PKM2翻译后修饰的鉴定

?PKM2翻译后修饰的鉴定

摘要：丙酮酸激酶（Pyruvate Kinase，PK）是催化糖酵解最后一步反应的关键酶，在肿瘤细胞代谢及生长中起着至关重要的作用。它在人体内存在四种同工酶：L、R、M1和M2型，M2型（即PKM2）特异高表达于胚胎及成体干细胞。蛋白质翻译后修饰在维持蛋白质功能，调节信号传导以及大量其他重要的细胞生命过程中发挥着关键性的作用。PKM2的丙酮酸激酶活性受外界环境和蛋白质翻译后修饰调控。本研究利用免疫沉淀，胶内酶解和质谱等技术鉴定出PKM2上存在17个磷酸化修饰位点，10个乙酰化修饰位点，1个甲基化修饰位点，这为进一步研究各种修饰的生物学效应及其交互应答奠定了良好的基础。

关键词：PKM2；蛋白质翻译后修饰；交互应答

The identification of protein post-translational

modifications of PKM2

Student majoring in National Life Science and Technique Talent Training Base

Abstract：Pyruvate kinase(Pyruvate Kinase,PK)is the key enzyme which catalyzes the last step of glycolysis and plays a vital role in the metabolism and growth of tumor cells.It includes four isoenzymes in the human body:type L,type R,type M1 and type M2.Type M2(PKM2)specifically and highly express in embryonic cells and adult stem cells.Protein post-translational modification plays a key role in the maintenance of protein function,regulating signal pathway,as well as in a number of important processes of cells.Pyruvate kinase activity of PKM2 is regulated by the external environment and the regulation of protein post-translational modifications.Totally,17 phosphorylated sites,10 acetylated sites,and 1 methylated sites on PKM2 have been identified by immunoprecipitation,gel digestion and LC-MS.It lays a good foundation for the further study of cross-talk of these modifications.

Key words:PKM2;Post-translational modification;Cross-talk

1 引言

1.1 PKM2

丙酮酸激酶（PK）调节糖酵解的最终限速步骤并催化磷酸基团从磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）转移到二磷酸腺苷，该转移产生一个丙酮酸和一个三磷酸腺苷[8,9]PKM1、PKM2、PKL和PKR是不同类型的PK异构体，在哺乳动物细胞和组织中表达。PKM2是由核蛋白A1/2和多嘧啶序列结合蛋白(polypyrimidine tract binding protein，PTB)调控PKM前mRNA可变剪接形成的。PKM2在胚胎中表达，随着胚胎发育，PKM2逐渐被其他同工酶代替，但在肿瘤发生过程中PKM2表达上升并取代其他同工酶，如肝癌中PKL消失，而PKM2大量表达[1]

PKM2是肿瘤代谢领域的热点之一。结合最近三年的文献，发现PKM2被多种复杂的机制调控，通过改变表达量或酶活在多个层面调节肿瘤细胞代谢和生长。PKM2有四聚体和二聚体两种构象，分别具有不同的酶活性，在细胞质中主要以四聚体存在，具有高丙酮酸激

酶活性；二聚体可入核，具有高蛋白激酶活性。中间代谢产物和蛋白质翻译后修饰等细胞内外因素调控PKM2构象转换，使肿瘤细胞根据不同需要在产生能量和合成生物大分子之间快速转换，有效维持肿瘤能量和合成原料供应的平衡，这极大地增强了肿瘤细胞对环境的适应力。FBP是PKM2构象转换的重要调节因子[3-5]

PKM2促进癌细胞生长是通过减慢糖酵解使碳水化合物代谢产物进入其他次要途径，包括己糖胺途径，二磷酸尿苷（UDP）葡萄糖合成，甘油合成和PPP，PPP产生的大分子前体，有助于细胞增殖和还原物如NADPH的减少。随后的研究证实，表达PKM2的肺癌细胞比表达PKM1的细胞致癌性更大。通过调节外显子剪接可以使PKM2相对于PKM1优先表达。PK的mRNA剪接后包含外显子9翻译所得PKM1亚型，而包含外显子10的mRNA则会翻译得PKM2。MYC基因会上调核不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein,hnRNPs)它与PK mRNA的外显子9相结合导致mRNA中包含外显子10，从而主要表达PKM2。通过促进PKM2表达，MYC产生更多的NADPH，与ATP的增加相同步，并满足不断增殖的辅助需求。在临床上，PKM2高表达于各种癌症类型患者的样品中，从而发现PKM2可能对于早期检测癌症的是个有用的生物标志物。由此可见，进一步研究PKM2在癌症中的普遍性以及PKM2在肿瘤发生中的作用意义重大。

