(2015年版药典)非无菌药品微生物限度检查操作规程

１、目得：建立非无菌药品微生物限度检查检验标准操作规程,规范检验操作,确保检验结果准确。

２、适用范围:适用于本公司所有采用非无菌药品微生物限度检查法测定得供试品.

３、责任者：QC检验员、ＱC经理。

4、正文:

4、1 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法

４．1.１简述

微生物计数法系用于能在有氧条件下生长得嗜温细菌与真菌得计数。

当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等就是否符合规定得微生物限度标准时，应按下述规定进行检验,包括样品得取样量与结果得判断等。除另有规定外，本法不适用于活菌制剂得检查。

本检查法可采用替代得微生物检查法,包括自动检测方法,但必须证明替代方法等效于药典规定得检查方法。

微生物计数试验应在受控洁净环境下得局部洁净度不低于B 级得单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作,防止再污染，防止污染得措施不得影响供试品中微生物得检出。单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。

如供试品有抗菌活性,应尽可能去除或中与。供试品检查时，若使用了中与剂或灭活剂,应确认其有效性及对微生物无毒性。

供试液制备时如果使用了表面活性剂,应确认其对微生物无毒性以及与所使用中与剂或灭活剂得相容性。

4．1。２计数方法

计数方法包括平皿法、薄膜过滤法与最可能数法（Moｓt—Probabｌe—Ｎｕm ｂerMethod，简称MPN 法)。ＭPN 法用于微生物计数时精确度较差,但对于某些微生物污染量很小得供试品,MＰN 法可能就是更适合得方法。

供试品检查时, 应根据供试品理化特性与微生物限度标准等因素选择计数方法,所选得方法必须具备检测充足样品量得能力,以保证所获得得试验结果能够判断供试品就是否符合规定。所选方法得适用性须经确认。

4.1。3 计数培养基适用性检查与供试品计数方法适用性试验

供试品微生物计数中所使用得培养基应进行适用性检查。

供试品得微生物计数方法应进行方法适用性试验,以确认所采用得方法适合于该

产品得微生物计数。

若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时,计数方法应重新进行适用性试验。

表1 试验菌液得制备与使用

注：当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌与酵母菌总数时,应进行培养基适用性检查,检查方法同沙氏葡萄糖琼脂培养基。

4。１．4 菌种及菌液制备

菌种试验用菌株得传代次数不得超过5 代（从菌种保藏中心获得得干燥菌种为第０代),并采用适宜得菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株得生物学特性。计数培养基适用性检查与计数方法适用性试验用菌株见表1。

菌液制备按表１规定程序培养各试验菌株。取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌得新鲜培养物，用pＨ7、0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0、9％无菌氯化钠溶液制成适宜浓度得菌悬液;取黑曲霉得新鲜培养物加入3~5ml 含0、05%聚山梨酯80 得pH7、０无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或０、９%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜得方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0、０5％聚山梨酯８0 得pH7、０无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或０、9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度得黑曲霉孢子悬液.

菌液制备后若在室温下放置,应在２小时内使用；若保存在２～8℃，可在24小时内使用。稳定得黑曲霉孢子悬液可保存在２~8℃，在验证过得贮存期内使用.

４．1．５阴性对照

为确认试验条件就是否符合要求，应进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。如阴性对照有菌生长,应进行偏差调查。

４.1。６培养基适用性检查

微生物计数用得成品培养基、由脱水培养基或按处方配制得培养基均应进行培养基适用性检查。

按表１规定,接种不大于１0０cfu 得菌液至胰酪大豆胨液体培养基管或胰酪大豆胨琼脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，置表1 规定条件下培养。

每一试验菌株平行制备2 管或2 个平皿。同时,用相应得对照培养基替代被检培

养基进行上述试验。

被检固体培养基上得菌落平均数与对照培养基上得菌落平均数得比值应在0、5—２范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上得菌落一致；被检液体培养基管与对照培养基管比较，试验菌应生长良好。

4。1．7 计数方法适用性试验

⒈供试液制备

根据供试品得理化特性与生物学特性，采取适宜得方法制备供试液.供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不应超过45℃.供试液从制备至加入检验用培养基,不得超过１小时。

常用得供试液制备方法如下。如果下列供试液制备方法经确认均不适用,应建立其她适宜得方法.

⑴水溶性供试品取供试品，用pＨ7、０无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或pH7、

2 磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成１：10 供试液。

若需要,调节供试液pH 值至6～8。必要时,用同一稀释液将供试液进一步１0倍系列稀释.水溶性液体制剂也可用混合得供试品原液作为供试液.

⑵水不溶性非油脂类供试品取供试品,用pH7、0 无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液,或pＨ7、２磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基制备成１：10 供试液。分散力较差得供试品，可在稀释剂中加入表面活性剂如０、1％得聚山梨酯80，使供试品分散均匀.若需要,调节供试液pＨ值至6～8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10 倍系列稀释。

⑶油脂类供试品取供试品,加入经过滤除菌得十四烷酸异丙酯使溶解,或与最少量并能使供试品乳化得无菌聚山梨酯８0 或其她无抑菌性得无菌表面活性剂充分

混匀。表面活性剂得温度一般不超过40℃（特殊情况下，最多不超过45℃），小心混合，若需要可在水浴中进行，然后加入预热得稀释剂使成1∶1０供试液,保温，混合，并在最短时间内形成乳状液。必要时,用含适宜浓度得无菌聚山梨酯８0 或其她无抑制性无菌表面活性剂得稀释剂进一步10 倍系列稀释。

⑷需用特殊方法制备供试液得供试品

膜剂供试品取供试品，剪碎,加pH7、0 无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液，或pH7、2磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基，浸泡,振摇，制备成1∶１0 得供试液。若需要,调节供试液pH 值至6～8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释.

肠溶及结肠溶制剂供试品取供试品,加入pH6、8 无菌磷酸盐缓冲液（用于肠溶制剂）或pH７、6 无菌磷酸盐缓冲液(用于结肠溶制剂）,置45℃水浴中,振摇,使溶解,制备成1∶10 得供试液。必要时，用同一稀释液将供试液进一步1０倍系列稀释。

气雾剂、喷雾剂供试品取供试品，置冰冻室冷冻约1 小时,取出，迅速消毒供试品开启部位，用无菌钢锥在该部位钻一小孔，放至室温，并轻轻转动容器,使抛射剂缓缓全部释出。用无菌注射器从每一容器中吸出全部药液于无菌容器中混合，然后取样检查。

贴膏剂供试品取供试品，去掉防粘层,将粘贴面朝上放置在无菌玻璃或塑料器皿上,在粘贴面上覆盖一层适宜得无菌多孔材料(如无菌纱布),避免贴膏剂粘贴在一起。将处理后得贴膏剂放入盛有适宜体积并含有表面活性剂（如聚山梨脂80 或卵磷脂）稀释液得容器中，振荡至少３０分钟。必要时,用同一稀释液将供试液进一步10 倍系列稀释。

⒉接种与稀释

按下列要求进行供试液得接种与稀释,制备微生物回收试验用供试液。所加菌液得体积应不超过供试液体积得1％。为确认供试品中得微生物能被充分检出，首先应选择最低稀释级得供试液进行计数方法适用性试验。

（1）试验组取上述制备好得供试液，加入试验菌液，混匀，使每１ml供试液或每张滤膜所滤过得供试液中含菌量不大于１00cfu。

（2）供试品对照组取制备好得供试液，以稀释液代替菌液同试验组操作。

(3)菌液对照组取不含中与剂及灭活剂得相应稀释液替代供试液，按试验组操作加入试验菌液并进行微生物回收试验。

若因供试品抗菌活性或溶解性较差得原因导致无法选择最低稀释级得供试液进行方法适用性试验时,应采用适宜得方法对供试液进行进一步得处理。如果供试品对微生物生长得抑制作用无法以其她方法消除,供试液可经过中与、稀释或薄膜过滤处理后再加入试验菌悬液进行方法适应性试验.

