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细菌内毒素检查法

细菌内毒素检查法
细菌内毒素检查法

细菌内毒素检查法

1 简述

1.1 本规范适用于细菌内毒素检查法——凝胶法和光度测定法。后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时,可使用其中任何一种方法进行实验。当测定结果有争议时,除另有规定外,以凝胶限度试验结果为准。

1.2 供试品细菌内毒素限值的确定

1.2.1 药典中有规定的,按供试品各论中规定限值;

1.2.2 尚无标准规定的,按以下公式确定供试品内毒素限值:

L=K/M

式中

L为供试品的细菌内毒素限值,以EU/ml、EU/mg、EU/U表示。

K为按规定的给药途径,人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量,以EU/(k g?h)表示。其中注射剂,K=5EU/(k g?h);放射性药品注射剂,K=2.5EU /(k g?h);鞘内用注射剂,K=0.2EU/(k g?h)。

M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量,以m1/(k g?h)、mg/(k g?h)、U/(k g?h)表示。药品人用最大剂量可参阅国家批准的药品说明书和《临床用药须知》等权威著作,中国人均体重按60kg计算,注射时间小于l小时的按l小时计。若供试品按体表面积给药,供试品每平方米体表面积计量乘以0.027即可转换为每千克体重计量[即M=(最大给药剂量/(m2·h)×1.62m2)/60kg]。

1.3 供试品最大有效稀释倍数的确定

供试品的最大有效稀释倍数(MVD)按下式计算:

MVD=CL/λ

L为供试品的细菌内毒素限值;C为供试品溶液的浓度。当L以EU/ml表示时,C等于1.0ml/m1;当L的单位以EU/mg或EU/U表示时,C为供试品制备成溶液后的浓度,单位为mg/m1或U/m1。

作业指导书指导书编号TYFDC-SOP-FF-073

细菌内毒素检查法第2页共18页

第二版

批准李忠华初审吴雅凝起草吴雅凝λ在凝胶法中为鲎试剂的标示灵敏度,在光度测定法中为所使用的标准曲线

中的最低内毒素浓度。

如供试品为注射用无菌粉末或原料药,则MVD取1,可计算供试品的最小有效稀释浓度C:λ/L。

1.4 在使用新一批号的鲎试剂前,必须进行鲎试剂灵敏度复核实验。

1.5 药典中已有规定的品种或有其他内毒素检验标准的品种,可直接进行内毒素检查,如在检验中出现干扰的情况需再进行干扰实验的验证;其他未建立内毒素检查的品种需先进行干扰实验,确定不干扰浓度后再进行内毒素检查。

1.6 细菌内毒素检查过程中的阴性对照、阳性对照和供试品阳性对照必须同时进行,否则实验结果无效。

2 实验材料及用具

2.1 天平供试品称量用,精度为0.1mg以下。

2.2 电热干燥箱除外源性内毒素用,温度应能达到250℃。

2.3 恒温水浴箱或适宜的恒温器(37℃±1℃)。

2.4 水银温度计或酒精温度计,精度在l℃以下。

2.5 旋涡混合器。

2.6 鲎试剂,应具有国家主管部门的批准文号。

2.7 细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品,除另有规定外,应使用由中国药品生物制品检定所统一发放的标准品。

2.8 凝胶法细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准,其内毒素含量小于0.015EU/ml(用于凝胶法)0.005EU/ml(用于光度测定法)且对内毒素试验无干扰作用。

2.9 实验用具移液管(或刻度吸管、微量加样器及无热原吸头)、凝集管(10m m ×75mm)、三角瓶、试管、试管架、洗耳球、时钟、75%酒精棉、剪刀、砂轮。所用玻璃器皿须经250℃干烤至少30min。若使用塑料器械,如微孔板和与微量加样器配套的吸头等,应选用标明无内毒素并且对实验无干扰的器械。

2.10 细菌内毒素光度测定仪器。

3 实验准备

3.1 玻璃器皿的洗涤将玻璃器皿放入铬酸洗液或其他热原灭活剂或清洗液中充分浸泡,然后取出将洗液空干,用自来水将残留洗液彻底洗净,再用蒸馏水反复冲洗三遍以上,空干后放入适宜的密闭金属容器中或用锡箔纸包好后再放入金

属容器内,放置入电热干燥箱。

3.2 除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素玻璃器皿置烤箱后,将烤箱调至250℃,待烤箱温度升至设定的温度后开始计时,干烤至少30min。达到规定时间后,关断电源,待烤箱温度自然降至室温。在不打开金属容器的情况下,可在两天内使用;如果玻璃器皿用锡箔纸包装,在不打开包装的情况下可在两周内使用,否则须再次干烤除去可能存在的外源性内毒素。

3.3 供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。必要时,可调节被测溶液(或其稀释液)的pH值,一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在在6.0~8.0的范围内为宜,可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲液调节pH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在己去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。

4 凝胶法操作方法

4.1 鲎试剂灵敏度复核

鲎试剂灵敏度复核的目的不仅是考察鲎试剂的灵敏度是否准确,也是考察检验人员操作方法是否正确及实验条件是否符合规定。

因此要求每个实验室在使用一批新的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时,应进行鲎试剂灵敏度复核实验。

4.1.1 实验操作

4.1.1.1 细菌内毒素标准溶液的制备

取细菌内毒素国家标准品或工作标准品一支,轻弹瓶壁,使粉末落入瓶底,然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕,75%酒精棉球擦拭后启开,启开过程中应防止玻璃屑落入瓶内。

按照标准品说明书,加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物,用封口膜将瓶口封严,置旋涡混合器上混合15min。然后进行稀释,制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液,即2λ、λ、0.5λ、0.25λ(λ为所复核的鲎试剂的标示灵敏度),每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30s(详细过程参见标准品使用说明书)。

若使用的为细菌内毒素国家标准品,可按其使用说明书中的方法将其稀释至规定浓度后分装、保存。若为细菌内毒素工作品,为一次性使用。

4.1.1.2 待复核鲎试剂的准备

取规格为0.1ml/支的鲎试剂18支,轻弹瓶壁,使粉末落入瓶底,用砂轮在瓶颈轻轻划痕,75%酒精棉球擦拭后启开备用,防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1ml检查用水溶解,轻轻转动瓶壁,使内容物充分溶解,避免产生气泡。若待复核鲎试剂的规格不是0.1ml/支时,取若干支按其标示量加入检查用水复溶,充分溶解后将鲎试剂溶液混和在一起,然后每o.1m1分装到10m m×75mm凝集管中,要求至少分装18管备用。

4.1.1.3 加样

将已充分溶解的待复核鲎试剂18支(管)放在试管架上,排成5列,其中4列4支(管),1列2支(管)。4支(管)4列每列每支分别加入0.1ml的2λ、λ、0.5λ和0.25λ的内毒素标准溶液;另2支(管)加入0.1ml检查用水。

4.1.1.4 加样结束后,将鲎试剂用封口膜封口,轻轻振动混匀,避免产生气泡,连同试管架放人37℃±1℃水浴或适宜恒温器中,试管架保持水平状态,保温60±2min。

4.1.1.5 观察并记录结果。将试管架从水浴中轻轻取出,避免振动,将每管拿出缓缓倒转180°观察,管内形成凝胶,并且凝胶不变形,不从管壁滑脱者为阳性,记录为(+);未形成凝胶或凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性,记录为(-)。

4.1.2 实验结果计算

如最大浓度2λ4管均为阳性,最低浓度0.25λ 4管均为阴性,阴性对照为阴性时实验为有效,按下式计算反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的复核结果(λc)。

λc=lg-1(∑X/n)

式中X为反应终点浓度的对数值(lg)。反应终点浓度是系列递减的内毒素标准溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。n为每个浓度的平行管数。

4.1.3 结果判断

当λc在0.5λ~2λ(包括0.5λ和2λ)时判定该批鲎试剂灵敏度复核合格,可用于干扰实验和供试品细菌内毒素检查,并以λ(标示灵敏度)为该批鲎试剂的灵敏度。

4.1.4 举例

设待复核鲎试剂的灵敏度为0.125EU/m1。实验结果如下:

内毒素浓度(EU/ml)0.25 0.125 0.0625 0.031 Nc 反应终点浓度

重复管数1 + + - - - 0.125

2 + - - - - 0.25

3 + + + - 0.0625

4 + + + - 0.0625

λc =lg-1(∑X/4)

=lg-1[(lg0.125+lg0.25+lg0.0625+lg0.0625)/4]

=0.105(EU/m1)

λc在0.5λ~2λ范围内,符合规定。并且使用该批鲎试剂时,其灵敏度为标示灵敏度0.125EU/ml。

4.2 干扰实验

4.2.1 操作方法

干扰实验的目的是确定供试品在多大的稀释倍数或浓度下对内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作用,为能否使用细菌内毒素检查法提供依据。并且验证当供试品的配方和工艺有变化,鲎试剂来源改变或供试品阳性对照结果呈阴性时供试品是否存在干扰作用。

由于干扰实验检验的是在供试品存在的情况下内毒素与鲎试剂的反应是否正常,与所使用鲎试剂的灵敏度无关,因此在干扰实验预实验中原则上可使用任一灵敏度的鲎试剂。但建议使用较低灵敏度(如0.5或0.25EU/m1)的鲎试剂,可尽量避免供试品所含的内毒素对干扰实验造成的阳性影响。

