GC-CI-MS-SIM 方法诊断新生儿苯丙酮尿症

V o l.22高等学校化学学报　N o.1　2001年1月 CH E M I CAL JOU RNAL O F CH I N ESE UN I V ERS IT IES 52～54　

[研究简报]

GC-C I-M S-SI M方法诊断新生儿苯丙酮尿症

邓春晖　胡耀铭　胡克季 张雅芬　顾学范

(复旦大学分析测试中心,上海200433) (新华医院,上海200082)

关键词　苯丙酮尿症;氨基酸;气相色谱质谱联用;筛查;衍生化

中图分类号　O658,Q51 文献标识码　A 文章编号　025120790(2001)0120052203

苯丙酮尿症(PKU)的发病原因是患者苯丙氨酸羟化酶的缺陷,从而导致体内苯丙氨酸(Phe)不能正常代谢为酪氨酸(T yr),前者在体内大量堆积并氧化为有害的苯丙酮酸.PKU是目前筛查范围最广的氨基酸代谢遗传疾病,全世界每年约有一千万婴儿接受PKU筛查;在中国PKU也是卫生部要求重点筛查的病种[1].目前常规筛查方法是细菌抑制法(B I A),它的特点是费用低、速度慢、容易产生假阳性;Chace等[2,3]报道了M S2M S方法筛查新生儿PKU.曲峻等[4]发展了Chace的方法,采用H PL C与M S2M S联用方法(L C2M S2M S)筛查新生儿PKU[4],利用H PL C富集,M S2M S作为H PL C的检测器定量血样中的苯丙氨酸和酪氨酸.M S2M S和L C2M S2M S方法速度快,准确性好,由于是通过测定Phe 与T yr的比值来筛查PKU,克服了假阳性的产生[2～4].但是L C2M S2M S和M S2M S价格都很昂贵,不适合国内普及推广.本文将血样中的Phe与T yr进行化学修饰后,采用化学电离源选择离子的方式用气相色谱质谱(Gas ch rom atography2che m ical i on izati on2m ass s pectrograph2selective i on m easure m ent简称GC2C I2M S2S I M)进行分析,测定Phe和T yr相应衍生物的准分子离子峰面积,用外标法计算出血样中的Phe与T yr摩尔浓度,与M S2M S、L C2M S2M S一样取得同样满意的效果.由于GC2M S价格较低,适合国内普及推广.

1　实验部分

1.1　仪器与试剂　甲醇(分析纯),0.1%HC l2甲醇(自制),苯丙氨酸标准品(第二军医大学服务公司),酪氨酸标准品(新兴医药保健公司),3.0mo l L HC l2正丁醇(自制),三氟醋酸酐,血纸样(上海新华医院提供).氮气吹干装置(自制),高速离心机,烘箱,GC2M S(美国F innigan公司)

1.2　实验方法　色谱条件:H P21石英毛细管色谱柱(30m×0125mm,0125Λm);柱温150℃～250℃(保持2m in);升温速度15℃ m in;汽化室温度280℃;H e载气,流量110mL m in.

质谱条件:正离子化学源;CH4反应气;离子室温度150℃;倍增器电压550V;选择离子m z 318,430

样品处理:将采集血样吸附在滤纸上,挥干;用打孔器在滤纸血斑处打下一直径为810mm圆形片(全血约合20ΛL),放入115PV管中,加入200ΛL甲醇萃取剂(含011%HC l),振荡30m in,离心,吸取100ΛL上清液注入210mL安瓿管,氮气吹干;加入100ΛL HC l2正丁醇,封管,在120℃烘箱内酯化60m in,开管后加入50ΛL CH2C l2,氮气吹干;加入100ΛL乙酸乙酯和100ΛL三氟醋酸酐,封管,在烘箱120℃酰化30m in,反应液用氮气吹干,加100ΛL甲醇溶解,取1ΛL作GC2C I2M S2S I M 分析.