⒊抗菌活性得去除或灭活供试液接种后，按下列“微生物回收"规定得方法进行微生物计数。若试验组菌落数减去供试品对照组菌落数得值小于菌液对照组菌数值得50％,可采用下述方法消除供试品得抑菌活性。

⑴增加稀释液或培养基体积。

⑵加入适宜得中与剂或灭活剂.

中与剂或灭活剂（表2）可用于消除抗菌剂得抑菌活性, 最好在稀释剂或培养基灭菌前加入。若使用中与剂或灭活剂，试验中应设中与剂或灭活剂对照组,即取相应量稀释液替代供试品同试验组操作,以确认其有效性与对微生物无毒性.中与剂或灭活剂对照组得菌落数与菌液对照组得菌落数得比值应在0、５～２范围内。

表２常见干扰物得中与剂或灭活方法

⑶采用薄膜过滤法。

⑷上述几种方法得联合使用.

若没有适宜消除供试品抑菌活性得方法，对特定试验菌回收得失败，表明供试品对该试验菌具有抗菌活性,同时也表明供试品不可能被该类微生物污染。但就是，供试品也可能仅对特定试验菌株具有抑制作用，而对其她菌株没有抑制作用。

因此,根据供试品须符合得微生物限度标准与菌数报告规则,在不影响检验结果判断得前提下，应采用能使微生物生长得更高稀释级得供试液进行计数方法适用性试验。若方法适用性试验符合要求，应以该稀释级供试液作为最低稀释级得供试液进行供试品检查.

⒋供试品中微生物得回收

表１所列得计数方法适用性试验用得各试验菌应逐一进行微生物回收试验。

微生物得回收可采用平皿法、薄膜过滤法或MPＮ法。

⑴平皿法平皿法包括倾注法与涂布法。表1 中每株试验菌每种培养基至少制备2 个平皿，以算术均值作为计数结果。

倾注法取照上述“供试液得制备"、“接种与稀释”与“抑菌活性得中与或消除”制备得供试液1ｍl,置直径90mm 得无菌平皿中，注入15～20mｌ温度不超过4５℃熔化得胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。

若使用直径较大得平皿,培养基得用量应相应增加。按表1 规定条件培养、计数。

同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。计算各试验组得平均菌落数。

涂布法取１５～20ｍl 温度不超过45℃得胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基，注入直径９０mm 得无菌平皿，凝固，制成平板,采用适宜得方法使培养基表面干燥.若使用直径较大得平皿，培养基用量也应相应增加。每一平皿表面接种上述照“供试液得制备”、“接种与稀释”与“抑菌活性得中与或消除"制备得供试液不少于0、1ｍl。按表1 规定条件培养、计数。同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。计算各试验组得平均菌落数.

⑵薄膜过滤法薄膜过滤法所采用得滤膜孔径应不大于0、4５μm,直径一般为50ｍm，若采用其她直径得滤膜，冲洗量应进行相应得调整。选择滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响微生物得充分被截留。滤器及滤膜使用前应采用适宜得方法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后得完整性.水溶性供试液过滤前先将少量得冲洗液过滤以润湿滤膜.油类供试品，其滤膜与滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜得最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后,若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为1０0mｌ。总冲洗量不得超过1０00ml,以避免滤膜上得微生物受损伤.

取照上述“供试液得制备”、“接种与稀释"与“抑菌活性得中与或消除"制备得供试液适量(一般取相当于1g、1ml或1０cm2得供试品,若供试品中所含得菌数较多时，供试液可酌情减量），加至适量得稀释液中,混匀,过滤.用适量得冲洗液冲洗滤膜。

若测定需氧菌总数,转移滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上；若测定霉菌与酵母总数,转移滤膜菌面朝上贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上.按表1 规定条件培养、计数。每株试验菌每种培养基至少制备一张滤膜。同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。

⑶MPN 法MPN 法得精密度与准确度不及薄膜过滤法与平皿计数法,仅在供试品需氧菌总数没有适宜计数方法得情况下使用，本法不适用于霉菌计数。若使用MPN 法，按下列步骤进行。

取照上述“供试液得制备”、“接种与稀释”与“抑菌活性得中与或消除”制备得供试液至少3 个连续稀释级,每一稀释级取3 份1ｍl 分别接种至3 管装有9～10ｍl 胰酪大豆胨液体培养基中，同法测定菌液对照组菌数。必要时可在培养基中加入表面活性剂、中与剂或灭活剂。

接种管置３0～35℃培养3 天,逐日观察各管微生物生长情况。如果由于供试品得原因使得结果难以判断,可将该管培养物转种至胰酪大豆胨液体培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基，在相同条件下培养1～2 天,观察就是否有微生物生长。根据微生物生长得管数从表3 查对被测供试品每1ｇ或每1mｌ中总需氧菌得最可能数。

表３微生物最可能数检索表

注：表内所列检验量如改用1ｇ(或ml）、0．1g（或ml）与0。01g（或ml）时,表内数字应相应降低10 倍;如改用0。01 ｇ（或ml)、0。０01 g(或ml）与0.００0１g（或ｍl）时，表内数字应相应增加10 倍，其余类推。

⒌结果判断

计数方法适用性试验中,采用薄膜过滤法或平皿法时，试验组菌落数减去供试品

对照组菌落数得值与菌液对照组菌落数得比值应在0、5~２范围内；采用MPN法,试验组菌数应在菌液对照组菌数得9５％置信限内。若各试验菌得回收试验均符合要求,照所用得供试液制备方法及计数方法进行该供试品得需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数计数。

方法适用性确认时,若采用上述方法还存在一株或多株试验菌得回收达不到要求，那么选择回收最接近要求得方法与试验条件进行供试品得检查。

4。1．８供试品检查

检验量

检验量即一次试验所用得供试品量（g、ml 或cm2).

除另有规定外，一般供试品得检验量为10g 或１0ml;膜剂为10０cm2;贵重药品、微量包装药品得检验量可以酌减.检验时，应从2 个以上最小包装单位中抽取供试品,大蜜丸还不得少于４丸，膜剂还不得少于４片。

一般应随机抽取供试品，取规定容器数,混合,取规定量供试品进行检验.

供试品得检查

按计数方法适用性试验确认得计数方法进行供试品中需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数得测定.

胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基用于测定需氧菌总数；沙氏葡萄糖琼脂培养基用于测定霉菌与酵母菌总数。

阴性对照试验以稀释剂代替供试液进行阴性对照试验,阴性对照试验应无菌生长.如果阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。

⒈平皿法

平皿法包括倾注法与涂布法。除另有规定外，取规定量供试品，按方法适用性试

验确认得方法进行供试液制备与菌数测定,每稀释级每种培养基至少制备2个平皿.

培养与计数除另有规定外，胰酪大豆胨琼脂培养基平板在３0~3５℃培养３天,沙氏葡萄糖琼脂培养基平板在2０~25℃培养5 天，观察菌落生长情况，点计平板上生长得所有菌落数，必要时可适当延长培养时间至7 天进行菌落计数并报告.菌落蔓延生长成片得平皿不宜计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试液得平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。若同稀释级两个平皿得菌落数平均值不小于１5，则两个平皿得菌落数不能相差1 倍或以上。

菌数报告规则需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于3００cfu 得稀释级、霉菌与酵母菌总数测定宜选取平均菌落数小于100cfｕ得稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字)得依据。取最高得平均菌落数，计算1ｇ、１ｍl 或1０cm2供试品中所含得微生物数.