4.2.1.1 干扰实验预实验

预实验的目的是初步确定供试品的最大不干扰浓度(当限值以EU/mg或EU /U活性单位表示)或最小不干扰稀释倍数(当限值以EU/m1表示),为正式干扰实验提供依据。

4.2.1.1.1 将无可检测到内毒素的供试品进行一系列倍数的稀释,但最大的稀释倍数不得超过MVD=CL/λ0.03(0.03EU/ml为现今我国市售鲎试剂的最高灵敏度)。

4.2.1.1.2 使用鲎试剂对每一稀释倍数进行检验。每一稀释倍数下做2支供试品管和2支供试品阳性对照(即用该浓度的供试品稀释液将内毒素标准品制成2λ

浓度)。另取2支加入细菌内毒素检查用水作为阴性对照,2支加入2λ浓度的内毒素标准溶液作为阳性对照。

供试品阳性对照制备举例:制备稀释倍数为4的供试品阳性对照液方法,取0.3ml浓度为4λEU/ml的内毒素标准液+0.3ml的稀释倍数为2的供试品稀释液一个制得0.6ml含2λEU/m1内毒素标准的稀释倍数为4的供试品稀释液。

保温60±2min后,观察并记录结果。

4.2.1.1.3 当阴性对照为阴性,阳性对照为阳性时,实验为有效。当系列浓度中出现供试品溶液2管为阴性,供试品阳性对照2管为阳性时,认为供试品在该浓度下不干扰实验,此稀释倍数即为最小不干扰稀释倍数。即可选择该稀释倍数进行正式干扰实验。

当系列浓度中所有浓度的供试品管都不为阴性,或供试品阳性对照不为阳性时,说明供试品对内毒素与鲎试剂的反应存在干扰,则应对供试品进行更大倍数稀释(不得超过MVD=CL/λ0.03),或通过其他适宜的方法(如过滤、中和、透析或加热处理等)排除干扰。为确保所选择的处理方法能有效地排除干扰几不会使内毒素失去活性,要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验。

当供试品的内毒素限值单位为EU/mg或EU/U活性单位时,应将最小不干扰稀释倍数换算成最大不干扰浓度(即该稀释倍数下溶液的浓度),以mg/ml 或活性单位/m1表示。

4.2.1.1.4 举例

例:设某注射液限值为2.5EU/ml,按MVD=CL/λ计算出灵敏度为0.03EU /m1下的MVD为83倍,将供试品溶液稀释一系列检验,用灵敏度为0.25EU /ml的鲎试剂进行预实验。结果如下

稀释倍数原液 5 10 20 40 80 供试品溶液- - - - - - - - - - - -

供试品阳性对照- - - - - - ++ ++ ++ 如上结果可初步确定该样品的最小不干扰稀释倍数为20倍,可在此浓度下进行正式干扰实验。

4.2.1.2 干扰实验

目的是检验在某一浓度下的供试品对于鲎试剂与内毒素的反应有无干扰作用。使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过所使用的鲎试剂的最大有效稀释倍数的溶液。

4.2.1.2.1 制备内毒素标准对照溶液

取1支细菌内毒素标准品,用细菌内毒素检查用水稀释成4个浓度的标准溶液即2λ、λ、0.5λ、0.25λ,(方法同4.1.1.1.1)。

4.2.1.2.2 制备含内毒素的供试品溶液

4.2.1.2.2.1 将供试品稀释至预实验中确定的不干扰稀释倍数,再用此稀释液将4.2.1.2.1中的同支细菌内毒素标准品稀释成4个浓度即2λ、λ、0.5λ、0.25λ的含内毒素的供试品溶液。

以注射用头孢哌酮钠(1g/瓶)为例:取10ml检查用水溶解注射用头孢哌酮钠即为100mg/ml,设需将其稀释20倍(5mg/m1)后备用。(注:冻干品或无菌粉末用检查用水溶解后体积有无变化,根据具体情况定)。

取一支细菌内毒素标准品,加入lml检查用水溶解,然后取内毒素标准溶液0.3ml制备内毒素标准对照溶液;再取内毒素标准溶液0.3ml加上2.7ml的5mg/ml头孢哌酮钠溶液,即为含10倍内毒素稀释液的供试品溶液,取0.3ml含10倍内毒素稀释液的供试品加上2.7ml的5mg/ml头孢哌酮钠溶液,即为含100倍内毒素稀释液的供试品溶液。其余依次类推。

4.2.1.2.2.2 简化法制备含内毒素的供试品溶液:

0.5ml浓度为1.0EU/m1的内毒素标准溶液+0.5ml浓度为10mg/ml的供试品溶液→得到lml的含2λ内毒素的浓度为5mg/m1的供试品溶液。

同理分别用0.5ml浓度为0.5EU/ml、0.25EU/ml和0.125EU/ml的内毒素标准溶液制备含0.25EU/ml、0.125EU/ml和0.0625EU/ml内毒素的浓度为5mg/ml的供试品系列溶液。(其体积的大小视情况而定)。

4.2.1.2.3 鲎试剂的准备

取规格为0.1ml/支的鲎试剂28支,轻弹壁使粉末落入瓶底,用砂轮在瓶颈轻轻划痕,75%酒精棉球擦拭后启开备用,防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1ml 检查用水溶解,轻轻转动瓶壁,使内容物充分溶解,避免产生气泡。若待复核鲎试剂的规格不是0.1ml/支时,按其标示量加入检查用水复溶,将复溶后的鲎试剂溶液混和在一起,然后每0.1m1分装到10×75mm凝集管中,要求至少分装36

管备用。

4.2.1.2.4 加样

将准备好的鲎试剂取其中10支(管)放在试管架上,排成5列,4列2支(管),1列2支(管)。其中的2支4列每列每支分别加入0.1ml的2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准溶液(C),另一列2支(管)加入0.1ml检查用水作为阴性对

照(D)。

将另外18支(管)鲎试剂放在试管架上,排成5列,4列4支(管),1列2支(管)。其中的4支4列每列每支分别加入0.1ml的含2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的内毒素的供试品溶液(B),另一列2支(管)加入0.1ml供试品溶液作为样品阴性对照(A)。

加样结束后,用封口膜封口,轻轻振动混匀,避免产生气泡,连同试管架放人37℃±1℃水浴或适宜恒温器中,保温60±2min后,观察并记录结果。

4.2.2 实验结果计算

只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性,并且系列溶液C 的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时,试验方为有效。

4.2.3 结果判断

当系列溶液B的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时,认为供试品在该浓度下无干扰作用。其他情况则认为供试品在该浓度下存在干扰作用。若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰,应将供试品溶液进行不超过MVD 的进一步稀释,再重复干扰试验。

应使用适宜方法(如过滤、中和、透析或加热处理等)排除于扰,如对供试品进行更大倍数稀释,是排除干扰因素的简单有效方法。建立新品种细菌内毒素检查方法时,每个厂家至少取三个批号(不包括亚批)的供试品,用两个以上鲎试剂生产厂家的鲎试剂进行干扰实验。

4.2.4 举例

设供试品为某注射液,预实验中初步确定其最小不干扰稀释倍数为20倍,使用灵敏度为0.125EU/m1的鲎试剂检测供试品是否对内毒素检查存在干扰。

内毒素浓度(EU/ml)0.25 0.125 0.0625 0.03 Nc 反应终点浓度

内毒素标准溶液

+ + + - - 0.0625

+ + + - - 0.0625

含供试品的内毒素溶液+ + - - - 0.125 + + - - - 0.125 + + - - 0.125 + + - - 0.125

系列溶液B与C的结果均符合鲎试剂灵敏度复核试验要求,说明该供试品进行20倍稀释后确已排除干扰作用,在低于或等于此浓度的情况下即可使用细菌

内毒素检查法。

4.3 供试品细菌内毒素检查凝胶限度试验

在细菌内毒素检查中,每批供试品必须做2支供试品管和2支供试品阳性对照,同时每次实验必须做2支阳性对照和2支阴性对照。

4.3.1 操作方法

4.3.1.1 供试品溶液的制备

首先计算MVD=C·L/λ,C、L的意义同1.3。λ为所使用鲎试剂的标示灵敏度。然后将供试品进行稀释,其稀释倍数不得超过MVD。

4.3.1.2 阳性对照溶液的制备

用检查用水将内毒素标准品稀释制成2λ浓度的内毒素标准溶液。

(方法同4.1.1.1)。

4.3.1.3 供试品阳性对照溶液的制备

用待检测的供试品溶液或其稀释液将内毒素标准品制成2λ浓度的内毒素溶液。(方法同4.2.1.3.2供试品阳性对照溶液的制备)。

4.3.1.4 阴性对照液即细菌内毒素检查用水

4.3.1.5 鲎试剂的准备

取规格为0.1ml/支的鲎试剂8支,轻弹瓶壁使粉末落人瓶底,用砂轮在瓶颈轻轻划痕,75%酒精棉球擦拭后启开备用,防止玻璃屑落人瓶内。每支加入0.1ml检查用水溶解,轻轻转动瓶壁,使内容物充分溶解,避免产生气泡。若使用的鲎试剂的规格不是0.1ml/支时,取若干支,按其标示量加入检查用水复溶,

