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从琼脂糖中回收DNA片段

从琼脂糖中回收DNA片段

实验目的:

掌握从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的技术。

DNA片段的胶回收:

电泳洗脱法

低熔点琼脂糖凝胶电泳挖块法

冻融回收法

玻璃奶回收法

柱回收法(按说明书进行)

胶回收注意事项:

将电泳槽用ddH2O反复清洗干净,倒入新鲜配制的灭菌电泳缓冲液;

根据点样量制备合适厚度的琼脂糖凝胶板;

切胶时尽可能切掉不含DNA片段的凝胶;

要尽量减少DNA在紫外下的照射时间以减少对DNA的损伤;

熔胶要完全。

目的基因片段与载体连接

实验目的:掌握DNA片段的体外连接技术。

DNA连接酶:

能催化双链DNA片段紧靠在一起的5’-P末端和3’-OH末端之间形成磷酸二酯键,使两末端连接。

E.coli DNA连接酶T4 DNA连接酶

1、E.coli DNA连接酶:

由E.coli基因lig编码,需烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)作为辅助因子。

修复双链DNA上的单链缺刻(nick),用于连接匹配粘端。

2、T4 DNA连接酶:

从T4噬菌体感染的E.coli中分离得到,由T4基因DNA30编码,需ATP作为辅助因子。

修复双链DNA上的单链缺刻(nick),用于连接匹配粘端;

连接RNA-DNA杂交双链上DNA链缺刻;

连接平端双链DNA分子。

1、修复双链DNA上的单链缺刻,用于连接匹配粘端。

带匹配粘端的DNA分子靠近时,自发形成暂时的碱基配对,利于连接酶把紧邻的5’-P与3’-OH连接到一起。

不同DNA片断通过匹配粘端的连接。

同一DNA片断通过匹配粘端的连接--自身环化。

2、连接RNA-DNA杂交双链中DNA链上的缺刻。

3、连接带平端的双链DNA分子。

注意:

DNA连接酶不能催化两单链DNA分子连接;

只能连接双链DNA分子的单链缺刻(nick);

不能连接双链中1个或多个核苷酸缺失所致的缺口(gap)。

E.coli DNA连接酶:连接匹配粘端;

T4 DNA连接酶:连接匹配粘端、平端。

最常用的为T4 DNA连接酶。

匹配粘端的连接:

1)哪些情况下会产生匹配粘端?

同一限制酶切割产生;

同尾酶切割产生。

2)可以用E.coli DNA连接酶、也可以用T4 DNA连接酶。

3)连接效率高。

4)连接后的情况如何?

同一限制酶切割的DNA片段,连接后仍保留该限制酶的识别序列。

两种同尾酶切割的DNA片段,连接后丧失这两种限制酶的识别序列。

平端的连接:

1)哪些情况下会产生平端?

限制酶切割产生;

RNA逆转录合成的cDNA为平端双链;

PCR扩增也能产生,如用Pfu扩增时。

2)只能用T4 DNA连接酶。

3)连接效率低,仅为粘端的1%。

4)连接后的情况如何?

同一限制酶切割的DNA片段,连接后仍保留该限制酶的识别序列,有时还出现另一种新的限制酶识别序列。

不同限制酶切割的DNA片段,连接后丧失这两种限制酶的识别序列。

提高平端连接效率的方法

加大连接酶用量(10倍于粘端连接,1-2U);

加大平端DNA片段的浓度;

加入10% PEG 8000;

加入单价阳离子(NaCl),终浓度150-200 mM。