1.2 PKM2蛋白质翻译后修饰

蛋白质翻译后修饰(Protein post-translational modification PTM)是指通过共价键连接官能团或蛋白质，调节蛋白亚基的水解，或降解整个蛋白来提高蛋白质的功能多样性。超过200种不同的翻译后修饰已被报道，包括磷酸化，糖基化，泛素化，亚硝基化，甲基化及乙酰化等[43]众所周知，蛋白质翻译后修饰在维持蛋白质功能，如活性，稳定性和交互作用以及信号调节和大量其他重要的细胞生命活动中发挥着关键性的作用。

磷酸化是研究最普遍和最深入的后修饰，是调节细胞生命活动的最常见的调控方式之一。从古至今，几乎存在于每个哺乳动物体内。通常蛋白激酶上数个氨基酸（羟基，酸性基或氨基，咪唑氮环）侧链反应性基团会发生磷酸化。磷酸化在细胞信号转导过程中扮演着重要的角色。Soufi等研究显示发生在细菌中的S/T/Y磷酸化在调控细菌的生理过程中起重要作用，如细胞周期[20]细胞分化[21]应激反应[22]胞外多糖生产[23]等等。赵等发现各种不同亚型的组蛋白的磷酸化分别参与了基因转录、DNA修复、细胞凋亡及染色体浓缩等过程,并与其他修饰方式共同调控细胞生长、分裂等生命活动。乙酰化是通过乙酰辅酶A（乙酰-CoA）将乙酰基共价结合到蛋白质上的过程[35]这个过程是由乙酰转

移酶完成的，并且也可以由脱乙酰基酶去除（除了N端乙酰化均可逆）这种修饰一般发生在N-末端，赖氨酸残基，以及S/T残基。蛋白质甲基化是指由甲基转移酶催化，甲基从S-腺苷甲硫氨酸转移至相应的蛋白质，可形成任一可逆的甲基化，但O-羧基基团如甲基化则形成不可逆的甲基。蛋白甲基化是可以发生在许多残基包括精氨酸，赖氨酸，组氨酸，谷氨酰胺和脯氨酸中。在许多细胞过程，如转录活性，DNA修复中甲基化起着至关重要的作用。比如Stallcu等发现组蛋白的赖氨酸甲基化与细胞核的转录活性相关，并调节其他类型的组蛋白修饰，是细胞的正常有丝分裂所必需的。

PKM2的丙酮酸激酶活性受外界环境和蛋白质翻译后修饰调控。磷酸化是PKM2的一种重要修饰手段，成纤维细胞生长因子受体1（FGFR1）可促使PKM2第105位酪氨酸磷酸化，消除FBP对PKM2的变构效应[6]吕等人的研究显示：高浓度葡萄糖可促使PKM2第305位赖氨酸乙酰化，抑制PKM2酶活并促使其通过自噬途径被降解；PKM2乙酰化可促使肿瘤细胞内糖酵解中间产物累积，促进肿瘤生长[4]PKM2的第433位赖氨酸位点乙酰化可被有丝分裂和原癌基因调控，乙酰化干扰了PKM2与FBP结合并促使PKM2入核，增强其蛋白激酶活性[5]

1.3 蛋白质翻译后修饰间交互应答

蛋白质翻译后修饰作为高度灵活的开关，调控蛋白质的活性、浓度及定位等多种功能。迄今为止，大部分研究都只关注一种类型的修饰，然而在蛋白质的翻译后修饰之间存在广泛的交互应答（Cross-Talk）即一种修饰的存在会影响其他修饰的出现。如Noort等发现在细菌中乙酰化和磷酸化同时存在于同一个蛋白中[17]Swaney等发现在酵母细胞蛋白质降解过程中蛋白质的磷酸化与泛素化发生了显著的交互应答，在466个蛋白中同时存在磷酸化和泛素化修饰[18]在单个的具有复杂而重要功能的蛋白质上存在不同翻译后修饰之间的交互应答：如p53的磷酸化能增强p300对其乙酰化，影响p53的转录激活[19]组蛋白H3上28位丝氨酸的磷酸化能诱导27位赖氨酸的甲基化和乙酰化之间的转换，从而影响基因的转录[20]

相关文献报道，PKM2多个赖氨酸位点存在乙酰化、泛素化和琥珀酰化两种或三种修饰；丝氨酸或苏氨酸位点周围五个氨基酸内存在赖氨酸位点，如S87可被磷酸化，K89可被乙酰化和泛素化，揭示PKM2翻译后修饰之间可能也存在交互应答，调控了PKM2丙酮酸激酶和蛋白激酶活性之间的平衡和转换，从而调控肿瘤细胞生长。目前PKM2复杂的分子调控机制及蛋白质翻译后修饰之间是否存在交互应答等研究尚有很多空白。

因此，本课题将主要鉴定PKM2的蛋白质翻译后修饰。构建PKM2的表

达质粒，利用免疫沉淀，胶内酶解，质谱等技术鉴定磷酸化、乙酰化和甲基化等修饰的具体位点，为阐明蛋白质翻译后修饰间交互应答的方式，以及为蛋白质翻译后修饰对PKM2丙酮酸激酶活性和蛋白激酶活性的平衡以促进肿瘤生长的机制研究提供依据。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 细胞株

