人脂联素基因的原核表达、纯化及活性检测

里！型！！塑型！！垫！婴！型塑坠！

人脂联素基因的原核表达、纯化及活性检测。

刘德敏杨莉丽丁玉静孙颖于德民

摘要目的：在大肠杆菌中表达具有活性的重组人脂联素蛋白。方法：利用ＰＣＲ技术扩增人脂联素基因完全编

码序列，选用Ｇａｔｅｗａｙ原核表达体系，经过ＢＰ反应、ＬＲ反应两步反应，将ＰＣＲ产物克隆人ｐＥＴ—ＤＥＳＴ４２质粒，构建

融合表达载体ｐＥＴ—ＤＥＳＴ４２，ａｔｔＢ—ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ，转化大肠杆菌Ｂ１２１（ＤＥ３），以异丙基硫代一Ｂ—Ｄ一半乳糖苷（ＩＹｒＧ）诱

导表达脂联索融合蛋白，经镍柱亲和层析纯化，ＮＤＳＢ２０１高效复性后，使重组蛋白作用于体外培养的肝细胞，ＲＴ

ＰＣＲ法检测重组脂联素对肝细胞葡萄糖一６一磷酸酶转录水平的影响。结果：成功构建了表达载体ｐＥＴ—ＤＥＳＴ４２／ａｔｔＢ—

ａｄｉｇｎｎｅｃｔｉｎ，ＤＮＡ序列测定结果与预期一致。ＩＰｒＧ诱导表达的融合蛋白经纯化后ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ鉴定具有人脂联素抗

原性，并可使培养的肝细胞中葡萄糖－６一磷酸酶转录水平下降。结论：获得具有生物学活性的重组人脂联素为进一

步研究脂联素的生理机制奠定了基础。

关键词脂联索克隆，分子基因表达肝细胞重组蛋白质类葡糖一６—磷酸酶大肠杆菌

ＰｒｏｋａｒｙｏｔｉＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＡｃｔＭｔｙＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＨｕｍａｎＡｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎＧｅｎｅ

Ｌ１ＵＤｅｎｔｉｎ，ＹＡＮＧＬｉｆｔ，ＤＩＮＧＹ删抽ｇ，ＳＵＮＹｉｎｇ，ＹＵＤｅｍｉｎ

ＴｉａｎｊｉｎＭｅｄｗｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＭｅｔａｂｏｌｉｃＨｏｐｉｔｕｌ，Ｔｉａｎｊｉｎ３０００７０，Ｃｈｉｎａ

ＡｂｓｔｒａｃｔＯｂｌｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｅｘｐｒｅｓｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎａｄｉｐｏｎｅｅｔｉｎｗｉｔｈｂｉｏｌｏ咖ａｌａｅｆｉｖｉＶｉｎＥｃｏｌｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＴｈｅｅＤＮＡｃｏｄｉｎｇｆｒａｇｍｅｎｔｏｆｈｕｍａｎａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｇｅｎｅⅧａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙＰＣＲＧａｔｅｗａｙｐｍｋａｒｙｏｆｉｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｗａｓｕｓｅｄ

ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｗｅｒｅｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｐＥＴ－ＤＥＳＴ４２ｐｌａｓｍｉｄｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｆｕｓｉｏｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＥＴ—ＤＥＳＴ４２／ａｔｔＢ－ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ

ｓｉｔｅｒＢＰｒｅａｃｆｉｃｍａｎｄＬＲｒｅａｃｔｉｏｎｐＥＴ－ＤＥＳＴ４２／ａｎＢ—ａｄｉｐｏｎｅｅｔｉｎＷａｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＥｅｏｌｉＢ１２｜ａｎｄｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｗⅡｅ

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Ｋｅｙｗｏｒｄｓａｄｉｐｏｎｅｅｔｉｎｃｌｏｎｉｎｇ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ

ｐｒｏｔｅｉｎｓｇｌｕｅｏｓｅ一６一

ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ

ｅｓｃｈｅｆｉｃｈｉａｃｏｌｉ

人脂联素（ａｄｉｐ（、ｎｅｃｔｉｎ）基因全长１７ｋｂ，位于染色体３ｑ２７，包含３个外显子和２个内含予。该基因编码的脂联素蛋白在血浆中分子质量为２８ｋｕ。脂联素在血循环中含量较高，其血浆浓度约占总血浆蛋白的Ｏ０１％ｒ”。目前，脂联素在调节血糖稳态、抗动脉粥样硬化及抗炎等方面的作用已有较为肯定的认识［２１。脂联素在治疗领域的尝试也已开始，为了能够更好地了解脂联素的结构及作用机制，本研究利用Ｇａｔｅｗａｙ表达系统快速构建了人脂联素原核表达载体，表达并纯化了重组脂联素蛋白。

１材料与方法

１．１材料大肠杆菌ＤＨＳａ及Ｂ１２１（ＤＥ３）均为本实验室保存，质粒ｐＭＤｌ８一Ｔ，ｒＴａｑＤＮＡ聚合酶，ＤＮＡ凝胶回收试剂盒为大连宝生物公司产品。质粒ｐＤＯＮＲ２０１，ｐＥＴ—ＤＥＳＴ４２以及Ｇａｔｅｗａｙ表达体系均为［ｎｖｉｔｒａｇｅｎ公司产品（澳大利亚新南威尔士大学齐建成教授馈赠）。Ｍ－ＭＬＶ逆转录酶为ｐｍｍｅｇｎ产品。兔抗人脂联素多克隆抗体购自Ｂｉｏｖｅｎｄｏｒ公司；辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记的羊抗兔ｌｇＧ为北京中杉公司产品。蛋白纯化试剂盒以及１６４０培养基为Ｎｏｖｏｇｅｎ公司产品。蛋白复性用ＮＤＳＢ２０１由美国Ｓａｎｔａｃ［ｕｚ公司ＴｏｍｍｉｅＬｅｅＳｔａｄｉｎｇ先生馈赠。异丙基硫代一８一Ｄ一半乳糖苷（Ｉ丌Ｇ），二硫苏糖醇（ＤＷｒ）等均为进口或国产分析纯试剂。

１，２方法

１．２．１人脂肪组织总ＲＮＡ的提取和脂联素基因的克隆新鲜皮下脂肪组织标本取自一行子宫痛切除术且无代谢性疾病者。提取总ＩＬＮＡ。将１ｔｒｇ总ＲＮＡ．７２℃变性２ｍｉｎ后迅速冰浴降温，加入１５此逆转录酶混合液（２ＵＲｎａｓｅ抑制剂，

?天津市教委基金资助项目（项目编号：２００３０２５）；天津市自然科学基金资助项目（项目编号：０４３６０９２１１）

作者单位：３（ｍ０７０天津医科大学代谢病医虢

　万方数据

走津医药２００７年９月第３５卷第９期

０．５ｒｎｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ，５；ｔｍｏｌ／Ｌ随机引物，１０ＵＭ—ＭＬＶ），２５０ｃ温