充分溶解后将鲎试剂溶液混和在一起,然后每0.1m1分装到10×75mm凝集管中,要求至少分装8管备用。

4.3.1.6 加样取8支(管)溶解好的鲎试剂,其中2支加入0.1ml供试品溶液或其稀释液(其稀释倍数不得超过MVD)作为供试品管,2支加入0.1ml阳性对照溶液作为阳性对照管(PC),2支加入0.1ml检查用水作为阴性对照管(NC),

2支加入0.1ml供试品阳性对照溶液作为供试品阳性对照管(PPC)。

4.3.1.7 将试管中溶液轻轻混匀后,用封口膜封闭管口,垂直放入37℃±1℃水浴或适宜恒温器中,保温60±2min。保温和取放试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。

4.3.2 结果判断

当阳性对照都为阳性、供试品阳性对照都为阳性且阴性对照都为阴性时,实验方为有效。若供试品2管均为阴性,认为该供试品符合规定;如供试品2管均为阳性,应认为不符合规定;如2管中1管为阳性,1管为阴性,按上述方法另取4支供试品管复试,4管中如有1管为阳性,即认为不符合规定。若第一次实验时供试品的稀释倍数小于MVD而结果出现2管均为阳性或2管中1管为阳性时,按同样方法复试,复试时要求将其稀释至MVD。

若供试品的稀释倍数小于MVD而溶液A出现不符合规定时,需将供试品稀释至MVD重新实验,再对结果进行判断。

4.3.3 举例

供试品为葡萄糖注射液,其内毒素限值为0.5EU/ml,设所用鲎试剂的灵敏度为0.125EU/ml,

MVD=C·L/λ=0.5/0.125=4

将样品进行4倍稀释,并做4倍稀释下的供试品阳性对照。

供试品供试品阳性对照阳性对照阴性对照

- - + + + + - -

结果是否有效有效

结果判断该批葡萄糖注射液的内毒素含量小于0.5EU/ml,符合规定

4.4 凝胶半定量实验

半定量实验是使用凝胶法估测供试品中内毒素含量的方法。系利用供试品系

列与鲎试剂反应的终点浓度计算出供试品中内毒素的含量。

4.4.1 操作方法

4.4.1.1 供试品系列的制备

用检查用水将供试品溶液从已确定的不干扰浓度或稀释倍数下开始进行对倍稀释,制备成2、4、8等n个浓度,但最大稀释倍数不得超过MVD。n可根据实验设计不同确定。

4.4.1.2 内毒素标准系列的制备

用检查用水将内毒素标准品稀释成4个浓度的标准溶液即2λ、1λ、0.5λ、0.25λ,(方法同4.1.1.1)。

4.4.1.3 供试品阳性对照溶液的制备

用已确定不干扰浓度或稀释倍数的供试品溶液将内毒素标准品制成2λ浓度的内毒素溶液。(方法同4.2.1.1.2供试品阳性对照溶液的制备)。

4.4.1.4 阴性对照液即细菌内毒素检查用水。

4.4.1.5 鲎试剂的准备

取规格为0.1ml/支或分装好的鲎试剂12+2n支,其他准备按正式干扰实验项下的“鲎试剂准备”。

4.4.1.6 加样

将准备好的鲎试剂取其中10支(管)放在试管架上,排成5列,每列2支。其中4列每列每支分别加入0.1ml的2λ、λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准溶液,另一列2支(管)加入0.1ml检查用水作为阴性对照。

将另外2n支(管)鲎试剂放在试管架上,排成n列,每列2支(管)。每列每支分别加入0.1ml一个浓度的供试品溶液。

另2支(管)加入0.1ml供试品阳性对照溶液作为供试品的阳性对照。

4.4.1.7 将试管中溶液轻轻混匀后,用封口膜封闭管口,垂直放人37℃±1℃水浴或适宜恒温器中,保温60±2min。保温和取放试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。

4.4.2 实验结果计算

如内毒素标准系列最大浓度2λ均为阳性,最低浓度0.25λ均为阴性,阴性对照为阴性供试品阳性对照为阳性时,按下式计算内毒素标准溶液的反应终点浓

度的几何平均值(λt)和供试品系列溶液反应终点浓度的几何平均值(C E)。

λt=lg-1(∑X t/2)

C E=lg-1(∑X E/2)

式中X t为内毒素溶液的反应终点浓度的对数值(1g)。

X E为供试品溶液的反应终点浓度的对数值(lg)。每个系列的反应终点浓

度即每一系列平行管的终点稀释倍数D乘以宣试剂标示灵敏度λ,所有

平行管反应终点浓度的几何平均值即为供试品溶液的内毒素浓度口。4.4.3 结果判断

当λt在0.5λ~2λ之间,试验方为有效。供试品的内毒素含量即为供试品系列反应终点浓度的几何平均值。

系列溶液A中每一系列的终点稀释倍数乘以λ,为每个系列的反应终点浓度。如果检验的是经稀释的供试品,则将终点浓度乘以供试品进行半定量试验的初始稀释倍数,即得到每一系列内毒素浓度c。

若每一系列内毒素浓度均小于规定的限值,判定供试品符合规定。每一系列内毒素浓度的几何平均值即为供试品溶液的内毒素浓度[按公式c E=antilg( c/2)]。如果试验中供试品溶液的所有平行管均为阴性,应记为内毒素浓度小于λ(如果检验的是稀释过的供试品,则记录为小于λ乘以该供试品进行半定量试验的初始稀释倍数)。

若任何系列内毒素浓度不小于规定的限值时,则判定供试品不符合规定。当供试品溶液的所有平行管均为阳性,可记为内毒素的浓度大于或等于最大的稀释倍数乘以λ。

4.4.4 举例

设供试品为某注射液,干扰实验已确定其最小不干扰稀释倍数为20倍,其内毒素限值为10EU/ml,现使用灵敏度为0.03EU/ml的鲎试剂检测供试品中的内毒素含量。

MVD=C·L/λ=10/0.03≈320倍

将供试品溶液先稀释至20倍后,再进行对倍稀释。将20倍稀释液稀释2、4、8、16倍,同时制备内毒素标准系列。

内毒素浓度(EU/m1) 0.0625 0.03 0.015 0.0075 Nc 反应终点浓度

+ - - - - 0.0625 内毒素标准溶液

+ - - - - 0.0625 供试晶稀释倍数 1 2 4 8 16 PPC 反应终点稀释倍数

+ + + + - + 8 供试品系列

+ + + - - + 4 λt=1g-1(∑x t/2)

=lg-1[(lg0.0625+lg0,0625)/2]

=0.0625(EU/m1)

C E=lg-1(∑x/2)

=lg-1[lg(8×0.03)+lg(4×0.03)]/2

=0.170EU/m1

供试品20倍稀释液的内毒素含量=0.170EU/ml

由于供试品先被释释了20倍,因此供试品的内毒素含量为0.170×20=3.40EU /ml,低于规定的内毒素限值,此批注射液内毒素检查项符合规定。

5 光度测定法操作方法

光度测定法分为浊度法和显色基质法。

浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法。根据检测原理,可分为终点浊度法和动态浊度法。终点浊度法是依据反应混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时的浊度(吸光度或透光率)之间存在着量化关系来测定内毒素含量的方法。动态浊度法是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度或透光率所需要的反应时间,或是检测浊度增加速度的方法。

显色基质法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特殊底物显色释放出的有色团的多少而测定内毒素含量的方法。根据检测原理,分为终点显色法和动态显色法。终点显色法是依据反应混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的有色团的量之间存在的量化关系来测定内毒素含量的方法。动态显色法是检测反应混合物的吸光度或透光率到达某一预先设定的检测值度所需要的反应时间,或是检测值增长速度的方法。

5.1 仪器的设置

浊度法分为终点浊度法和动态浊度法,显色基质法也分为终点显色法和动态显色法。针对不同的方法,应配置相应的测定仪器。

在实验开始前,应根据仪器的说明和实验的设计设定反应时间,反应温度(一般为37℃±1℃),检测波长等相关系数。

供试品和鲎试剂的分装加样量、供试品和鲎试剂的比例以及保温时间等,需参照所用仪器和试剂的有关说明进行。

5.2 标准曲线的可靠性试验

当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能会影响检验结果的改变时,需进行标准曲线的可靠性试验。

5.2.1 实验操作

5.2.1.1 细菌内毒素标准溶液的制备

用检查用水将一支内毒素标准品溶解稀释,并制成至少3个浓度的稀释液(相邻浓度间稀释倍数不得大于10),如10、l、0.1EU/ml或0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03EU/m1,但最低浓度不得低于所用鲎试剂的标示检测限。稀释操作方法同凝胶法。

5.2.1.2 鲎试剂的准备

要求内毒素标准系列中每一浓度至少做3支平行管,并要求同时做2支阴性对照。根据所制备的标准曲线中浓度的个数来计算所需要的鲎试剂体积。

由于凝胶法鲎试剂和光度测定法鲎试剂在工艺上有所不同,因此在进行光度法检测时需使用专用鲎试剂而不能用凝胶法鲎试剂代替。光度法鲎试剂都为0.5ml 以上装量,在溶解后需将所有鲎试剂混合在一起,备用。