如各稀释级得平皿均无菌落生长,或仅最低稀释级得平板有菌落生长，但平均菌落数小于１时,以﹤1 乘以最低稀释倍数得值报告菌数。

⒉薄膜过滤法

除另有规定外，按计数方法适用性试验确认得方法进行供试液制备。取相当于1g、1ｍｌ或１0cm2供试品得供试液，若供试品所含得菌数较多时,可取适宜稀释级得供试液,照方法适用性试验确认得方法加至适量稀释液中,立即过滤,冲洗，冲洗后取出滤膜,菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基上培养。

培养与计数培养条件与计数方法同平皿计数法，每张滤膜上得菌落数应不超过100cfu.

菌数报告规则以相当于1g、1mｌ或１０cm２供试品得菌落数报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以﹤1 报告菌数(每张滤膜过滤1g、1mｌ或１0cm2供试

品）,或﹤１乘以最低稀释倍数得值报告菌数。

⒊MＰN 法

取规定量供试品,按方法适用性试验确认得方法进行供试液制备与供试品接种，所有试验管在30～35℃培养３~5 天，如果需要确认就是否有微生物生长,按方法适应性试验确定得方法进行。记录每一稀释级微生物生长得管数,从表3查对每1ｇ或1ｍl 供试品中需氧菌总数得最可能数。

4。1.９结果判断

需氧菌总数就是指胰酪大豆胨琼脂培养基上生长得总菌落数（包括真菌菌落数）；霉菌与酵母菌总数就是指沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长得总菌落数（包括细菌菌落数)。若因沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长得细菌使霉菌与酵母菌得计数结果不符合微生物限度要求,可使用含抗生素（如氯霉素、庆大霉素）得沙氏葡萄糖琼脂培养基或其她选择性培养基（如玫瑰红钠琼脂培养基）进行霉菌与酵母菌总数测定.使用选择性培养基时，应进行培养基适用性检查。若采用MPＮ法,测定结果为需氧菌总数。

各品种项下规定得微生物限度标准解释如下：

１01cfｕ：可接受得最大菌数为20;

１02ｃfu：可接受得最大菌数为2０0;

10３cfu: 可接受得最大菌数为2000：依此类推。

若供试品得需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数得检查结果均符合该品种项下得规定，判供试品符合规定；若其中任何一项不符合该品种项下得规定,判供试品不符合规定.

稀释液、冲洗液及培养基

见非无菌产品微生物限度检查:控制菌检查法(通则１1０6）

无菌检查法系用于检查药典要求无菌得药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料、及其她品种就是否无菌得一种方法。若供试品符合无菌检查法得规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。

4。1。１0 稀释液、冲洗液及培养基

见非无菌产品微生物限度检查：控制及检查法。

４、2 非无菌产品微生物限度检查:控制及检查法

4.2．1 简述

控制菌检查法系用于在规定得试验条件下，检查供试品中就是否存在特定得微生物。

当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料就是否符合相应得微生物限度标准时,应按下列规定进行检验，包括样品取样量与结果判断等。

本检查法可采用替代得微生物检查法，包括自动检测方法,但必须证明替代方法等效于药典规定得检查方法。

供试液制备及实验环境要求同“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”(通则1１05）。

如果供试品具有抗菌活性，应尽可能去除或中与.供试品检查时, 若使用了中与剂或灭活剂,应确认有效性及对微生物无毒性.

供试液制备时如果使用了表面活性剂,应确认其对微生物无毒性以及与所使用中与剂或灭活剂得相容性。

４.2。2 培养基适用性检查与控制菌检查方法适用性试验

供试品控制菌检查中所使用得培养基应进行适用性检查。

供试品得控制菌检查方法应进行方法适用性试验,以确认所采用得方法适合于该

产品得控制菌检查。

若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时,控制菌检查方法应重新进行适用性试验。

4．２。3 菌种及菌液制备

菌种试验用菌株得传代次数不得超过5 代（从菌种保藏中心获得得干燥菌种为第0 代)，并采用适宜得菌种保藏技术进行保存,以保证试验菌株得生物学特性。

金黄色葡萄球菌（Stａphｙlｏｃoccｕs aｕreｕs)〔CMCC（B)26 00３〕

铜绿假单胞菌(Pseudoｍｏｎas ａerugｉnｏｓa)〔CＭＣC(B)1０１0４〕大肠埃希菌（Esｃhｅricｈia ｃｏｌi）〔CMCC(B）44 102〕

乙型副伤寒沙门菌(Sａｌmonella pａｒaｔyphi B)〔ＣMＣＣ（B）50 09４〕白色念珠菌(Caｎdiｄa alｂicａns）〔CMCC（F）98 001〕

生孢梭菌(Cｌostridiｕm sｐorogeｎｅｓ）〔CMCC（B)64 ９４１〕

菌液制备将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、沙门菌分别接种于胰酪大豆胨液体培养基中或在胰酪大豆胨琼脂培养基上,3０～３5℃培养１8~24 小时；将白色念珠菌接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上或沙氏葡萄糖液体培养基中，２0～25℃培养2~3 天；将生孢梭菌接种于梭菌增菌培养基中置厌氧条件下３0~3５℃培养24～４8 小时或接种于硫乙醇酸盐流体培养基中３0～35℃培养18～24 小时.上述培养物用pH7、0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0、9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度得菌悬液。

菌液制备后若在室温下放置,应在2 小时内使用;若保存在２~8℃，可在24 小时内使用。生孢梭菌孢子悬液可替代新鲜得菌悬液，稳定得孢子悬液可保存在２～8℃,在验证过得贮存期内使用。

４。2.４阴性对照

为确认试验条件就是否符合要求,应进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长.如阴性对照有菌生长,应进行偏差调查。

4.2．５培养基适用性检查

控制菌检查用得成品培养基、由脱水培养基或按处方配制得培养基均应进行培养基得适用性检查。

控制菌检查用培养基得适用性检查项目包括促生长能力、抑制能力及指示特性得检查。各培养基得检测项目及所用得菌株见表1。

表１控制菌检查用培养基得促生长能力、抑制能力与指示特性

液体培养基促生长能力检查分别接种不大于1０0cfｕ得试验菌(见表１）于被检培养基与对照培养基中，在相应控制菌检查规定得培养温度及不长于规定得最短培养时间下培养，与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好。

固体培养基促生长能力检查用涂布法分别接种不大于1０0ｃfu 得试验菌（见表１)于被检培养基与对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定得培养温度及不长于规定得最短培养时间下培养，被检培养基与对照培养基上生长得菌落大小、形态特征应一致。

版药典非无菌药品微生物限度检查操作规程

1.目的：建立非无菌药品微生物限度检查检验标准操作规程，规范检验操作，确保检验结果准确。 2.适用范围：适用于本公司所有采用非无菌药品微生物限度检查法测定的供试品。 3.责任者：QC检验员、QC经理。 4.正文： 4.1非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法 4.1.1简述 微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。 当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合规定的微生物限度标准时，应按下述规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。除另有规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。 本检查法可采用替代的微生物检查法，包括自动检测方法，但必须证明替代方法等效于药典规定的检查方法。 微生物计数试验应在受控洁净环境下的局部洁净度不低于B级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。 如供试品有抗菌活性，应尽可能去除或中和。供试品检查时,若使用了中和剂或灭活剂，应确认其有效性及对微生物无毒性。 供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。 4.1.2计数方法

计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（Most-Probable-NumberMethod，简称MPN 法）。MPN法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微生物污染量很小的供试品，MPN法可能是更适合的方法。 供试品检查时,应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法，所选的方法必须具备检测充足样品量的能力，以保证所获得的试验结果能够判断供试品是否符合规定。所选方法的适用性须经确认。 4.1.3计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验 供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。 供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数。 若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，计数方法应重新进行适用性试验。 表1试验菌液的制备和使用