育１０ｒａｉｎ，３７℃温育ｌｈ，９４℃加热５ｍｉｎ终止反应。以１“Ｌ得到的ｃＤＮＡ为模板，ＰＣＲ扩增长度为８１７ｂｐ的含人脂联素基因读码框架的ＤＮＡ序列。上游引物：５＇－ＧＥＴＣＡＧＧＡＴＧＣＴＧＴＴＧＣＴ一３’，下游引物：５’～ｃＴｒＣＣＴＡＡＣＣＧＴＡＣＴＧＡ一３’。ＰＥＲ产物经纯化回收后，与ｐＭＤ～１８Ｔ载体连接，｛勾建重组质粒ｐＭＤ一１８Ｔ／脂联素，送大连宝生物公司测序鉴定。１．２．２人脂联素基因原桉表达载体的构建按照Ｇａｔｅｗａｙ表

达体系操作手册，ＰＣＲ产物两端需带上该表达体系所特有的ａｔｔＢ位点，因此设计以下引物。上游引物：５７－ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴ＇ＩＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＣＡＴＧＣＴＧＴＴＧＣＴＧＧＧＡＧＣＴ－３’，下游引物：５’』．．ＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴｃＧＴｒＧＧＴＧＴＣＡＴＧＧＴＡＧＡＧＡＡＧ“Ａｑ’（黑体部分分别为ａｔｔＢｌ、ａｔｔＢ２位点）。纯化回收ＰＣＲ产物，进｛亍如下ＢＰ反应：２）ｘＬＰＣＲ产物，２ｐＬｐＤＯＮＲ２０１质粒，４山ＢＰ反应缓冲液，ＴＥ缓冲液２比混匀后加八２ｖ－ＬＢＰｃｌｏｏａｓｅ蛐ｇｙｍｅ，ｄｄＨ２０４山混匀，２５ａＣ孵育６０ｍｌｎ后，加人２止蛋白酶Ｋ溶媛，３７℃孵育１０ｍｉｎ，转化ＤＨ５ａ感受态细胞，接种于ＬＢ琼脂平板，筛选阳性克隆，提取质粒。该质粒为插人载体。进行ＬＲ

反应：２斗Ｌ插入质粒（约１５０ｎｇ），２ｔｔＬｐＥＴ－ＤＥＳＴ４２质粒，４“ＬＬ丑反应缓冲渡，ＴＥ２ｔｚＬ，混匀励ＩＩＡ．２仙ＬＬＲｃｌｏ，ｍｓｅｅｎｚｙｍｅ，其后步骤同上，转化ＢＬ２１感受态细胞，筛选阳性克隆，提取质粒进行ＤＮＡ测序鉴定，阳性菌檬子－８０℃缳存。

１．２．３重组脂联素蛋白的表达、纯化和复性将阳性菌株的过夜培养物转接于珀液体培养基中，３７℃振荡培养至Ｏｎ锄为０．６左右，加ＡＩＰＴＧ（终浓度为１ｍｍｄ／Ｌ），诱导６ｈ，离心集菌。超声碎菌，１００００。ｇ离心１５ｒａｉｎ收集上清和沉淀。沉淀部分（包涵体）经处理后用组氨酸纯化试剂盒（Ｑｉａｇｅｎ）避行纯化。纯化蛋白缓慢加入复性液（５０ｎｍｌｏｌ／ＬＴｒｉｓ—ＨＣＬ．２００ｎｕｎｏＹＬＮａＣＩ，１５ｍｏｉ，ＬＮＤＳＢ２０１，ｐＨ８．０）及２ｍｍｏｌ／Ｌ半胱氨酸（Ｃｙｓ）／还原性Ｃｖｓ，４０ｃ搅拌混匀并放置１ｈ后透析。１．２．４Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测蛋白样品行１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳后，用ｓｅｍｉ－ｄｒｙ方法转移到硝酸纤维素膜上，封闭液室温振荡封闭１ｈ，加入以封闭棱稀释的一抗（Ｉ：３０００）４℃过夜，洗涤后加人ＨＲＰ～羊抗兔ｉｇＧ（１：５０００），室温孵育１ｈ，洗膜后ＤＡＢ显示条带。

１．２．５重组脂联素的活性检测透析、浓缩的重组脂联素蛋白样品经Ｂｒａｄｆｏｒｄ法定量，设４个浓度组，分别为

５００、１０００、２０００、５０００峭几，及对照组（高糖加蛋白透析液），原代大鼠肝细胞培养啭细胞完全贴壁后，换成含葡萄糖（２５ｒｅｔｏｏｌ／

Ｌ）和不同浓度重组脂联素的培养液继续孵育１６ｈ。ＲＴ－ＰＣＲ法测定各组肝细胞中葡萄糖“—磷酸酶的转录水平。由大连宝生物公司合成葡萄糖＿６—磷酸酶引物，上游引物５＇－ＧＣＧＣＴ－ＧＴＣＴＧＴＧＴＡＴＧＧＧ３’，下游引物５’—ＧＣＴｆＧＧＣＧＡＴＧＣＴＡＣ—ＣＴＧＡ一３‘，Ｂ—ａｃｔｉｎ上游引物５’一ＣＧＧＧＡＣＣＴＧＡＣＡＧＡＣＴＡＣ—ＴＡＣ一３７，下游引物５＇－ＧＴＡＣＴＣＴＣ－ＣＴｒＣＴＧＡＣＣＡ－３＇ｏＰＣＲ扩增条件为：９４ｃｃ预变性３ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ；５４℃退火４５ｓ；７２

６４５

℃延伸３０ｓ；葡萄糖一６一磷酸酶扩增３３个循环，１３－ａｃｔｌｎ扩增２３个循环；最后７２℃延伸３ｍｉ”。ＰＣＲ产物行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统照相并＿Ｉ；｜于软件分析。

２结果

２，１人脂联素基因的克隆及表达载体的构建从人脂肪组织提取总ＲＮＡ，经ＲＴ—ＰＣＲ法扩增得到包含脂联素基因读码框架的８１７ｂｐ的脂联素基因片段．构建的ｐＭＤｌ８一刚自联素为３５０９ｂｐ。经ＢＰ反应后得到的插入载体长度为３１７３ｂｐ，ＬＲ反应所得到的表达载体ｐＤＥＳＴ４２／ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ长度为６４７７如，经１％琼脂糖凝胶电泳显示，大小均与预期相符，见图１，测序结果ＤＮＡ序列与预期一致，未发现错配碱基。

ｌ：８１７ｂｐ目目联素ｅＤＮＡ片＆；２：ｐｂｌＤｌ８一嘴联索载体；３、８：ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；４：ａｔｔＢ一脂联素；５：ｐＭＤｌ８－ＴｔａｔｌＢ一脂联素：６：ｐＤＯＮＲ２０ｌ／ａｔｔＢ川自联幕；７：ｐＥＴ—ＤＥＳＴ４２／ａｔｔＢ一脂联素

图１～自联索基因的克隆和表达载体构建

２．２重组脂联素蛋白的鉴定表达载体ｐＥＴ—ＤＥＳＴ４２／ａｔｔＢ一脂联素转化人ＢＬ２１菌株，表达的融合蛋白绝大部分以包涵体形式存在，由于载体上带有一羧基端融合标签及纯化标签，所以融合蛋白分子质量约为３０ｋｕ。蛋白经纯化后为单一条带，分子质量大小与预期相符，见图２。Ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ鉴定结果显示重组蛋白具有人脂联素抗原性，见图３。