肝癌细胞株MHCC97-H由中科院细胞库提供,人胚肾细胞株HEK293T由本实验室保存。

2.1.2 真核表达质粒

含Flag标签的pcDNA3.1（+）质粒本实验保存。

2.1.3 主要试剂

DMEM/HIGH GLUCOSE、胎牛血清购自HyClone;0.25％胰酶溶液购自GIBCO；ECL Plus试剂盒购自CTB；一抗稀释液、二抗稀释液、RIPA裂解液购自Beyotime；Tris-base、甘氨酸、丙烯酰胺、过硫酸胺均购自Amrosco公司；琼脂糖，琼脂粉，酵母提取物，蛋白胨，甲醇，乙醇，异丙醇，乙酸，NaCl，KCl，KH2PO4，Na2HPO4?12H2O，EDTA，DMSO，均购自上海生工公司；DTT,IAA均购自北京拜尔迪生物技术有限公司；Mass Spectra Grade Modified Trypsin购自华利世科技；抗体Flag购自SIGMA。

2.1.4 仪器设备

电子精密天平（Mettler）PCR System 970(Applied Biosystem)恒流恒压电泳仪（Bio-Rad）LAS-3000（BioTek）生物安全柜（Labconco）CO2培养箱（Thermo）离心机（Eppendorf）80℃冰箱（Thermo）超纯水系统（Millipore）酶标仪（BioTek）流式细胞仪（Beckman Coulter）紫外分光光度仪（Thermo）旋涡混合器（Thermo）磁力加热搅拌器（江苏省金坛市医疗仪器厂）低温摇床（上海一恒科技）超净工作台（苏州净化设备厂）三孔智能水浴锅（大研仪器公司）高压灭菌锅（上海坤肯灭菌锅）可调温度摇床（上海一恒科技）细胞培养皿（10cm、6cm）移液枪，离心管Tip头和EP管(Axygen公司)LTQ-Orbitrap质谱仪，Imager-master扫描仪等。

2.1.5 主要溶液配制

细胞培养相关溶液：

10×磷酸盐缓冲液（10×PBS）80g NaCl、35.8g Na2HPO4?12H2O、2.4g KH2PO4，加入800mLddH2O中，搅拌溶解后，调pH至7.4，定容至1L，高压灭菌后置于4℃，用前稀释成1×使用液。

10×TBS缓冲液：80g NaCl、2g KCl、30g Tris，加入800mLddH2O中，搅拌溶解后，调pH值至7.4，定容至1L。用前稀释成1×使用液。4℃保存备用。

1mg/mL嘌呤霉素：25mg嘌呤霉素溶于25mL PBS中，0.22?m滤器过滤，分装置于-20℃备用。

冻存液：DEME：血清：DMSO=7:2:1。

分子克隆相关溶液：

0.5M EDTA：93.05g EDTA?2Na盐加入400mLddH2O中，剧烈搅拌充分溶解后，用NaOH调节pH值至8.0，定容至500mL，高压灭菌保存。

50×TAE电泳缓冲液：242g Tris，57.1mL乙酸，100mL 0.5M EDTA，ddH2O定容至1000mL，pH 8.0。

LB培养基：称取蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，置于1L烧杯中，加入800mL ddH2O充分搅拌溶解

，调节pH值至7.0，定容至1L；高温高压灭菌后，4℃保存。如果配制抗生素选择培养基，则在冷却后加入相应抗生素至所需浓度，摇匀后4℃保存。

LB固体培养基：称取蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，琼脂糖15g，置于1L烧杯中，加入800mL ddH2O充分搅拌溶解，调节pH值至7.0，定容至1L；高温高压灭菌后，冷却至50℃左右，加入抗生素，倒平板，凝固后，4℃保存。

蛋白分析相关溶液：

100mM PMSF：1.74g PMSF加入100mL异丙醇溶解，分装于1.5mL离心管中，20℃保存。

10%SDS：10g SDS加入80mL ddH2O中，充分溶解后，用浓盐酸调pH至7.2，定容至100mL，室温保存。

10%过硫酸胺（APS）1gAP加入10mL ddH2O中，充分溶解后，4℃保存，保存时间为1周。

30%丙烯酰胺贮存液：29g丙烯酰胺、1g N,N'亚甲双丙烯酰胺，加入60mL ddH2O中，加热至37℃溶解，定容至终体积为100mL。用0.45μm滤器过滤，于棕色瓶中4℃保存。

