隔离好的无菌间或清洁无尘的房间内，以免尘土过多易使过滤器阻塞，降低净化效果，缩短其使用寿命。 （2）新安装的或长期未使用的工作台，工作前必须对工作台和周围环境用真空吸尘器或不产生纤维的工具进行清洁工作，然后再采用药物灭菌法或紫外线灭菌进行灭菌处理。 （3）使用净化工作台前，应先用75％酒精擦洗台面，并提前以紫外线灭菌灯照射30～50min处理净化工作区内积存的微生物。关闭灭菌灯后应启动风机使之运转两分钟后再进行培养操作。 （4）净化工作区内不应存放不必要的物品，以保持洁净气流流型不受干扰。
喜格细胞培养实验室设计之配置标准
1. 超净工作台 目前绝大部分细胞实验室使用超净工作台实现无菌操作，具有操作简单、安装方便、占用空间小且净化效果很好。安徽人和净化为您介绍两种主要超净工作台-侧流式（垂直式）和外流式（水平层流式）。工作原理一般是将室内空气经粗过滤器初滤，由离心风机压入静压箱，再经高效空气过滤器精滤，由此送出的洁净气流以一定的均匀的断面风速通过无菌区，从而形成无尘无菌的高洁净度工作环境。 （1）侧流式工作台：空气净化后的气流由左或右侧通过工作台面流向对侧，也有从上向下或从下向上流向对侧，形成气流屏障保持工作区无菌，工作台结构为封闭式； （2）外流式工作台：净化后的空气面向操作者流动，因而外方气流不致混入操作，工作台结构为开放式，但进行有害物质实验操作对操作者不利。超净工作台应需要定期请有关部门检查洁净度，符合要求的超净工作台其洁净度应达到100级，用尘埃粒子计数仪检测粒径≤5μm的尘埃粒子数量不应超过3.5个/L；空气流量应控制在0.75-1.0m3/s；细菌菌落数平均<1个，根据无菌状况必要时需要置换过滤器。 2. 显微镜 倒置式显微镜是细胞培养实验室日常工作常规必备设备，主要用于日常了解细胞的生长情况并观察有无污染发生。如资金允许，建议选用配置有照相系统的高品质相差显微镜、解剖显微镜、荧光显微镜、录像系统或缩时电影拍摄装置等，可随时拍摄并记录细胞生长情况。 3. 培养箱 体外培养的细胞和体内细胞一样，需要在恒定的温度下生存，一般最适生长温度为37℃，温差变化不应超过±0.5℃。温度升高2℃时，变不利于细胞生存，温度达到40℃以上细胞将很快死亡。因此，可精确控温的恒温培养箱、CO2培养箱是最佳选择。 （1）恒温培养箱：应选隔水式或晶体管式自控温培养箱，此类培养箱灵敏度高，温度控制较稳定。一般的恒温培养箱价格较便宜，其缺点是只宜于作密闭式培养。 （2） CO2培养箱：目前多数的细胞培养室已广泛使用。CO2培养箱的优点是能够提供进行细胞培养时所需要的一定量的CO2（常用浓度为5％），易于稳定培养液pH，适用于开放或半开放培养。使用培养瓶时，为使培养瓶内与外界保持通气状态，可将瓶盖略微旋松，为避免细胞被污染，使用这种培养方式时，培养箱内空气必须保持清洁，需定期用紫外线照射或酒精消毒，同时培养箱内应放置盛有无菌蒸馏水的水槽，防止培养液蒸发，保持箱内相对湿度在100%。 （3）细胞培养耗材：培养细胞的器皿可用培养皿、培养板或培养瓶。 4. 烘箱（干燥箱） 用于细胞培养的一些器械、器皿必须烘干后才能使用，玻璃器皿等须干热消毒。干热消毒时，烘箱内温度一般要达到160℃以上，通常使用鼓风式烘箱。其优点是温度均匀、效果较好，缺点是升温过程较慢。升温时不能先升温后鼓风而应鼓风与升温同时开始，至100℃时，停止鼓风。需注意避免包裹器皿的纸或棉花烧焦，烧焦的碎屑可影响细胞的生长。消毒