微生物限度检查若干问题

微生物限度检查若干问题 微生物限度检查若干问题 微生物限度检查是对非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染程度的一种检查方法，是药品微生物学检验的重要容之一。中国药典2000年版二部附录ⅪJ“微生物限度检查法”、《中国药品检验标准操作规》（2000年版）及参考书《药品微生物学检验手册》均做了详尽的阐述。下面对几个比较重要的问题，谈一点工作学习体会，仅供参考。 一、实验室要求 开展微生物限度检查工作，首先要按照《药品检验所实验室质量管理规》及《药品生产质量管理规》的要求，建立一个布局合理，使用方便，操作安全的实验室，并且配有完善的实验设施和管理制度。微生物限度检查、无菌检查、抗生素微生物检定实验室以及接种室（接种对照菌及菌种传代）均应严格分开。 （一）无菌室： 1结构与要求： 最好设在二楼以上（防潮、防霉、采光好），面积不超过10平方米，高度不超过24米，由2个缓冲间和操作间组成。缓冲间与操作间之间应有样品传递窗，出入操作间和缓冲间的门不应直对。无菌室应六面光滑平整，能耐受清洗消毒，墙壁与地面、墙壁与天花板连接处应呈凹弧形，无缝隙、无死角。 无菌室光照应不低于300勒克斯，缓冲间和操作间均应装有紫外线杀

菌灯2-25w/m3作空气消毒用。紫外线波长200-300nm者''具有杀菌作用，其中以265-266nm最强，这与DNA的吸收光谱围一致。其杀菌机理可能是在DNA中引起胸腺嘧啶双聚体形成，从而干扰DNA复制，导致细菌变异或死亡。紫外线杀菌灯1m以距离杀菌效果最佳''每次开灯照射时间为 20min。其缺点：穿透力弱，一纸可以挡住，不能穿透固体物，对人的皮肤眼睛有损伤，所以紫外线灯开关应装在无菌室外便于开关。 2温度、湿度：温度应控制在18-26℃''相对湿度40-60''操作间或净化工作台的洁净空气应保持对环境形成正比''不低于49Pa。 3操作间：应安装空气除菌过滤层流装置，操作间不应安装下水道，洁净度不低于1万级，净化工作台局部应为100级。操作间应准备电子称（感量01g''最大称量300g''乙醇灯''火柴''2碘酊及75乙醇棉球，大、小橡皮乳头，记号笔，灭菌的剪刀，镊子、注射器等。 4缓冲间：应有洗手盒、消毒液、无菌衣、帽、口罩，拖鞋等，不应放置培养箱和其他杂物。 （二）洁净级别及检查方法： 通常采用尘粒数及浮游菌数或沉降菌数测定法。 98年国家药监局颁布药品生产质量管理规''把药品生产洁净区空气洁 净度划分为四个级别： 空气洁净度级别表 ──────────────────────────── 尘埃数/立方米活微生物数个 洁净级别─────────────────────

符合2015年版药典QC微生物培训考题答案

检验员培训考试试题(微生物) 部门职位姓名分数 一、填空(40分,每空1分) 1. 微生物限度检查应在不低于D级背景下的B级单向流空气区域内进行。 2. 微生物限度检查法中需氧菌检查所用培养基为胰酪大豆胨琼脂培养基,培 养温度为30-35 ℃;霉菌,酵母菌检查所用培养基为沙氏葡萄糖琼脂培养基培养温 度为20-25 ℃。 3. 具抑菌活性的供试品,常用消除抑菌活性的方法有:增加稀释液或培养基体积,加入适宜的中和剂或灭活剂,薄膜过滤法。 4. 采用薄膜过滤法,滤膜孔径应不大0.45μm,直径一般为50mm。 5. 供试液制备若需加温时,温度不应超过45℃。供试液从制备至加入检验用培养基,不得超过1小时。 6. 制备的菌液若在室温下放置,应在 2 小时内使用,若保存在2~8℃, 可在24小时内使用。 7.计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验,需氧菌总数计数所用试验菌株为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉;霉菌和酵母菌总数计数所用试验菌株为白色念珠菌、黑曲霉。 11.计数方法适用性试验中,采用平皿法或薄膜过滤法时,试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5-2 。 12. 检查大肠埃希菌时,应做阴性对照试验和阳性对照试验。

13. 配制培养基时,要填写培养基配制记录,记录内容包括:名称、配制量、配方、灭菌条件、配制日期、配制批号、配制者、PH值 14.在收到检定菌后,保管员要在保存菌种容器外加贴标签,内容为名称、编号、购买日期,同时还要填写菌种接收记录。 二、判断题(5分,每题1分) 1.平皿法操作时应先注入培养基,再加入1ml供试液。(×) 2.以稀释液代替供试液进行阴性对照试验,阴性对照试验应无菌生长。如果阴性对照有菌生长,应进行偏差调查(√) 3.从菌种保藏中心获得的干燥菌种为0代,试验用菌株的传代次数不得超过5 代(√) 4.控制菌检查用培养基促生长能力检查、抑制能力检查接种不大于100cfu试验菌于被检培养基和对照培养基中。(×) 5.纯化水的微生物限度质量标准为每lml供试品中需氧菌总数不得过lOOcfu。(√) 三、选择题(5分,每题1分) 1. 进行供试品控制菌检查时,阳性对照试验的加菌量为( C ) A、不大于50cfu B、50~100cfu C、不大于100cfu

药品微生物限度检验方法标准操作规程

标准操作规程 目的：建立一个药品微生物限度检验标准操作规程。 范围：适用于本企业生产的所有品种，本企业所有洁净生产区域，QC微生物限度检查室，洁净工作室等。 责任者：QC主任、化验员。 规程： 本规程引至《中国药典》2000年版。 1. 概述：微生物限度检查系指非规定灭菌制剂及其原辅料受到微生物污染程度的一种检查方法，包括染菌量及控制菌的检查。我公司QC设无菌操作室，用于微生物限度检查。无菌操作室的管理及使用制度见本文附录一。 2. 抽样：供试品应按批号随即抽样，一般抽样量为检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍。抽样时，凡发现有异常可疑的样品，应缺陷选用疑问的样品，但因机构损伤明显破裂的包装不得作为样品，凡已能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观看出长螨、长霉、虫蛀及变质的药品，可直接判为不合格，无需要再抽样检验。 3. 供试品的保存：供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，以防供试品中的污染菌因保藏条件所引起致死、损伤或繁殖。供试品在检验之前，应该保持原有包装状态，严禁开启，包装已开启的样品不得作为供试品。 4. 检查： 4.1. 使用设备：电热恒温培养箱、电热恒温水温箱、试管、刻度吸管、量筒、三角瓶、培养皿、试管架、注射器、针头、注射器盒、研钵、75％酒精棉球、紫外灯（365nm波长）。 4.2. 检查的全过程应严格遵守无菌操作，严防再污染。使用设备、仪器、人员及无菌操作室常用的消毒、灭菌方法见本文附录二。除另有规定外，供试品制备成供试液后，均在均匀状态取样。制成供试液后，应该在60分钟内注皿操作完毕。 标准操作规程