5.2.1.3 加样

将标准内毒素溶液和阴性对照按仪器要求的体积分装到仪器配置的反应容

器中,如小试管或微孔板。再加入要求体积的鲎试剂,轻轻混匀,避免产生气泡,然后将反应容器放人光度测定仪中进行反应。

5.2.2 结果判断

当阴性对照的吸光度或透光率小于标准曲线最低点的检测值或反应时间大于标准曲线最低点的反应时间,将全部数据进行线性回归分析。

根据线性回归分析,标准曲线的相关系数(γ)的绝对值应大于或等于0.980,

试验方为有效。否则须重新试验。

5.3 干扰实验

干扰实验的目的同凝胶法干扰实验。当鲎试剂、供试品的来源、配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时,须重新进行干扰试验。

5.3.1 实验操作

5.3.1.1 标准曲线的制备

操作同5.2.1.1。

5.3.1.2 将供试品进行一系列的稀释,但不得超过MVD。选择标准曲线中点或一个靠近中点的一个内毒素浓度,设为λm,作为添加到供试品中的标准内毒素浓度。可按如下方法制备供试品每一稀释倍数下的样品阳性对照:

如使用的标准曲线为50、5、0.5、0.05EU/m1的标准系列,选择0.5EU/m1浓度作为λm。现需制备稀释倍数为4的供试品阳性对照液。可取0.3ml浓度为1.0EU/m1的内毒素标准液+0.3ml稀释倍数为2的供试品稀释液制得0.6ml 含0.5EU/m1内毒素标准的稀释倍数为4的供试品稀释液。也可按仪器或试剂厂商提供的其他方法配制。

5.3.1.3 鲎试剂的准备

根据标准曲线及供试品浓度个数来计算所需要的鲎试剂体积。鲎试剂溶解后需将所有试剂混合在一起,备用。

5.3.1.4 加样

标准曲线每个浓度不少于2支平行管,供试品每个浓度不少于2支平行管,同时供试品每个浓度的样品阳性对照也不少于2支平行管。并用检查用水做2支阴性对照。

将标准内毒素溶液、供试品、供试品阳性对照和阴性对照按仪器要求的体积分装到仪器配置的反应容器中,再将鲎试剂也按要求的体积加入到反应容器中,轻轻混匀,避免产生气泡,然后将反应容器放入光度测定仪中进行反应。

5.3.2 实验结果计算

当反应完毕后,仪器自动生成标准曲线并按所得线性回归方程分别计算出供试品溶液和含标准内毒素的供试品溶液的内毒素含量C t和C s,按下式计算供试品每一浓度的回收率(R)。

R=(C s-C t)/λm×100%

5.3.3 结果判断

当供试品的内毒素的回收率在50%~200%之间时,则认为在此浓度下供试品溶液不存在干扰作用。

当供试品系列的内毒素的回收率都不在指定的范围内,可重新制备最低浓度(λ)更低的标准曲线(但不得超过时候鲎试剂的最低检测限),从而提高MVD,将供试品进行更大倍数的稀释来排除干扰。或按“凝胶法干扰试验”中提及的其他适宜方法去除干扰因素,并要重复干扰试验来验证处理的有效性。

5.4 供试品细菌内毒素检查

5.4.1 实验操作

5.4.1.1 标准曲线的制备

操作同5.2..1.1。

5.4.1.2 将供试品稀释至一个已证实无干扰作用的浓度,并同时制备该浓度下的供试品阳性对照。

5.4.1.3 鲎试剂的准备及加样

标准曲线每个浓度不少于2支平行管,供试品不少于2支平行管,供试品阳性对照也不少于2支平行管。并用检查用水做2支阴性对照。

将标准内毒素溶液、供试品、供试品阳性对照和阴性对照按仪器要求的体积分装到仪器配置的反应容器中,再将鲎试剂也按要求的体积加入到反应容器中,轻轻混匀,避免产生气泡,然后将反应容器放人光度测定仪中进行反应。

5.4.2 结果判断

当反应完毕后,使用标准曲线来计算供试品的每一个平行管的内毒素浓度。

试验必须符合以下三个条件方为有效:

(1)标准曲线的结果要符合“标准曲线的可靠性试验”中的要求。

(2)该浓度下的内毒素回收率要在50%~200%的范围内。

(3)阴性对照的检测值小于标准曲线最低点的检测值或反应时间应大于标准曲线最低点的反应时间。

若供试品溶液所有平行管的平均内毒素浓度乘以稀释倍数后,小于规定的内毒素限值,判供试品符合规定。若大于或等于规定的内毒素限值,判供试品不符合规定。

6 注意事项

6.1 实验前,须用肥皂洗手,用75%酒精棉球消毒。

6.2 在使用洗耳球、移液管取样时,应注意不要将洗耳球中的气体吹人溶液中,以防止气体中的内毒素进入供试液。

6.3 溶解鲎试剂及混匀供试品和鲎试剂时,不要剧烈振荡避免产生气泡。

6.4 由于凝集反应是不可逆的,所以在反应过程中及观察结果时应注意不要使试管受到振动,以免使凝胶破碎产生假阴性结果。

6.5 进行干扰实验时,标准对照系列和含内毒素的供试品溶液系列应同时进行。

6.6 在进行鲎试剂灵敏度复核、干扰实验和供试品细菌内毒素检查时,各个实验中要求的对照应同时进行,并在实验有效的情况才能进行计算和判断。

6.7 实验操作应在清洁环境中进行,过程中应防止微生物的污染。

——本规范依据《中国药典》2015年版四部通则1143细菌内毒素检查法制定。

中国药典2010年版《细菌内毒素检查法》

中国药典2010年版《细菌内毒素检查法》 ——凝胶法 凝胶法 凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。 鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下,使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度,用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时,应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 根据鲎试剂灵敏度的标示值(λ),将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解,在旋涡混合器上混匀15分钟,然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液,每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。取分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支,其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液,每一个内毒素浓度平行做4管;另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后,封闭管口,垂直放入37℃±1℃恒温器中,保温60分钟±2分钟。 将试管从恒温器中轻轻取出,缓缓倒转180°,若管内形成凝胶,并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性;未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。 当最大浓度2λ管均为阳性,最低浓度0.25λ管均为阴性,阴性对照管为阴性,试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值,即为鲎试剂灵敏度的测定值(λc). λc=1g-1(∑X/4)

式中 X为反应终点浓度的对数值(1g)。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。 当λc在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)时,方可用于细菌内毒素检查,并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。 干扰试验按表1制备溶液A、B、C和D,使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数(MVD)的溶液,按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。 只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性,并且系列溶液C 的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时,试验方为有效。按下式计算系列溶液C和B的反应终点浓度的几何平均值(Es和Et)。 Es= 1g-1(∑Xs/4) Et= 1g-1(∑Xt/4) 式中,Xs、Xt分别为系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的对数值(1g)。当Es在0.5λ—2λ(包括0.5λ和2λ)及Et在0.5Es—2Es (包括0.5Es 和2Es)时,认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD 的稀释倍数下对试验有干扰,应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释,再重复干扰试验。 表1 凝胶法干扰试验溶液的制备

细菌内毒素检查

细菌内毒素检查 1、实验原理 2、实验试剂 3、试验器具 4、检查方法概述 5、供试品溶液的制备 6、内毒素限值的确定 7、最大有效稀释倍数(MVD)的确定 8、鲎试剂灵敏度复核 9、干扰试验 10、供试品的细菌内毒素检查 1、实验原理:利用鲎试剂与微量内毒素产生凝聚反应的现象,以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。 2、实验试剂: ①鲎试剂:从海洋无脊椎动物“鲎”的蓝色血液中提取的变形细胞溶解物,经低温冷冻干燥精制的生物制剂。 鲎试剂的生物活性以其能检出细菌内毒素的最低有效浓度表示,即鲎试剂的灵敏度,单位为EU/ml。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生可能影响检验结果的改变时,应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 ②细菌内毒素国家标准品:系自大肠埃希菌提取精制得到的内毒素,用于标定细菌内毒素工作标准品和标定,仲裁鲎试剂灵敏度。 ③细菌内毒素工作标准品:系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价,用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。 ④细菌内毒素检查用水:指内毒素含量少于0.015EU/ml(用于凝胶法)或0.005 EU/ml (用于光度测定法),且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。 3、实验器具:刻度吸管、凝聚管(10×75mm)、三角瓶、小试管(10×100mm)、试管架、洗耳球、封口膜或金属试管帽、时钟、脱脂棉、吸水纸、剪刀砂轮。 耐热器皿常用干热灭菌法(250℃,30分钟以上)去除,塑料用具应选用无内毒素并且对试验无干扰的器械(目前多为无热源的一次性用品)。 4、检验方法概述 ①凝胶法:限量法、半限量法 ②光度测定法:浊度法(终点浊度法和动态浊度法)、显色基质法(终点浊度法和动态浊度法) 凝胶法:最简单、经济、应用广泛、中国药典的“仲裁”方法,对干扰相对不敏感,较光度测定法不灵敏。 5、供试品溶液的制备 某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸取制成供试品溶液。 一般要求供试品溶液的PH值在6.0~8.0的范围内。 可使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节PH值。 6、内毒素限值的确定 一般按公式:L≡K/M 式中: L为供试品的细菌内毒素限量,以EU/ml,EU/mg、或EU/U(活性单位)表示。

Q4B 附件14 细菌内毒素测试

Q4B Evaluation and Recommendation of Pharmacopoeial Texts for Use in the ICH Regions Annex 14: Bacterial Endotoxins Test General Chapter This draft guidance, when finalized, will represent the Food and Drug Administration's (FDA's) current thinking on this topic. It does not create or confer any rights for or on any person and does not operate to bind FDA or the public. You can use an alternative approach if the approach satisfies the requirements of the applicable statutes and regulations. If you want to discuss an alternative approach, contact the FDA staff responsible for implementing this guidance. If you cannot identify the appropriate FDA staff, call the appropriate number listed on the title page of this guidance. For questions regarding this draft document contact (CDER) Robert King 301-796-1242, or (CBER) Christopher Joneckis 301-827-0373.