1.5M Tris-HCl（pH 8.8）18.17g Tris加入80mL ddH2O中，搅拌溶解后，浓盐酸调pH至8.8，定容至100mL。

1.5M Tris-HCl（pH 6.8）12.11g Tris加入80mL ddH2O中，搅拌溶解后，浓盐酸调pH至6.8，定容至100mL。

10×SDS电泳液缓冲液：30.3g Tris、144g甘氨酸、10g SDS，加入800mL ddH2O中，搅拌溶解后，调pH至8.3，定容至1L，使用时稀释10倍。

2×SDS凝胶加样缓冲液：4g SDS、0.2g溴酚蓝、3g二硫苏糖醇（DTT）20mL Tris-HCl（pH 6.8）20mL甘油，加入ddH2O定容至100mL。

膜转印缓冲液：30.3g Tris碱、144g甘氨酸，溶于800mLddH2O中，搅拌溶解后，定容至1L。用前取100mL上述溶液，加入200mL无水甲醇和700mL ddH2O混匀，现用现配。

TBST缓冲液（含0.05%Tween-20的TBS缓冲液）8g NaCl、0.2g KCl、3g Tris，加入800mL ddH2O，置于1L烧杯中，充分搅拌溶解后，加入0.5mL Tween-20充分混匀，定容至1L，室温保存。

封闭液：5g脱脂奶粉溶于100mL TBST中，充分搅拌溶解，现用现配。

考马斯亮蓝染色液：1g考马斯亮蓝R250溶于250mL异丙醇，加入100mL乙酸和650mL ddH2O混匀，室温贮存。

脱色液：100mL乙醇、800mL ddH2O和100mL冰乙酸，混匀室温备用。

50mM NH4HCO3：称取0.79g NH4HCO3溶于200ml ddH2O中，混合均匀，室温贮存。

10mM DTT：0.00015g DTT溶于100μl 25mM NH4HCO3。

10mg/ml IAA：0.00132g IAA溶解于132μl 25mM NH4HCO3，现配现用，注意避光。

提肽液：50ml乙和5ml甲酸，用ddH2O定容至100ml，混合均匀。

2.2 方法

2.2.1 细胞培养

a.复苏：从液氮罐中取出所需的细胞，迅速将其置于37℃水浴锅中,剧烈来回晃动,直至冻存管内完全融化为液体，1000rpm离心3min-5min，弃上清，用lmL新鲜完全培养基将细胞重悬，转移至含有新鲜完全培养基的培养皿中，混匀后放入培养箱中。

b.

传代：当细胞密度为70%80%时，即进行传代。吸尽旧培养基,加入约5mL的PBS溶液，轻轻晃动，重复洗1～2次，加入lmL 0.25%胰酶消化液，轻轻晃动,使胰酶均匀覆盖在细胞上，倒置显微镜下观察，细胞收缩变圆，边缘变得透亮，轻轻晃动培养皿，可见细胞脱落，此时加入2mL DMEM完全培养基(10%FBS，pH7.0)终止消化，用lmL的移液枪轻柔吹打,使细胞重悬成单个细胞；根据需要按比例加到新的培养皿中，加入完全培养基混匀，将细胞放入培养箱即可。

c.冻存：将状态优秀的需冻存的细胞,依照上面的方法消化成细胞悬液,加入到15ml的离心管中,1000rpm，离心3min-5min。弃上清，用冻存液重悬细胞，将细胞悬液移到冻存管，写上细胞名称及时间，用封口膜封口，放入4℃冰箱，静置30min；移入-20℃冰箱，静置2h；将细胞转移到-80℃冰箱或者液氮罐中。

2.2.2 质粒构建

2.2.2.1 RNA提取

a.弃掉旧培养基，用1×PBS缓冲液清洗2遍

b.每个10cm皿加1ml Trizol，水平放置片刻，裂解细胞，用枪吹打细胞使其脱落

c.将含有细胞的裂解液转移至1.5ml的EP管中，用枪反复吹吸至裂解液中无明显沉淀

d.室温静置5min

e.每1ml Trizol加200 μl氯仿，剧烈震荡30s，室温放置3min

f.12000g,4℃离心15min，离心后混合物分成三层，RNA存在于上层无色的水相中，且水相体积大约为所加Trizol体积的60%

g.吸取水样层，约400 μl，转移至新EP管中，加入500 μl预冷的异丙醇，颠倒数次混匀，室温沉淀10min

h.12000g，4℃离心15min，弃上清

i.按每毫升Trizol加入1mL预冷的75%乙醇（DEPC水配制）洗涤沉淀，旋涡振荡混合样品

j.7500g，4℃离心5min，弃上清

k.重复i,j再用75%乙醇（DEPC水配制）洗一遍，室温晾干沉淀，真空抽干5min

l.加15μL DEPC水溶解

m.取2μl于EP管中，检测浓度，其余-80℃冻存

2.2.2.2 mRNA的反转录

按照下列表格在冰上配制反转录反应液

试剂体积终浓度

5×PrimeScript RT Master Mix 2 ?L 1×

RNA 400ng

ddH2O 约8?L—

总体积10 ?L

轻柔混匀后按如下条件进行反转录反应

37℃15 min（反转录反应）

85℃5 sec（反转录酶的失活反应）

4℃

2.2.2.3 基因扩增

根据PKM2的序列，设计引物如下，由铂尚生物技术（上海）有限公司合成。

PKM2正向引物：5’CACCATGTCGAAGCCCCATAC TCAA-3’?