１：纯化后的重组脂联素蛋白；２：细胞裂解渡；３：包涵体；４：ＤＥ３对照；５：分子质量Ｍ盯ｋｅｒ（ｋｕ）

匿２表达产物的ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分析

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包涵体；２：上清；３：细胞裂解被；４：对照

图３表达产物的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析

２．３重组脂联素蛋白对原代培养肝细胞葡萄糖一６一磷酸酶ｒｒｄ｛ＮＡ水平的影响在细胞培养液中加入２５ｍｍｏｌ／Ｌ的葡萄糖可以使葡萄糖“一磷酸酶的转录水平增高２倍，而脂联素可以使这种高糖水平下的葡萄糖一６—磷酸酶转录水平下降。葡萄糖＿６—磷酸酶的两个亚单位：ｐ３６（调节亚基）和ｐ４６（催化亚基）随着脂联素浓度的增高呈不同水平的降低，见图４。当培养液中的脂联素浓度达到５ｏｏｏ“以时，葡萄糖一６—磷酸酶ｍＲＮＡ的丰度比对照组下降了４０％。

１：对照组；２：５００舭重纠日联翥蛋白组；３：ｉ０００岫几重组脂联素蛋白组；４：２０００剧Ｌ重组脂联素蛋白组；５：５０００ｍ重组脂联素蛋白组

围４ＲＴ－ＰＣＲ凝胶电泳

３讨论

脂联素水平与胰岛素敏感性呈正相关，其血清水平的降低先于胰岛素抵抗出现，脂联素对肝糖的产生有直接作用，并影响细胞对胰岛素的敏感性；脂联素的水平与高密度脂蛋白水平也明显相关，是心血管系统的保护因子；脂联素还通过ＡＭＰ激酶刺激肝脏、肌肉等组织内脂肪的氧化利用，因此脂联素水平的降低可能是导致肝脏脂肪堆积的一个重要原因。以上均提示脂联素有望成为治疗胰岛素抵抗综合征的靶点Ｈ。动态检测血清脂联素水平对于了解胰岛素抵抗和２型糖尿病的发展程度以及降糖药物的临床治疗效果将具有重要指导意义。

本研究利用Ｇａｔｅｗａｙ表达体系，选用的系统属

墅型翌翌型！，墅型！！！！！翌！！！

于表达重组蛋白功能最强大的系统之一，构建载体快速、准确。原核表达蛋白表达量虽高但不能正确修饰，而且大部分以包涵体形式存在。为了使蛋白溶解易于纯化，往往会使用一些较强的变性剂，例如盐酸胍，本研究尝试利用一种非去污性物质（ＮＤＳＢ），这类物质可使蛋白在低变性条件下进行正确的折叠，防止沉淀形成。ＮＤＳＢ经透析很容易除去，还可以防止蛋白问的非特异性相互作用，达到体外高效复性蛋白的效果，明显优于普通的透析或稀释复性。

Ｃｏｍｂｓ等８利用胰岛素钳夹实验构建的小鼠胰岛素抵抗模型，并将复性的脂联素蛋白输入小鼠体内，发现血糖水平下降，而且通过Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹分析发现，脂联索主要是通过减少肝糖输出来降低血糖，其主要作用位点为磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶以及葡萄糖一６一磷酸酶。本研究通过在原代培养的肝细胞培养液中加入获得的重组脂联素，发现脂联素可抑制葡萄糖一６一磷酸酶转录水平。当加入的重组脂联素浓度达到５０００ｐ舡时，可使葡萄糖一６一磷酸酶转录水平明显下降，通过体内外实验同时表明葡萄糖一６—磷酸酶是脂联素调节肝脏的葡萄糖稳态的一个作用靶点，这与Ｃｏｍｂｓ等目的实验相一致。本研究还表明在这种体外培养的肝细胞中，脂联素可以不依赖胰岛素而发挥作用，这一点还有待进一步研究。

参考文献

…１ＨｏｔｔａＫ，Ｆｕｎａｂ＂ｈｉＴ，ＡｒｉｔａＹ，ｅｔａｌＰｌａｓｍｅｏｎｃｅｍｒａｔｌｏｕａｏｆＭｅｌ，ａｄｉｐ０８ｅ—印ｅｃｊ丘。ｐｍｔｅｉｎ，ａｄｉｐｏｎｅｃｔｍ，ｉｎｌｙｐｅ２ｄｉａｂｅｔｉｃｐａ－ｔｉｅｎｔ４Ｊｌ

ＡｒｔｅｆｉｏｓｄｉｅｒＴｈｒｏｍｂＶｗＢｉｏｌ，２０００。２０（６）：１５９５—１５９９【２］ＭａｎｉｇｒａｓａａＭＲ＋ＦｅｒｒｏｎｉＰ，Ｓ趿ＩｍｌＦ，ｅｌａｌＡｓ舳ｃｉｍｉｎｎｂｅｔｗｅｅｎｃｉ卜ｃｏｆａｔｉｎｇⅢｌｉｐｏｎｅｅｔｉｎａｎｄｉｎｔｅｄ眦ｋｉｎ一１０ｌｅｖｅｌｓｉｎ蚰ｄｒｏｉｄｏｂｅｓｉｔｙ：ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｗｉｇｌＩｔｌｏｓｓ叨ＪＣｌｉａＥｎｄｏｃｔｌｎｏｌＭｅｔａｂ，２００５，９０（１０）：５８７６—５８７９

ｆ３１方显锋，刘穗敏，孙颖葡萄糖和术糖醇对葡萄糖６磷酸酶基因表达的调节作用Ⅱ］天津医药，２００５，３３（１）：３０－－３２

踟ＯｇａｗａＹ，ＫｉｋａｃｈｌＴ，Ｈ咿诎ｉＫ，ｄ

ａ１．ｕ５ｄＩ】１Ｉｌ黜ｏｆ㈣ｅｄｌｐｏｎｅｅｔｉｎｌｅｖｄ船ａｄｕ孵ａｏｓｔｉｃⅢａ矗ｅｒｏｆｍｅｔａｂｏｌｉｃｓｙｎｄｒｏｍｅｉｎｏｂｅｓｅＪａｌｍａｅ船ｃｈｉｌｄｒｅｎ［ＪｌＨｙｐｅｒｔｅｎｓＲｅｓ，２００５，２８（１）：５１—５７［５］ＣｏｍｂｓＴＰ，ＢｅｒｇＡＨ．ＯｂｌｉｃｉＳ，ｅｔａｌＥｎｄｏｇｅｎｏｕｓｄｕ…ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｓｉｎｈｉｂｉｔｅｄｂｙｔｈｅａｄｌｐｏｓｅ－ｄｅｒｉｖｅｄｐｒｏｔｅｉｎＡｃｒｐ３０明ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ，２００１．１０８（１２）：１８７５—１８８１