内毒素法

细菌内毒素检查法标准操作规程 1 目的 建立细菌内毒素检查法的标准操作规程。规范细菌内毒素检验操作,确保检验数据的准确性。 2 范围 适用于细菌内毒素的检验操作。 3 职责 3.1 质量控制部检验人员对具体操作负责; 3.2 质量保证部负责监督本规程的执行。 4 定义 无 5 内容 5.1 概述与原理 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素,以判断供试品中内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌内毒素检查包括两种方法,即凝胶法和光度测定法,后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时,可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时,除另有规定外,以凝胶限度试验结果为准。 基本原理:鲎试剂是鲎血液细胞提取物的冻干品,主要包含4种成分,分别是C 因子、B因子、凝固酶原和凝固蛋白原。细菌内毒素检查法主要依靠细菌内毒素可以活化其中的C因子,使鲎试剂发生一系列的酶联反应,最终形成凝胶或使凝固酶活化某些外加的显色集团(显色法)的原理,来检测细菌内毒素的量。 细菌内毒素的活性单位有两种表达方式,即EU和IU。美国、中国和日本扥国家使用EU,欧洲地区使用IU。在活性量值上,1EU=1IU,计算是可以互换。 5.2 仪器与用具 5.2.1 电子天平、电热干燥箱、时钟、水浴锅、温度计、试管架、漩涡器、剪刀、无菌封口膜、无热原吸头、试管、砂轮、移液枪,75%乙醇、木棉等。 5.2.2 细菌内毒素标准品 细菌内毒素标准品按级别分为国际标准品、国家标准品和工作标准品。其中,国际标准品是由WHO制备,在世界范围内进行效价的协作标定,主要用于世界各国标定各自国家的标准品之用,细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价。在细菌内毒素检查试验中,应使用细菌内毒素国家标准或细菌内毒素工作标准品。 5.2.3 细菌内毒素检查用水:内毒素含量小于0.015EU/mL(凝胶法),且对内毒素试验无干扰作用。 5.2.4 鲎试剂:一批新的鲎试剂在首次使用时要先进行灵敏度复核,结果符合药典规定后,方可用于后续试验。制备或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时,应进行鲎试剂试验。

细菌内毒素检查法---------------操作规程

******有限公司 标准操作规程 目的 建立细菌内毒素检查操作规程,保证检测结果的准确性。 适用范围 所有原料、成品的细菌内毒素检查。 责任人 QC检验员 内容 1 简述 1.1 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素,以判断供试品中细菌毒素的限量是否符合规定的一种方法。 1.2 细菌内毒素检查包括凝胶法和光度测定法两种方法。供试品检测时可使用其中任何一种方法。当测定结果有争议时,除另有规定外,以凝胶法结果为准。 1.3 本规范适用于凝胶法检查。凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。 1.4 细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示 1.5 细菌内毒素国家标准品(NSE)系自大肠埃希菌提取精制而成,用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。 1.6 细菌内毒素工作标准品(WSE)系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价,用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。 1.7 凝胶法细菌内毒素检查用水(BET水)系指内毒素含量小于0.015Eu/ml灭菌注射用水。光度测定法用的细菌内毒素检查用水,其内毒素的含量应小于0.005Eu/ml。 1.8 鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下,使鲎试剂产生凝集的内毒素

******有限公司 标准操作规程 的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度,用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时,应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 1.9 供试品干扰试验项用于建立新品种细菌内毒素检查方法以及供试品的配方和生产工艺或试验环境有变化,鲎试剂来源不同或供试品阳性对照结果呈阴性时确定供试品是否存在抑制或增强作用。 1.10 检查法项为供试品细菌内毒素检查方法。阴性对照、阳性对照和供试品阳性对照必须同时进行,否则试验结果无效。 2实验材料及用具 2.1 天平供试品称量用,感量为0.1mg以下。 2.2 电热干燥箱除外源性内毒素用,温度应能维持250℃以上至少一小时。 2.3 恒温水浴箱或适宜的恒温器,应能在37土1℃保持一小时。 2.4 水银温度计或酒精温度计,精度在1℃以下。 2.5 旋涡混合器 2.6 鲎试剂(应具有国家主管部门的批准文号)及细菌内毒素检查用水(符合规定)。2.7 细菌内毒素国家标准品(NSE),细菌内毒素工作标准品(WSE),除另有规定外应由中国药品生物制品检定所统一发放。 2.8 实验用具移液管(或刻度吸管,定量移液器)、凝集管(103 75mm)、三角瓶、小试管(163100mm)、试管架、洗耳球、封口膜或金属试管帽、时钟、脱脂棉、吸水纸、剪刀、砂轮所用玻璃器皿须经250℃干烤至少1小时。塑料用具应使用其它适宜的除细菌内毒素方法。 2.9 试剂 75%乙醇、蒸馏水、5%重铬酸钾硫酸洗液。 3 操作方法 3.1 试验准备 3.1.1 洗液的配制配制铬酸洗液或其他适宜的细菌内毒素灭活剂。 3.1.2 玻璃器皿的洗涤将被洗涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并空干水分后置洗液中浸泡4小时,取出将洗液滤干,用自来水将残余的洗液洗净,再用新鲜蒸馏水冲洗干燥后置适宜的密闭金属容器中,迅速置烤箱中。

细菌内毒素定量检测临床意义

细菌内毒素定量检测的临床意义 1.细菌内毒素的本质 细菌内毒素为革蓝氏阴性菌及某些阴性菌样微生物,如立克次体、螺旋体、衣原体细胞壁外膜中的一种脂多糖(Lipoplydscharide, LPS)成分,它往往在细菌生长时释放或细菌死亡时裂解出来。 2.细菌内毒素在机体内反应及临床表现 微量的细菌内毒素进入机体后即可引起机体内发热、血管扩张、血管通透性增加、中性粒细胞增多、补体激活、机体血压下降等一系列病理、生理反应,严重时可导致弥漫性血管内凝血(DIC)及多器官功能衰竭直至休克、死亡。细菌内毒素(内毒素)作为革蓝氏阴性菌细胞壁最外层中的脂多糖(LPS),当严重细菌感染以及脓毒血症和多脏器功能衰竭时它在血浆中的浓度升高,而自身免疫过敏和病毒感染时内毒素水平不会升高,但局部有限的细菌感染,轻微的感染不会导致其升高。内毒素水平的升高一般出现在严重休克,全身性炎症反应综合症(SIRS)和多多脏器功能紊乱综合症(MODS),无细菌性感染患者中水平通常低于那些有细菌性病灶的患者,而从肠道释放因子或细菌移位可能引起诱导。 3.细菌内毒素水平检测在临床上应用 体液细菌内毒素水平检测是诊断和监测细菌性(尤其是革蓝氏阴性菌)疾病感染的一个重要参数,通过内毒素水平的定量快速检测可以预示: (1)作为一个急性重要参数用来鉴别诊断细菌性和非细菌性感染和炎症。(2)监测有感染危险的患者(如外科术后和器官移植后免疫抑制期以及多处创伤后)以及需要重症监护患者,用来探测细菌感染的全身影响或检测脓毒性并发症。(3)评价严重炎性疾病临床进程及预后,如腹膜炎、脓毒症、SIRS和MODS。4.体液内毒素水平测定的临床意义 体液内毒素水平是严重细菌性炎症(尤其是革蓝氏阴性菌)的一个重要的特异性指,而且也是脓毒症和炎症活动有关的多脏器衰竭的可靠指标。内毒

细菌内毒素检查方法

细菌内毒素检查方法综述 【关键词】细菌内毒素检查法;,,,机理;,,,预实验;,,,特殊值 细菌内毒素检查是静脉、鞘内给药药物以及放射性药物等质量检查的一个重要方面。以前,细菌内毒素检查用家兔热原法进行,自从1980年《美国药典》第20版收载了细菌内毒素实验以来,《英国药典》《欧洲药典》《日本药局方》《中国药典》等相继收载了该方法。1995年《美国药典》第23版已收载了471种药品进行细菌内毒素检查,而《中国药典》1995年版也收载了12种药品进行细菌内毒素检查[1],2000版更收载有47种药品利用此方法进行热原检查。细菌内毒素检查法已逐渐代替家兔热原检查法,显示出其在检查热原方面的重要性。本文对细菌内毒素检查法作一综述。 1 方法、机理及影响因素 1.1 应用的方法目前,美国药品食品管理局(FDA)承认3种鲎试剂检测细菌内毒素含量的方法,即凝胶(gelclot)法、生色(chromogenic)法和动态浊度(keniticturbidimetry)法[2]。近年来较新的方法有水箭电泳免疫法(测残余蛋白)、酶联免疫吸附法(测残余酶)。后者所需鲎试剂仅相当于凝胶法的1/100,且灵敏度更高,抗干扰能力更好。《中国药典》1995年版只采用凝胶法。凝胶法是将等体积的供试品溶液和新配制的鲎试剂(TAL)溶液在试管中混匀,一般各0.1 ml,(37±1)℃反应(60±2)min。如果被检测的溶液不含干扰凝集反应的因素,且其含有内素素浓度等于或大于所用鲎试剂的灵敏度(λ)时,就会在试管中显示阳性反应,即形成凝胶;否则呈阴性反应,即呈澄明溶液或轻度混浊,视内毒素的浓度而定[1]。该反应极其灵敏,凝胶形成速率与内毒素浓度成正比,并受温度、反应物中Ca2 /Mg2 离子浓度和pH等因素的影响[3]。同样,《中国药典》2000年版也只采用凝胶法。淘金者https://www.wendangku.net/doc/3710401385.html, 1.2 凝胶法鲎试剂与内毒素反应的机理见图1。 图1 凝胶法鲎试剂与内毒素反应的机理(略) 2 影响细菌内毒素检查的因素 2.1 检品的干扰pH值、离子浓度以及某些干扰成分,都会影响到检查结果的准确性,得到所谓“假阳性”或“假阴性”结果。只有证实检品对凝集反应无干扰之后,检查的结果才是可信的。判断检品是否有干扰要做检品的干扰实验。