PKM2反向引物：5’TCACGGCACAGGAACAACACGCAT-3’?

按照下表配置PCR反应体系：

试剂体积终浓度

cDNA模板1 ?L 2.5 ng

正反向引物混合液4 ?L 各0.2 ?M

10×Exbuffer 5 ?L 1×

dNTP mixture 5 ?L 0.2 ?M

Ex Taq酶0.25 ?L 0.05 U/?L

ddH2O 34.75 ?L—

总体积50 ?L

将上述体系置于PCR仪中，分别按以下步骤扩

增：

95℃，变性5min；

95℃，变性30s；

55℃，复性30s；

72℃，延伸45s（根据片段大小而定）

72℃，延伸10min；

4℃保存。

2.2.2.4 琼脂糖凝胶电泳

a.用超纯水将电泳槽和梳子冲洗干净，将梳子插在电泳槽上，晾干。

b.配制足量的1×TAE电泳缓冲液，以灌满电泳槽和配制凝胶。

c.取配制好的1×TAE电泳缓冲液100mL于三角烧瓶中，准确称量琼脂糖干粉1.3g加到盛有电泳缓冲液的容器中，在微波炉内加热至琼脂糖融化，不时地小心旋转三角烧瓶以保证粘在壁上的未熔化的琼脂糖颗粒进入溶液。加热沸腾至凝胶澄清透明

d.待凝胶溶液稍冷却至60℃左右，倒入胶槽。凝胶适宜厚度为3~5mm，需检查在梳齿下或梳齿间应无气泡。

e.室温下30min，待凝胶溶液完全凝结。将胶槽置于电泳槽内，加少量电泳缓冲液于凝胶顶部，小心拔出梳子。

f.取3~5?L PCR产物和1?L 6×loading buffer与2?L SYBR Green I（1:300）混匀后，加样于电泳孔中。

g.凝胶中选一加样孔，加入DL2000 Marker 3?L和1?L SYBR Green I（1:1000）的混合液；

h.关上电泳槽盖，接好电极插头，DNA应向阳极侧（红色插头）泳动。设定100V电压，电泳30min，待染色条带移动至胶中后部时关闭电源。

i.将凝胶转移至凝胶成像分析系统上成像，分析条带灰度。观察电泳带型及其位置，并与所用DL2000 Marker条带对比，确认扩增产物的片段大小，同时通过成像灰度估计扩增产物的质量。

2.2.2.5 PCR产物回收（AxyPrep PCR清洁试剂盒）

a.在PCR反应液中，加3倍体积的Buffer PCR-A。

b.混匀后，将混合液转移到DNA制备管中，将制备管置于2 ml 离心管中，12000×g离心1min，弃滤液。

c.将制备管置回2mL 离心管，加700μL Buffer W2，12000g 离心30s，弃滤液。以同样的方法再用400μL Buffer W2洗涤一次，12000g离心1min，以确保盐份被完全清除，消除对酶切反应的影响。

d.将制备管置于洁净的1.5mL离心管中，加入20~30μL超纯水，室温静置3-5min后，12000g离心1min。回收，之后用NanoDrop 2000C测浓度。

2.2.2.6 酶切

按照下表配置酶切反应体系：

试剂载体目的基因片段

DNA 2μL(1μg)10μL(0.3μg)

10×FastDigest buffer 3μL 3μL

BamH I 1μL 1μL

EcoRⅠ1μL 1μL

ddH2O 23μL 15μL

总体积30μL 30μL

其中DNA体积需根据所需DNA质量及其浓度计算后确定。体系加好后轻轻混匀，置于37℃孵育5~30min。

2.2.2.7 基因片段回收（AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒）

酶切结束后，酶切载体和空载体进行琼脂糖凝胶电泳，之后酶切载体割胶回收。

a.将含目的基因的琼脂糖凝胶用干净的刀片切下，吸尽凝胶表面液体，称重，作为一个凝胶体积。

b.