定量分析:精确配制0192Λg mL,213Λg mL,416Λg mL,23Λg mL,46Λg mL苯丙氨酸、酪氨酸的标准溶液,分别标为P1～P5和T1～T5.取下标相同的苯丙氨酸标准溶液和酪氨酸的标准溶液各100ΛL加入同一个安瓿管,然后按上述样品处理方法操作.取1ΛL样品.用GC2C I2M S2S I M测定

收稿日期:2000206212.

联系人简介:胡克季(1941年出生),男,教授,硕士生导师,从事色谱和质谱理论及应用、生物大分子分离与纯化方面的研究.

Phe 和T yr 衍生物的准分子离子M +1峰的峰面积,根据峰面积作标准曲线

.血纸样按样品处理方法处理,以上述相同条件进行GC 2C I 2M S 2S I M 分析,并根据各自标准曲线计算出血样中Phe 和T yr 的浓度.

2　结果与讨论

2.1　方法原理　用正丁醇在烘箱内120℃条件下使苯丙氨酸、酪氨酸丁脂化,再与三氟醋酸酐酰化,分别生成化合物:alanine ,32phenyl 2N 2(trifluoroacetyl )2,butyl ester 和L 2tyrosine ,N (trifluo roacetyl )2,

butyl ester ,trifl .这两种化合物具有较好的挥发性,可以用GC 2M S 进行定量分析

.上述二步反应迅速、完全,符合定量分析的要求.因此通过测定苯丙氨酸、酪氨酸的上述衍生物峰面积来定量其浓度.采用CH 4作为反应气、正离子化学电离源使上述衍生物产生强度很大的准分子离子峰,提高GC 2M S 的灵敏度.由于血样中有很多干扰峰影响Phe 和T yr 峰面积的准确测定,选用Phe 和T yr 衍生物强度很大的准分子离子(m z 318,m z 430)作为特征离子进行扫描,可以提高灵敏度且很好地避免了干扰峰的影响,确保定量分析的准确性.图1为Phe 和T yr 衍生物的选择离子色谱图,两种化合物的保留时间分别为5.984m in 和6.768m in

.

F i g .1　GC -C I -M S -SI M Chro ma togram s of blood s am ple

a .Chrom atogra m peak of alanine ,32phenyl 2N 2(trifluoroacetyl )2,butyl ester ;b

.Chrom atogra m peak of L 2tyrosine ,N (trifluoroacetyl )2,butyl ester ,trifl

.2.2　标准曲线　将定量离子色谱峰面积A 对浓度c 作线性回归,得线性方程:

A phe =22351c -1248 r 2=0.999

A T yr =34885c +2230 r 2=0.997

可见两者在检测范围内有很好的线性关系.

2.3　加样回收率和精密度　Phe 和T yr 加入01092Λg ,0146Λg ,213Λg 的加样回收率分别为95%,98%,102%;98%,101%,96%.Phe 各浓度的精密度为311%,214%,115%(n =4),T yr 为216%,113%,212%(n =4).检测限Phe ,T yr 都为0101Λg .正常新生儿血液氨基酸浓度下,Phe 和T yr 的信噪比在103数量级以上.

2.4　讨　论　常规筛查PKU 的方法细菌抑制法(B I A )是通过测定血样中Phe 的浓度来诊断PKU ,当

血液中Phe 的摩尔浓度大于258Λmol L 时,可以诊断为PKU [3].但是早熟婴儿及成年人血液的Phe

浓度很大,因此用上述方法容易产生假阳性.而用Phe 与T yr 摩尔浓度之比作为诊断依据可以消除假阳性,Phe 与T yr 摩尔浓度比大于215可以确诊为PKU [2,3,5].Table 1　The result of quan tit a ti ve ana lysis for Phe and Tyr i n blood s am ples

Sa mp le

c (Phe ) (Λmol ?L -1)c (Tyr ) (Λmol ?L -1)c (phe ) c (Tyr )Sa mp le c (Phe ) (Λmol ?L -1)c (Tyr ) (Λmol ?L -1)c (phe ) c (Tyr )1#

678601785#92311381102

#8717701496#44657801773#10625801417#

36345601804#8652673124 表1为GC 2C I 2M S 2S I M 测定血样中Phe ,T yr 的结果.根据它们的比值确诊4#、5#患有PKU .其