中国药典版《细菌内毒素检查法》.pdf

中国药典XXXX年版《细菌内毒素检查法》 ——凝胶法 凝胶法 凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。 鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下,使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度,用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时,应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 根据鲎试剂灵敏度的标示值(λ),将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解,在旋涡混合器上混匀15分钟,然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液,每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。取分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支,其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液,每一个内毒素浓度平行做4管;另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后,封闭管口,垂直放入37℃±1℃恒温器中,保温60分钟±2分钟。 将试管从恒温器中轻轻取出,缓缓倒转180°,若管内形成凝胶,并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性;未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。 当最大浓度2λ管均为阳性,最低浓度0.25λ管均为阴性,阴性对照管为阴性,试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值,即为鲎试剂灵敏度的测定值(λc). λc=1g-1(∑X/4)

式中 X为反应终点浓度的对数值(1g)。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。 当λc在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)时,方可用于细菌内毒素检查,并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。 干扰试验按表1制备溶液A、B、C和D,使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数(MVD)的溶液,按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。 只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性,并且系列溶液C 的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时,试验方为有效。按下式计算系列溶液C和B的反应终点浓度的几何平均值(Es和Et)。 Es= 1g-1(∑Xs/4) Et= 1g-1(∑Xt/4) 式中,Xs、Xt分别为系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的对数值(1g)。当Es在0.5λ—2λ(包括0.5λ和2λ)及Et在0.5Es—2Es (包括0.5Es 和2Es)时,认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD 的稀释倍数下对试验有干扰,应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释,再重复干扰试验。 表1 凝胶法干扰试验溶液的制备

细菌内毒素检查标准操作规程..

细菌内毒素检查标准操作规程 1 简述 1.1 本规范适用于中国药典2005年版附录中细菌内毒素检查法一凝胶法和光度测定法。后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时,可使用其中任何一种方法进行实验。当 测定结果有争议时,除另有规定外,以凝胶法结果为准。 1.2 供试品细菌毒素限值的确定。 (一)药典中有规定的,按供试品各论中规定限值; (二)尚无标准规定的,按以下公式确定供试品内毒素限值: L=K/M 式中 L为供试品的细菌内毒素限值,以EU/ml、EU/mg、EU/U表示。 K为按规定的给药途径,人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量,以EU/kg/h表示。其中注射剂,K=5EU/kg/h;放射性药品注射剂,K=2.5EU/kg/h;鞘内用注射剂, K=0.2EU/kg/h。 M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量,以ml/kg/h、ml/kg/h、U/kg/h表示。药品人用最大剂量可参阅国家批准的药品说明书和《临床用药须知》等权威著作,中国人 均体重按60kg计算,注射时间小于1小时的按1小时计。按人用剂量计算限值时,如遇特殊情况,可根据生产和临床用实际情况做必要调整,但需说明理由。 1.3 供试品最大有效稀释倍数的确定 供试品的最大有效稀释倍数(MV D)按下式计算: MV D=C?L/λ L为供试品的细菌内毒素限值;C为供试品溶液的浓度。当L以EU/ml表示时,C等于1.0ml/ml;当L的单位以EU/mg或EU/U表示时,C为供试品制备成溶液后的浓度,单位为mg/ml 或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药,则MV D取1,可计算供试品的最小有效稀释浓度C: λ/L。

细菌内毒素检查法培训班考核试卷.doc

《细菌内毒素检查法》XX所1999年培训班考核试卷 得分_______________________ 姓名________ 单位__________________ 答题时间____ 年—月—R 一、填空题(20分) 1,热原检查法最早于____ 年首次收载于美国药典—版。中国药 典____ 年版开始收载热原检查法。 2,细菌内毒素检查法1980年USP ___ 版收载细菌内毒素检查法。 3,我国药品细菌内毒索检测的法定方法最早始于1988年,出卫生部 颁布试行,1991年转为正式部标准。__ 年中国药典1990年版第二増补 本收载,中国药典1995年版正式收载 4,中国药典1998年增补本自___ 起实施。 5,我国蛍试剂质量控制的法定方法最早于—年曲一卫生部颁布试行, 经修订后于1991年正式实施。 6,细菌内毒索检查用水系指与灵敏度为___ 或更高灵敏度的蛍试剂 ____ 小时不产生凝集反应的灭菌注射用水。 7,卫生部在颁布该标准时,明确规定:“具冇___ 的賞试剂方可用 于细菌内毒素检查法”。 8,中国药典1998年增补本《细菌内毒索检查法》收载的方法系利用 与__________ 产生凝集反应的机理,以判断供试品中________ 是否符合 规定的一种方法。 9,细菌内内毒素试验所用器川L,需经处理,除去叮能存在的外源性内毒索,常用的方法是—°C干烤至少1小时,也可用其他适宜的方法。 10,细菌内毒素试验中细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准 品用_________ 溶解,在旋涡混合器上混合—分钟,然后制备成各种浓 度的内毒素标准溶液,每稀释一步均应在旋涡混合器上混合—秒钟。 11,______________________________________ 每批新的賞试剂在用于试验前都要进行 ____________________________ 。卷试剂灵敏 度定义为在检查法规定的条件下能检测出内毒素标准溶液或供试品溶液中的

细菌内毒素检查标准操作规程

细菌内毒素检查标准操作规程

细菌内毒素检查标准操作规程 1 简述 1.1 本规范适用于中国药典附录中细菌内毒素检查法一凝胶法和光度测定法。后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时,可使用其中任何一种方法进行实验。当 测定结果有争议时,除另有规定外,以凝胶法结果为准。 1.2 供试品细菌毒素限值的确定。 (一)药典中有规定的,按供试品各论中规定限值; (二)尚无标准规定的,按以下公式确定供试品内毒素限值: L=K/M 式中 L为供试品的细菌内毒素限值,以EU/ml、EU/mg、EU/U表示。 K为按规定的给药途径,人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量,以EU/kg/h表示。其中注射剂,K=5EU/kg/h;放射性药品注射剂,K=2.5EU/kg/h;鞘内用注射剂, K=0.2EU/kg/h。 M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量,以ml/kg/h、ml/kg/h、U/kg/h表示。药品人用最大剂量可参阅国家批准的药品说明书和《临床用药须知》等权威著作,中国人 均体重按60kg计算,注射时间小于1小时的按1小时计。按人用剂量计算限值时,如遇特殊情况,可根据生产和临床用实际情况做必要调整,但需说明理由。 1.3 供试品最大有效稀释倍数的确定 供试品的最大有效稀释倍数(MV D)按下式计算: MV D=C?L/λ L为供试品的细菌内毒素限值;C为供试品溶液的浓度。当L以EU/ml表示时,C等于1.0ml/ml;当L的单位以EU/mg或EU/U表示时,C为供试品制备成溶液后的浓度,单位为mg/ml 或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药,则MV D取1,可计算供试品的最小有效稀释浓度C: λ/L。 λ在凝胶法中为鲎试剂的标示灵敏度,在光度测定法中为所使用的标准曲线中的最低内毒素浓度。 1.4 在使用新一批号的鲎试剂前,必须进行鲎试剂灵敏度复核实验。 1.5 药典中已有规定的品种或有其它内毒素检验标准的品种,可直接进行内毒素检查,如在检验中出现干扰的情况需再进行干扰实验的验证;其它未建立内毒素检查的品种需 先进行干扰实验,确定不干扰浓度后再进行内毒素检查。 1.6 细菌内毒素检查过程中的阴性对照、阳性对照和供试品对照必须同时进行,否则实验结果无效。 2 实验材料及用具 2.1 天平供试品称量用,精度为0.1mg以下。