加入3倍凝胶体积buffer DE-A，混合均匀后于75℃加热，每2~3min混匀一次，直至凝胶块完全熔化。

c.加buffer DE-A体积1/2的buffer DE-B，混合均匀，若分离的DNA片段小于400 bp时，加入1个凝胶体积的异丙醇。

d.将3中混合液转移到DNA制备管中，12000g离心1min，弃滤液。

e.将制备管置回2mL离心管，加500μL buffer W1，12000g离心30s，弃滤液。

f.将制备管置回2mL离心管，加700μL buffer W2，12000g 离心30s，弃滤液。以同样的方法再用700μL buffer W2洗涤一次，12000g 离心1min，以确保盐份被完全清除，消除对酶切反应的影响。

g.将制备管置回2mL离心管中，12000×g离心1min。

h.将制备管置于洁净的1.5mL离心管中，在制备膜中央加25~30μLddH2O，室温静置1min。12000g离心1min洗脱DNA。

2.2.2.8 连接

按照下表配置连接反应体系：

样品体积（实验组）体积（阴性对照组）

酶切的载体2.0 μL（0.1-0.3pmol）2.0 μL（0.1-0.3pmol）

目的基因2.μL（0.01-0.03pmol）—

10×T4 buffer 1.0 μL 1.0 μL

T4连接酶0.5μL 0.5μL

ddH2O 4.5 μL 6.5 μL

总体积10.0μL 10.0μL

连接体系中，目的基因分子数：载体分子数>3:1，通常目的片段物质的量是载体的3~10倍。将混合液轻轻混匀，置于16℃孵育过夜。

2.2.2.9 质粒转化、筛选阳性克隆

a.取感受态细胞DH5α置于冰浴中。

b.向感受态细胞悬液中加入质粒DNA，所用感受态细胞悬液体积应多于DNA体积的10倍；同时设一空白菌作为阴性对照，其中不加质粒。轻轻旋转1.5mL离心管以混匀内容物，冰浴30min。

c.将1.5mL离心管置于42℃水浴中热休克60~90秒，然后快速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却2-3min，该过程不要摇动离心管。

d.向每个离心管中加入900μL无菌的LB培养基（不含抗生素）混匀，37℃，200rpm振荡培养45min，使细菌复苏。

e.取200μL转化液涂布在含卡钠的选择性LB平板上，将平板正置于室温直至液体被吸收，37℃倒置培养12-16hr。

f.观察菌落生长情况，挑取平板上的单克隆菌落进行菌落PCR，经琼脂糖凝胶电泳挑选出阳性克隆，进行测序验证。测序正确的阳性克隆以30%的比例加入灭菌的甘油，分装到无菌的1.5mL离心管中，80℃冻存备用。

2.2.3 质粒小量抽提（AxyPrep质粒DNA小量试剂盒）

a.接菌于5mL 100μg/mL氨苄青霉素的无菌LB培养基中，37℃培养12-16h左右。

b.收集菌液，5000g离心1min，弃尽上清。

c.向菌体加入250μL S1 buffer，悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀。

d.加入250μL S2 buffer，温和并充分地上下翻转4-6次使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。

e.加入350μL S3 buffer，温和并充分地上下翻转混合6-8次。

f.12000g离心10min，取上清，转移至

制备管中。

h.加入500μL W1 buffer，12000g离心1min，弃滤液。

i.加入700μL W2 buffer，12000g离心1min，弃滤液。重复一次。

j.12000g离心1min，去除残留液体。

k.将制备管移入洁净的1.5 ml离心管中，在制备管膜中央加25~30μLddH2O，室温静置2-3min。12000g离心1 min洗脱，得到目标质粒。

2.2.4 细胞转染

a.转染前一天,铺10cm板，密度约为30%40%时，开始转染。

b.转染前1h，弃原来的细胞培养液，加入7mL不含胎牛血清的DMEM。

c.用350μl OPI-MEM培养基稀释5μg目的质粒，轻轻混匀。

d.加11μl Lipo2000至另外350μl OPI-MEM中，轻轻混匀，室温孵育5min。

e.将Lipo2000缓慢滴入质粒稀释管中，轻轻混匀，室温孵育20min。

f.将DNA与Lipo2000混合液缓慢加至10cm板中。

g.将细胞至于37℃，5%CO2细胞培养箱中，4h-6h后换成完全培养液（DMEM+10%FBS）

2.2.5 蛋白收集

a.细胞裂解：弃废液，并用预冷的PBS清洗细胞1-2次，然后加入胰酶进行消化，消化结束后，加入2ml含10%FBS的DMEM终止消化，并收集细胞于15ml离心管中进行离心，1200rpm，3-5min，弃上清；加入相应体积的RIPA裂解液（含1mM PMSF）4℃，孵育20-25min，然后13000 rpm-14000 rpm离心15min，将上清移至新EP管中。

b.样品处理：收集样品，每10μl加入2.5μl 5×loading buffer，沸水煮5min-10min。

2.2.6 Western Blot

a.SDS-PAGE电泳分离：将分离胶灌入玻璃板，并用异丙醇压平液面，室温30min聚合。弃去异丙醇，灌浓缩胶，室温聚合。上样，浓缩胶中运行电流为10mA，当样品到达分离胶界面，电流调至20mA。