（２００６４）９—２１收稿２００７．０４－１０修回）

（本文编辑李国琪）　万方数据

【CN110007091A】一种脂联素检测试剂盒及其制备方法【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910261668.4 (22)申请日 2019.04.02 (71)申请人 杭州博谱医药科技有限公司 地址 311121 浙江省杭州市余杭区仓前街 道龙潭路8号1幢105室 (72)发明人 朱永良　陈佳明　周沛沛　郑毓婕　 (74)专利代理机构 杭州杭诚专利事务所有限公 司 33109 代理人 尉伟敏 (51)Int.Cl. G01N 33/68(2006.01) G01N 33/74(2006.01) (54)发明名称一种脂联素检测试剂盒及其制备方法(57)摘要本发明属于医学检验领域，具体涉及一种人体内脂联素含量的检测试剂盒，其包括试剂R1以及试剂R2；试剂R1为包被脂联素单抗1的胶乳颗粒；试剂R2为包被脂联素单抗2的胶乳颗粒。本发明克服了现有的胶乳免疫比浊法脂联素检测试剂盒中试剂R1以及试剂R2在使用过程中会出现混合不均的现象，导致试剂空白以及反应幅度波动，同时试剂R2中的多抗会与Ⅷ型胶原、补体C1q 和Ⅷ因子有交叉反应，影响测试结果准确性，本发明中的试剂R1以及R2均为胶乳试剂，提升两者的混合均匀性，避免出现试剂空白以及反应幅度大幅波动的现象；通过将脂联素单抗替换传统试剂中使用的脂联素多抗，避免了额外的交叉反应， 提升了试剂的检测精确性以及稳定性。权利要求书1页 说明书9页 附图1页CN 110007091 A 2019.07.12 C N 110007091 A

1.一种脂联素检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括试剂R1以及试剂R2； 所述的试剂R1为包被脂联素单抗1(Adiponectin Monoclonal Antibody)的胶乳颗粒； 所述的试剂R2为包被脂联素单抗2(Mouse Anti-Human Adiponectin)的胶乳颗粒。 2.根据权利要求1所述的一种脂联素检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂R1制备方法如下：将胶乳颗粒在活化准备液的作用下形成活性酯，再将所述活性酯与含有脂联素单抗1 (Adiponectin Monoclonal Antibody)的抗体溶液1反应，然后再加入封闭剂完成偶联，得到包被脂联素单抗1(Adiponectin Monoclonal Antibody)的胶乳颗粒R1。 3.根据权利要求2所述的一种脂联素检测试剂盒，其特征在于，所述的抗体溶液1中脂联素单抗1(Adiponectin Monoclonal Antibody)的浓度为2mg/mL。 4.根据权利要求1所述的一种脂联素检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂R2制备方法如下：将胶乳颗粒在活化准备液的作用下形成活性酯，再将所述活性酯与含有脂联素单抗2 (Mouse Anti-Human Adiponectin)的抗体溶液2反应，然后再加入封闭剂完成偶联，得到包被脂联素单抗2(Mouse Anti-Human Adiponectin)的胶乳颗粒R2。 5.根据权利要求4所述的一种脂联素检测试剂盒，其特征在于，所述的抗体溶液2中脂联素单抗2(Mouse Anti-Human Adiponectin)的浓度为2mg/mL。 6.根据权利要求2或4所述的一种脂联素检测试剂盒，其特征在于，所述的活化准备液为活化准备液1以及活化准备液2的组合物，其中所述的活化准备液1为N-羟基琥珀酰亚胺纯化水溶液，所述的活化准备液2为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐纯化水溶液。 7.根据权利要求6所述的一种脂联素检测试剂盒，其特征在于，所述的活化准备液1的配制方法如下：准确称量50mg N-羟基琥珀酰亚胺，用2mL纯化水溶解，摇晃均匀得到活化准备液1；所述的活化准备液2的配制方法如下：准确称量30mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，用4mL纯化水溶解，摇晃均匀得到活化准备液2。 8.根据权利要求2或4所述的一种脂联素检测试剂盒，其特征在于，所述的封闭剂为BSA 溶液或者吐温20溶液中的一种或两种的组合物。 9.根据权利要求8所述的一种脂联素检测试剂盒，其特征在于，所述的BSA溶液为2%BSA 溶液，溶剂为纯化水；所述的吐温20溶液为5%吐温20溶液，溶剂为纯化水。 10.一种制备如权利要求1 ~9所述的脂联素检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括： （1）试剂R1的制备：制备包被脂联素单抗1(Adiponectin Monoclonal Antibody)的胶乳颗粒R1；（2）试剂R2的制备：制备包被脂联素单抗2(Mouse Anti-Human Adiponectin)的胶乳颗粒R2；（3）将试剂R1以及试剂R2单独分装，密封保存即得。 权　利　要　求　书1/1页 2 CN 110007091 A