中6#和7#为成年人血样,可见成年人血液中Phe 的浓度比正常新生儿血液中的Phe 大得多,但浓度

比却小于1.用B I A 方法诊断6#和7#为PKU ,结果产生假阳性

.3

5N o .1邓春晖等:GC 2C I 2M S 2S I M 方法诊断新生儿苯丙酮尿症

本方法与B I A 相比,可以消除假阳性,提高诊断的准确性.与M S 2M S ,L C 2M S 2M S 相比同样有分析速度快、稳定性好等优点.同时由于采用化学电离源和选择离子的方法,因而具有较高分析灵敏度,更重要的是GC 2M S 与M S 2M S 、L C 2M S 2M S 相比价格低得多,适合我国普及推广.因此,GC 2C I 2M S 2

S I M 方法是一种适合我国大规模筛查PKU 的较好方法

.参　考　文　献

　1　Chango A .V .,Christian B .H ..Am .J .C lin .N utr .[J ],1998,67(3):473—476

　2　Chace D .H .,M ilington D .S .,Terada N ..C lin .Che m .[J ],1993,39:66—71

　3　Donald H .C .,Joohn E ..C lin .Che m .[J ],1998,44:2405—2409

　4　QU Jun (曲　峻),WU Zhu 2P ing (吴筑平),LUO Guo 2A n (罗国安).Che m .J .Chinese U niversities (高等学校化学学报)[J ],

2000,21(2):210—212

　5　L evy P .A .,M iller J .B ..C lin .Chi m .A cta [J ],1998,270(2):177—181

Newborn Screen i n g of Phenylketonur i a by GC -C I -M S -SI M

D EN G Chun 2H ui ,HU Yao 2M ing ,HU Ke 2J i

3(A naly sis M easure m ent Center ,F ud an U niversity ,S hang hai 200433,Ch ina )

ZHAN G Ya 2Fen ,GU Xue 2Fan

(X inhua H osip tal ,S hang hai 200082,Ch ina )Abstract T he app licati on of M S in ne w born screen ing is one of the most i m portant branches of M S ’s current clinical app licati on .In th is paper w e first reported a ne w m ethod of ne w bo rn screening for Phenylketonuria (PKU )by GC 2C I 2M S 2S I M ,w h ich w as relatively cheap ,fast ,sensitive and accurate .In th is m ethod Phenylalanine (Phe )and T yrosine (T yr )w ere extracted from dry bl ood s pots w ith 0.1%

mo l L HC l 2m ethano l

.T he p rotein in the extracti on w as go tten rid of by cen trifugo r .Phe and T yr w ere reacted w ith 310mol L HC l 2butanol ,then the p roducts Phe and T yr butyl esters w ere reacted w ith trifluo roacetic anhydride .T he final derivati ons from Phe and T yr ,alanine ,32phenyl 2N 2(trifluoroacetyl )2,butyl este and L 2tyrosine ,N (trifluoroacetyl )2,butyl ester ,triflw ere analyzed by GC 2C I 2M S 2S I M .T he con ten ts of the two a m ino acids in bl ood sa mp les w ere deter m ined by calculating the areas of their final derivati on s w ith exteri o r standard .F inally ,the molar rati os of Phe to T yr in bl ood

sa mp le w ere calculated as the basis of PKU diagnosis

.Because che m ical i onizati on and selective i on m easure m en t w ere used in th is m ethod ,the li m its of detecti on for Phe and T yr w ere l ow and the sen sitivity w as excellen t .A bout 30bl ood sa mp lesw ere analyzed by th ism ethod ,and the results p rove that

th is m ethod could successfully discri m inate betw een nor m al infan ts and PKU po sitive ones

.T he p rice of in strum en t GC 2M S is cheaper than that of M S 2M S .T herefo re it w as capable for large 2scale screening in

devel op ing countries

.Keywords Phenylketonuria ;Am ino acid ;GC 2C I 2M S 2S I M ;Screen ing ;D erivatizati on

(Ed .:A ,G )45 高等学校化学学报V ol

.22