b.转膜：切除浓缩胶，在湿转液中平衡10min。剪取与分离胶大小相同的PVDF膜和滤纸。PVDF膜先在甲醇中浸透，取出浸入湿转液平衡5min-10min。滤纸同样在湿转液中浸润10min。自下而上依次叠放(阴极)海绵、滤纸（3张）凝胶、PVDF膜、滤纸（3张）海绵(阳极)恒定电压100V转膜90 min。

c.封闭：转移结束后，5%的脱脂奶粉室温下封闭lh-2h。

d.抗体孵育：稀释后的抗体，4℃孵育过夜。用TBST洗涤PVDF膜3次，每次5min-10min；加入稀释后的相应二抗，室温孵育1h，用TBST洗涤3次，每次5min-10min。

e.化学发光检测：1:1(v/v)混合ECLPlus试剂盒中的A液和B液，然后将混合液均匀覆盖于PVDF膜的正面，室温避光孵育反应3-5min，曝光。

2.2.8 免疫沉淀

a.从-20℃冰箱取出收集的蛋白，放在冰上融化

b.取10μl加于500μl裂解液中，4℃混合10min,并与融化的蛋白样品4℃,2000rpm离心1min

c.弃Anti-Flag M2 Agrose from mouse的上清，将全部的蛋白样品加入，4℃孵育2h-4h,2000rpm离心1min,弃上清

d.用pH7.0,100mM Tris-HCl清洗，2000rpm离心1min,弃上清，并重复一次

e.加20μl 2×蛋白上样缓冲液，

100℃煮3min-5min

f.4000rpm离心1min,取10μl上清进行SDS-PAGE

2.2.9 考染

考马斯亮蓝R250微波加热染色2min，再用脱色液（10%乙醇+10%乙酸）脱色

2.2.10 胶内酶解

a.切胶：将目的组分的凝胶切下，收集至1.5 mL离心管中。

b.加入600 μl ddH2O,震荡洗涤10min，重复一次

c.脱色：加200 μl 25mM NH4HCO3/50%乙腈，37℃脱色，至胶粒无色为止

d.干胶：吸尽脱色液，加100%的乙腈使胶粒充分脱水，胶粒变成白色固体状即可。

e.挥发：吸尽乙腈，保持盖子打开，使胶粒周围残余乙腈挥发。

f.还原烷基化：加入50μl 10mM DTT，37℃孵育1h；吸去DTT，加入50μl IAA，37℃孵育30min

h.吸去IAA，加入50μl 25mM NH4HCO3，震荡洗涤10min

i.再用50μl 25mM NH4HCO3/50%乙腈，震荡洗涤10min，重复一次

j.室温干燥1h

k.加20μl Mass Spectra Grade Modified Trypsin于4℃吸胀20min-30min左右，然后，置于37℃酶解仪中，酶解16h

l.将酶解后的上清转移至新的EP管中

m.在胶中加入100μl提肽液，超声20min,37℃孵育20min，把上清吸至上个步骤的新EP管中，重复一次

n.冻干，20℃保存

2.2.11 质谱鉴定

质谱扫描：

喷针外加电压：2.3KV；

扫描范围：350-1500m/z全扫描；

扫描方式：高分辨模式(high resolution)

串级质谱扫描范围：100-1250m/z;

串级质谱扫描模式：信息依赖性获取模式(IDA,information dependent acquisition)

数据处理：

将串级质谱得到的.raw文件和.wiff文件转换为.mzXML文件，并且导入Progenesis LC-MS软件，经过谱图校正处理后，得到整合过的.mgf文件。随后使用Mascot软件对.mgf文件进行搜库。采用标准蛋白质数据库为SwissProt，搜库参数设置如下:Trypsin半酶切，漏切上限为2；肽段误差允许为10ppm，串级质谱误差允许为1Da；固定修饰为Carbamidomethyl(C)鉴定甲基化的可变修饰为Oxidation,Methyl(R)Methyl(K)鉴定乙酰化的可变修饰为Acetyl(K)Acetyl(N-term)Acetyl(Protein N-term)鉴定磷酸化的可变修饰为Oxidation,Phosopho(Y)Phosopho(ST)

3 结果

3.1 真核表达载体

图1真核表达载体pcDNA3.1(+)Flag

图1中真核表达载体pcDNA3.1(+)Flag上的EcoR I和BamH I是本实验酶切所选择的酶。

3.2 双酶切琼脂糖凝胶电泳

1 2 3

图2 真核表达载体的琼脂糖凝胶电泳图

1.pcDNA3.1-Flag;2.pcDNA3.1-Flag酶切后的片段;3.Marker

图2显示未酶切的真核表达载体pcDNA3.1-Flag片段大小约为5428bp，酶切后的真核表达载体pcDNA3.1-Flag片段大小约为5405bp，与理论值符合。