人脂联素基因的原核表达、纯化及活性检测

里！型！！塑型！！垫！婴！型塑坠！ 人脂联素基因的原核表达、纯化及活性检测。 刘德敏杨莉丽丁玉静孙颖于德民 摘要目的：在大肠杆菌中表达具有活性的重组人脂联素蛋白。方法：利用ＰＣＲ技术扩增人脂联素基因完全编 码序列，选用Ｇａｔｅｗａｙ原核表达体系，经过ＢＰ反应、ＬＲ反应两步反应，将ＰＣＲ产物克隆人ｐＥＴ—ＤＥＳＴ４２质粒，构建 融合表达载体ｐＥＴ—ＤＥＳＴ４２，ａｔｔＢ—ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ，转化大肠杆菌Ｂ１２１（ＤＥ３），以异丙基硫代一Ｂ—Ｄ一半乳糖苷（ＩＹｒＧ）诱 导表达脂联索融合蛋白，经镍柱亲和层析纯化，ＮＤＳＢ２０１高效复性后，使重组蛋白作用于体外培养的肝细胞，ＲＴ ＰＣＲ法检测重组脂联素对肝细胞葡萄糖一６一磷酸酶转录水平的影响。结果：成功构建了表达载体ｐＥＴ—ＤＥＳＴ４２／ａｔｔＢ— ａｄｉｇｎｎｅｃｔｉｎ，ＤＮＡ序列测定结果与预期一致。ＩＰｒＧ诱导表达的融合蛋白经纯化后ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ鉴定具有人脂联素抗 原性，并可使培养的肝细胞中葡萄糖－６一磷酸酶转录水平下降。结论：获得具有生物学活性的重组人脂联素为进一 步研究脂联素的生理机制奠定了基础。 关键词脂联索克隆，分子基因表达肝细胞重组蛋白质类葡糖一６—磷酸酶大肠杆菌 ＰｒｏｋａｒｙｏｔｉＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＡｃｔＭｔｙＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＨｕｍａｎＡｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎＧｅｎｅ Ｌ１ＵＤｅｎｔｉｎ，ＹＡＮＧＬｉｆｔ，ＤＩＮＧＹ删抽ｇ，ＳＵＮＹｉｎｇ，ＹＵＤｅｍｉｎ ＴｉａｎｊｉｎＭｅｄｗｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＭｅｔａｂｏｌｉｃＨｏｐｉｔｕｌ，Ｔｉａｎｊｉｎ３０００７０，Ｃｈｉｎａ ＡｂｓｔｒａｃｔＯｂｌｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｅｘｐｒｅｓｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎａｄｉｐｏｎｅｅｔｉｎｗｉｔｈｂｉｏｌｏ咖ａｌａｅｆｉｖｉＶｉｎＥｃｏｌｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＴｈｅｅＤＮＡｃｏｄｉｎｇｆｒａｇｍｅｎｔｏｆｈｕｍａｎａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｇｅｎｅⅧａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙＰＣＲＧａｔｅｗａｙｐｍｋａｒｙｏｆｉｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｗａｓｕｓｅｄ ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｗｅｒｅｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｐＥＴ－ＤＥＳＴ４２ｐｌａｓｍｉｄｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｆｕｓｉｏｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＥＴ—ＤＥＳＴ４２／ａｔｔＢ－ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ ｓｉｔｅｒＢＰｒｅａｃｆｉｃｍａｎｄＬＲｒｅａｃｔｉｏｎｐＥＴ－ＤＥＳＴ４２／ａｎＢ—ａｄｉｐｏｎｅｅｔｉｎＷａｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＥｅｏｌｉＢ１２｜ａｎｄｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｗⅡｅ ｉｎｄｕｃｅｄｂｙＩＰＴＧｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｄｉｐｏｎｅｅｔｌｎ，ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎＷ８８ｐｕｎｆｉｅｄｂｙＮｉ?ＮＴＡａⅡｉｎｉｔｙｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆ ｐｕｒｉｆｉｅｄｒｅｃｏｍｂｍａｔａｎｔ ａｄｉｐｏｎｅｅｆｉｎｏｎｇｌｕｃｏｓｅ－６－ｐｈ０８ｐｈａｔｏｎｅｗ∞ｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙ ＲＴ—ＰＣＲ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＴｈｅＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｓｈｏｗｅｄ出啦ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｒｅｃｔｏｒｐＥＴ—ＤＥｓＴ４２ｆ戬啦＿ａｄｉｐ叫ｅｃ血ｗ啦ｅｍａｓｔｒｕｃｔｅｄｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ．ｐｕｒｉｆｉｅｄａｄｉｐｏｎｅｅｔｉｎｓｈｏｗｅｄａｎｄｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｎｄｒｅｄｕｃｅｄｓｋｏ”６一ｐｈ０８ｐｈａｔａｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｅｖｅｌＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｗｅｈａｖｅｏｂｔａｉｎｅｄｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈａｍａｎａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｗｉｔｈｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｙ．ｗｈｉｃｈｉｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｖ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓａｄｉｐｏｎｅｅｔｉｎｃｌｏｎｉｎｇ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓｇｌｕｅｏｓｅ一６一 ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｅｓｃｈｅｆｉｃｈｉａｃｏｌｉ 人脂联素（ａｄｉｐ（、ｎｅｃｔｉｎ）基因全长１７ｋｂ，位于染色体３ｑ２７，包含３个外显子和２个内含予。该基因编码的脂联素蛋白在血浆中分子质量为２８ｋｕ。脂联素在血循环中含量较高，其血浆浓度约占总血浆蛋白的Ｏ０１％ｒ”。目前，脂联素在调节血糖稳态、抗动脉粥样硬化及抗炎等方面的作用已有较为肯定的认识［２１。脂联素在治疗领域的尝试也已开始，为了能够更好地了解脂联素的结构及作用机制，本研究利用Ｇａｔｅｗａｙ表达系统快速构建了人脂联素原核表达载体，表达并纯化了重组脂联素蛋白。 １材料与方法 １．１材料大肠杆菌ＤＨＳａ及Ｂ１２１（ＤＥ３）均为本实验室保存，质粒ｐＭＤｌ８一Ｔ，ｒＴａｑＤＮＡ聚合酶，ＤＮＡ凝胶回收试剂盒为大连宝生物公司产品。质粒ｐＤＯＮＲ２０１，ｐＥＴ—ＤＥＳＴ４２以及Ｇａｔｅｗａｙ表达体系均为［ｎｖｉｔｒａｇｅｎ公司产品（澳大利亚新南威尔士大学齐建成教授馈赠）。Ｍ－ＭＬＶ逆转录酶为ｐｍｍｅｇｎ产品。兔抗人脂联素多克隆抗体购自Ｂｉｏｖｅｎｄｏｒ公司；辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记的羊抗兔ｌｇＧ为北京中杉公司产品。蛋白纯化试剂盒以及１６４０培养基为Ｎｏｖｏｇｅｎ公司产品。蛋白复性用ＮＤＳＢ２０１由美国Ｓａｎｔａｃ［ｕｚ公司ＴｏｍｍｉｅＬｅｅＳｔａｄｉｎｇ先生馈赠。异丙基硫代一８一Ｄ一半乳糖苷（Ｉ丌Ｇ），二硫苏糖醇（ＤＷｒ）等均为进口或国产分析纯试剂。 １，２方法 １．２．１人脂肪组织总ＲＮＡ的提取和脂联素基因的克隆新鲜皮下脂肪组织标本取自一行子宫痛切除术且无代谢性疾病者。提取总ＩＬＮＡ。将１ｔｒｇ总ＲＮＡ．７２℃变性２ｍｉｎ后迅速冰浴降温，加入１５此逆转录酶混合液（２ＵＲｎａｓｅ抑制剂， ?天津市教委基金资助项目（项目编号：２００３０２５）；天津市自然科学基金资助项目（项目编号：０４３６０９２１１） 作者单位：３（ｍ０７０天津医科大学代谢病医虢 　万方数据

原核生物基因表达与调控

第八章原核生物基因表达与调控 一、教学目的和要求： 掌握原核生物基因表达及调控机制 二、教学重点： １、乳糖操纵子调控机制 2、半乳糖操纵子调控机制 3、色氨酸衰减子调控机制 三、教学难点： 1、半乳糖操纵子调控机制 2、色氨酸衰减子调控机制 四、教学方法： 面授并辅以多媒体教学 五、教学内容 生物体的每个活细胞都含有相同的一整套基因。 基因表达具有高度的时空专一化：如肌红蛋白基因（肌细胞） 基因表达的调控：生物有机体对其基因表达的时空程序、表达速率等所进行的调节和控制。 本底水平表达：调控处于关闭状态，只翻译极少量的蛋白质。 第一节原核生物基因的转录和翻译原核生物的DNA： 单个裸露的DNA 不编码占5% 转录和翻译同一时间，地点进行 转录水平调控(主) ，兼有翻译水平调控 ?根据基因表达产物可划分： 组成型蛋白：基因表达不受时期、部位、环境影响——组成型表达。 /适应型蛋白：基因表达受时期、部位、环境影响——非组成型表达。?一种生物的整套遗传密码可以比作一本密码字典,该种生物的每个细胞中都有这本字典。为什么基因只有在它应该发挥作用的细胞内和应该发挥作用的时间才能呈现活化状态? ?结论：必然有一个基因调控系统在发挥作用。 ?基因调控主要在三个水平上进行: ?①. DNA水平 ?②. 转录水平 ?③. 翻译水平 ?一、转录的起始 转录是原核生物基因表达的主要调控点，主要涉及两个方面：1、RNA合成的酶系；2、RNA合成起始和终止信号，即DNA分子上的特定序列。 通过RNA聚合酶、转录因子和启动子的相互作用实现转录调控，改变细胞的表型，从而实现细胞生理状态和环境的变化。

人脂联素(ADPN)