4.3. 培养：除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30－35℃，霉菌、酵母菌培养温度为25－28℃，控制菌培养温度为36±1℃，检验结果的报告以1g、1ml或10cm2为单位。 4.4. 复检 4.4.1. 菌数测定不合格者应复检，控制菌检查以一次检出为准，不再复试，但应保留检出菌株一个月备查。 4.4.2. 以复试项下不合格项目为准，作单项复试。复试需另取同批号样品，测定2次。 4.4.3. 复试报告，以3次测定结果的算术平均值报告。 4.5. 检验报告 4.5.1. 检验报告以1g、1ml或10cm2为单位。 4.5.2. 测定菌数报告，以每次测定结果全部平均值报告。 4.5.3. 控制菌按检验结果报告，如未检出控制菌时，报告为“按规定抽样检验结果未检出XX菌”，如抽样中任意一样品要检出控制菌时，报告为“按规定抽样，检出XX菌，不符合药品微生物限度标准。” 4.6. 培养基、试药及稀释剂的相关内容见本文件附录三。 4.7. 供试液的制备：按供试液的理化特性与生物学特性可采取适宜的方法制成供试液。 4.7.1. 供试品的取样及注意事项 供试品取样应有一定数量，以使检验结果具有代表性，正常的供试品一般每批应随机抽取两瓶或两盒以上的包装单位，检验时每次应分取两瓶(盒)以上的样品共10g或10ml。 供试品在检验前，应严格保持包装的原有状态，不得启开，并放在阴凉干燥处，防止微生物再繁殖，以免影响检验结果，凡已将原包装启开，则无代表性应另取样。 供试品稀释后须在1－2小时内操作完毕，防止微生物繁殖或死亡。 供试品稀释成供试液后，应在均匀状态下取样，凡因抑菌或不溶于水的剂型，其供试品应作特殊处理后进行检验。 4.7.2. 液体供试品：取供试品10ml，加入稀释剂90ml中，混匀，作为供试液。油剂可加适量 聚山梨酯80，混匀，吸取相当于10g或10ml供试品，标准操作规程 再稀释成100ml作为供试液；合剂（系指含王桨或蜂蜜者，下同）可用供试品作为供试液。 4.7.3. 固体、半固体或黏稠液供试品：称取供试品10g，置0.9%无菌氯化钠溶液100ml中，用匀浆仪或其他适宜的方法混匀后作为供试液。在制备过程中，必要时可加适量聚山梨酯80，并适当加温，但不应超过45℃。 （1）非水溶性供试品：取供试品5g（5ml）加入含溶化的无菌司盘80 5g、单硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯80 10g混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45℃左右的0.9%无菌氯化钠溶

2015版中国药典微生物检验规程

微生物检验规程 1.实验注意事项 1.1无菌操作要求 1.1.1 接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。 1.1.2专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。 1.1.3 接种样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球将手擦干净。 1.1.4 进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。 1.1.5 从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。 1.1.6 接种样品、转种细菌必须在酒精灯旁操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞（即硅氟胶塞）都要通过火焰消毒。 1.1.7 接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆的连接处。 1.1.8 吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。1.2无菌间使用要求 1.2.1 无菌间内应保持清洁，工作后用消毒溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与实验无关的物品。 1.2.2无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外灯，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。 1.2.3处理和接种样品时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。 1.3消毒灭菌要求 1.3.1灭菌前准备 （1）所有需要灭菌的物品首先应清洗晾干，玻璃器皿用纸包装严密，如用金属筒应将上面通气孔打开。 （2）装培养基的三角瓶，内容物不应超过总体积的2/3（例如500mL的三角瓶最好装300～350mL培养基，以防再次加热融化时爆沸）。 （3）无菌室内使用的毛巾、脱脂棉球用纸包裹，进行湿热灭菌。

非无菌药品微生物限度标准

药品微生物限度标准 王知坚

?我国药品微生物限度标准的历史沿革?药品微生物限度检查在制剂通则中的修订内容 ?药品微生物限度标准的修订内容 ?限度标准的注意事项 ?国外药典微生物限度标准的收载情况

历史沿革

?检查法的历史沿革 –国务院1973年121号文件标志着我国药品微生 物限度检查工作正式启动 –在1974年颁布了74版《卫生部药品卫生学检查法》，是首次颁布与药品微生物限度检查有关 的检查方法 –先后于84年和90年两次修订，颁布新的检查法–1995年版《中国药典》首次在附录中收载微生物限度检查法 –2000年版、2005年版和2010年版《中国药 典》先后收载该检查法，并进行了不同程度的 修订和完善

?限度标准的变迁 –1986年版《卫生部部颁药品微生物限度标准》?国内首次颁布与药品微生物质量有关的限度标准 ?限度标准的分类依据为剂型，不同剂型制订不同的 限度标准值；控制菌检查的分类依据为给药途径， 不同途径的制剂有不同的检查内容 –1989年版《卫生部部颁药品卫生补充规定》?是对86版限度标准的修订和补充 ?分类方式上与86版相同

–《中国药典》2000年版 ?首次将微生物限度标准收载入国家药典 ?在编制体例上仍延用部颁标准的做法，按剂型制订限度标准，按给药途径和剂型特点制订控制菌标准–《中国药典》2005年版 ?首次确定按给药途径来制订不同产品的限度标准和控制菌标准 ?首次在制剂通则中对某一类制剂制订较为特殊的微生物控制要求，如眼用液体制剂需要达到近似无菌的要求 ?在标准的具体规定上，体现了当时对微生物质量的研究水平，如含生药原粉的制剂要求开展大肠菌群检查，用于深部组织的制剂要求不得检出梭菌。

药品微生物限度检验方法标准操作规程

药品微生物限度检验方法标准操作规 程

标准操作规程 目的：建立一个药品微生物限度检验标准操作规程。 范围：适用于本企业生产的所有品种，本企业所有洁净生产区域，QC微生物限度检查室，洁净工作室等。 责任者：QC主任、化验员。 规程： 本规程引至《中国药典》。 1. 概述：微生物限度检查系指非规定灭菌制剂及其原辅料受到微生物污染程度的一种检查方法，包括染菌量及控制菌的检查。我公司QC设无菌操作室，用于微生物限度检查。无菌操作室的管理及使用制度见本文附录一。 2. 抽样：供试品应按批号随即抽样，一般抽样量为检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍。抽样时，凡发现有异常可疑的样品，应缺陷选用疑问的样品，但因机构损伤明显破裂的包装不得作为样品，凡已能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观看出长螨、长霉、虫蛀及变质的药

品，可直接判为不合格，无需要再抽样检验。 3. 供试品的保存：供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，以防供试品中的污染菌因保藏条件所引起致死、损伤或繁殖。供试品在检验之前，应该保持原有包装状态，严禁开启，包装已开启的样品不得作为供试品。 4. 检查： 4.1. 使用设备：电热恒温培养箱、电热恒温水温箱、试管、刻度吸管、量筒、三角瓶、培养皿、试管架、注射器、针头、注射器盒、研钵、75％酒精棉球、紫外灯（365nm波长）。 4.2. 检查的全过程应严格遵守无菌操作，严防再污染。使用设备、仪器、人员及无菌操作室常见的消毒、灭菌方法见本文附录二。除另有规定外，供试品制备成供试液后，均在均匀状态取样。制成供试液后，应该在60分钟内注皿操作完毕。 标准操作规程 4.3. 培养：除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30－35℃，霉菌、酵母菌培养温度为25－28℃，控制菌培养温度为36±1℃，检验结果的报告以1g、1ml或10cm2为单位。 4.4. 复检