3.3 质粒测序

将构建的质粒送至铂尚生物技术（上海）有限公司测序，测序结果比对NCBI的blast,序列相同，无突变。

3.4 PKM2蛋白的表达

图3 PKM2蛋白的表达

1.Control的表达;2.PKM2的表达

图3中的

1，2是分别将pcDNA3.1-Flag和pcDNA3.1-Flag-PKM2分别转染至人胚肾细胞HEK293T，收集细胞，总细胞裂解液上样量为20-40μg，经Western blot处理后化学发光检测所得。

由此可见，PKM2蛋白在人胚肾细胞HEK293T有表达，而pcDNA3.1-Flag无蛋白表达，证明质粒转染成功。

3.5 免疫沉淀

1 2 3

图4 考马斯亮蓝染色的凝胶扫描图

1Marker（170KDa,130KDa,100KDa,70KDa,55KDa,40KDa,35KDa,25KDa,15KDa）2.PKM2;3Control

图4中的2，3分别是将pcDNA3.1-Flag-PKM2，pcDNA3.1-Flag转染至人胚肾细胞HEK293T，免疫沉淀后经考马斯亮蓝染色的凝胶扫描成像。由图4看出，PKM2的分子量约为58KDa，与实际分子量相符合。

3.6 质谱鉴定

质谱鉴定利用Mascot搜库所得部分串级质谱图如图5，图6

图5 乙酰化肽段KGVNLPGAAVDLPAVSEK的串级谱图

图5为鉴定到的trypsin酶解后PKM2蛋白的一条乙酰化肽段207-224（KGVNLPGAAVDLPAVSEK）的CID串级谱图。从图中的b,y离子碎裂可以推断出，这条肽段的K207位置发生了乙酰化。

图6 磷酸化肽段LDIDSPPITAR的串级谱图

图6为鉴定到的trypsin酶解后PKM2蛋白的一条磷酸化肽段33-43（LDIDSPPITAR）的CID串级谱图。从图中的b,y离子碎裂可以推断出，这条肽段的S37位置发生了磷酸化。

本研究所有鉴定到PKM2的修饰位点统计结果如表1

表1 PKM2上蛋白质翻译后修饰位点

修饰种类修饰位点

总数位点

甲基化1 K3

乙酰化10 K62,K135,K188,K206,K207,K247,K270,K311,K322,K422

磷酸化18 T15,S37,S77,Y105,114,Y175,S182,S205，S222,S287,T328,S333,Y370,S434,S437,Y466,T524

4 讨论

本研究成功构建出重组质粒pcDNA3.1-Flag-PKM2，转染至细胞后收集相应表达产物PKM2，鉴定出PKM2上存在乙酰化、甲基化、磷酸化三种蛋白质翻译后修饰以及具体的修饰位点。

4.1引物设计

引物设计是基因成功扩增的关键步骤。引物过长会导致延伸温度升高，不利于Taq DNA聚合酶的反应。引物设计过程中，多次校正引物的序列，避免与模版中出现较多相似性片段而导致错配。

4.2细胞转染

经多次摸索，发现30%40%是细胞转染的最适生长密度。脂质体与质粒的体积质量比2：1能提高转染效率。转染整个过程一律采用不含血清不含双抗的DMEM完全培养基，因为血清会影响质粒与脂质体的结合。同时脂质体对细胞有一定毒性，所以要在4~6小时内及时更换培养液。

4.3免疫沉淀

免疫沉淀裂解液中需要添加蛋白酶抑制剂以防止目的蛋白的降解。对抗体-agarose beads复合物的洗涤时间过短或洗涤次数过少会造成非特异性吸附，同时离心时转速不可过大，否则琼脂糖珠子易碎裂。SDS-PAGE采用了4%12%梯度胶,有利于蛋白的分离与浓缩，提高目的蛋白含量。

4.4 胶内酶解

脱色温度37℃比常温更利于脱色。干胶要让乙腈挥发干净，若有残留会影响后续的质谱鉴定。酶解所用胰酶的量是在胶4℃吸胀后不够补加，但不可加过量，以免胰酶自我酶解成肽段影响目标蛋白的鉴定。

本研究鉴定结果中PKM2的磷酸化位点S37,Y105都被报道过。Yang等研究发现PKM2的S37位点磷酸化与表皮生长因子受体和人类GBM中的ERK1/2的活性有关，PKM2的核易位可能在人类的肿瘤生长过程中发挥显著作用。Hitosugi等的研究显示PKM2的Y105磷酸化位点会通过辅助因子FBP从而破坏四聚体PKM2的形成。而且PKM2的磷酸化位点Y105常见于人类癌症中，可见与癌症的发生联系紧密。对比磷酸化蛋白数据库（https://www.wendangku.net/doc/3f9413435.html,）T35,T114,S333,S434,S437,T524为本次研究新鉴定出的磷酸化位点，可能也存在潜在的重要功能，具体有待进一步的研究。