细菌内毒素的检测

细菌内毒素的检测 摘要:本文研究了注射用头孢哌酮钠他唑巴坦钠细菌内毒素的检测。 本文是在通过调查大量的科技文献的基础上,按照中国药典2000版二部附录XI E细菌内毒素检查法所规定的试验方法而进行的。实验方案是根据注射用头孢哌酮钠他唑巴坦钠的细菌内毒素限度,并结合现有的实验条件而确定的。注射用头孢哌酮钠他唑巴坦钠(Cefoperazone Sodium and Tazuobatanna)为头孢类抗生素头孢哌酮与β-内酰胺酶抑制剂他唑巴坦钠组成的复方注射用无菌粉针,在临床上用于治疗下呼吸道感染、泌尿生殖系统感染、腹腔盆腔感染、以及其他感染。质量标准[国家食品药品监督管理局标准(试行)YBH0538 2003]中控制热原的方法仍为家兔热原法,鉴于家兔热原法有影响因素复杂、操作繁琐、检验成本高等缺点,而用细菌内毒素检查法来控制产品中的热原具有操作简便快捷、检验灵敏度高等优点[1]。为了在大范围内开展本品的细菌内毒素检查,我们对本品进行了细菌内毒素检查凝胶法的研究。本品细菌内毒素限值为0.15Eu/ml,在1.667至0.400mg/ml的浓度范围内,本品对细菌类毒素与鲎试剂的反应无干扰。我们对3批样品进行了检验,并与家兔热原法进行对比,结果一致都为阴性,认为本品可用细菌内毒素检查凝胶法代替家兔热原法。

关键词:注射用头孢哌酮钠他唑巴坦钠细菌内毒素鲎试剂灵敏度复核试验干扰预试验干扰实验热原检查 0引言 细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖(Lipoply Saccharide)和微量蛋白(Protein)的复合物,它的特殊性不是细菌或细菌的代谢产物,而是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有内毒素生物活性的物质。其化学成分广泛分布于革兰氏阴性菌(如大肠杆菌、布氏杆菌、伤寒杆菌、变形杆菌、沙门氏菌等)及其它微生物(如衣原体、立克次氏体、螺旋体等)的细胞壁层的脂多糖,其化学成份主要是由O-特异性链、核心多糖、类脂A三部分组成。(附图1) 附图1 内毒素脂多糖结构示意图 <一>、O—特异性链:位于脂多糖分子最外层的多糖链,是由3—5个单糖(一般不多于25个)连成为一个多糖链。其单糖包括戊糖、氨基戊糖、已糖、氨基已糖、脱氧已糖等,单糖的种类、位置和排列顺序和空间构型,因菌种不同而异。因此,它决定菌体热原的特异性。

细菌内毒素检查法操作规程

标准操作规程 目的 建立细菌内毒素检查操作规程,保证检测结果的准确性。 适用范围 所有原料、成品的细菌内毒素检查。 责任人 检验员 内容 1简述 1.1本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素,以判断供试品中细菌毒素的限量是否符合规定的一种方法。 1.2 细菌内毒素检查包括凝胶法和光度测定法两种方法。供试品检测时可使用其中任何一种方法。当测定结果有争议时,除另有规定外,以凝胶法结果为准。 1.3 本规范适用于凝胶法检查。凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。 1.4 细菌内毒素的量用内毒素单位()表示 1.5 细菌内毒素国家标准品()系自大肠埃希菌提取精制而成,用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。 1.6 细菌内毒素工作标准品()系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价,用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。 1.7 凝胶法细菌内毒素检查用水(水)系指内毒素含量小于0.015灭菌注射用水。光度

测定法用的细菌内毒素检查用水,其内毒素的含量应小于0.005。 1.8 鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下,使鲎试剂产生凝集的内毒素 标准操作规程 的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度,用表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时,应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 1.9供试品干扰试验项用于建立新品种细菌内毒素检查方法以及供试品的配方和生产工艺或试验环 境有变化,鲎试剂来源不同或供试品阳性对照结果呈阴性时确定供试品是否存在抑制或增强作用。 1.10 检查法项为供试品细菌内毒素检查方法。阴性对照、阳性对照和供试品阳性对照 必须同时进行,否则试验结果无效。 2实验材料及用具 2.1 天平供试品称量用,感量为0.1以下。 2.2 电热干燥箱除外源性内毒素用,温度应能维持250C以上至少一小时。 2.3 恒温水浴箱或适宜的恒温器,应能在37 土「C保持一小时。 2.4 水银温度计或酒精温度计,精度在1C以下。 2.5旋涡混合器 2.6 鲎试剂(应具有国家主管部门的批准文号)及细菌内毒素检查用水(符合规定)。 2.7细菌内毒素国家标准品(),细菌内毒素工作标准品(),除另有规定外应由中国药品生物制品检定所统一发放。 2.8 实验用具移液管(或刻度吸管,定量移液器)、凝集管(10 X 75)、三角瓶、小试管(16 X 100)、试管架、洗耳球、封口膜或金属试管帽、时钟、脱脂棉、吸水纸、剪刀、 砂轮所用玻璃器皿须经250C干烤至少1小时。塑料用具应使用其它适宜的除细菌内毒素方法。 2.9 试剂75%乙醇、蒸馏水、5师铬酸钾硫酸洗液。 3操作方法 3.1 试验准备 3.1.1 洗液的配制配制铬酸洗液或其他适宜的细菌内毒素灭活剂。 3.1.2 玻璃器皿的洗涤将被洗涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并空干水分后置

细菌内毒素检查法标准操作规程

细菌内毒素检查法标准操作规程 目的: 建立细菌内毒素检查的基本操作,为细菌内毒素检查人员提供正确的操作规程。 2.依据: 《中华人民共和国药典》2000年版二部。 3.范围: 本标准适用于细菌内毒素检查的操作。 4.职责: QC细菌内毒素检查人员对本标准的实施负责。 5.程序: 5.1. 定义: 5.1.1.细菌内毒素检查法:本法系利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理, 以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法,内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。 5.1.2.细菌内毒素国家标准品:系自大肠杆菌精制得到的内毒素,用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。 5.1.3.细菌内毒素工作标准品:系以细菌内毒素国家标准品为基准进行标定,确定 其重量相当效价,每1ng工作标准品效价应不小于2EU,不大于50EU。细菌内毒素工作标准品用于试验中鲎试剂灵敏度复核干扰试验及设置的各种对照。 5.1.4.细菌内毒素检查用水:系指与灵敏度为0.03EU/ml或更高灵敏度的鲎试剂24 小时不产生凝集反应的灭菌注射用水。 5.2. 实验设备:电热干燥箱(50~300±1)℃、电热恒温水温箱。 实验用具:注射器(精度0.02ml)、针头、试管架、白胶布、砂轮、75%酒精棉球、金属直镊、注射器盒、时钟。 试剂:鲎试剂(其标示值用λ表示)、内毒素工作标准品、内毒素检查用水。 5.3. 用具除热原:试验中所用的试管、注射器、针头、金属直镊等冲洗干净,置电热干燥箱中(注射器、针头、金属直镊等放入注射器盒中封好,再放入干燥箱中),经250℃加热30分钟,除去热原。 5.4. 检查法:

药典三部版通则细菌内毒素检查法

药典三部版通则细菌内 毒素检查法 标准化工作室编码[XX968T-XX89628-XJ668-XT689N]

1143 细菌内毒素检查法 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素,以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌内毒素检查包括两种方法,即凝胶法和光度测定法,后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时,可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时,除另有规定外,以凝胶限度试验结果为准。 本试验操作过程应防止内毒素的污染。 细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示,1EU与1个内毒素国际单位(IU)相当。 细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成,用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价,干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。 细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价,用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。 细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准,其内毒素含量小于 0.015EU/ml(用于凝胶法)或0.005EU/ml(用于光度测定法),且对内毒素试验无干扰作用。 试验所用的器皿需经处理,以去除可能存在的外源性内毒素。耐热器皿常用干热灭菌法(250℃、30分钟以上)去除,也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器皿,如微孔板和与微量加样器配套的吸头等,应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。 供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。必要时,可调节被测溶液(或其稀释液)的pH值,一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0~8.0的范围内为宜,可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。 内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值(L)一般按以下公式确定: L=K/M 式中 L为供试品的细菌内毒素限值,一般以EU/ml、EU/mg或EU/U(活性单位)表示; K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量,以EU/(kg·h)表示,注射剂K=5 EU/(kg·h),放射性药品注射剂K=2.5 EU/ (kg·h),鞘内用注射剂K=0.2 EU/(kg·h); M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量,以ml/(kg·h)、mg/(kg·h)或U/(kg·h)表示,人均体重按60kg计算,人体表面积 按1.62㎡计算。注射时间若不足1小时,按1小时计算。供试品每 平方米体表面积剂量乘以0.027即可转换为每千克体重剂量(M)。

细菌内毒素检查验证方案

细菌内毒素检查验证方案文件编号:VP-QC-2015-06 起草人: 审核人: 批准人:

批准日期:年月日

目录 1 概述 1 2 验证目的及范围 1 3 验证小组人员组成及职责 1 4 验证依据 2 5 验证前准备 2 6 验证的实施 2 7 偏差处理 5 8 验证数据及评估 5 9验证报告及评审 5 10 再验证及周期 5 11 验证文件及归档 5 12 附件 5

1 概述 细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由格兰阴性菌产生的细菌内毒素,以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌内毒素检查报告两种发放,即凝胶法和光度测定法,后者包括浊度法和显色基质法,供试品检测时,可使用其中任何一种方法进行实验。公司自行制备的注射用水需进行细菌内毒素的检查,本方案将采用凝胶法进行试验。 2 验证目的和方法 本验证方案适用于注射用水的细菌内毒素的检查,通过对鲎试剂灵敏度复核试验、干扰试验及凝胶限度试验,建立该产品的细菌内毒素检查方法,并对其有效性进行评价,确保检测方法的专属性、灵敏度,保证检测结果可符合质量标准要求。 3.验证小组人员组成及职责: 3.1验证小组由以下部门人员组成:质量部、QC、生产部。 3.2 验证小组组成及职责列表