BP 非无菌制剂的微生物限度

Appendix XVI D. Microbiological Quality of Non- sterile Pharmaceutical Preparations and Substances 非无菌制剂的微生物限度 (Ph. Eur. general text 5.1.4) The presence of certain micro-organisms in non-sterile preparations may have the potential to reduce or even inactivate the therapeutic activity of the product and has a potential to adversely affect the health of the patient. Manufacturers therefore have to ensure a low bioburden of finished dosage forms by implementing current guidelines on Good Manufacturing Practice during the manufacture, storage and distribution of pharmaceutical preparations. 非无菌制剂中存在一定量的微生物可能导致药物的治疗活性降低或消失，并对患者健康有着潜在的危害。因此生产商应在药品生产、储存、运输过程中实施GMP管理，使制剂的微生物负荷保持在低水平。 Microbial examination of non-sterile products is performed according to the methods given in general chapters 2.6.12 and 2.6.13. Acceptance criteria for non-sterile pharmaceutical products based upon the total aerobic microbial count (TAMC) and the total combined yeasts/moulds count (TYMC) are given in Tables 5.1.4.-1 and 5.1.4.-2. Acceptance criteria are based on individual results or on the average of replicate counts when replicate counts are performed (e.g. direct plating methods). 非无菌制剂的微生物检测按照通则2.6.12和2.6.13的方法执行。非无菌制剂的微生物限度基于表5.1.4-1和5.1.4-2的需氧微生物总数（TAMC）及酵母菌/霉菌总数（TYMC）。接受标准适用于单个检出结果或者做重复样品时结果的平均数（例如，直接平板法）。 When an acceptance criterion for microbiological quality is prescribed it is interpreted as follows: 给出的微生物质量接受标准解读如下： — 101 CFU: maximum acceptable count = 20; — 101 CFU: 最大可接受数= 20; — 102 CFU: maximum acceptable count = 200; — 102 CFU: 最大可接受数= 200; — 103 CFU: maximum acceptable count = 2000； — 103 CFU: 最大可接受数= 2000； Table 5.1.4.-1 includes a list of specified micro-organisms for which acceptance criteria are set. The list is not necessarily exhaustive and for a given preparation it may be necessary to test for other micro-organisms depending on the nature of the starting materials and the manufacturing process. 表5.1.4-1给出了各种剂型的具体微生物接受标准。此表格并不完全，根据起始物料和生产工艺的性质可能需要其他的微生物检查。 If it has been shown that none of the prescribed tests will allow valid enumeration of micro-organisms at the level prescribed, a validated method with a limit of detection as close as possible to the indicated acceptance criterion is used.

(2015年版药典)非无菌药品微生物限度检查操作规程

1. 目的：建立非无菌药品微生物限度检查检验标准操作规程，规范检验操作，确保检验结果准确。 2. 适用范围：适用于本公司所有采用非无菌药品微生物限度检查法测定的供试品。 3. 责任者：QC检验员、QC经理。 4. 正文： 4.1 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法 4.1.1 简述 微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。 当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合规定的微生物限度标准时，应按下述规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。除另有规定外，本法不

适用于活菌制剂的检查。 本检查法可采用替代的微生物检查法，包括自动检测方法，但必须证明替代方法等效于药典规定的检查方法。 微生物计数试验应在受控洁净环境下的局部洁净度不低于B 级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。 如供试品有抗菌活性，应尽可能去除或中和。供试品检查时, 若使用了中和剂或灭活剂，应确认其有效性及对微生物无毒性。 供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。 4.1.2 计数方法 计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（Most-Probable-NumberMethod，简称MPN 法）。MPN 法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微生物污染量很小的供试品，MPN 法可能是更适合的方法。 供试品检查时, 应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法，所选的方法必须具备检测充足样品量的能力，以保证所获得的试验结果能够判断供试品是否符合规定。所选方法的适用性须经确认。 4.1.3 计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验 供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。 供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数。 若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，计数方法应重新进行适用性试

非无菌药品微生物限度检查指导原则

附录×××非无菌药品微生物限度检查指导原则 为更好应用非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法（附录×××）、 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法（附录×××）及非无菌药品 微生物限度标准(附录×××)，特制定本指导原则。 非无菌药品中污染的某些微生物可能导致药物活性降低，甚至使药品丧失疗效，从而对患者健康造成潜在的危害。因此，在药品生产、贮藏和流通各个环节中，药品生产企业应严格遵循GMP的指导原则，以降低产品受微生物污染程度。非无菌产品微生物计数法、控制菌检查法及药品微生物限度标准可用于判断非规定无菌制剂及原料、辅料是否符合药典的规定，也可用于指导制剂、原料、辅料的微生物质量标准的制定，及指导生产过程中间产品微生物质量的监控。本指导原则将对标准和方法中的特定内容及标准的应用做进一步的说明。 1.非无菌药品微生物限度检查中，受控的洁净环境是指不低于GMP现行版要求的D级洁净环境。 2. 非无菌药品微生物限度检查过程中，如使用表面活性剂、灭活剂及中和剂，在确定其能否适用于所检样品及其用量时，除应证明该试剂对所检样品的处理有效外,还须确认该试剂不影响样品中可能污染的微生物的检出(即无毒性)，因此无毒性确认试验的菌株不能仅局限于验证试验菌株，而应当包括产品中可能污染的微生物。 3.供试液制备方法、抑菌成分的消除方法及需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法应尽量选择微生物计数方法中操作简便、快速的方法,同时,所选用的方法应避免损伤供试品中污染的微生物。对于抑菌作用较强的供试品,在供试品溶液性状允许的情况下，应尽量选用薄膜过滤法进行试验。 4.对照培养基系指按培养基处方特别制备、质量优良的培养基，用于培养基适用性检查，以保证药品微生物检验用培养基的质量。对照培养基由中国食品药品检定研究院研制及分发。 5.进行微生物计数方法适用性试验时,若因没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用而导致微生物回收的失败，应采用能使微生物生长的更高稀释级供试液进行方法适用性试验。此时更高稀释级供试液的确认要从低往高的稀释级进行,

(2015年版药典)非无菌药品微生物限度检查操作规程

１、目得：建立非无菌药品微生物限度检查检验标准操作规程,规范检验操作,确保检验结果准确。 ２、适用范围:适用于本公司所有采用非无菌药品微生物限度检查法测定得供试品. ３、责任者：QC检验员、ＱC经理。 4、正文: 4、1 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法 ４．1.１简述 微生物计数法系用于能在有氧条件下生长得嗜温细菌与真菌得计数。

当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等就是否符合规定得微生物限度标准时，应按下述规定进行检验,包括样品得取样量与结果得判断等。除另有规定外，本法不适用于活菌制剂得检查。 本检查法可采用替代得微生物检查法,包括自动检测方法,但必须证明替代方法等效于药典规定得检查方法。 微生物计数试验应在受控洁净环境下得局部洁净度不低于B 级得单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作,防止再污染，防止污染得措施不得影响供试品中微生物得检出。单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。 如供试品有抗菌活性,应尽可能去除或中与。供试品检查时，若使用了中与剂或灭活剂,应确认其有效性及对微生物无毒性。 供试液制备时如果使用了表面活性剂,应确认其对微生物无毒性以及与所使用中与剂或灭活剂得相容性。 4．1。２计数方法 计数方法包括平皿法、薄膜过滤法与最可能数法（Moｓt—Probabｌe—Ｎｕm ｂerMethod，简称MPN 法)。ＭPN 法用于微生物计数时精确度较差,但对于某些微生物污染量很小得供试品,MＰN 法可能就是更适合得方法。 供试品检查时, 应根据供试品理化特性与微生物限度标准等因素选择计数方法,所选得方法必须具备检测充足样品量得能力,以保证所获得得试验结果能够判断供试品就是否符合规定。所选方法得适用性须经确认。 4.1。3 计数培养基适用性检查与供试品计数方法适用性试验 供试品微生物计数中所使用得培养基应进行适用性检查。 供试品得微生物计数方法应进行方法适用性试验,以确认所采用得方法适合于该