人脂联素（ADPN)酶联免疫检测 试剂盒使用说明书 使用前仔细阅读本说明书。本酶联免疫试剂盒是基于双抗体夹心技术原理，来检测人脂联素（ADPN)，只能用于研究用途，不得用于医学诊断。 用途：用于人血清、血浆及相关液体样本中脂联素（ADPN)的测定。 工作原理 本试剂盒采用的是双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）测定样品中人脂联素（ADPN)的水平。向预先包被了人脂联素（ADPN)单克隆抗体的酶标孔中加入脂联素（ADPN)，温育；洗涤后，加入HRP标记过的脂联素（ADPN)抗体。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶，然后加入底物A、B，产生蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅与样品中人脂联素（ADPN)的浓度呈正相关。 试剂盒组成 需要而未提供的试剂和器材 1．37℃恒温箱。 2．标准规格酶标仪。 3．精密移液器及一次性吸头 4．蒸馏水， 5．一次性试管 6．吸水纸 注意事项 1．从2-8℃取出的试剂盒，在开启试剂盒之前要室温平衡至少30分钟。酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。 2．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。 3．建议所有标准品、样本都做双份检测。如标本中待测物质含量过高，请先用样品稀释

液稀释一定倍数（n倍）后再按说明书操作进行测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。 4．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准。 5．为避免交叉污染，要避免重复使用手中的吸头和封板膜。 6．不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。 7．底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。 洗板方法 手工洗板方法：甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将稀释后的洗涤液至少0.35ml注入孔内，浸泡1-2分钟。根据需要，重复此过程数次。自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。 标本要求 1．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 2．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。 操作程序 1．标准品的稀释：（本试剂盒提供原倍标准品一支，用户请按照说明自行在小试管中倍比 2 测样品孔。在酶标包被板上标准品孔中加入稀释好的标准品50μl；在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。 轻轻晃动混匀，37℃温育30分钟。 3．弃去液体，甩干，每孔加满稀释后洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。 如此重复5次，拍干。 4．每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。轻轻晃动混匀，37℃温育30分钟。 5．弃去液体，甩干，每孔加满稀释后洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。 如此重复5次，拍干。 6．每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。 7．取出酶标板，每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 8．测定：以空白孔调零，在450nm波长下测量各孔的吸光度值（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。 9．根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD 值在回归方程上计算出对应的样品浓度。也可以使用各种应用软件来计算。应记住由于样品稀释了的，其实际浓度应该乘以总稀释倍数。 操作程序总结：

原核基因表达调控综述

细菌能随环境的变化，迅速改变某些基因表达的状态，这就是很好的基因表达调控的实验型。人们就是从研究这种现象开始，打开认识基因表达调控分子机理的窗口的。 一、操纵元的提出 大肠杆菌可以利用葡萄糖、乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖等作为碳源而生长繁殖。当培养基中有葡萄糖和乳糖时，细菌优先使用葡萄糖，当葡萄糖耗尽，细菌停止生长，经过短时间的适应，就能利用乳糖，细菌继续呈指数式繁殖增长(见下图)。 大肠杆菌利用乳糖至少需要两个 酶：促使乳糖进入细菌的乳糖透催化乳(lactose permease)过酶半乳糖苷酶-糖分解第一步的β。

见下图)(β-galactosidase)( -β在环境中没有乳糖或其他β-半乳糖苷时，大肠杆菌合成细菌大量合成分钟后，2－3半乳糖苷酶量极少，加入乳糖半乳糖苷酶，其量可提高千倍以上，在以乳糖作为唯一β-半乳糖苷酶量可占到细菌总蛋白量的碳源时，菌体内的β-。在上述二阶段生长细菌利用乳糖再次繁殖前，也能测3%半乳糖苷酶活性显著增高的过程。这种典型的β-出细菌中诱导现象，是研究基因表达调控的极好模型。 和Jacob针对大肠杆菌利用乳糖的适应现象，法国的1961于Monod等人做了一系列遗传学和生化学研究实验，学说，如下图所示。下图中年提出乳糖操纵元(lac operon)是转录是大肠杆菌编码利用乳糖所需酶类的基因，P、za开始的P结合而阻碍从O能与R，R编码合成调控蛋白i所需要的启动子，调控基因a、z 基因转录，所以O就是调节基因开放的操纵序列，乳糖能改变R结构使其不能与P结合，因而乳糖浓度增高时基因就开放，转录合成所编码的酶类，这样大肠杆菌就能适应外界乳糖供应的变化而改变利用乳糖的状况，这个模型是人们在科学实验的基础上第一次开始认识基因表达调控的分子机理。

脂联素的检测意义

脂联素的检测意义 检测方法： LC-MS/MS 送检要求： 样本采集：早晨7:30-10:30用EDTA抗凝管（紫帽管）空腹采血，成人4ml，儿童2ml。采血时根据医嘱要求坐位或卧位采集相应血液样本。 样本保存：样本采集后应及时分离血浆（离心条件:×1000g，5-10分钟），装入冻存管并冷冻避光保存待检。48h内全程冷冻避光运输至实验室。 注意事项： ①采血前患者准备：抽血前1天应以清淡饮食为主，避免抽烟，禁止喝酒，避免熬夜。应提前半小时到采血地点静坐或站立等待采血，避免剧烈运动及情绪激动后采样。当日采血前停用激素治疗药物。 ②拒收样本：非EDTA抗凝血浆。

激素在人体内含量低，结构相似物多，甚至有同分异构体存在。传统的免疫学技术因检测方法的局限性，易受多因素干扰，其灵敏度和特异性较低。质谱技术可以准确识别化合物小分子，检测浓度可达ng 级、pg级甚至fg级，大大提高了检测的灵敏度和特异性。2013年美国内分泌学会在临床内分泌与代谢杂志（Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism）发表声明，宣布自2015年开始只接受质谱方法检测激素的研究结果，这无疑肯定了质谱方法在内分泌激素检测中的重要性。 金域采用Waters UPLC I-Class-TQ-S建立的液相色谱质谱方法特异性高，可实现11-脱氧皮质醇、21-脱氧皮质醇、皮质酮的色谱分离和17-羟孕酮、11-脱氧皮质酮的色谱分离；检测范围宽和灵敏度高，如雌酮、雌二醇、雌三醇、睾酮、双氢睾酮检测下限可至50pg/ml，检测上限可至20000pg/ml。检测下限可同时实现男性中雌激素和女性中雄激素的检测，检测上限也能满足男性中雄激素和女性特殊时期中雌激素的检测。建立的方法不仅满足了很好的灵敏度，而且实现了优良的特异性，充分发挥了液相色谱串联质谱在激素检测中的优势。

人脂联素(ADP)ELISA试剂盒说明书

人脂联素ADP)酶联免疫分析（ELISA） 试剂盒使用说明书 厦门慧嘉生物科技有限公司 本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中脂联素（ADP)的含量。 实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人脂联素（ADP)水平。用纯化的抗-脂联素（ADP)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入脂联素（ADP)，再与HRP 标记的脂联素（ADP)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的脂联素（ADP)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中人脂联素（ADP)浓度。 试剂盒组成： 样本处理及要求： 1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上 清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心 20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。 3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程