4 验证依据 《中华人民共和国药典》2015版1143 细菌内毒素检查法 5.验证前准备 5.1验证人员培训:验证报告起草人有责任在方案批准后(且在验证实施前)对本次验证相关人员进行培训。培训人员记录见附件1。 5.2 确认仪器仪表设施经过确认和校验,并填写确认记录。 6 验证的实施 6.1实验材料及用具 6.1.1电子天平 6.1.2. 电热干燥箱

细菌内毒素检查操作规程

GMP管理文件 一、引用标准:中华人民共和国S药典(2005年版)一部。 二、目的:本标准规定了细菌内毒素检查法标准操作规程。 三、适用范围:适用于细菌内素毒素的检查。 四、责任者:质检人员。 五、正文: 1、简述本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素,以供试吕中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌内毒素检查包括两种方法,即凝胶法和光度测定法,后者包括浊度法和显基质法。供试品检测时,可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时,除另有规定外,以凝胶法结果为准。 细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。 细菌内毒素国家标准品系自大肠杆菌提取精制而成,用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。 细菌内毒素工作标准系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价,用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。 凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量含量小于ml的灭菌

注射用水。光度测定法用的细菌内毒素检查用水,其内毒素的含量应小于ml。 试验所用的器皿需经处理,以去除可能存在的外源性内毒素。常用的方法是在250℃干烤至少60分钟,也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器械,如微孔板和与微量加样器配套的吸头等,应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。试验操作过程应防止微生物的污染。 供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。一般要求供试品溶液的PH值在~的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品,需调节被测溶液(或其稀释液)的PH值,何使用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂家推荐的适宜的缓冲液调节PH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。 最大有效稀释倍数(MVD)的确定最大有效稀释倍数是指在试验中供试品被允许稀释的最大倍数,在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。用以下公式来确定MVD: MVD=Cl/λ C为供品溶液的浓度,当L以EU/ml表示时,则c等于ml,当L 以EU/mg或EU/U表示时,c的单位需为mg/ml或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药,则MVD取1,可计算供试品的最小有效稀

细菌内毒素检查验证方案设计

细菌毒素检查验证方案文件编号:VP-QC-2015-06 起草人: 审核人: 批准人: 批准日期:年月日

目录 1 概述 1 2 验证目的及围 1 3 验证小组人员组成及职责 1 4 验证依据 2 5 验证前准备 2 6 验证的实施 2 7 偏差处理 5 8 验证数据及评估 5 9验证报告及评审 5 10 再验证及周期 5 11 验证文件及归档 5 12 附件 5

1 概述 细菌毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由格兰阴性菌产生的细菌毒素,以判断供试品中细菌毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌毒素检查报告两种发放,即凝胶法和光度测定法,后者包括浊度法和显色基质法,供试品检测时,可使用其中任何一种方法进行实验。公司自行制备的注射用水需进行细菌毒素的检查,本方案将采用凝胶法进行试验。 2 验证目的和方法 本验证方案适用于注射用水的细菌毒素的检查,通过对鲎试剂灵敏度复核试验、干扰试验及凝胶限度试验,建立该产品的细菌毒素检查方法,并对其有效性进行评价,确保检测方法的专属性、灵敏度,保证检测结果可符合质量标准要求。 3.验证小组人员组成及职责: 3.1验证小组由以下部门人员组成:质量部、QC、生产部。 3.2 验证小组组成及职责列表 4 验证依据 《中华人民国药典》2015版1143 细菌毒素检查法 5.验证前准备 5.1验证人员培训:验证报告起草人有责任在方案批准后(且在验证实施前)对本次验证相关人员进行培训。培训人员记录见附件1。 5.2确认仪器仪表设施经过确认和校验,并填写确认记录。

6 验证的实施 6.1实验材料及用具 6.1.1电子天平 6.1.2. 电热干燥箱 6.1.3. 恒温恒湿箱 6.1.4.水银温度计 6.1.5. 旋涡混合器 6.1.6. 鲎试剂(具有国家主管部门的批准文号) 6.1. 7.细菌毒素工作标准品(由中国药品生物制品检定所统一发放的标准品) 6.1.8.细菌毒素检查用水:应符合灭菌注射用水标准,其毒素含量小于0.015EU/ml,且 对毒素试验无干扰作用。 6.1.9. 实验用具:移液管、凝集管、三角瓶、试管、试管架、洗耳球、时钟、75%酒精棉、剪刀、砂轮。 6.2实验准备 6.2.1玻璃器皿的洗涤将玻璃器皿放入铬酸洗液或其他热原灭活剂或清洗液中充分浸泡,然后取出将洗液空干,用自来水将残留洗液彻底洗净,再用蒸馏水反复冲洗三遍以上,空干后放入适宜的密闭金属容器中或用锡箔纸包好后再放入金属容器,放置入烤箱。

细菌内毒素检查方法建立中应注意的几个问题重点

细菌内毒素检查方法建立中应注意的几个问题 摘要:本文对细菌内毒素检查方法的建立、限值的确定、方法学验证及常见问题进行了介绍。在建立细菌内毒素检查法之前,应尽可能多的收集有关该药品的基本信息,例如:有关样品的溶解性信息,推荐的稀释液,在水中的溶解度,以及最适溶剂;样品的pH范围;分子量大小;产品规格、体积或重量;拟用于临床的用法和用量等等。以便选择合适的样品处理方法和内毒素检查方法,对于早期研发阶段的药物,应选择合适的赋形剂,以有利于细菌内毒素检查中对样品的稀释处理。此外,在确定内毒素限值时还应尽可能采用最大人拟用剂量,为临床安全性和有效性研究中增加剂量留出空间。 一、细菌内毒素检查方法建立的主要步骤 对某一新化合物建立细菌内毒素检查方法时,首先应根据人体最大日给药剂量和给药途径,计算和确定样品的内毒素限值,选择合适的鲎试剂,根据临床规格,计算最大有效稀释倍数,稀释产品,并在低于最大稀释倍数的浓度下进行检查。可以采用凝胶法,也可以采用终点法或动态法。当测定结果有争议时,除另有规定外,以凝胶法为准。 1、细菌内毒素限值的确定 一个药品在投放市场前,它是否满足内毒素限值的要求?样品的内毒素含量具体是多少?这些问题不但关注用药安全,还应该最大限度的提供有关内毒素含量的准确信息,为药品生产过程中质量控制提供警戒信息。尽管细菌内毒素检查方法的建立是一个科学方法的研究过程,但其最终目的还是要为控制药品质量服务。因此,在方法建立时,不但要阐明限值的合理性,考虑技术可能达到的限值,同时还要满足相关药品管理法规的要求。 研究人员在建立方法的早期,一般会按照临床建议的最大人用剂量确定一个非正式的限值,这个限值可以根据实验室可以达到的最低检测水平,把限值订的相对比较严格,但往往由于早期的临床剂量会比最终上市的临床剂量高几倍,所以严格的限值,可能会使得正式生产时很多产品不能通过检查,从而造成不必要的浪费;因此参按照法规允许的最高水平,酌情确定样品的限值。 样品内毒素限值的确定一般与临床人体最大给药剂量有关,剂量越大,单位重量或体积的内毒素限值越低。一般按以下公式计算:内毒素限值L=K/M。式中内毒素限值L是以EU/ml、EU/mg或EU/u表示;K为按规定的给药途径,人体每公斤体重每小时最大可耐受的内毒素剂量,以EU/(kg.h)表示,注射剂K=5EU/(kg.h),其中放射性药品注射剂K=2.5EU/(kg.h),鞘内用注射剂K=0.2EU/(kg.h)。一般我国人群平均体重按60kg计算,人体对细菌内毒素的最大耐受量为300EU/h;另我国人体的平均体表面积按1.55m2计算,人体每平方米的最大耐受剂量为(300EU/h)/ 1.55m2 =(193EU/h)/ m2 。 M为人体每公斤体重每小时接受的最大给药剂量,以ml/(kg.h)、mg/(kg.h)或u/(kg.h)表示。 内毒素限值计算举例(一):A注射剂的人体最大用量为每小时1.5g,每公斤每小时体重的剂量为1.5g/60kg=0.025g/kg=25mg/kg,内毒素限值L=K/M=(5EU/kg)/( 25mg/kg ) = 0.2EU/mg。在细菌内毒素检查法中,细菌内毒素标准品和鲎试剂常常以EU/ml表示,所以在具体实验中样品的内毒素的限量可以转换为EU/ml的表示方法,可使实验操作计算更为方便。假定产品A的浓度为100mg/ml(或原料药经溶解后的浓度为100mg/ml), 那么,将产品A的限值从EU/mg转变为EU/ml时,内毒素限值L= 0.2 EU/mg 100 mg/ml = 20 EU/ml。内毒素限值计算举例(二):B注射剂的临床最大用药剂量为1g/m2,规格为50mg/ml,内毒素限值L=(193 EU/ m2)/(1g/m2)=193 EU/g=0.193 EU/mg,转换为EU/ml 表示时,L = 0.193 EU/mg50 mg/ml=9.65EU/ml。 大输液品种的限值一般定为0.5EU/ml,灭菌注射用水则定为0.25EU/ml。内毒素限值没有考

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