2015版药典表面微生物检测操作规程

1.目的：建立表面微生物测试标准操作规程，保证测试人员操作规范化、标准化。 2.范围：适用于洁净室（区）表面、设备以及与产品接触表面的微生物量的测试。 3.责任：表面微生物检测员。 4.内容： 4.1基本概念： 4.1.1菌落:细菌培养后,由一个或几个细菌繁殖而形成的一细菌集落,简称CFU.通常用个数表示。 4.1.2表面微生物： 4.1.3表面微生物菌落数: 规定面积的洁净室（区）表面、设备以及与产品接触表面，用接触平皿法或擦拭法检测的微生物的菌落数目，以个/皿表示。 4.2测试原理: 本测试方法利用接触平皿法或擦拭法收集洁净室（区）表面、设备以及与产品接触表面的微生物，经若干时间，在适宜的方法和条件下让其繁殖到可见

的菌落数，以平板培养皿中的菌落数来评定洁净室（区）表面、设备以及与产品接触表面的微生物数，并以此来评定洁净区的洁净度。 4.3测试方法： 4.3.1使用的仪器设备和培养基: 高压消毒锅:使用时应严格按照操作规程进行。 恒温培养箱:必须定期对培养箱的温度计进行检定。 培养皿:一般采用φ90mm×15mm玻璃培养皿。使用前将培养皿置于160℃干热灭菌120min。 接触碟：一般采用φ55mm无菌接触碟。 培养基:胰酪大豆胨琼脂培养基。 将培养基加热熔化，冷却至约45℃在无菌操作条件下将培养基注入培养皿，每皿约15ml。待琼脂培养基凝固后，将培养基平皿放入32℃恒温培养箱中培养72小时若培养基平皿上确无菌落生长即可供采样用，制备好的培养基平皿应在2-8℃的坏境中存放。 4.3.2采样点选择： 洁净区微生物测试点选择表面微生物监测的采样点数目及其布局根据以下几个方面设置： 空调系统验证的结果 房间的用途 与产品的距离 人流物流方向 如何布点：对于同一洁净区，每个相同的取样物体在其不同的地方采2个样。如墙面2个采样点，地面2个采样点，洁净区主要设备2个采样点。 注：表面微生物监测的取样点数应依下列因素确定： 1.洁净区（室）的大小；

药品微生物限度检查结果影响因素分析及控制方法

药品微生物限度检查结果影响因素分析及控制 方法 文件管理序列号：[K8UY-K9IO69-O6M243-OL889-F88688]

药品微生物限度检查结果影响因素分析及控制方法 blueski推荐?[2010-3-4] 出处：来自网上 作者：房宇辉董艳丽 ? 摘要：微生物限度检查法系指非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染程度的一种检查方法，包括染菌量及控制菌的检查，是对生产单位所用的药品原料、器具设备、工艺流程、生产环境和操作者的卫生状况进行卫生评价的综合依据。由于微生物限度检查程序繁琐，操作严格，检查周期长，干扰因素多等原因都会造成检验结果误差，这样难......微生物限度检查法系指非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染程度的检查方法，包括染菌量及控制菌的检查，是对生产单位所用的药品原料、器具设备、工艺流程、生产环境和操作者的卫生状况进行卫生评价的综合依据。由于微生物限度检查程序繁琐，操作严格，检查周期长，干扰因素多等原因都会造成检验结果误差，样难以对生产做出系统、科学的管理。现就微生物检查时，容易引起误差的几方面原因以及控制方法分析如下。 1 实验者主观因素及操作技能中的误差

1.1 无菌观念淡薄一些操作者认为，微生物限度范围定得宽，多几个、少几个菌对结果影响不大，因此操作马虎、随意，这样容易造成供试品的再次污染以及已污染菌的繁殖及死亡，从而不能真实的反映供试品的染菌情况。因此每一个检验者应明确的了解，在检验过程中的每一个环节，每个空间，每个操作，每个工具及材料，没灭菌者都是带菌者，都会对检验结果产生不确定影响，因而应牢固的建立无菌观念。 1.2 操作技能中误差一些操作者在操作不熟练，及实验条件控制不严格，细节不够注意，每次操作前的消毒处理必须彻底，不得留有死角，对实验所用器具根据材料的性质进行相应的灭菌;开启供试品包装的工具，如剪刀、砂轮等也应消毒，实验用的器具如吸管应清洗干净，灭菌，放液时不得接触液面，每ml样品必须放尽，否则影响细菌记数的准确性;这些细小环节都有可能污染供试品的可能，使平皿染菌数增多，导致实验误差，所以应该对实验每个环节都要考虑，分析，根据本单位具体情况建立个系统、科学的操作规范（SOP），正确熟练的掌握无菌技术及操作规范是准确完成检验结果、得出可靠结论的基本条件。 2 操作环境不符合要求带来的误差 按无菌要求，无菌室应由无菌操作间和两个缓冲间组成，操作间与缓冲间之间应有样品传递箱，操作间和缓冲间的门不应直对;操作间内不应安装下水道，无菌室的照明灯应嵌装在天花板内，室内六壁应光滑平整，能耐受清洗消毒;无菌室的温湿度和洁净级别应准确无误，并有相应的检测设备，由于条件限制，一些单位的无菌室在设计上不符合要求，

非无菌药品微生物限度检验原始记录

非无菌药品微生物限度检验原始记录 样品编号：检验开始时间：年月日样品名称：检验完成时间：年月日检测项目：检测依据： □水溶性供试品：用胰酪大豆胨液体培养基制成1:10供试液，必要时用胰酪大豆胨液做稀释液进一步10倍系列稀释。也可用原液作为供试液。 □水溶性非油脂类供试品：用胰酪大豆胨液体培养基制成1:10供试液，分散力较差的供试品可在稀释液中加入表面活性剂，必要时用胰酪大豆胨液做稀释液进一步10倍系列稀释。也可用原液作为供试液。 □油脂类供试品：取供试品，加入无菌十四烷酸异丙酯使溶解制成1:10供试液，必要时用十四烷酸异丙酯进一步10倍系列稀释。 取供试样品10g或10ml；膜剂为100cm2，根据试验性质不同，按照上述方法进行处理，制成10倍系列稀释液。 一、需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数：吸取1ml样品均液于无菌平皿内，每个稀释度做2个平皿。同时，分别吸取1ml空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照，胰酪大豆胨琼脂培养基平板在30~35℃培养3~5天，观察计算需氧菌总数；沙氏葡萄糖琼脂平板在20~25℃培养5~7天，观察计算霉菌和酵母菌总数。 计算及结果：需氧菌总数（CFU/g,ml,cm2）： 霉菌和酵母菌总数（CFU/g,ml,cm2）： 电子天平编号：使用状况试验前：试验后： 培养箱编号：使用状况试验前：试验后： 检测人：校核人：审核人：

样品编号： 二、 注：+生长或有可疑菌落；-未生长或无可疑菌落。 电子天平编号：使用状况试验前：试验后：培养箱编号：使用状况试验前：试验后：检测人：校核人：审核人：

抗生素残留量检查原始记录 样品编号：检验开始时间：年月日样品名称：检验完成时间：年月日检测项目：检测依据： 取直径8cm的培养皿，注入融化的抗生素II号培养基15~20ml，使在碟底内均匀摊布，放置水平台上使凝固，作为底层。取抗生素II号培养基15~20ml置于1支50℃水浴预热的试管中，加入0.5%~1.5%（ml/ml）的菌悬液300μm混匀，取适量注入已铺至底层的培养皿中，放置水平台上，冷却后，在每个培养皿上等距离均匀放置钢管，于钢管中依次滴加供试品溶液、阴性对照溶液（磷酸盐缓冲液）及对照品溶液，培养皿置于37℃培养18~22h，进行结果判定。 “+”表示有抑菌圈，“-”表示无抑菌圈，“A”表示大抑菌圈，“B”表示小抑菌圈 电子天平编号：使用状况试验前：试验后： 培养箱编号：使用状况试验前：试验后： 检测人：校核人：审核人：