中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。 4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/ 分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备 用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。 6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上 进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融. 7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 操作步骤 1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标 准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为900μg/ L,600μg/ L ,300μg/ L, 150μg/ L, 75μg/ L）。 2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样 品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。 4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。 5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此 重复5次，拍干。 6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 7.温育：操作同3。 8.洗涤：操作同5。 9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色 15分钟. 10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止 液后15分钟以内进行。 注意事项： 1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。 2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。 3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

脂联素的检测意义

脂联素水平测定的临床意义 肥胖（肥胖儿童，肥胖成人，内脏肥胖） 评估肥胖的程度和类型，监测肥胖的发生和发展，预测II型糖尿病和动脉粥样硬化的发生和发展以及判断肥胖的预后是早期干预的目标，也是减肥效果的指标，并可以用于监测药物引起的肥胖症（抗精神病药）。 葡萄糖代谢异常，脂质代谢异常，胰岛素抵抗 脂联素的变化在预测心血管疾病风险方面比葡萄糖代谢紊乱和脂质代谢紊乱更早，这是胰岛素敏感性的评价指标之一，也是胰岛素抵抗发生和发展的重要标志。 代谢综合征 作为特征标记之一，它可用于预测疾病的发生和发展，并观察疾病的动态。它是干预治疗的目标。 II型糖尿病

它是儿童II型糖尿病的预测，早期诊断，鉴别诊断，预后和治疗的重要标志。它用于监测II型糖尿病及其并发症的发生和发展，并作为II型糖尿病及其并发症的治疗靶标。第一代糖尿病患者中II型糖尿病的早期指标。 冠状动脉心脏疾病 冠心病的发生，发展和严重程度的监测指标可用于预测冠心病的状况，诊断冠心病和评估治疗效果。 高血压 严重程度判断的新指标是糖代谢异常的原发性高血压的特征指标。它也可用于判断原发性高血压患者的左心室舒张功能和左心室肥大。它是高血压肥胖症治疗的目标。 心血管疾病 它是预测心血管事件发生的重要指标。急性心肌梗塞的发生和发展，动态观察指标；急性脑梗塞的发生预测，病情变化和预后判断，脑梗塞的治疗目标；预测不稳定型心绞痛的发生和治疗目标，对心绞痛患者的动脉粥样硬化疾病发展进行预测；慢性心力衰竭

的治疗目标；动脉粥样硬化的替代指标（脂联素和动脉僵硬度），内膜中层厚度或狭窄程度。 多囊卵巢综合征 疾病发展的长期指标之一。 阻塞性睡眠呼吸暂停综合征 疾病监测和治疗的目标。 肝病 脂肪肝，非酒精性脂肪肝的治疗目标，肝纤维化的可能目标。 肾脏疾病 它是预防和干预多种肾脏疾病中心血管疾病的指标。 妊娠 预测早产，监测妊娠高血压的发生和发展，预测妊娠先兆子痫，预测和评估妊娠糖尿病。

大鼠脂联素(ADP)ELISA试剂盒说明书

大鼠脂联素（ADP)酶联免疫分析 试剂盒使用说明书 厦门慧嘉生物科技有限公司 本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定大鼠血清，血浆及相关液体样本中脂联素（ADP)的含量。 实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠脂联素（ADP)水平。用纯化的大鼠脂联素（ADP)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入脂联素（ADP)，再与HRP标记的脂联素（ADP)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的脂联素（ADP)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大鼠脂联素（ADP)浓度。 样本处理及要求： 1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上 清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心 20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。 3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程

中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。 4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/ 分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备 用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。 6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上 进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融. 7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 操作步骤： 1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标 准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为90 μg/L，60 μg/L ，30 μg/L，15 μg/L，7.5 μg/L）。 2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样 品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。 4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。 5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此 重复5次，拍干。 6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 7.温育：操作同3。 8.洗涤：操作同5。 9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色 15分钟. 10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止 液后15分钟以内进行。 注意事项： 1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。 2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

真核生物与原核生物基因表达调控的区别

原核生物和真核生物基因表达调控特点的比较1.相同点:转录起始是基因表达调控的关键环节2.不同点:A.原核基因的表达调控主要包括转录和翻译水平 真核基因的表达调 控主要包括染色质活化、转录、转录后加工、翻译、翻译后加工多个层次B.原核基因表达调控主要为负调控,真核主要为正调控C.原核转录不需要转录因子,RNA聚合酶直接结合启 动子,由sita因子决定基因表的的特异性 真核基因转录起始需要基础特异两类转录因子 依赖DNA-蛋白质、蛋白质-蛋白质相互作用 调控转录激活D.原核基因表达调控主要采用操纵子模型 转录出多顺反子RNA 实现协调调节 真核基因转录产物为单顺反子RNA 功能相关蛋白的协调表达机制更为复杂。真核生物基因表达调控的环节主要在转录水平 其次是翻译水平。原核生物基因以操纵子的形式存在。转录水平调控涉及到启动子、sita因子 与RNA聚合酶结合 、阻遏蛋白 负调控 、正调控蛋白、倒位蛋白、RNA聚合酶抑制物、衰减子等。翻译水平的调控涉及SD序列、mRNA的稳定性 不稳定(5’端和3’端的发夹结构可保护不被酶水解mRNA的5’端与核糖体结合 可明显提高稳定性)、翻译产物及小分子RNA的调控作用。真核生物基因表达的调控环节较多 在DNA水平上可以通过染色体 丢失、基因扩增、基因重排、DNA甲基化、染色体结构改变影响基因表达。在转录水平主要通过反式作用因子调控转录因子与TATA盒的结合、RNA聚合酶与转录因子-DNA复合物的结合及转录起始复合物的形成。在转录后水平主要通过RNA修饰、剪接及mRNA运输的控制来影响基因表达。在翻译水平有影响起始翻译的阻遏蛋白、5’AUG、5’端非编码区长度、mRNA 的稳定性调节及小分子RNA。真核基因调控中最重要的环节是基因转录 真核生物基因表达需要转录因子、启动子、沉默子和增强子。葡萄糖存在 乳糖不存在 此时无诱导剂

斑马鱼(Zebra fish)脂联素(ADPN)ELISA试剂盒说明书

本试剂盒只能用于科学研究，不得用于医学诊断 斑马鱼（Zebra fish）脂联素（ADPN）ELISA检测试剂 盒 使用说明书 检测原理 试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被脂联素（ADPN）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的脂联素（ADPN）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。 样品收集、处理及保存方法 1.血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。 2.血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。 3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。 4.组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。 5.保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。自备物品 1.酶标仪（450nm） 2.高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL 3.37℃恒温箱 操作注意事项 1.试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。 2.实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。 3.浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或者空白；按照说明书操作时样本已经稀释5倍，最终结果乘以5才是样本实际浓度。 4.严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。 5.所有液体组分使用前充分摇匀。

人脂联素ELISA试剂盒

人脂联素ELISA试剂盒 产品编号：SEKH0079 适用于人血清、血浆或细胞培养上清液等样本 仅供研究，不用于临床诊断

目录 背景介绍 (01) 检测原理 (01) 注意事项 (02) 安全提示 (02) 试剂盒组成及储存 (03) 自备实验器材 (03) 样品收集及储存 (03) 试剂准备 (04) 检测步骤 (06) 结果判断 (06) 参数表征 (07) 参考文献 (09) 常见问题分析及解决办法 (10)