非无菌产品微生物限度标准

1107 非无菌药品微生物限度标准
非无菌药品的微生物限度标准是基于药品的给药途径和对患者健康潜在的 危害以及药品的特殊性而制订的。药品生产、贮存、销售过程中的检验，药用原 料、辅料及中药提取物的检验，新药标准制订，进口药品标准复核，考察药品质 量及仲裁等，除另有规定外，其微生物限度均以本标准为依据。 1.制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌的制剂和原辅料 应符合 无菌检查法规定。 2.用于手术、烧伤或严重创伤的局部给药制剂 应符合无菌检查法规定。 3. 非无菌化学药品制剂、生物制品制剂、不含药材原粉的中药制剂的微生 物限度标准（见表 1） 表1 非无菌化学药品制剂、生物制品制剂、不含药材原粉的中药制剂的微
生物限度标准 给药途径 需 氧 菌 总 数 （ cfu/g 、 或
2
控制菌 霉菌和酵母菌总数 （cfu/g、cfu/ml 或 cfu/10cm2） 不得检出大肠埃希菌（1g 或
cfu/ml cfu/10cm ）
口服给药 固体制剂 液体制剂 10
3
1ml） ；含药材原粉的化学药 102 101 品制剂及含脏器提取物的制 剂还不得检出沙门菌 （10g 或 10ml）
102
口腔黏膜给药制剂 齿龈给药制剂 鼻用制剂 耳用制剂 皮肤给药制剂 102 101 102 101
不得检出大肠埃希菌、金黄 色葡萄球菌、铜绿假单胞菌 （1g、1ml 或 10cm2） 不得检出金黄色葡萄球菌、 铜绿假单胞菌（1g、1ml 或 10cm ）
2
呼吸道吸入给药制 剂
102
101
不得检出大肠埃希菌、金黄 色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、
1

符合2015年版药典QC微生物培训考题答案

检验员培训考试试题（微生物） 部门职位姓名分数 一、填空（40分，每空1分） 1. 微生物限度检查应在不低于D级背景下的B级单向流空气区域内进行。 2. 微生物限度检查法中需氧菌检查所用培养基为胰酪大豆胨琼脂培养基，培养温度为30-35 ℃；霉菌，酵母菌检查所用培养基为沙氏葡萄糖琼脂培养基培养温度为20-25 ℃。 3. 具抑菌活性的供试品，常用消除抑菌活性的方法有：增加稀释液或培养基体积，加入适宜的中和剂或灭活剂，薄膜过滤法。 4. 采用薄膜过滤法，滤膜孔径应不大0.45μm，直径一般为50mm。 5. 供试液制备若需加温时，温度不应超过45℃。供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。 6. 制备的菌液若在室温下放置，应在 2 小时内使用，若保存在2~8℃， 可在24小时内使用。 7.计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验，需氧菌总数计数所用试验菌株为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉；霉菌和酵母菌总数计数所用试验菌株为白色念珠菌、黑曲霉。 11.计数方法适用性试验中，采用平皿法或薄膜过滤法时，试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5-2 。 12. 检查大肠埃希菌时，应做阴性对照试验和阳性对照试验。 13. 配制培养基时，要填写培养基配制记录，记录内容包括：名称、配制量、配方、灭菌条件、配制日期、配制批号、配制者、PH值 14.在收到检定菌后，保管员要在保存菌种容器外加贴标签，内容为名称、编号、购买日期，同时还要填写菌种接收记录。 二、判断题（5分，每题1分） 1.平皿法操作时应先注入培养基，再加入1ml供试液。（×） 2.以稀释液代替供试液进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。如果阴性对照有菌生长，应进行偏差调查（√） 3.从菌种保藏中心获得的干燥菌种为0代，试验用菌株的传代次数不得超过5

版药典微生物限度检查方法验证方案

版药典微生物限度检查 方法验证方案 Document number：WTWYT-WYWY-BTGTT-YTTYU-2018GT

人工牛黄甲硝唑胶囊微生物限度检查方法验证方案 下表用于记录修订/变更主要内容及历史。

目录 1. 概述 2. 验证目的和范围 3. 组织及职责 4. 验证进度计划表 5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认 6. 验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认 7.验证项目和验证方法 试验菌株 需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备 需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法需氧菌总数检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法 控制菌检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法 8.偏差与漏项控制 9.验证报告会审

1. 概述 我公司生产品种人工牛黄甲硝唑胶囊，产品微生物限度检查项目为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、以及大肠埃希菌检查和沙门菌检查。参照《中国药典》2015版四部附录1105：微生物计数法，以及1106：控制菌检查法的规定，本公司对该产品的微生物限度检查方法予以验证。通过验证以确认所采用的微生物限度检查方法适用。 人工牛黄甲硝唑胶囊处方中含有甲硝唑、人工牛黄以及常用辅料成分，文献资料介绍甲硝唑对细菌有抑菌特性，对霉菌和酵母菌无抑菌活性。甲硝唑在水中微溶，可以通过离心沉淀-薄膜过滤法去除其对微生物生长的影响。本验证方案通过试验菌株的回收率测试，首先确认常规倾注平皿法是否适用于本品的微生物限度检查；如常规倾注平皿法不适用，则进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的微生物限度检查。 本验证方案根据样品特性制定微生物限度检查方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。 2. 验证目的和范围 验证该产品的微生物限度检查方法的适用性，对其有效性进行评价，保证检验结果的可靠性。本验证方案采用3批按GMP要求组织生产的人工牛黄甲硝唑胶囊，进行微生物限度检查方法的验证。 3.组织及职责 验证方案和验证报告的起草、审核、批准 验证方案由质量部QC组负责起草，由质量部审核，最终由质量负责人批准。验证方案实施完成后，由QC组负责汇总微生物限度检查法验证的结果、撰写报告，由质量部审核，最终由质量负责人批准报告。 验证方案的培训 验证方案在经质量负责人批准后，，由QC组组长对本次验证实施的相关人员组织培训工作，

非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法

非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法 浙江省食品药品检验研究院 郑小玲

计数方法的概况 主要内容 1计数培养基适用性检查 2供试品计数方法适用性检查 3供试品检查 4结果判断 5

平皿法 薄膜过滤法 MPN 法 有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数 不适用活菌制剂的检查受控环境洁净环境下的局部洁净度不低于B 级 可采用替代方法 确认方法的适用性

细菌数：营养琼脂培养基，30～35℃，3天 霉菌和酵母菌数：玫瑰红 钠琼脂培养基，20～28℃，5天。酵母菌计数：酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂 需氧菌总数（TAMC)： 胰酪大豆胨琼脂（TSA）， 胰酪大胨肉汤（TSB） 30～35℃，3～5天 霉菌和酵母菌总数（TYMC)： 沙氏葡萄糖琼脂培养基， 20～25℃，5～7天 修订后

?菌种及菌液制备 菌种：标准菌株(CMCC)，传代次数不超过5代 金葡、铜绿、枯草、白念、黑曲 菌液制备：用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠 溶液制菌悬液。 菌液制备后室温放置，2小时内使用；2～8℃，24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。?阴性对照 以稀释剂进行阴性对照组，应无菌生长

TSA、TSB、SDA： 1、实验用菌株：TSA:金葡、铜绿、枯草、白念、黑曲 TSB：金葡、铜绿、枯草 SDA:白念、黑曲 2、接种：TSA、SDA:涂布法、倾注法。TSB：直接接入 接种量不大于100cfu，细菌30～35℃培养不超过3天，真菌20～25℃培养不超过5天。 每一试验菌株平行制备2管或2个平皿。 对照培养基替代被检培养基同法操作。 3、TSA、SDA与对照培养基比较，回收率为50%～200%，菌落形态 与对照培养基一致。TSB与对照培养基比较，试验菌应生长良好。 玫瑰红钠培养基、SDA+抗生素、选择性培养基