背景介绍： 脂联素（Adiponectin,ADPN）又称Acrp30、adipoQ、apM1和GBP28，是脂肪细胞分泌的一种内源性蛋白，在葡萄糖和脂质稳态中具有潜在作用。体液中循环脂联素水平较高，约占血浆总蛋白的0.01%。脂联素分子N端为胶原样结构域，C端为球状序列，其中球状区是脂联素生物活性的关键部位，该结构特征与补体因子C1q有明显的序列和结构相似性。虽然它们氨基酸序列几乎不存在同源性，但相似的三维结构和某些保守的氨基酸残基表明脂联素C1q样结构域与TNF超家族成员之间存在进化联系。脂联素可聚集成不同分子量的聚合物，包括三聚体(低分子量)、多聚体(中等分子量)和可能影响生物活性的高聚体(高分子质量)。脂联素在脂肪细胞分化过程中被诱导，胰岛素可刺激脂联素的分泌。脂联素受体有两种形式，分别为AdipoR1和AdipoR2，AdipoR1在骨骼肌中高表达，而AdipoR2主要在肝组织中表达。 检测原理： 本ELISA试剂盒采用基于双抗体夹心法的酶联免疫吸附检测技术。将抗人Adiponectin单克隆抗体包被在酶标板上；分别加入梯度稀释的标准品和预稀释的样本，标准品和样本中的人Adiponectin会与酶标板上的包被抗体充分结合；洗板后加入生物素化抗人Adiponectin抗体，该抗体会与板子上包被抗体捕获的标准品和样本中的人Adiponectin发生特异性结合；洗板后加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉亲和素，生物素与链霉亲和素会发生高强度的非共价结合；洗板后加入显色剂底物TMB，若反应孔中样品存在不同浓度的人Adiponectin，则HRP会使无色TMB变成不同深浅（正相关）的蓝色物质，加入终止液后反应孔会变成黄色；最后，在λmax=450nm（OD=450nm）处测定反应孔样品吸光度（OD），样本中的人Adiponectin浓度与OD成正比，通过绘制标准曲线和四参数拟合软件便可计算出样本中人Adiponectin 的浓度。 原理图：

小鼠脂联素(ADP)说明书

小鼠脂联素（ADP)酶联免疫分析 试剂盒使用说明书 南京金益柏ELISA试剂仅供研究使用目的：南京金益柏ELISA试剂盒用于测定小鼠血清，血浆及相关液体样本中脂联素（ADP)的含量。 实验原理： 南京金益柏ELISA试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠脂联素（ADP)水平。用纯化的小鼠脂联素（ADP)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入脂 联素（ADP)，再与HRP标记的脂联素（ADP)抗体结合南京金益柏ELISA试剂盒，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，南京金益柏ELISA试剂盒并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的脂联素（ADP)呈正相关。南京金益柏ELISA试剂盒用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠脂联素（ADP)浓度。 试剂盒组成： 样本处理及要求： 1. 南京金益柏ELISA试剂盒血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右 （2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心

20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。 3.南京金益柏ELISA试剂盒尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/ 分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。 4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/ 分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。 5.南京金益柏ELISA试剂盒组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS， PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS （PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。 6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上 进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融. 7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 操作步骤： 1.南京金益柏ELISA试剂盒标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔， 在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。 （稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为1800pg/ml ，1200pg/ml ，600pg/ml ，300pg/ml ，150pg/ml ）。 2.南京金益柏ELISA试剂盒加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂， 其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。 4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。 5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此 重复5次，拍干。 6.南京金益柏ELISA试剂盒加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 7.温育：操作同3。 8.洗涤：操作同5。

脂联素的检测意义

脂联素： 脂肪组织主要由大量聚集成团的脂肪细胞构成，脂联素是脂肪细胞分泌的一种内源性生物活性多肽或蛋白质。脂联素是一种胰岛素增敏激素，能改善小鼠的胰岛素抗性和动脉硬化症；对人体的研究发现，脂联素水平能预示II型糖尿病和冠心病的发展，并在临床试验表现出抗糖尿病、抗动脉粥样和炎症的潜力。 概述： 研究人员发现了一种调节脂联素的新化合物，从而为研究脂联素功能和胰岛素敏感性机制提出了一种新途径。胰岛素是由胰脏β细胞分泌出来的激素，主要功能是促进血液中的葡萄糖进入肌肉或脂肪组织，提供人体所需的能量。当胰岛素不能发挥作用时，血液中的葡萄糖便无法转化为人体所需的能量，导致血糖升高，糖尿病由此发生。而胰岛素抗阻是指细胞不能有效利用胰岛素甚至对胰岛素的反应不再敏锐，这是造成糖尿病的最主要原因。科学家们相信游离脂肪酸和某些脂肪所释放的分子是引发胰岛素抗阻现象的罪魁祸首。Lily Dong和合作者一直在寻找与脂联素受体相关的蜂窝状蛋白质，以期发现调节脂联素激素功能的新靶标。 脂肪因子是由脂肪组织分泌的具有生物活性的细胞因子及激素,与胰岛素抵抗冠状动脉粥样硬化等代谢过程密切相关。其中,脂联素是外周血中含量最高的脂肪因子,在健康人中血浆脂联素水平为 5~30μg/mL。脂联素与其受体结合后,通过激活腺苷酸活化蛋白激酶(adenosinemonophos-phate-activatedproteinkinase,AMPK)、

p38丝裂原活化蛋白激酶和过氧物酶体增殖物激活受体(peroxidaseproliferationactivatedreceptor,PPAR)等信号分子发挥抗炎、抗糖尿病、抗动脉粥样硬化等多种生物学作用。在动物实验中,脂联素基因敲除小鼠较正常小鼠容易发生严重的免疫排斥反应,注射脂联素后排斥反应明显改善,表明脂联素可以降低小鼠的免疫排斥反应。而Wilk等研究发现，脂联素对抗原激活的效应T细胞有抑制作用,推测脂联素与免疫调节有关。 风湿性疾病泛指影响骨、关节及周围软组织的一组疾病,主要的病理改变有炎症和非炎症性病变。炎症性反应除痛风性关节炎是因尿酸结晶导致外，其余大部分因免疫反应引起。进一步研究显示，脂联素在类风湿关节炎(heumaticarthritis，RA)患者血浆及关节液中表达水平升高,且关节液中脂联素水平与白细胞数呈负相关。在系统性红斑狼疮(systemiclupuserythematosus,SLE)患者血清中的表达水平高于正常对照者,且与患者的疾病活动度明显相关。 生化特征： 在脂肪细胞分泌的具有生物活性的一类蛋白质因子中脂联素是脂肪组织基因表达最丰富的蛋白质产物之一，大量存在于血液循环中。在人体内以3-30ug/ml的浓度出现在循环血浆中。脂联素又被称作Acrp30、apM1、AdipoQ、GBP28，最初, 脂联素是在人体皮下脂肪组织、血浆和鼠科动物的脂肪细胞中被发现。人体内的脂联素由244个氨基酸组成，分子量为30KD.由氨基末端的分泌信号序列( aa 1-18) ，一段特异序列(aa19-41),一组由22个氨基酸组成